--- title: "\"Временные методические указания по определению актеллика в биологическом материале хроматографическими методами\"" number: "4038-85" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-4038-85" --- ## "Временные методические указания по определению актеллика в биологическом материале хроматографическими методами" # "Временные методические указания по определению актеллика в биологическом материале хроматографическими методами" (утв. Минздравом СССР 21.11.1985 N 4038-85)
Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
**А.И.ЗАИЧЕНКО**
21 ноября 1985 г. N 4038-85
**ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТЕЛЛИКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ**
**ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ**
> *(Дополнение к [N 2085-79](https://bukva.ai/docs/2085-79))* Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов. Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР. Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР. ## 1. Краткая характеристика пестицида Актеллик (пиримифос-метил), его активное вещество - 0,0-диметил-0-(2-диетиламино-6-метилпиримидил-4)-тиофосфат. Структурная формула: H C 3 //\ OP(OCH ) | \// | \ / | 3 2 S | | --- | --- | --- | N\\ /N \\/ C H -N-C H 2 5 2 5 Эмпирическая формула: C H O N PS. 11 20 3 3 Молекулярная масса: 305,35. Актеллик представляет собой светло-желтую жидкость, температура плавления 15 - 18 °С. Разлагается сильными кислотами, щелочами, а также при температуре 100 °С. Актеллик хорошо растворяется во многих органических растворителях и -4 слабо в воде. Давление пара 1,1 х 10 мм рт. ст. при 30 °С. Показатель 25 преломления - n = 1,527. Применяется в виде порошка, содержащего 2% актеллика; 25-процентного концентрата эмульсии - "Актеллик 25 ЕС" (jF 2520); 50-процентного концентрата эмульсии - "Актеллик 50 ЕС" (jF 2764). Актеллик эффективен против вредителей хлебных злаков; рекомендован для борьбы с эктопаразитами птиц. Он отличается быстрым проявлением инсектицидной активности при сравнительно невысокой норме его расхода. Актеллик мало токсичен. При внесении внутрь крысам ЛД - 2050 мг/кг. 50 При нанесении на кожу ЛД - 2000 мг/кг. Он не кумулируется в жировых 50 тканях. МДУ актеллика в мясе и яйцах кур не установлен. Допустимая суточная доза актеллика для человека установлена на уровне 0,01 мг/кг массы тела в сутки, что составляет примерно 0,5 - 0,7 мг/человека/сутки (данные ФАО/ВОЗ). ## 2. Методика определения актеллика ### 2.1. Основные положения ##### 2.1.1 Принцип метода Метод основан на извлечении актеллика из исследуемой пробы смесью ацетона и воды (1:1), очистке экстракта и определении методом хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением либо методом газожидкостной хроматографии. ##### 2.1.2 Метрологическая характеристика метода (приведена в таблице). Таблица **МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА** | Метод анализа | Наименование объекта | Диапазон определяемых концентраций, мкг | Нижний предел обнаруж., мг/кг | Среднее значение определ., % | Стандартное откл. | Доверительный интервал среднего, % | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Энзимо-хроматографический Газожидкостная хроматография | Мясо кур Яйца кур Мясо кур Яйца кур | 0,005 - 0,1 -"- 0,0001 - 0,002 | 0,02 -"- 0,001 -"- | 78 65 80 68 | 4,0 3,1 2,6 3,2 | 78 +/- 6,1 65 +/- 5,2 80 +/- 3,2 68 +/- 5,4 | ### 2.2. Реактивы и растворы Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79. н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78. Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., [ГОСТ 4166-76](https://bukva.ai/docs/gost-4166-76). Бром, ч., [ГОСТ 4109-74](https://bukva.ai/docs/standart-gost-4109-79). Силикагель марки КСК, ГОСТ 3956-77, дробленый и просеянный через сито 100 меш, или пластинки "Силуфол". Кальций сернокислый (CaSO х 2H O), ч.д.а., ГОСТ 3210-77, просушенный 4 2 в шкафу при температуре 160 °С в течение 6 часов. Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ 6-09-07-1156-78, или фирмы "Хемапол" (Чехословакия). Буферный раствор (рН = 8,69). К 2,1 мл ортофосфорной кислоты прибавляют 2,3 мл уксусной и 2,47 г борной кислот, доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с рН = 8,69 к 100 мл указанной смеси прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра. Уксусная кислота, х.ч., ГОСТ 18290-72. Ортофосфорная кислота, х.ч., ГОСТ 6552-80. Борная кислота, х.ч., [ГОСТ 9656-75](https://bukva.ai/docs/gost-9656-75). Натрий серноватистокислый, ч.д.а., 0,1 М водный раствор. Калий железосинеродистый, х.ч., [ГОСТ 4206-75](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-gost-4206-75), 1,6-процентный водный раствор. Калий железистосинеродистый, х.ч., [ГОСТ 4207-75](https://bukva.ai/docs/standart-gost-4207-75), 2-процентный водный раствор. Этиловый спирт, 96%, ТУ 6-09-1710-77. Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота. Свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев. Для приготовления ферментного раствора 1 г печени гомогенизируют с 9 мл буферного раствора и фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора. Этот раствор используют для опрыскивания пластинок. Раствор готовят непосредственно перед обработкой. Основной стандартный раствор "А" актеллика, концентрация 100 мкг/мл. Рабочие стандартные растворы "Б" - 5,0 мкг/мл и "В" - 1,0 мкг/мл готовят разбавлением основного стандартного раствора в ацетоне. Проявляющий раствор. 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл буферного раствора рН = 8,69, 2 мл железосинеродистого и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед обработкой пластинок. ### 2.3. Приборы и посуда Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76. Воронки фильтровальные, ГОСТ 8613-75. Воронки делительные емкостью 1000 мл, 500 мл, ГОСТ 8613-75. Испаритель ротационный с набором колб, тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76. Камера для хроматографирования, ГОСТ 10585-75. Камера для опрыскивания, ТУ 25-11-430-70. Колбы мерные емкостью 25, 50, 100, 1000 мл, [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74). Колба Бунзена, ГОСТ 6514-75. Пластинки стеклянные, 9 х 12 см. Пробирки мерные на шлифах емкостью 5 - 10 мл, [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74). Пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл, [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74). Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74. Микрошприц емк. 10 мкл, МШ-10, ТУ 5Е-2.833.024, или микропипетка на 0,1 мл, [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74). Ступка керамическая, d = 10 см. Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1411-76. Хроматограф "Цвет-164" с пламенно-фотометрическим детектором (или "Цвет-106" с термоионным детектором). ### 2.4. Подготовка к определению ##### 2.4.1 Приготовление пластинок Для приготовления пластинок берут 35 г силикагеля "КСК", 2 г сернокислого кальция и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки в горизонтальном положении в течение 18 - 20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе. ##### 2.4.2 Подготовка проб Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными [правилами](https://bukva.ai/docs/2051-79) отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утв. N 2051-79 от 21.09.1979. ### 2.5. Проведение определения ##### 2.5.1 Экстракция и очистка экстракта Навеску анализируемого объекта (20 г мяса кур или 5 г желтка яйца) тщательно измельчают (желток перемешивают) и помещают в коническую колбу, приливают 20 мл смеси ацетона и воды (1:1) и экстрагируют в течение 1 часа при перемешивании пробы. Экстракцию повторяют дважды по 30 мин. в тех же условиях. Фильтруют пробы через бумажный фильтр (синяя лента) на воронке Бюхнера либо через стеклянный фильтр Шотта N 4. Экстракт помещают в холодильник на 2 часа. Фильтруют экстракт, фильтр промывают смесью ацетона и воды (1:1). Объединяют фильтраты, прибавляют дистиллированную воду (100 мл). Проводят переэкстракцию пестицида в н-гексан. Для этого к ацетоно-водному экстракту добавляют 30 - 40 мл н-гексана и встряхивают 2 - 3 мин. После разделения слоев гексановый отделяют, а к ацетоно-водному прибавляют такое же количество н-гексана, как указано выше. Встряхивают снова 2 - 3 мин. и слои разделяют. Переэкстракцию в н-гексан повторяют еще раз. Гексановые экстракты объединяют, сушат безводным сернокислым натрием и упаривают до небольшого объема (1 - 2 мл) на ротационном испарителе. Из данного объема аликвотную часть (10 - 30 мкл) наносят на пластинку или 3 - 5 мкл вводят в газовый хроматограф. ##### 2.5.2 Определение энзимно-хроматографическим методом На пластинку, покрытую тонким слоем силикагеля, или на пластинку "Силуфол" на расстоянии 1,5 см от нижнего и бокового краев наносят 5 - 10 мкл стандартного раствора актеллика с концентрацией 5,0 мкг/мл, что соответствует 0,02 - 0,05 мкг действующего начала. На расстоянии 1,5 - 2,0 *см* от точки нанесения стандартного раствора наносят анализируемую пробу. Производят хроматографирование в системе растворителей н-гексана + ацетон = 9:1. Сушат пластинку на воздухе и активируют парами брома. Для этого пластинку на 1 мин. помещают в эксикатор, насыщенный парами брома. После удаления избытка брома с пластинки (~ 60 мин.) производят ингибирование. Для этого пластинку опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют в течение 40 - 60 мин. в насыщенном водными парами термостате при температуре 38 °С. Для увлажнения в термостате ставят чашку Петри с водой. После инкубации пластинку опрыскивают проявляющим раствором (индоксилацетат) и снова помещают пластинку в термостат, нагретый до 38 °С, на 2 - 3 мин. Актеллик проявляется в виде белых пятен на голубом фоне с величиной R = 0,52. f Количественное определение производят путем сравнения площади пятна с наиболее близкой к ней по величине площадью стандарта. Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле: А х S х Y х 1000 2 Х = -----------------, Р х S х Y 1 1 где: А - количество препарата в стандарте, мкг; S - площадь пятна стандарта, кв. мм; 1 S - площадь пятна пробы, кв. мм; 2 Y - объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкг; 1 Y - общий объем экстракта, мл; Р - масса пробы, взятой для анализа, г. ##### 2.5.3 Определение методом газожидкостной хроматографии Из подготовленного экстракта пробы отбирают аликвотную часть (3 - 5 мкл) и вводят в испаритель хроматографа. Условия хроматографирования: хроматограф с пламенно-фотометрическим детектором: стеклянная колонка длиной 100 см и диаметром 3 мм, заполненная 5% SE-30 на хроматоне N-AW-ДМСS (0,16 - 0,20 мм). Температура испарителя - 220 °С, температура колонки - 190 °С; скорость газа-носителя (азота) - 40 мл/мин.; скорость водорода - 66 мл/мин.; скорость воздуха - 120 мл/мин.; время удерживания актеллика в указанных условиях - 4 мин. 35 сек.; 8 входное сопротивление - 10 Ом; -2 шкала множителя - 4 х 10 в; -10 шкала по току - 4 х 10 А; скорость движения ленты самописца - 240 мм/ч. Условия хроматографирования при использовании хроматографа с термоионным детектором приведены в сборнике "Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде", ч. XI, 1981 г., с. 296 - 303. Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле: Н х Y х А х Y 2 1 3 Х = ----------------, Н х Y х Р 1 2 где: А - количество препарата в стандарте, мкг/мл; Н - высота пика стандарта, мм; 1 Н - высота пика препарата в пробе, мм; 2 Y - объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, мкл; 1 Y - объем анализируемого раствора, введенного в хроматограф, мкл; 2 Y - объем экстракта пробы для анализа, мл; 3 Р - навеска пробы, г. 2.6. Обработка результатов анализа приведена в [разделах 2.5.2](#p100075) и [2.5.3](#p100086). ## 3. Требования техники безопасности Соблюдать требования техники безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями, бромом. 4. Настоящие Методические указания подготовлены: Н.И. Киселевой и С.И. Гнед (ВНИИГИНТОКС, г. Киев). ## 5. Дополнение Настоящие Методические указания рекомендуются в дополнение к "Энзимно-хроматографическому методу определения фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах и биосубстратах", разработанному М.В. Письменной (ВНИИГИНТОКС, г. Киев), утв. 19 октября 1979 г. за N 2086-79, и к "Методическим [указаниям](https://bukva.ai/docs/2085-79) по определению актеллика в растительном материале, в почве и в воде хроматографией в тонком слое и на газовом хроматографе", разработанным Т.М. Петровой, Ю.Б. Андреевым (ВНИИ защиты растений, г. Ленинград), Красных А.А. (Всероссийский НИИ защиты растений, пос. Рамонь Воронежской обл.), утв. 19 октября 1979 г. за N 2085-79. 6. Методические указания апробированы в институтах: Всесоюзный институт защиты растений, г. Ленинград (Петрова Т.М.); Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии, г. Москва (Полякова В.Н.). ---