Временные методические указания по определению ровраля методом хроматографии в тонком слое в биосубстратах
(утв. Минздравом СССР 31.07.1984 № 3076-84)
31 июля 1984 г. № 3076-84
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РОВРАЛЯ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ В БИОСУБСТРАТАХ
1. Краткая характеристика препарата
Ровраль — 1-изопропилкарбамоил-3-/3,5-дихлорфенил/-3-гидантоин.
N-CONHCH(CH )
/\ 3 2
/ \=O
| . | ___Cl |
|---|
\ ___ /
─── \ C H O N Cl . Cl 13 13 3 3 2
Синонимы и торговые названия: ипродион, афнор, ВСИ, 26019 РН, РОП 500ф, НРС 910, ЛФА 2071, гликофен.
Химически чистый препарат представляет собой белое кристаллическое вещество без запаха с точкой плавления 136 °C, растворимое в этаноле, ацетонитриле, толуоле, бензоле, ацетоне, дихлорметане и практически
-7
нерастворимое в воде. Упругость паров незначительна: при 20 °C — 2 x 10 мм рт. ст.
ЛД внутрижелудочно для белых крыс — 3500 мг/кг, для мышей — 4000 50 мг/кг. Раздражающее действие отсутствует.
Ровраль — фунгицид, применяемый в борьбе с серой гнилью на винограде и овощных культурах.
2. Методика определения ровраля в биосубстратах хроматографическим методом
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод основан на извлечении действующего вещества препарата из анализируемых проб органическим растворителем — ацетонитрилом или метиленом хлористым, солянокислотной очистке упаренных экстрактов, экстракции из солянокислых растворов метиленом хлористым и последующем определении методом тонкослойной хроматографии.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1 (см. Приложение).
2.1.3 Избирательность метода
Определению ровраля не мешают препараты дерозал, бенлат, зупарен, применяемые, как и ровраль, при борьбе с серой гнилью.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетонитрил ч, ТУ 6-09-3534-74.
Толуол чда, ГОСТ 5789-78.
Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76.
Метилен хлористый хч, ТУ 6-09-2662-77.
Ацетон ОП-2 осч, 9 — 5, ТУ 6-09-3513-75.
Этиловый эфир (медицин.) фарм.
Натрия гидроокись хч, ГОСТ 4328-77, 1 н водный раствор.
Кали едкое осч, 18 — 3 ОСТ 6-01-301-74, 15-процентный водный раствор.
Этиловый спирт хч, ТУ 6-09-1710-77.
Соляная кислота хч, ГОСТ 3118-77, 0,1, 1 и 5 н водные растворы.
Натрий азотистокислый хч, ГОСТ 4197-74.
Аммоний хлористый осч, 2 — 4 ТУ 6-09-587-75.
Силикагель КСК, ТУ 6-09-2525-72 (0,10 — 0,14 мм).
Кальций сернокислый безводный чда, ТУ 6-09-706-76.
Фильтры бумажные «синяя лента», ТУ 6-09-1678-77.
N-(1-Нафтил)этилендиамин дигидрохлорид ч, ТУ 6-09-15-420-80.
Аммоний сульфаминовокислый ч, ТУ 6-09-15-364-78, 5-процентный раствор в 0,1 н соляной кислоте.
1-Нафтол чда, ГОСТ 5838-79, 1-процентный раствор в этиловом спирте.
Дифениламин чда, ГОСТ 5825-70.
Цинк хлористый чда, ГОСТ 4529-69.
Пластинки хроматографические «Силуфол» UV-254 (ЧССР).
Диазореактив: к 10 г азотистокислого натрия приливают 20 мл конц. соляной кислоты и доводят объем жидкости до 50 мл дистиллированной водой. Раствор используется свежеприготовленным.
Проявляющий реактив № 1: <...> г едкого калия растворяют в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 0,1 г 1-нафтола. Раствор устойчив в течение 7 дней при хранении в холодильнике.
Проявляющий реактив № 2: 0,5 г дифениламина растворяют в 100 мл ацетона и добавляют 0,5 г цинка хлористого. Раствор используется свежеприготовленным.
Стандартный раствор ровраля с содержанием 100 мкг действующего вещества в 1 мл хлороформа, ацетона или этилового спирта готовят из хч или технического препарата с учетом % содержания действующего вещества. Раствор устойчив в течение 10 — 15 дней.
2.3. Приборы, аппаратура и посуда
Испаритель ротационный, ТУ 25-11-917-74, тип ИР-1M.
Камера для хроматографирования, ГОСТ 10565-74.
Камера для опрыскивания хроматографических пластинок, ГОСТ 11413-74.
Воронки делительные, ГОСТ 861-75, на 100 мл.
Воронки химические, ГОСТ 8613-75.
Колбы конические, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.
Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, на 100 и 1000 мл.
Пипетки, ГОСТ 20292-74, на 1, 2, 5 мл.
Микропипетки, ГОСТ 20292-74.
Пульверизаторы стеклянные, ГОСТ 19391-65.
Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1081-73.
Колбы круглодонные со шлифом 29, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.
Чашки выпарительные № 3, 4, ГОСТ 9147-73.
Баня водяная, ТУ 46-22-608-75.
Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.
2.4. Описание определения
2.4.1 Экстракция и очистка
Кровь, легкие, печень, почки, мозг. 5 г навески органов (5 мл крови) измельчают и помещают в коническую колбу на 100 мл, перемешивают с 3 г безводного сульфата натрия и заливают 30 мл ацетонитрила, помешивают 2 — 3 минуты и оставляют на 10 — 15 минут, затем фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» в фарфоровую чашу. Экстракцию оставшегося в колбе биосубстрата повторяют еще дважды ацетонитрилом по 30 мл. Объединенный экстракт упаривают в фарфоровой чаше на бане досуха. К сухому остатку добавляют 2 — 3 мл 5 н соляной кислоты, тщательно ополаскивая остаток со стенок чаши, и сливают через слой стекловаты в делительную воронку на 100 мл. Чашу еще трижды ополаскивают по 2 мл 5 н соляной кислоты и сливают в ту же воронку. Из раствора соляной кислоты ровраль экстрагируют метиленом хлористым трижды по 15 мл. Органический слой отделяют, проводя его через воронку с безводным сульфатом натрия (слой 2 см) в круглодонную колбу на 100 мл для упаривания на испарителе. Растворитель выпаривают досуха, остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и наносят количественно на хроматографическую пластинку.
Моча. 5 мл мочи помещают в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют встряхиванием в течение 2 — 3 минут 15 мл метилена хлористого, отделяют метилен хлористый, проводя через слой (2 см) безводного сульфата натрия в 100 мл круглодонную колбу для выпаривания. Экстракцию проводят еще 2 раза метиленом хлористым по 15 мл. Экстракт упаривают досуха на роторном испарителе, остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и наносят количественно на хроматографическую пластинку.
Кал. 5 г кала помещают в коническую колбу на 100 мл, заливают 50 мл ацетонитрила, помешивают содержимое колбы 2 — 3 минуты и оставляют на 10 — 15 минут. Фильтруют экстракт в фарфоровую чашу через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют еще дважды по 30 мл ацетонитрила.
Объединенные экстракты упаривают до 15 — 20 мл, помещают в делительную воронку, ополоснув ацетонитрилом (5 мл x 2) чашу. Ацетонитрильный слой промывают дважды 30 мл гексана, гексановые вытяжки собирают в отдельную делительную воронку и промывают 10 мл ацетонитрила. Объединяют ацетонитрильные слои в фарфоровой чаше и упаривают досуха на водяной бане. Далее поступают аналогично анализу крови, легких и т.д.
2.4.2 Хроматографирование
Хроматографирование проводят нисходящим способом. Хроматографические пластинки «Силуфол» сгибают от верхнего края на 2 см. Пробы и стандартные растворы наносят на пластинку на расстоянии 2 см от линии сгиба. Гнутый конец пластинки помещают в лодочку, в которую налит подвижный растворитель: смесь гептана и этилового эфира (1:4) или смесь толуола и этанола (93:7). Лодочка помещена в камеру для хроматографирования. После окончания хроматографирования пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут на воздухе (под вытяжкой) для удаления следов растворителей. Условия проявления хроматограммы следующие (в зависимости от проявляющего реагента):
А. 1. Опрыскивание смесью 1 н раствора гидроокиси натрия и этилового спирта (50 x 50)(около 10 мл на пластинку).
2. Выдерживание пластинок в сушильном шкафу при 120 °C в течение 10 минут.
3. Опрыскивание 5 н соляной кислотой (8 мл на пластинку).
4. Опрыскивание последовательно растворами:
а) 2 г натрия азотистокислого в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (4 мл на пластинку);
б) 5 г аммония хлористого или аммония сульфаминовокислого в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (8 мл на пластинку).
5. Высушивание пластинок в токе воздуха.
6. Опрыскивание раствором N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида (5 г на 100 мл 1 н раствора соляной кислоты) или 1-процентным раствором 1-нафтола в этаноле (около 10 мл на пластинку).
Следует обратить внимание на то, что расход всех реактивов для обработки хроматограмм должен быть минимальным, а струя раствора — рассеянной.
Б. Опрыскивание пластинок 15-процентным спиртовым раствором едкого калия и термическая обработка при 150 °C в течение 20 минут. Затем пластинки последовательно обрабатывают диазореактивом и проявляющим реактивом № 1 или № 2.
При наличии ровраля в пробе на хроматограммах проявляются розово-фиолетовые пятна в случае N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида, оранжевые пятна в случае применения 1-нафтола или малиновые в случае применения дифениламина. R пятен 0,35 (гептан - диэтиловый эфир (1:4)) и
f
0,50 — 0,55 (толуол — этанол (93:7)).
2.5. Обработка результатов анализа
Количественная оценка хроматограмм проводится путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартных растворов.
Содержание препарата в исследуемой пробе вычисляют по формулам:
A
X — концентрация исследуемого препарата, мкг/мл;
A — количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;
V — объем взятой для анализа крови или мочи, мл;
в печени, почках, мозге, легких, кале -
A
X — концентрация исследуемого препарата, мкг/мл;
A — количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;
3. Требования безопасности
При проведении исследований по вышеприведенной Методике необходимо соблюдать правила предосторожности, требуемые при работе с ядовитыми, взрыво- и легковоспламеняющимися веществами.
| Метрологические | Анализируемый объект | ||||||
| параметры | печень | почки | легкие | мозг | кровь | кал | моча |
| Диапазон определяемых концентраций | 0,1 — 10 мкг/г | 0,1 — 10 мкг/г | 0,1 — 10 мкг/г | 0,1 — 10 мкг/г | 0,1 — 10 мкг/г | 0,2 — 10 мкг/г | 0,04 — 10 мкг/г |
| Предел обнаружения, мкг | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | 0,2 |
| Предел обнаружения, мкг/ г, мкг/мл | 0,1 мкг/г | 0,1 мкг/г | 0,1 мкг/г | 0,1 мкг/г | 0,1 мкг/мл | 0,2 мкг/г | 0,04 мкг/мл |
| Среднее значение определения стандартных количеств | 86,0 | 88,0 | 89,0 | 85,4 | 94,0 | 85,4 | 98,2 |
| C, % | |||||||
| Стандартное отклонение | 1,58 | 3,87 | 1,58 | 3,64 | 3,08 | 3,65 | 0,84 |
| S | |||||||
| Дов. интервал среднего значения при p = 0,95 и n = 5, | +/- 1,96 | +/- 4,80 | +/- 1,96 | +/- 4,51 | +/- 3,82 | +/- 4,54 | +/- 1,04 |
| Относительное стандартное отклонение S , % | 1,0 | 4,0 | 1,0 | 4,0 | 3,0 | 4,2 | 0,08 |
| 2 | |||||||
| Погрешность определения дельта, % | +/- 2,27 | +/- 5,45 | +/- 2,20 | +/- 5,28 | +/- 4,06 | +/- 5,3 | +/- 1,059 |