Методические указания по определению нитрапирина и его метаболита 6-хлорпиколиновой кислоты в воде, почве и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 08.06.1987 № 4360-87)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ НИТРАПИРИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА 6-ХЛОРПИКОЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ВОДЕ, ПОЧВЕ И БИОЛОГИЧЕСКОМ

---

<*> Разработаны Ю.А. Бунятяном, М.С. Петросян, А.А. Геворгян, С.А. Джагацпанян (Филиал ВНИИГИНТОКС).

    Краткая  характеристика   препарата.  Нитрапирин  -  2-хлор-6-
(трихлорметил)пиридин.   Брутто-формула   C H Cl N.   Молекулярная
                                           6 3  4
масса 230,9.  Общепринятое  название -  н-серве. Химически  чистое
вещество - кристаллический порошок со слабым сладковатым  запахом.
Температура  воспламенения более  350 °C,  т.  пл.  62  -  63  °C.
Давление  пара  при 25 °C  составляет  0,37 Па. Нитрапирин  хорошо
растворим  в  хлороформе,  ацетоне,  безводном  аммиаке, хлористом
метилене, ксилоле при 20 - 26 °C. Растворимость в  воде  менее  40

мг/л. Рекомендован для применения в качестве стабилизатора азотных удобрений.

Основной продукт превращения нитрапирина в объектах окружающей

среды  и  животном  организме - 6-хлорпиколиновая кислота (6-ХПК).
Брутто-формула  C H O ClN.   Молекулярная  масса  157,5. Химически

             6 4 2

чистое   вещество   -   белый   кристаллический   порошок,  хорошо
растворимый в этилацетате,  ацетоне, малорастворимый в хлороформе,
диэтиловом  эфире, этаноле, бензоле, воде. МДУ нитрапирина и 6-ХПК

в овощных и зерновых культурах 0,4 мг/кг; ПДК в воде 0,02 мг/л.

    Принцип  метода.   Метод  основан  на  извлечении  исследуемых
соединений   из   пробы   органическим   растворителем,    очистке
экстрактов, хроматографировании в тонком слое пластинок  "Силуфол"
УФ     и  обнаружении   препаратов   раствором  аммиаката серебра,

254 подвергнутых УФ-облучению до и после проявления.

Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 151.

Таблица 151

СРЕДЫ И БИОМАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ

Анализируемый объект	Предел определения, мг/л, мг/кг, мкг/г, мкг/мл	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал при n = 5, p = 0,95, %
Нитрапирин
Вода	0,005	94,00	+/- 4,60	+/- 5,72
Почва	0,02	84,10	+/- 1,97	+/- 2,44
Картофель	0,02	86,40	+/- 1,84	+/- 2,28
Свекла	0,02	84,40	+/- 0,90	+/- 1,12
Зерно	0,02	82,00	+/- 1,58	+/- 1,96
Печень	0,2	90,40	+/- 5,71	+/- 7,10
Почки	0,2	89,86	+/- 6,62	+/- 8,23
Легкие	0,2	93,90	+/- 4,34	+/- 5,39
Мозг	0,2	87,66	+/- 5,21	+/- 6,48
Кал	0,2	88,40	+/- 8,52	+/- 10,60
Кровь	0,2	87,46	+/- 6,48	+/- 8,06
Моча	0,1	96,00	+/- 5,47	+/- 6,80
6-ХПК
Вода	0,005	89,0	+/- 1,57	+/- 1,97
Почва	0,2	83,0	+/- 3,00	+/- 3,72
Зерно	0,2	82,0	+/- 2,75	+/- 3,34
Зеленая масса	0,3	80,0	+/- 3,03	+/- 3,78
Печень	0,1	87,6	+/- 3,29	+/- 4,08
Почки	0,1	86,0	+/- 1,58	+/- 1,96
Легкие	0,1	88,0	+/- 3,87	+/- 4,80
Мозг	0,2	83,0	+/- 3,00	+/- 3,72
Кал	0,2	85,4	+/- 3,64	+/- 4,51
Кровь	0,1	94,0	+/- 3,08	+/- 3,82
Моча	0,1	91,2	+/- 0,84	+/- 1,04

Избирательность метода. В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии ХОП, а также таких близких по структуре и области применения соединений, как 2М-4Х, 2,4-Д, бенлат, БМК, хлорамп.

    Реактивы и материалы. Ацетон  ч.д.а.  Этилацетат  х.ч.  Бензол
х.ч. н-Гексан  ч.  Этиловый  эфир медицинский. Хлорид калия  х.ч.,
24-процентный  раствор,  приготовленный на 0,5-процентном растворе
едкого натра. Едкий натр х.ч., 0,5-процентный в.р. Серная  кислота
х.ч.,  0,2-процентный  и  10-процентный (по объему)  в.р. Уксусная
кислота х.ч. Сульфат натрия безводный ч.д.а.  Нитрат серебра  х.ч.
Аммиак водный ч.д.а. Пластинки хроматографические "Силуфол" УФ   .

                                                          254

Фильтры бумажные «синяя лента». Ортофосфорная кислота х.ч., 2-процентный (по объему) водный раствор, предварительно насыщенный

хлоридом калия.  Уголь активированный марки БАУ. Мета-кремнекислый
магний ч. Стандартный раствор нитрапирина в ацетоне с  содержанием
100 мкг/мл.  Стандартный раствор 6-ХПК в этилацетате с содержанием

100 мкг/мл. Растворы нитрапирина и 6-ХПК хранят в сухом прохладном месте не более 15 дней. Ацетонитрил ч.

Приборы, аппаратура, посуда. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Ротационный испаритель. Водоструйный насос. Воронки: Бюхнера; делительные на 100, 500 мл. Колбы: Бунзена; круглодонные короткогорлые со шлифом № 29 на 100, 250 мл; конические на 100, 250 мл; мерные на 25, 100 мл. Камера для хроматографирования. Камера для опрыскивания. Пипетки с делениями на 2, 5, 10 мл. Микропипетки на 0,1 мл. Пульверизаторы стеклянные. Стаканы химические на 50, 100, 250 мл.

Подготовка к определению. Приготовление проявляющих реагентов: № 1 — 0,5 г нитрата серебра помещают в мерную колбу на 100 мл, растворяют в нескольких миллилитрах ацетона, добавляют 5 мл аммиака и 5 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы перемешивают, доводят уровень раствора до метки ацетоном. Раствор хранят в темной склянке не более 10 дней; № 2 — 0,85 г нитрата серебра помещают в мерную колбу на 100 мл и дважды растворяют в нескольких миллилитрах дистиллированной воды, прибавляют 2,5 мл концентрированного аммиака. Содержимое колбы перемешивают, доводят уровень раствора до метки дистиллированной водой. Реагент хранят в темной склянке не более 3 мес.

Подготовка хроматографической колонки с чередующимися слоями кремнекислого мета-магния и безводного сульфата натрия. В хроматографическую колонку (длина 400 мм, диаметр 20 мм) помещают стекловату и насыпают безводный сульфат натрия высотой 2,5 см. Затем насыпают слой в 7,5 см мета-кремнекислого магния (активированного при 650 °C в течение 4 ч) и слегка уплотняют стеклянной палочкой. Затем вновь чередуют слой безводного сульфата натрия (2,5 см) и мета-кремнекислого магния (7,5 см) и снова уплотняют. В верхнюю часть колонки на высоту 2,5 см насыпают слой безводного сульфата натрия. Смачивают колонку 40 мл гексана и помещают под нее коническую колбу на 100 мл для сбора вытекающей из колонки жидкости.

Отбор проб. Пробы транспортируют в стеклянной таре с притертыми пробками. Анализы проводят в дни отбора проб.

Ход анализа. Определение нитрапирина. Экстракция и очистка. Пробу воды (100 мл) помещают в делительную воронку и экстрагируют нитрапирин трижды хлороформом порциями по 30 мл. Объединенный экстракт проводят через воронку с безводным сульфатом натрия и отгоняют растворитель на ротационном испарителе досуха при температуре не более 35 °C.

Навеску почвы в 50 г помещают в плоскодонную колбу и смешивают с 5 г безводного сульфата натрия. Экстракцию проводят 100 мл смеси гексан — ацетон (1:1). Экстракт отфильтровывают в делительную воронку через фильтр «синяя лента», промывают 150 мл 2-процентного водного раствора сульфата натрия и встряхивают. После разделения гексановый слой переносят в круглодонную колбу со шлифом через воронку с 2 — 3 г безводного сульфата натрия. Растворитель отгоняют на роторном испарителе при температуре 35 °C.

Образец картофеля или свеклы в 50 г измельчают, помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 5 г безводного сульфата натрия и смешивают. Препарат извлекают дробными экстракциями (50, 30, 30 мл) при интенсивном встряхивании с гексаном. Объединенные экстракты промывают в делительной воронке 30 мл дистиллированной воды. Водный слой отбрасывают, а гексановый слой отфильтровывают через фильтр «синяя лента» с 2 — 3 г безводного сульфата натрия в круглодонную колбу со шлифом. Растворитель отгоняют на роторном испарителе при температуре 35 °C.

Пробу зерна крупного помола в 50 г помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, заливают 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 30 мин., затем проводят еще дважды, экстрагируют гексаном порциями по 30 мл. Объединенные экстракты отфильтровывают в круглодонную колбу и отгоняют растворитель на роторном испарителе при 35 °C. Сухой остаток растворяют в 10 мл этилового эфира, вливают в колонку для хроматографирования в тот момент, когда мениск ранее введенного гексана достигнет верхней части адсорбента. Затем колбу обмывают 10 мл этилового эфира и также вводят в колонку. Элюируют нитрапирин из колонки смесью гексана с этиловым эфиром (2:1). Собранные в приемник первые 60 мл элюата отбрасывают, а содержащие препарат последующие 40 мл собирают в круглодонную колбу со шлифом. Растворитель отгоняют на роторном испарителе при температуре 35 °C.

Экстракцию из биосубстратов экспериментальных животных проводят следующим образом. Пробу крови, мочи (5 мл) трижды экстрагируют хлороформом порциями по 10 мл. Объединенные экстракты высушивают безводным сульфатом натрия и отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре 35 °C досуха. Остаток с помощью ацетона наносят на хроматографическую пластинку и хроматографируют.

Пробу печени, мозга, легких, почек, кала (5 г) тщательно измельчают, помещают в коническую колбу на 100 мл, добавляют 10 мл ацетонитрила, смешивают стеклянной палочкой и экстрагируют. Экстракцию повторяют еще дважды ацетонитрилом порциями по 10 мл. Экстракты проводят через воронку с безводным сульфатом натрия. Объединенные экстракты очищают встряхиванием с гексаном 3 раза по 10 мл. Гексановые экстракты сливают, а ацетонитрильные упаривают на ротационном испарителе при температуре 35 °C досуха. Остаток с помощью ацетона наносят на хроматографическую пластинку и хроматографируют.

    Хроматографирование  и  проявление  хроматограмм   с   пробами
нитрапирина.  Сухой остаток после удаления растворителя растворяют
в  ацетоне  и  наносят  на  пластинку "Силуфол" УФ   . Пластинку с

                                              254

нанесенными  пробами и стандартными растворами помещают в камеру с
подвижной  системой  гексан  - ацетон (5:1). После поднятия фронта

растворителей на 12 см пластинку вынимают из камеры, подсушивают и

опрыскивают   5   мл   проявляющего  реагента  N  1  и  подвергают
УФ-облучению  в  течение  10  мин.  Нитрапирин  проявляется в виде
темно-серых пятен с R  0,77 +/- 0,02 на светло-коричневом фоне.

                 f

Обработка результатов анализа. Количественная оценка проводится сравнением площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартного раствора. Содержание нитрапирина в пробе (X, мг/кг, мг/л или мкг/г, а в случае биосубстратов — мкг/мл) вычисляют по формуле:

                              A

X = -, P

где:

A — количество вещества, найденное путем сравнения со стандартами, мкг;

P — масса или объем анализируемой пробы, г или мл.

Определение 6-ХПК. Экстракция и очистка экстрактов. Пробу воды 200 мл помещают в делительную воронку, подкисляют 1,5 — 2 мл 10-процентного раствора серной кислоты (до pH 1 — 2) и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 50 мл. Остаток количественно наносят на хроматографическую пластинку после упаривания на ротационном испарителе при температуре 55 — 60 °C.

Навеску почвы (50 г), измельченной и просеянной, подкисляют 20 мл 2-процентной ортофосфорной или 0,2-процентным раствором серной кислоты и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 50 мл. Растворитель фильтруют через воронку Бюхнера, отгоняют на ротационном испарителе досуха при температуре 55 — 60 °C. К сухому остатку прибавляют 10 — 15 мл 20-процентного раствора хлорида калия, приготовленного на 0,5-процентном растворе едкого натра, колбу тщательно ополаскивают и переносят в делительную воронку. Колбу еще раз промывают 10 — 15 мл того же раствора щелочи и сливают в ту же воронку. Объединенный щелочной экстракт промывают дважды по 10 — 15 мл гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а щелочной раствор подкисляют 10-процентным раствором серной кислоты до pH 1 — 2 и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 15 — 20 мл. Объединенный экстракт проводят через воронку с безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняют при температуре 55 — 60 °C, остаток наносят на хроматографическую пластинку.

Пробу 25 г растительного материала (зерновые, зеленая масса) помещают в колбу и приливают 15 — 20 мл 2-процентного раствора ортофосфорной или 0,2-процентного раствора серной кислоты, предварительно насыщенного хлоридом калия, и экстрагируют 6-ХПК трижды по 50 мл этилацетатом. Растворитель фильтруют через воронку Бюхнера и отгоняют досуха на ротационном испарителе при температуре 55 — 60 °C. Далее поступают аналогично анализу почвы.

Очистка экстрактов в случае сильного загрязнения пигментами. Если после первой экстракции этилацетатом экстракты сильно загрязнены пигментами, то очистку можно проводить следующим образом. В случае зеленой массы к сухому остатку прибавляют 15 — 20 мл 20-процентного раствора хлорида калия, приготовленного на 0,5-процентном растворе едкого натра. Содержимое колбы тщательно перемешивают. В колбу при перемешивании прибавляют смесь, полученную в результате энергичного встряхивания 2 г активированного угля марки БАУ, 15 мл 0,5-процентного раствора едкого натра и 15 мл гексана. Пробу выдерживают 1 ч, периодически встряхивая, и фильтруют через воронку Бюхнера. Колбу и уголь на фильтре промывают дважды 0,5-процентным раствором едкого натра по 10 мл. Смесь переносят в делительную воронку, гексановый слой отбрасывают. К водному слою прибавляют 1 — 2 мл 10-процентного раствора серной кислоты (pH 1 — 2) и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 20 — 30 мл. Объединенные экстракты высушивают, растворитель отгоняют при 55 — 60 °C, остаток наносят на хроматографическую пластинку.

Пробу биосубстратов экспериментальных животных (кровь, моча, печень, почки, легкие, мозг, кал) 5 г или 5 мл помещают в колбу и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 10 — 15 мл. Растворитель отфильтровывают через бумажный фильтр в колбу для выпаривания и отгоняют на ротационном испарителе досуха при температуре 55 — 60 °C. Далее поступают аналогично анализу почвы.

Хроматографирование и проявление хроматограмм с пробами 6-ХПК. После отгонки растворителя пробы с помощью этилацетата количественно наносят на пластинки «Силуфол» на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки (размеры пластинки 15 x 15 см). Сначала хроматографирование проводят в бензоле. При этом 6-ХПК остается на старте, а примеси, содержащиеся в пробе, продвигаются вверх. После

подсушивания   пластинок   на   воздухе  (под  вытяжкой)  проводят
вторичное  хроматографирование  в  смеси бензол - уксусная кислота
(1:1).   После   хроматографирования  пластинки  ее  высушивают  и
выдерживают   под  ртутно-кварцевой  лампой  7  -  10  мин.  Далее

пластинку опрыскивают проявляющим реагентом № 2 и снова подвергают

УФ-облучению  до четкого  проявления  пятен (примерно 5 мин.). При
наличии  в пробе 6-ХПК на пластинке проявляются пятна бурого цвета
с величиной R  0,54 +/- 0,01.

         f

Обработка результатов анализа. Количественная оценка проводится путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартного раствора. Содержание 6-ХПК в анализируемой пробе (X, мг/кг, мг/л, а в случае биосубстратов — мкг/г, мкг/мл) определяют по формуле:

                              A

X = -, P

где:

---