Временные методические указания по измерению концентраций покоящихся спор энтомофторовых грибов (микоафидина, энтомофторина) методом световой микроскопии в воздухе рабочей зоны

(утв. Минздравом СССР 27.11.1984 № 3158-84)

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПОКОЯЩИХСЯ СПОР ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ (МИКОАФИДИНА, ЭНТОМОФТОРИНА) МЕТОДОМ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

    Энтомофторовые    грибы,   в   частности   Entomophthora   thaxteriana,
используются   для   производства  средств  защиты  растений  (микоафидина,
энтомофторина  и  др.).  В  состав  микоафидина  входят   покоящиеся  споры

                                  7

указанного вида гриба (не менее 4 x 10  в 1 г), фрагменты мицелия и остатки
питательной  среды.  Препарат  представляет  собой мелкодисперсный аморфный
порошок  желтого или бежевого цвета, имеющий слабый специфический (грибной)
запах.  Гигроскопичен. В воде образует нестойкую суспензию. У энтомофторина

состав и свойства подобны описанным.

Токсичность микоафидина и энтомофторина низкая: ЛД для белых мышей и 50 крыс при введении в желудок превышает 10 г/кг. ПДК (ориентировочная) в 3 воздухе рабочей зоны — 5 x 10 спор/куб. м.

Микоафидин и энтомофторин используются в качестве конкретных инсектицидов против тлей. Препараты применяются методом опрыскивания вегетирующих растений.

1. Методика определения покоящихся спор энтомофторовых грибов в воздухе методом световой микроскопии

1.1. Основные положения

1. Метод основан на осаждении аэрозоля на аналитические фильтры типа АФА из перхлорвинила, просветлении фильтров в парах ацетона, подсчете покоящихся спор энтомофторовых грибов на фильтрах методом микроскопии в проходящем свете, расчете содержания спор в воздухе. 2

2.  <a id="p100009"></a>Диапазон  определяемых  количеств  спор на фильтре - 12 x 10  - 6 x

5 10 . 2

3. <a id="p100010"></a>Предел обнаружения спор на фильтре - 5 x 10 .

4. Среднее значение определения стандартных количеств спор — 82%.

5. Стандартное отклонение отдельного определения — 26,1%.

6. Относительное стандартное отклонение — 0,2.

7. Доверительный интервал среднего при P = 0,05 и n = 5 — +/- 29,4%.

8. Метод избирателен в присутствии посторонней микрофлоры, минеральных и органических частиц. Мешает определению избыток пыли на фильтре — если ее количество превышает 3 — 5 мг.

1.2. Реактивы и материалы

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79.

Этанол 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.

Эфир диэтиловый (для наркоза), Фармакопея СССР.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Мешки полиэтиленовые хозяйственные, ОСТ 6-19-37-033-82.

Формалин, Фармакопея СССР.

Фильтры АФА-ВП-20 или АФА-ХП-20.

Вата обезжиренная медицинская, ГОСТ 5566-75.

1.3. Приборы, аппаратура и посуда

Аспирационное устройство, ТУ 64-1-862-77.

Аллонжи ИРА-2000, ТУ 690-00-00.

Трубки соединительные резиновые.

Микроскоп МБИ-3 и т.п.

Стекла предметные.

Стекла покровные, 24 x 24 мм, ГОСТ 6672-75. x

Микрометр окулярный винтовой МОВ-1-15 , ГОСТ 7865-56.

Объект-микрометр ОМП, ГОСТ 7513-75.

Кювета металлическая (150 x 100 x 30 мм) со стеклянной крышкой.

Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.

Колбы конические на 100 мл, ГОСТ 10394-72.

1.4. Подготовка к определению

Отбор, транспортировку, хранение и анализ проб проводят при соблюдении правил асептики. Аналитические аэрозольные фильтры и аллонжи стерилизуют в парах формальдегида (в полиэтиленовых мешках, завернутыми в бумагу) в течение 24 часов при комнатной температуре. Площадь поля зрения микроскопа определяют при помощи микрометра окулярного и объект-микрометра. Предметные и покровные стекла обрабатывают смесью этанола с эфиром (1:1).

1.5. Отбор проб

Улавливание спор энтомофторовых грибов осуществляют на аналитические аэрозольные фильтры из перхлорвинила путем фильтрации через них исследуемого воздуха. Через фильтр пропускают 50 — 600 л воздуха со скоростью 5 — 20 л/мин. Пробы можно хранить продолжительное время при температуре 2 — 5 °C.

1.6. Проведение определения

Фильтр с пробой помещают на предметное стекло (аэрозольными частицами вверх), свисающие части фильтра отрезают ножницами. Предметное стекло с фильтром помещают в металлическую кювету над слоем кипящего ацетона (подогревают на водяной бане, работу проводят в вытяжном шкафу) и накрывают стеклянной крышкой. Под воздействием паров ацетона происходит просветление фильтра в течение 5 — 15 с. Предметное стекло извлекают из кюветы, ацетон в течение 10 — 20 с испаряется.

Подсчет спор на фильтре проводят путем микроскопии в проходящем свете при увеличении 20 x 7 или 20 x 10 в препарате «раздавленная капля». Для этого на просветленный фильтр наносят на два участка на расстоянии 30 — 35 мм по одной капле дистиллированной воды и накрывают покровными стеклами. Подсчитывают количество покоящихся спор в 50 полях зрения микроскопа (по 5 x 5 на обоих участках фильтра). Для равномерного обзора всего участка фильтра споры подсчитывают в полях зрения, расположенных не подряд, а с интервалами в 2 — 3 поля. Покоящиеся споры энтомофторовых грибов имеют округлую форму и четко различимую двойную оболочку. В центре споры располагается крупная «жировая капля». Спора имеет размеры от 27 до 50 мкм (в среднем 33 мкм), а «жировая капля» — 12 — 20 мкм.

1.7. Обработка результатов

Концентрацию покоящихся спор энтомофторовых грибов в воздухе (X, спор/куб. м) вычисляют по формуле:

                             S x N x 1000

X = -------------,

                                S  x N  x V
                                 1    1    20

где:

S — площадь аналитического аэрозольного фильтра (той части, через которую проходит воздух при закреплении фильтра в аллонже), кв. мм;

S — площадь поля зрения микроскопа, кв. мм; 1

N — количество подсчитанных спор энтомофторовых грибов, ед.;

N — количество просмотренных полей зрения микроскопа, ед.; 1

V — объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным 20 условиям, л;

1000 — коэффициент пересчета литров в метры кубические.

2. Требования безопасности

Соблюдаются общие правила по технике безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями и электроприборами. Выполняются меры предосторожности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно патогенные), сущность которых сводится к предупреждению загрязнения проб и соблюдению правил личной гигиены.

---