Методические указания по измерению концентрации покоящихся спор энтомофторовых грибов (микоафидина, энтомофторина) методом световой микроскопии в воздухе рабочей зоны

(утв. Минздравом СССР 27.11.1984 № 3158-84)

27 ноября 1984 г. № 3158-84

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОКОЯЩИХСЯ СПОР ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ (МИКОАФИДИНА, ЭНТОМОФТОРИНА)

---

<*> Разработали В.И. Мурза, Г.Т. Архипчук (ВНИИГИНТОКС); А.И. Чумакова (ВИЗР); Е.Ф. Соловей (ВНИИ БМЗР).

    Энтомофторовые грибы, в частности  Entomophthora  thaxteriana,
используются    для    производства    средств   защиты   растений
(микоафидина,  энтомофторина  и  др.). В состав микоафидина входят

                                                     7

покоящиеся  споры  указанного вида гриба (не менее 4 x 10  в 1 г),
фрагменты   мицелия   и  остатки  питательной  среды.  Препарат  -
мелкодисперсный  аморфный  порошок  желтого  или  бежевого  цвета,
имеющий  слабый  специфический  (грибной)  запах. Гигроскопичен. В
воде  образует  нестойкую  суспензию.  У  энтомофторина  состав  и
свойства    подобны    описанным.    Токсичность   микоафидина   и
энтомофторина  низкая. ЛД   для  белых мышей и крыс при введении в

                     50

желудок превышает 10 г/кг. ПДК (ориентировочная) в воздухе рабочей 3 зоны 5 x 10 спор/куб. м.

Микоафидин и энтомофторин используются в качестве контактных инсектицидов против тлей. Препараты применяют с помощью опрыскивания вегетирующих растений.

Краткая характеристика препарата. Энтомофторовые грибы — эффективное средство борьбы с тлями. Грибы этого рода образуют два вида спор: конидии (инфекционные частицы) и покоящиеся споры, позволяющие сохраняться и выживать в неблагоприятных условиях. Эта стадия гриба используется для получения биопрепарата. Покоящиеся споры получают в массовом количестве в биолабораториях.

Принцип метода. Метод основан на осаждении на аналитические фильтры типа АФА из перхлорвинила, просветлении фильтра в парах ацетона, подсчете покоящихся спор энтомофторовых грибов на фильтрах методом микроскопии в проходящем свете, расчете содержания спор в воздухе.

    Метрологическая характеристика  метода.  Диапазон  определения
                                   2         5
количества  спор на фильтре 12 x 10  - 6 x 10 . Предел обнаружения

   2

5  x 10  спор на фильтре. Среднее значение определения стандартных
количеств  спор 82%. Стандартное отклонение отдельного определения
26,1%.  Относительное  стандартное  отклонение  0,2. Доверительный

интервал среднего при p = 0,05 +/- 29,4%.

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии посторонней микрофлоры, минеральных и органических частиц. Определению мешает избыток пыли на фильтре, если ее количество превышает 3 — 5 мг.

Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. Этанол 96-процентный. Диэтиловый эфир (для наркоза). Вода дистиллированная. Мешки полиэтиленовые хозяйственные. Формалин. Фильтры АФА-ВП-20 или АФА-ХП-20. Вата обезжиренная медицинская.

Приборы и аппаратура. Аспирационное устройство. Аллонжи ИРА-2000. Трубки соединительные резиновые. Микроскоп МБИ-3 или аналогичный. Стекла предметные и покровные 24 x 24 мм. Микрометр окулярный винтовой МОВ-1-15. Объект-микрометр ОМП. Кювета металлическая (150 x 100 x 30 мм) со стеклянной крышкой. Баня водяная. Колбы конические на 100 мл.

Подготовка к определению. Отбор, транспортировку, хранение и анализ проб проводят при соблюдении правил асептики. Аналитические аэрозольные фильтры и аллонжи стерилизуют в парах формалина (в полиэтиленовых мешках, завернутыми в бумагу) в течение 24 ч при комнатной температуре. Площадь поля зрения микроскопа определяют при помощи микрометра окулярного и объект-микрометра. Предметные и покровные стекла обрабатывают смесью этанола с эфиром (1:1).

Отбор проб. Споры энтомофторовых грибов улавливают на аналитические аэрозольные фильтры из перхлорвинила путем фильтрации через них исследуемого воздуха. Через фильтр пропускают 500 — 600 л воздуха со скоростью 5 — 20 л/мин. Пробы можно хранить продолжительное время при температуре 2 — 5 °C.

Ход анализа. Фильтр с пробой наносят на предметное стекло (аэрозольными частицами вверх), свисающие части фильтра срезают ножницами. Предметное стекло помещают в металлическую кювету над слоем кипящего ацетона (подогревают на водяной бане, работу проводят в вытяжном шкафу) и накрывают крышкой. Под воздействием паров ацетона фильтр осветляется в течение 5 — 10 с. Предметное стекло извлекают из кюветы, ацетон в течение 10 — 20 с испаряется. Споры на фильтре подсчитывают путем микроскопии в проходящем свете при увеличении 20 x 7 или 20 x 10 в препарате «раздавленная капля». Для этого на просветленный фильтр наносят на 2 участка на расстоянии 30 — 35 мм по одной капле дистиллированной воды и накрывают покровным стеклом. Количество покоящихся спор подсчитывают в 50 полях зрения микроскопа (по 5 x 5 на обоих участках фильтра). Для равномерного обзора всего участка фильтра споры подсчитывают в полях зрения, расположенных не подряд, а с интервалом в 2 — 3 поля. Покоящиеся споры энтомофторовых грибов имеют округлую форму и четко различимую двойную оболочку. В центре споры располагается крупная «жировая капля». Споры имеют размеры от 27 до 50 мкм, а «жировая капля» — 12 — 20 мкм.

Обработка результатов анализа. Концентрацию покоящихся спор энтомофторовых грибов в воздухе (X, спор/куб. м) вычисляют по формуле:

                           1000Sn

X = -------, S n V 1 1 20

где:

    S  -  площадь  аналитического аэрозольного фильтра (той части,
через  которую проходит воздух при закреплении фильтра в аллонже),

кв. мм;

S — площадь поля зрения микроскопа, кв. мм; 1

n — число подсчитанных спор энтомофторовых грибов;

n — число просмотренных полей зрения микроскопа; 1

V — объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к 20 стандартным условиям, л;

1000 — коэффициент пересчета литров в метры кубические.

Требования безопасности. Соблюдаются общие правила по технике безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями и электроприборами. Выполняются меры предосторожности, рекомендуемые для работы с условно-патогенными микроорганизмами, сущность которых сводится к предупреждению загрязнения проб и соблюдению правил личной гигиены.

---