Временные методические указания по определению ровраля методом хроматографии в тонком слое в биосубстратах

(утв. Минздравом СССР 31.07.1984 № 3076-84)

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РОВРАЛЯ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ В БИОСУБСТРАТАХ

(Дополнение к Методическим указаниям № 2422-81)

1. Краткая характеристика препарата

Ровраль — 1-изопропилкарбамоил-3-/3,5-дихлорфенил/-3-гидантоин.

    N-CONHCH(CH )

        /\         3 2
       /  \=O

.	___Cl

            \ ___ /

                  ─── \                             C  H  O N Cl .
                      Cl                             13 13 3 3  2

Молекулярная масса: 330,17.

Синонимы и торговые названия: ипродион, афнор, ВСИ, 26019 РН, РОП 500ф, НРС 910, ЛФА 2071, гликофен.

    Химически  чистый  препарат  представляет  собой  белое кристаллическое
вещество  без  запаха  с  точкой  плавления 136 °C,  растворимое в этаноле,
ацетонитриле,   толуоле,   бензоле,  ацетоне,  дихлорметане  и  практически

                                                                     -7

нерастворимое в воде. Упругость паров незначительна: при 20 °C — 2 x 10 мм рт. ст.

ЛД внутрижелудочно для белых крыс — 3500 мг/кг, для мышей — 4000 50 мг/кг. Раздражающее действие отсутствует.

Ровраль — фунгицид, применяемый в борьбе с серой гнилью на винограде и овощных культурах.

2. Методика определения ровраля в биосубстратах хроматографическим методом

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на извлечении действующего вещества препарата из анализируемых проб органическим растворителем — ацетонитрилом или метиленом хлористым, солянокислотной очистке упаренных экстрактов, экстракции из солянокислых растворов метиленом хлористым и последующем определении методом тонкослойной хроматографии.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1 (см. Приложение).

2.1.3 Избирательность метода

Определению ровраля не мешают препараты дерозал, бенлат, зупарен, применяемые, как и ровраль, при борьбе с серой гнилью.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетонитрил ч, ТУ 6-09-3534-74.

н-Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78.

Толуол чда, ГОСТ 5789-78.

Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76.

Метилен хлористый хч, ТУ 6-09-2662-77.

Ацетон ОП-2 осч, 9 — 5, ТУ 6-09-3513-75.

Гептан хч, ТУ 6-09-4520-77.

Этиловый эфир (медицин.) фарм.

Натрия гидроокись хч, ГОСТ 4328-77, 1 н водный раствор.

Кали едкое осч, 18 — 3 ОСТ 6-01-301-74, 15-процентный водный раствор.

Этиловый спирт хч, ТУ 6-09-1710-77.

Хлороформ хч, ГОСТ 20015-74.

Соляная кислота хч, ГОСТ 3118-77, 0,1, 1 и 5 н водные растворы.

Натрий азотистокислый хч, ГОСТ 4197-74.

Аммоний хлористый осч, 2 — 4 ТУ 6-09-587-75.

Силикагель КСК, ТУ 6-09-2525-72 (0,10 — 0,14 мм).

Кальций сернокислый безводный чда, ТУ 6-09-706-76.

Фильтры бумажные «синяя лента», ТУ 6-09-1678-77.

N-(1-Нафтил)этилендиамин дигидрохлорид ч, ТУ 6-09-15-420-80.

Аммоний сульфаминовокислый ч, ТУ 6-09-15-364-78, 5-процентный раствор в 0,1 н соляной кислоте.

1-Нафтол чда, ГОСТ 5838-79, 1-процентный раствор в этиловом спирте.

Дифениламин чда, ГОСТ 5825-70.

Цинк хлористый чда, ГОСТ 4529-69.

Пластинки хроматографические «Силуфол» UV-254 (ЧССР).

Диазореактив: к 10 г азотистокислого натрия приливают 20 мл конц. соляной кислоты и доводят объем жидкости до 50 мл дистиллированной водой. Раствор используется свежеприготовленным.

Проявляющий реактив № 1: <...> г едкого калия растворяют в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 0,1 г 1-нафтола. Раствор устойчив в течение 7 дней при хранении в холодильнике.

Проявляющий реактив № 2: 0,5 г дифениламина растворяют в 100 мл ацетона и добавляют 0,5 г цинка хлористого. Раствор используется свежеприготовленным.

Стандартный раствор ровраля с содержанием 100 мкг действующего вещества в 1 мл хлороформа, ацетона или этилового спирта готовят из хч или технического препарата с учетом % содержания действующего вещества. Раствор устойчив в течение 10 — 15 дней.

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

Испаритель ротационный, ТУ 25-11-917-74, тип ИР-1M.

Камера для хроматографирования, ГОСТ 10565-74.

Камера для опрыскивания хроматографических пластинок, ГОСТ 11413-74.

Воронки делительные, ГОСТ 861-75, на 100 мл.

Воронки химические, ГОСТ 8613-75.

Колбы конические, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, на 100 и 1000 мл.

Пипетки, ГОСТ 20292-74, на 1, 2, 5 мл.

Микропипетки, ГОСТ 20292-74.

Пульверизаторы стеклянные, ГОСТ 19391-65.

Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1081-73.

Вентилятор или фен.

Колбы круглодонные со шлифом 29, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.

Чашки Петри, ГОСТ 10973-75.

Чашки выпарительные № 3, 4, ГОСТ 9147-73.

Баня водяная, ТУ 46-22-608-75.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Стекловата.

2.4. Описание определения

2.4.1 Экстракция и очистка

Кровь, легкие, печень, почки, мозг. 5 г навески органов (5 мл крови) измельчают и помещают в коническую колбу на 100 мл, перемешивают с 3 г безводного сульфата натрия и заливают 30 мл ацетонитрила, помешивают 2 — 3 минуты и оставляют на 10 — 15 минут, затем фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» в фарфоровую чашу. Экстракцию оставшегося в колбе биосубстрата повторяют еще дважды ацетонитрилом по 30 мл. Объединенный экстракт упаривают в фарфоровой чаше на бане досуха. К сухому остатку добавляют 2 — 3 мл 5 н соляной кислоты, тщательно ополаскивая остаток со стенок чаши, и сливают через слой стекловаты в делительную воронку на 100 мл. Чашу еще трижды ополаскивают по 2 мл 5 н соляной кислоты и сливают в ту же воронку. Из раствора соляной кислоты ровраль экстрагируют метиленом хлористым трижды по 15 мл. Органический слой отделяют, проводя его через воронку с безводным сульфатом натрия (слой 2 см) в круглодонную колбу на 100 мл для упаривания на испарителе. Растворитель выпаривают досуха, остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и наносят количественно на хроматографическую пластинку.

Моча. 5 мл мочи помещают в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют встряхиванием в течение 2 — 3 минут 15 мл метилена хлористого, отделяют метилен хлористый, проводя через слой (2 см) безводного сульфата натрия в 100 мл круглодонную колбу для выпаривания. Экстракцию проводят еще 2 раза метиленом хлористым по 15 мл. Экстракт упаривают досуха на роторном испарителе, остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и наносят количественно на хроматографическую пластинку.

Кал. 5 г кала помещают в коническую колбу на 100 мл, заливают 50 мл ацетонитрила, помешивают содержимое колбы 2 — 3 минуты и оставляют на 10 — 15 минут. Фильтруют экстракт в фарфоровую чашу через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют еще дважды по 30 мл ацетонитрила.

Объединенные экстракты упаривают до 15 — 20 мл, помещают в делительную воронку, ополоснув ацетонитрилом (5 мл x 2) чашу. Ацетонитрильный слой промывают дважды 30 мл гексана, гексановые вытяжки собирают в отдельную делительную воронку и промывают 10 мл ацетонитрила. Объединяют ацетонитрильные слои в фарфоровой чаше и упаривают досуха на водяной бане. Далее поступают аналогично анализу крови, легких и т.д.

2.4.2 Хроматографирование

Хроматографирование проводят нисходящим способом. Хроматографические пластинки «Силуфол» сгибают от верхнего края на 2 см. Пробы и стандартные растворы наносят на пластинку на расстоянии 2 см от линии сгиба. Гнутый конец пластинки помещают в лодочку, в которую налит подвижный растворитель: смесь гептана и этилового эфира (1:4) или смесь толуола и этанола (93:7). Лодочка помещена в камеру для хроматографирования. После окончания хроматографирования пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут на воздухе (под вытяжкой) для удаления следов растворителей. Условия проявления хроматограммы следующие (в зависимости от проявляющего реагента):

А. 1. Опрыскивание смесью 1 н раствора гидроокиси натрия и этилового спирта (50 x 50)(около 10 мл на пластинку).

2. Выдерживание пластинок в сушильном шкафу при 120 °C в течение 10 минут.

3. Опрыскивание 5 н соляной кислотой (8 мл на пластинку).

4. Опрыскивание последовательно растворами:

а) 2 г натрия азотистокислого в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (4 мл на пластинку);

б) 5 г аммония хлористого или аммония сульфаминовокислого в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (8 мл на пластинку).

5. Высушивание пластинок в токе воздуха.

6. Опрыскивание раствором N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида (5 г на 100 мл 1 н раствора соляной кислоты) или 1-процентным раствором 1-нафтола в этаноле (около 10 мл на пластинку).

Следует обратить внимание на то, что расход всех реактивов для обработки хроматограмм должен быть минимальным, а струя раствора — рассеянной.

Б. Опрыскивание пластинок 15-процентным спиртовым раствором едкого калия и термическая обработка при 150 °C в течение 20 минут. Затем пластинки последовательно обрабатывают диазореактивом и проявляющим реактивом № 1 или № 2.

    При   наличии   ровраля   в   пробе   на   хроматограммах   проявляются
розово-фиолетовые  пятна в случае N-(1-нафтил)этилендиамин  дигидрохлорида,
оранжевые  пятна  в  случае  применения  1-нафтола  или  малиновые в случае
применения дифениламина. R  пятен 0,35  (гептан - диэтиловый  эфир (1:4)) и

                      f

0,50 — 0,55 (толуол — этанол (93:7)).

2.5. Обработка результатов анализа

Количественная оценка хроматограмм проводится путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартных растворов.

Содержание препарата в исследуемой пробе вычисляют по формулам:

в крови и моче -

                                  A

X = -, V

где:

X — концентрация исследуемого препарата, мкг/мл;

A — количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

V — объем взятой для анализа крови или мочи, мл;

в печени, почках, мозге, легких, кале -

                                  A

X = -, P

где:

X — концентрация исследуемого препарата, мкг/мл;

A — количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

P — навеска биосубстрата, г.

3. Требования безопасности

При проведении исследований по вышеприведенной Методике необходимо соблюдать правила предосторожности, требуемые при работе с ядовитыми, взрыво- и легковоспламеняющимися веществами.

Метрологические	Анализируемый объект
параметры	печень	почки	легкие	мозг	кровь	кал	моча
Диапазон определяемых концентраций	0,1 — 10 мкг/г	0,1 — 10 мкг/г	0,1 — 10 мкг/г	0,1 — 10 мкг/г	0,1 — 10 мкг/г	0,2 — 10 мкг/г	0,04 — 10 мкг/г
Предел обнаружения, мкг	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	1,0	0,2
Предел обнаружения, мкг/ г, мкг/мл	0,1 мкг/г	0,1 мкг/г	0,1 мкг/г	0,1 мкг/г	0,1 мкг/мл	0,2 мкг/г	0,04 мкг/мл
Среднее значение определения стандартных количеств	86,0	88,0	89,0	85,4	94,0	85,4	98,2
C, %
Стандартное отклонение	1,58	3,87	1,58	3,64	3,08	3,65	0,84
S
Дов. интервал среднего значения при p = 0,95 и n = 5,	+/- 1,96	+/- 4,80	+/- 1,96	+/- 4,51	+/- 3,82	+/- 4,54	+/- 1,04
Относительное стандартное отклонение S , %	1,0	4,0	1,0	4,0	3,0	4,2	0,08
2
Погрешность определения дельта, %	+/- 2,27	+/- 5,45	+/- 2,20	+/- 5,28	+/- 4,06	+/- 5,3	+/- 1,059

---