--- title: "\"Методические указания по определению котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, продуктах питания растительного происхождения и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии\"" number: "3066-84" issuer: "Министерство здравоохранения СССР" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-3066-84" --- ## "Методические указания по определению котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, продуктах питания растительного происхождения и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии" # "Методические указания по определению котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, продуктах питания растительного происхождения и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии" (утв. Минздравом СССР 31.07.1984 N 3066-84) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299).
Утверждены
Минздравом СССР
31 июля 1984 г. N 3066-84
**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОТОФОРА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, СЕМЕНАХ** **ХЛОПЧАТНИКА, ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ** **И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**
**И УФ-СПЕКТРОСКОПИИ <*>**
--- <*> Разработаны Л.А. Бунятян, М.С. Петросян, Ю.А. Бунятян (Филиал ВНИИГИНТОКС); Х.А. Касимовым, К.Б. Баратовым, И.И. Бабаевым (Таджикский НИИ эпидемиологии и гигиены). Краткая характеристика препарата. Котофор - 2-этилтио-4,6-бис- (изопропиламино)-симм-триазин. Брутто-формула C H N S. 11 21 5 Молекулярная масса 255,39. Химически чистый препарат - белый порошок с т. пл. 104 - 106 °C. Трудно растворяется в воде (16 мг/л), хорошо - в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, метаноле). Малотоксичен для теплокровных животных. МДУ котофора в хлопковом масле 4,5; жмыхе - 0,38 мг/кг. ПДК котофора в воде 1,0 мг/л. Котофор рекомендован для применения в качестве селективного гербицида для довсходового опрыскивания на посевах овощных, бахчевых культур и хлопчатника. Принцип метода. Метод основан на извлечении котофора из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстракта и последующем определении методами тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии.
Метрологическая характеристика метода дана в таблице 148.
Таблица 148
**МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА**
ПараметрыМетод анализаАнализируемый объект
водапочвасемена хлопчатникарастительные продуктыбиоматериал
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг или мг/лТСХ УФ0,02 - 1,0 0,02 - 0,50,05 - 1,0 0,05 - 0,5- 0,05 - 0,5- 0,05 - 0,50,6 - 1,0 -
Предел обнаружения, мкгТСХ УФ1 25 5- 2,5- 2,50,6 -
Предел определения, мг/кг или мг/лТСХ УФ0,02 0,020,05 0,05- 0,05- 0,050,6 -
Среднее значение определения стандартныхТСХ УФ96,8 97,087,0 94,0- 84,0- 90,075,0 -
количеств (с) при n = 5, %
Стандартное отклонение S,ТСХ УФ+/- 5,4 +/- 2,66+/- 3,47 +/- 2,95- +/- 10,7- +/- 3,95+/- 5,93 -
Доверительный интервал среднего при p = 0,95; n = 5, %ТСХ УФ+/- 4,9 +/- 2,63+/- 3,1 +/- 4,69- +/- 17,01- +/- 6,28+/- 5,3 -
Избирательность метода. Определению остаточных количеств котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, растительных продуктах и биологическом материале не мешают близкие по строению и области применения пестициды - мезоранил, прометрин. Реактивы и материалы. Этиловый спирт х.ч. Ацетон ч.д.а. н-Гексан х.ч. Хлороформ ч.д.а. Этиловый эфир (медицинский). Углерод четыреххлористый х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Силикагель КСК. Сульфат кальция ч.д.а. Оксид алюминия для хроматографии. Индикатор бромфеноловый синий ч.д.а., 0,4-процентный раствор в ацетоне. Индикатор бромтимоловый синий ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 2-процентный в.р. Лимонная кислота х.ч., 4-процентный в.р. Хлороводородная кислота х.ч., 1 н водный раствор. Гидроксид натрия х.ч., 1 н в.р. Уголь активированный марки БАУ. Фильтры бумажные. Пластинки для хроматографии "Силуфол". Вата обезжиренная (гигроскопическая). Стандартные растворы котофора в хлороформе с содержанием 100, 500 мкг/мл. Приборы, аппаратура, посуда. Спектрофотометр. Шкаф вытяжной химический. Шкаф сушильный. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде. Баня водяная. Камера для опрыскивания. Камера для хроматографирования. Пульверизатор стеклянный. Воронки: делительные на 150, 250, 1000 мл; простые конусообразные с коротким стеблем N 5. Колбы: конические на 250 мл; круглодонные на 100 мл; мерные с коническим шлифом на 100, 1000 мл. Капилляры стеклянные. Пипетки на 0,1; 10 мл. Пластинки хроматографические стеклянные размером 9 x 12 см. Сито лабораторное N 5 и 40. Подготовка к определению. Приготовление растворов. Приготовление 1 н раствора хлороводородной кислоты: 86 мл 36-процентной хлороводородной кислоты доводят в мерной колбе до 1 л дистиллированной водой. Раствор можно приготовить на фиксанале. Хранить в прохладном месте в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 мес. Приготовление 1 н раствора едкого натра: 40 г едкого натра растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и доводят ею до 1 л. Рекомендуется использовать свежеприготовленные растворы. Проявляющие реагенты: N 1 - смесь равных объемов 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне и 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. Готовят перед употреблением; N 2 - 4-процентный водный раствор лимонной кислоты. Хранить в прохладном месте не более 10 дней; N 3 - в мерную колбу на 250 мл помещают 1,0 г нитрата серебра, 0,1 г бромтимолового синего, растворяют в 90 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки ацетоном. Готовят перед употреблением. Стандартные растворы. Стандартные растворы котофора с содержанием 100 и 500 мкг действующего начала препарата в 1 мл хлороформа готовят из химически чистого или технического препарата с учетом процентного содержания действующего вещества. Растворы хранить в прохладном месте не более 1 мес. Приготовление пластинок с тонким слоем КСК. Тщательно промытую и высушенную пластинку размером 9 x 12 см протирают ватным тампоном, смоченным в этиловом спирте или диэтиловом эфире, и покрывают сорбционной массой, приготовленной из 35 г силикагеля КСК, 2 г сульфата кальция и 90 мл дистиллированной воды. Сорбционную массу готовят, тщательно растирая в фарфоровой ступке сначала сухую смесь силикагеля с гипсом, а затем и с водой до однородной массы. Затем 10 г сорбционной массы равномерно распределяют по всей поверхности пластинки, покачивая ее. Пластинки сушат при комнатной температуре 18 - 20 ч. Хранят в эксикаторе. Силикагель предварительно очищают от примесей, для чего заливают его на 18 - 20 ч хлороводородной кислотой (1:1). Потом кислоту сливают, промывают водой и кипятят 2 - 3 ч с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают обычной водой, а затем и дистиллированной до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 - 6 ч при температуре 130 °C. Обработанный и просушенный силикагель дробят и просеивают через сито N 40. Хранят в склянке с притертой пробкой. Приготовление пластинок с тонким слоем окиси алюминия. Для приготовления сорбционной массы на 10 пластинок берут 50 г оксида алюминия, просеянного через сито N 40, 5 г сульфата кальция. Оксид алюминия с сульфатом кальция тщательно растирают в фарфоровой ступке, переносят в коническую колбу, прибавляют 150 мл дистиллированной воды и встряхивают до образования однородной массы. Полученную массу наносят тонким слоем на заранее приготовленные стеклянные пластинки. Пластинки сушат в течение 12 - 15 ч при комнатной температуре. Готовые пластинки хранят в эксикаторе. Построение градуировочного графика для спектрофотометрического определения. На пластинку наносят 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 мл стандартного раствора с концентрацией котофора 100 мкг/мл, что соответствует 2, 5, 10, 20, 30, 50, 70 мкг, и хроматографируют в смеси хлороформ - гексан (4:1). С целью спектрофотометрирования пластинка, снятая с камеры, проявляется не полностью, а частично. При этом участок опытной площади покрывается листком чистой бумаги и опрыскивается проявляющим реактивом N 3 только область одного из пятен (лучше одна из концевых областей, например с 70 мкг вещества). Затем предполагаемые площади опытных пятен на уровне стандарта количественно вместе с оксидом алюминия переносят в центрифужные пробирки. В каждую пробирку заливают по 3 мл хлороформа, закрывают корковой пробкой и оставляют на 2 ч. Время от времени смесь взбалтывают, затем экстракт центрифугируют при -1 частоте вращения 1500 мин. в течение 15 мин. После этого хлороформный слой центрифугата осторожно, не взмучивая осадок, выливают в другую центрифужную пробирку и объем доводят хлороформом до 3 мл. Затем раствор переливают в кювету на 3 мм и спектрофотометрируют при длине волны 247 нм. Строят график зависимости оптической плотности от концентрации вещества. Линейность показаний наблюдается в пределах 2 - 50 мкг. При содержании котофора в пробе более 50 мкг необходимо развести ее и коэффициент разведения учитывать при расчетах. Отбор проб. Пробы воды, почвы, семян хлопчатника, продуктов питания растительного происхождения и биологического материала нужно транспортировать и хранить в стеклянной или полиэтиленовой таре, причем пробы биоматериала следует хранить при температуре минус 5 - минус 8 °C. Ход анализа. Экстракция методом ТСХ. Пробу воды (1 л) помещают в делительную воронку и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 50, 30, 30 мл. Объединенный экстракт сливают через воронку с 5 - 7 г безводного сульфата натрия в колбу ротационного испарителя и отгоняют хлороформ до объема 0,1 - 0,2 мл при температуре бани 80 °C. Навеску воздушно-сухой почвы (100 г) растирают в ступке, просеивают через сито N 5, заливают в конической колбе ацетоном до покрытия пробы и оставляют на ночь. Отфильтрованный объединенный экстракт кипятят на водяной бане при температуре бани 80 °C с активированным углем марки БАУ (5 - 7 г) до исчезновения окраски. Растворитель фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" и безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя. Уголь на фильтрате промывают несколькими порциями ацетона. Ацетон отгоняют с помощью ротационного испарителя до объема 0,1 - 0,2 мл. Пробу биологического материала (кровь, печень, почки, легкие, селезенка, сердце, мышечная ткань) 5 г тщательно измельчают ножницами, помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 30 мл смеси гексан - ацетон (1:1) и периодически встряхивают в течение часа. Смесь гексан - ацетон сливают, пробу повторно заливают смесью и опять периодически встряхивают 1 ч. Экстракцию повторяют трижды. Объединенные экстракты сушат безводным сульфатом натрия (3 - 5 г) и упаривают при температуре бани 80 °C. К сухому остатку прибавляют 2 мл 1 н хлороводородной кислоты, тщательно ополаскивают стенки колбы. Смывы сливают в делительную воронку, фильтруя через небольшой слой ваты. Колбу трижды ополаскивают 1 мл 1 н соляной кислоты, смывы сливают в ту же делительную воронку. В делительную воронку добавляют 4 мл 1 н раствора едкого натра и перемешивают, а затем по каплям приливают 1 н раствор едкого натра до нейтральной реакции (по индикаторной бумажке). После этого в воронку приливают 10 мл предварительно насыщенного водой хлороформа и встряхивают 1 - 2 мин. Хлороформный экстракт сливают из воронки в колбу через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию хлороформом повторяют трижды. Объединенный хлороформный экстракт отгоняют на ротационном испарителе при температуре бани 80 °C до объема 0,1 - 0,2 мл. Хроматографирование. Подготовленные экстракты количественно наносят при помощи капиллярной пипетки на хроматографическую пластинку "Силуфол" так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Центр пятна должен быть на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Колбочку с экстрактом 2 - 3 раза смывают небольшими порциями хлороформа, который также наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см от нее наносят стандартные растворы (шприцем или микропипеткой), содержащие 5, 10 или 20 мкг препарата. Пластинку с нанесенными растворами помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно налита смесь растворителей гексан - ацетон (10:3) или четыреххлористый углерод - диэтиловый эфир (4:1). Край пластинки не должен быть погружен в раствор более чем на 0,5 см. После того как фронт подвижного растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают и оставляют на несколько минут на воздухе для испарения подвижного растворителя. Пластинку обрабатывают с помощью пульверизатора проявляющим реактивом N 1. После высушивания пластинки на воздухе ее обрабатывают проявляющим реактивом N 2. Зоны локализации препарата обнаруживаются в виде синих пятен на желтом фоне с
различными величинами R (табл. 149).
f Таблица 149 ВЕЛИЧИНЫ R КОТОФОРА F | Система подвижных растворителей | Силикагель КСК | "Силуфол" | | --- | --- | --- | | Гексан - ацетон (10:3) Четыреххлористый углерод - диэтиловый эфир (4:1) | 0,52 +/- 0,01 0,21 +/- 0,01 | 0,50 +/- 0,01 0,29 +/- 0,01 | Количество котофора определяют путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен пестицида на хроматограммах пробы и стандартного раствора. Экстракция методом УФ-спектрофотометрии. Экстракцию проводят аналогично методу, описанному выше. Размельченные в ступке семена хлопчатника (50 г) трехкратно экстрагируют хлороформом порциями по 50 мл. Хлороформные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную колбочку и выпаривают до полного удаления хлороформа. Содержимое выпарительной колбочки переносят в коническую колбу на 250 мл путем двукратного смыва по 25 мл ацетоном. Затем в эту же колбу добавляют 100 мл ледяной дистиллированной воды. Колбу ставят в морозильную камеру холодильника на 1 ч, затем вынимают и содержимое быстро фильтруют через бумажный фильтр в другую коническую колбу и вновь ставят в морозильную камеру. Через 1 ч колбу снимают, содержимое фильтруют в выпарительную колбочку и имеющийся в фильтрате ацетон выпаривают на ротационном испарителе или водяной бане. Оставшуюся водную фракцию экстракта переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 25 мл. Экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха. Из средней пробы растительных продуктов (картофель, лук, томаты), размельченных миксером или мясорубкой, отбирают навеску 50 г. Экстракцию проводят трехкратно хлороформом по 100 мл в течение 30 - 40 мин. Полученные экстракты объединяют и выпаривают досуха на ротационном испарителе или водяной бане. Хроматографирование и спектрофотометрическое определение. Колбочку из-под экстракта трехкратно ополаскивают по 0,1 мл хлороформа и полученный смыв наносят на хроматографическую пластинку, отступая на 1 см от ее нижнего края. Рядом с пробой на пластинку наносят стандарт с известной концентрацией котофора. Затем развивают хроматограмму в смеси хлороформ - гексан (4:1). После завершения разгонки (10 см) пластинку вынимают из камеры и высушивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Покрыв листком чистой бумаги участок опытной площади пластинки, обрабатывают проявляющим реактивом N 3 лишь зону локализации свидетеля (R 0,50 - 0,60). Далее поступают, как описано выше, f спектрофотометрируя конечные растворы при длине волны 247 нм. Количество котофора определяют по градуировочному графику. Обработка результатов анализа. Содержание котофора в анализируемой пробе (X, мг/л, мг/кг или мгк/г) рассчитывают по формуле: A X = -, P где: A - количество котофора, найденное путем сравнения со стандартом (метод ТСХ) или по градуировочному графику (спектрофотометрическое определение), мкг;
P - количество или объем пробы, взятой для анализа, мл или г.
Требования безопасности. При определении остаточных количеств котофора необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с ядовитыми, взрыво- и огнеопасными веществами.
---