--- title: "\"Методические указания по определению нитрапирина и его метаболита 6-хлорпиколиновой кислоты в воде, почве и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии\"" number: "4360-87" issuer: "Министерство здравоохранения СССР" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-4360-87" --- ## "Методические указания по определению нитрапирина и его метаболита 6-хлорпиколиновой кислоты в воде, почве и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии" # "Методические указания по определению нитрапирина и его метаболита 6-хлорпиколиновой кислоты в воде, почве и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии" (утв. Минздравом СССР 08.06.1987 N 4360-87)
Утверждены
Минздравом СССР
8 июня 1987 г. N 4360-87
**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ НИТРАПИРИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА** **6-ХЛОРПИКОЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ВОДЕ, ПОЧВЕ И БИОЛОГИЧЕСКОМ**
**МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>**
--- <*> Разработаны Ю.А. Бунятяном, М.С. Петросян, А.А. Геворгян, С.А. Джагацпанян (Филиал ВНИИГИНТОКС). Краткая характеристика препарата. Нитрапирин - 2-хлор-6- (трихлорметил)пиридин. Брутто-формула C H Cl N. Молекулярная 6 3 4 масса 230,9. Общепринятое название - н-серве. Химически чистое вещество - кристаллический порошок со слабым сладковатым запахом. Температура воспламенения более 350 °C, т. пл. 62 - 63 °C. Давление пара при 25 °C составляет 0,37 Па. Нитрапирин хорошо растворим в хлороформе, ацетоне, безводном аммиаке, хлористом метилене, ксилоле при 20 - 26 °C. Растворимость в воде менее 40 мг/л. Рекомендован для применения в качестве стабилизатора азотных удобрений. Основной продукт превращения нитрапирина в объектах окружающей среды и животном организме - 6-хлорпиколиновая кислота (6-ХПК). Брутто-формула C H O ClN. Молекулярная масса 157,5. Химически 6 4 2 чистое вещество - белый кристаллический порошок, хорошо растворимый в этилацетате, ацетоне, малорастворимый в хлороформе, диэтиловом эфире, этаноле, бензоле, воде. МДУ нитрапирина и 6-ХПК в овощных и зерновых культурах 0,4 мг/кг; ПДК в воде 0,02 мг/л. Принцип метода. Метод основан на извлечении исследуемых соединений из пробы органическим растворителем, очистке экстрактов, хроматографировании в тонком слое пластинок "Силуфол" УФ и обнаружении препаратов раствором аммиаката серебра, 254 подвергнутых УФ-облучению до и после проявления. Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 151. Таблица 151
**МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ**
**НИТРАПИРИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА 6-ХПК В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ**
**СРЕДЫ И БИОМАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ**
Анализируемый объектПредел определения, мг/л, мг/кг, мкг/г, мкг/млСреднее значение определения, %Стандартное отклонение, %Доверительный интервал при n = 5, p = 0,95, %
Нитрапирин
Вода0,00594,00+/- 4,60+/- 5,72
Почва0,0284,10+/- 1,97+/- 2,44
Картофель0,0286,40+/- 1,84+/- 2,28
Свекла0,0284,40+/- 0,90+/- 1,12
Зерно0,0282,00+/- 1,58+/- 1,96
Печень0,290,40+/- 5,71+/- 7,10
Почки0,289,86+/- 6,62+/- 8,23
Легкие0,293,90+/- 4,34+/- 5,39
Мозг0,287,66+/- 5,21+/- 6,48
Кал0,288,40+/- 8,52+/- 10,60
Кровь0,287,46+/- 6,48+/- 8,06
Моча0,196,00+/- 5,47+/- 6,80
6-ХПК
Вода0,00589,0+/- 1,57+/- 1,97
Почва0,283,0+/- 3,00+/- 3,72
Зерно0,282,0+/- 2,75+/- 3,34
Зеленая масса0,380,0+/- 3,03+/- 3,78
Печень0,187,6+/- 3,29+/- 4,08
Почки0,186,0+/- 1,58+/- 1,96
Легкие0,188,0+/- 3,87+/- 4,80
Мозг0,283,0+/- 3,00+/- 3,72
Кал0,285,4+/- 3,64+/- 4,51
Кровь0,194,0+/- 3,08+/- 3,82
Моча0,191,2+/- 0,84+/- 1,04
Избирательность метода. В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии ХОП, а также таких близких по структуре и области применения соединений, как 2М-4Х, 2,4-Д, бенлат, БМК, хлорамп. Реактивы и материалы. Ацетон ч.д.а. Этилацетат х.ч. Бензол х.ч. н-Гексан ч. Этиловый эфир медицинский. Хлорид калия х.ч., 24-процентный раствор, приготовленный на 0,5-процентном растворе едкого натра. Едкий натр х.ч., 0,5-процентный в.р. Серная кислота х.ч., 0,2-процентный и 10-процентный (по объему) в.р. Уксусная кислота х.ч. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрат серебра х.ч. Аммиак водный ч.д.а. Пластинки хроматографические "Силуфол" УФ . 254 Фильтры бумажные "синяя лента". Ортофосфорная кислота х.ч., 2-процентный (по объему) водный раствор, предварительно насыщенный хлоридом калия. Уголь активированный марки БАУ. Мета-кремнекислый магний ч. Стандартный раствор нитрапирина в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл. Стандартный раствор 6-ХПК в этилацетате с содержанием 100 мкг/мл. Растворы нитрапирина и 6-ХПК хранят в сухом прохладном месте не более 15 дней. Ацетонитрил ч. Приборы, аппаратура, посуда. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Ротационный испаритель. Водоструйный насос. Воронки: Бюхнера; делительные на 100, 500 мл. Колбы: Бунзена; круглодонные короткогорлые со шлифом N 29 на 100, 250 мл; конические на 100, 250 мл; мерные на 25, 100 мл. Камера для хроматографирования. Камера для опрыскивания. Пипетки с делениями на 2, 5, 10 мл. Микропипетки на 0,1 мл. Пульверизаторы стеклянные. Стаканы химические на 50, 100, 250 мл. Подготовка к определению. Приготовление проявляющих реагентов: N 1 - 0,5 г нитрата серебра помещают в мерную колбу на 100 мл, растворяют в нескольких миллилитрах ацетона, добавляют 5 мл аммиака и 5 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы перемешивают, доводят уровень раствора до метки ацетоном. Раствор хранят в темной склянке не более 10 дней; N 2 - 0,85 г нитрата серебра помещают в мерную колбу на 100 мл и дважды растворяют в нескольких миллилитрах дистиллированной воды, прибавляют 2,5 мл концентрированного аммиака. Содержимое колбы перемешивают, доводят уровень раствора до метки дистиллированной водой. Реагент хранят в темной склянке не более 3 мес. Подготовка хроматографической колонки с чередующимися слоями кремнекислого мета-магния и безводного сульфата натрия. В хроматографическую колонку (длина 400 мм, диаметр 20 мм) помещают стекловату и насыпают безводный сульфат натрия высотой 2,5 см. Затем насыпают слой в 7,5 см мета-кремнекислого магния (активированного при 650 °C в течение 4 ч) и слегка уплотняют стеклянной палочкой. Затем вновь чередуют слой безводного сульфата натрия (2,5 см) и мета-кремнекислого магния (7,5 см) и снова уплотняют. В верхнюю часть колонки на высоту 2,5 см насыпают слой безводного сульфата натрия. Смачивают колонку 40 мл гексана и помещают под нее коническую колбу на 100 мл для сбора вытекающей из колонки жидкости. Отбор проб. Пробы транспортируют в стеклянной таре с притертыми пробками. Анализы проводят в дни отбора проб. Ход анализа. Определение нитрапирина. Экстракция и очистка. Пробу воды (100 мл) помещают в делительную воронку и экстрагируют нитрапирин трижды хлороформом порциями по 30 мл. Объединенный экстракт проводят через воронку с безводным сульфатом натрия и отгоняют растворитель на ротационном испарителе досуха при температуре не более 35 °C. Навеску почвы в 50 г помещают в плоскодонную колбу и смешивают с 5 г безводного сульфата натрия. Экстракцию проводят 100 мл смеси гексан - ацетон (1:1). Экстракт отфильтровывают в делительную воронку через фильтр "синяя лента", промывают 150 мл 2-процентного водного раствора сульфата натрия и встряхивают. После разделения гексановый слой переносят в круглодонную колбу со шлифом через воронку с 2 - 3 г безводного сульфата натрия. Растворитель отгоняют на роторном испарителе при температуре 35 °C. Образец картофеля или свеклы в 50 г измельчают, помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 5 г безводного сульфата натрия и смешивают. Препарат извлекают дробными экстракциями (50, 30, 30 мл) при интенсивном встряхивании с гексаном. Объединенные экстракты промывают в делительной воронке 30 мл дистиллированной воды. Водный слой отбрасывают, а гексановый слой отфильтровывают через фильтр "синяя лента" с 2 - 3 г безводного сульфата натрия в круглодонную колбу со шлифом. Растворитель отгоняют на роторном испарителе при температуре 35 °C. Пробу зерна крупного помола в 50 г помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, заливают 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 30 мин., затем проводят еще дважды, экстрагируют гексаном порциями по 30 мл. Объединенные экстракты отфильтровывают в круглодонную колбу и отгоняют растворитель на роторном испарителе при 35 °C. Сухой остаток растворяют в 10 мл этилового эфира, вливают в колонку для хроматографирования в тот момент, когда мениск ранее введенного гексана достигнет верхней части адсорбента. Затем колбу обмывают 10 мл этилового эфира и также вводят в колонку. Элюируют нитрапирин из колонки смесью гексана с этиловым эфиром (2:1). Собранные в приемник первые 60 мл элюата отбрасывают, а содержащие препарат последующие 40 мл собирают в круглодонную колбу со шлифом. Растворитель отгоняют на роторном испарителе при температуре 35 °C. Экстракцию из биосубстратов экспериментальных животных проводят следующим образом. Пробу крови, мочи (5 мл) трижды экстрагируют хлороформом порциями по 10 мл. Объединенные экстракты высушивают безводным сульфатом натрия и отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре 35 °C досуха. Остаток с помощью ацетона наносят на хроматографическую пластинку и хроматографируют. Пробу печени, мозга, легких, почек, кала (5 г) тщательно измельчают, помещают в коническую колбу на 100 мл, добавляют 10 мл ацетонитрила, смешивают стеклянной палочкой и экстрагируют. Экстракцию повторяют еще дважды ацетонитрилом порциями по 10 мл. Экстракты проводят через воронку с безводным сульфатом натрия. Объединенные экстракты очищают встряхиванием с гексаном 3 раза по 10 мл. Гексановые экстракты сливают, а ацетонитрильные упаривают на ротационном испарителе при температуре 35 °C досуха. Остаток с помощью ацетона наносят на хроматографическую пластинку и хроматографируют. Хроматографирование и проявление хроматограмм с пробами нитрапирина. Сухой остаток после удаления растворителя растворяют в ацетоне и наносят на пластинку "Силуфол" УФ . Пластинку с 254 нанесенными пробами и стандартными растворами помещают в камеру с подвижной системой гексан - ацетон (5:1). После поднятия фронта растворителей на 12 см пластинку вынимают из камеры, подсушивают и опрыскивают 5 мл проявляющего реагента N 1 и подвергают УФ-облучению в течение 10 мин. Нитрапирин проявляется в виде темно-серых пятен с R 0,77 +/- 0,02 на светло-коричневом фоне. f Обработка результатов анализа. Количественная оценка проводится сравнением площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартного раствора. Содержание нитрапирина в пробе (X, мг/кг, мг/л или мкг/г, а в случае биосубстратов - мкг/мл) вычисляют по формуле: A X = -, P где: A - количество вещества, найденное путем сравнения со стандартами, мкг; P - масса или объем анализируемой пробы, г или мл. Определение 6-ХПК. Экстракция и очистка экстрактов. Пробу воды 200 мл помещают в делительную воронку, подкисляют 1,5 - 2 мл 10-процентного раствора серной кислоты (до pH 1 - 2) и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 50 мл. Остаток количественно наносят на хроматографическую пластинку после упаривания на ротационном испарителе при температуре 55 - 60 °C. Навеску почвы (50 г), измельченной и просеянной, подкисляют 20 мл 2-процентной ортофосфорной или 0,2-процентным раствором серной кислоты и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 50 мл. Растворитель фильтруют через воронку Бюхнера, отгоняют на ротационном испарителе досуха при температуре 55 - 60 °C. К сухому остатку прибавляют 10 - 15 мл 20-процентного раствора хлорида калия, приготовленного на 0,5-процентном растворе едкого натра, колбу тщательно ополаскивают и переносят в делительную воронку. Колбу еще раз промывают 10 - 15 мл того же раствора щелочи и сливают в ту же воронку. Объединенный щелочной экстракт промывают дважды по 10 - 15 мл гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а щелочной раствор подкисляют 10-процентным раствором серной кислоты до pH 1 - 2 и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 15 - 20 мл. Объединенный экстракт проводят через воронку с безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняют при температуре 55 - 60 °C, остаток наносят на хроматографическую пластинку. Пробу 25 г растительного материала (зерновые, зеленая масса) помещают в колбу и приливают 15 - 20 мл 2-процентного раствора ортофосфорной или 0,2-процентного раствора серной кислоты, предварительно насыщенного хлоридом калия, и экстрагируют 6-ХПК трижды по 50 мл этилацетатом. Растворитель фильтруют через воронку Бюхнера и отгоняют досуха на ротационном испарителе при температуре 55 - 60 °C. Далее поступают аналогично анализу почвы. Очистка экстрактов в случае сильного загрязнения пигментами. Если после первой экстракции этилацетатом экстракты сильно загрязнены пигментами, то очистку можно проводить следующим образом. В случае зеленой массы к сухому остатку прибавляют 15 - 20 мл 20-процентного раствора хлорида калия, приготовленного на 0,5-процентном растворе едкого натра. Содержимое колбы тщательно перемешивают. В колбу при перемешивании прибавляют смесь, полученную в результате энергичного встряхивания 2 г активированного угля марки БАУ, 15 мл 0,5-процентного раствора едкого натра и 15 мл гексана. Пробу выдерживают 1 ч, периодически встряхивая, и фильтруют через воронку Бюхнера. Колбу и уголь на фильтре промывают дважды 0,5-процентным раствором едкого натра по 10 мл. Смесь переносят в делительную воронку, гексановый слой отбрасывают. К водному слою прибавляют 1 - 2 мл 10-процентного раствора серной кислоты (pH 1 - 2) и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 20 - 30 мл. Объединенные экстракты высушивают, растворитель отгоняют при 55 - 60 °C, остаток наносят на хроматографическую пластинку. Пробу биосубстратов экспериментальных животных (кровь, моча, печень, почки, легкие, мозг, кал) 5 г или 5 мл помещают в колбу и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 10 - 15 мл. Растворитель отфильтровывают через бумажный фильтр в колбу для выпаривания и отгоняют на ротационном испарителе досуха при температуре 55 - 60 °C. Далее поступают аналогично анализу почвы. Хроматографирование и проявление хроматограмм с пробами 6-ХПК. После отгонки растворителя пробы с помощью этилацетата количественно наносят на пластинки "Силуфол" на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки (размеры пластинки 15 x 15 см). Сначала хроматографирование проводят в бензоле. При этом 6-ХПК остается на старте, а примеси, содержащиеся в пробе, продвигаются вверх. После подсушивания пластинок на воздухе (под вытяжкой) проводят вторичное хроматографирование в смеси бензол - уксусная кислота (1:1). После хроматографирования пластинки ее высушивают и выдерживают под ртутно-кварцевой лампой 7 - 10 мин. Далее пластинку опрыскивают проявляющим реагентом N 2 и снова подвергают УФ-облучению до четкого проявления пятен (примерно 5 мин.). При наличии в пробе 6-ХПК на пластинке проявляются пятна бурого цвета с величиной R 0,54 +/- 0,01. f Обработка результатов анализа. Количественная оценка проводится путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартного раствора. Содержание 6-ХПК в анализируемой пробе (X, мг/кг, мг/л, а в случае биосубстратов - мкг/г, мкг/мл) определяют по формуле: A X = -, P где:
A - количество 6-ХПК, найденное путем сравнения со стандартами, мкг;
P - масса или объем анализируемой пробы, г или мл.
Требования безопасности. При работе с нитрапирином и 6-ХПК необходимо беречь глаза, а также соблюдать все необходимые меры предосторожности при работе в химических лабораториях и [правила](https://bukva.ai/docs/pravila-2455-81) устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены.
---