Методические указания по определению котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, продуктах питания растительного происхождения и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии

(утв. Минздравом СССР 31.07.1984 № 3066-84)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОТОФОРА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА, ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

---

<*> Разработаны Л.А. Бунятян, М.С. Петросян, Ю.А. Бунятян (Филиал ВНИИГИНТОКС); Х.А. Касимовым, К.Б. Баратовым, И.И. Бабаевым (Таджикский НИИ эпидемиологии и гигиены).

Краткая характеристика препарата. Котофор — 2-этилтио-4,6-бис- (изопропиламино)-симм-триазин. Брутто-формула C H № S. 11 21 5

Молекулярная  масса  255,39.  Химически  чистый  препарат  - белый
порошок  с  т.  пл.  104  - 106 °C. Трудно растворяется в воде (16

мг/л), хорошо — в органических растворителях (хлороформе, ацетоне,

метаноле).  Малотоксичен для теплокровных животных. МДУ котофора в
хлопковом  масле  4,5; жмыхе - 0,38 мг/кг. ПДК котофора в воде 1,0

мг/л.

Котофор рекомендован для применения в качестве селективного гербицида для довсходового опрыскивания на посевах овощных, бахчевых культур и хлопчатника.

Принцип метода. Метод основан на извлечении котофора из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстракта и последующем определении методами тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии.

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Параметры	Метод анализа	Анализируемый объект
		вода	почва	семена хлопчатника	растительные продукты	биоматериал
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг или мг/л	ТСХ УФ	0,02 — 1,0 0,02 — 0,5	0,05 — 1,0 0,05 — 0,5	- 0,05 — 0,5	- 0,05 — 0,5	0,6 — 1,0 -
Предел обнаружения, мкг	ТСХ УФ	1 2	5 5	- 2,5	- 2,5	0,6 -
Предел определения, мг/кг или мг/л	ТСХ УФ	0,02 0,02	0,05 0,05	- 0,05	- 0,05	0,6 -
Среднее значение определения стандартных	ТСХ УФ	96,8 97,0	87,0 94,0	- 84,0	- 90,0	75,0 -
количеств (с) при n = 5, %
Стандартное отклонение S,	ТСХ УФ	+/- 5,4 +/- 2,66	+/- 3,47 +/- 2,95	- +/- 10,7	- +/- 3,95	+/- 5,93 -
Доверительный интервал среднего при p = 0,95; n = 5, %	ТСХ УФ	+/- 4,9 +/- 2,63	+/- 3,1 +/- 4,69	- +/- 17,01	- +/- 6,28	+/- 5,3 -

Избирательность метода. Определению остаточных количеств котофора в воде, почве, семенах хлопчатника, растительных продуктах и биологическом материале не мешают близкие по строению и области применения пестициды — мезоранил, прометрин.

Реактивы и материалы. Этиловый спирт х.ч. Ацетон ч.д.а. н-Гексан х.ч. Хлороформ ч.д.а. Этиловый эфир (медицинский). Углерод четыреххлористый х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Силикагель КСК. Сульфат кальция ч.д.а. Оксид алюминия для хроматографии. Индикатор бромфеноловый синий ч.д.а., 0,4-процентный раствор в ацетоне. Индикатор бромтимоловый синий ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 2-процентный в.р. Лимонная кислота х.ч., 4-процентный в.р. Хлороводородная кислота х.ч., 1 н водный раствор. Гидроксид натрия х.ч., 1 н в.р. Уголь активированный марки БАУ. Фильтры бумажные. Пластинки для хроматографии «Силуфол». Вата обезжиренная (гигроскопическая). Стандартные растворы котофора в хлороформе с содержанием 100, 500 мкг/мл.

Приборы, аппаратура, посуда. Спектрофотометр. Шкаф вытяжной химический. Шкаф сушильный. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде. Баня водяная. Камера для опрыскивания. Камера для хроматографирования. Пульверизатор стеклянный. Воронки: делительные на 150, 250, 1000 мл; простые конусообразные с коротким стеблем № 5. Колбы: конические на 250 мл; круглодонные на 100 мл; мерные с коническим шлифом на 100, 1000 мл. Капилляры стеклянные. Пипетки на 0,1; 10 мл. Пластинки хроматографические стеклянные размером 9 x 12 см. Сито лабораторное № 5 и 40.

Подготовка к определению. Приготовление растворов. Приготовление 1 н раствора хлороводородной кислоты: 86 мл 36-процентной хлороводородной кислоты доводят в мерной колбе до 1 л дистиллированной водой. Раствор можно приготовить на фиксанале. Хранить в прохладном месте в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 мес.

Приготовление 1 н раствора едкого натра: 40 г едкого натра растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и доводят ею до 1 л. Рекомендуется использовать свежеприготовленные растворы.

Проявляющие реагенты: № 1 — смесь равных объемов 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне и 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. Готовят перед употреблением; № 2 — 4-процентный водный раствор лимонной кислоты. Хранить в прохладном месте не более 10 дней; № 3 — в мерную колбу на 250 мл помещают 1,0 г нитрата серебра, 0,1 г бромтимолового синего, растворяют в 90 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки ацетоном. Готовят перед употреблением.

Стандартные растворы. Стандартные растворы котофора с содержанием 100 и 500 мкг действующего начала препарата в 1 мл хлороформа готовят из химически чистого или технического препарата с учетом процентного содержания действующего вещества. Растворы хранить в прохладном месте не более 1 мес.

Приготовление пластинок с тонким слоем КСК. Тщательно промытую и высушенную пластинку размером 9 x 12 см протирают ватным тампоном, смоченным в этиловом спирте или диэтиловом эфире, и покрывают сорбционной массой, приготовленной из 35 г силикагеля КСК, 2 г сульфата кальция и 90 мл дистиллированной воды. Сорбционную массу готовят, тщательно растирая в фарфоровой ступке сначала сухую смесь силикагеля с гипсом, а затем и с водой до однородной массы. Затем 10 г сорбционной массы равномерно распределяют по всей поверхности пластинки, покачивая ее. Пластинки сушат при комнатной температуре 18 — 20 ч. Хранят в эксикаторе.

Силикагель предварительно очищают от примесей, для чего заливают его на 18 — 20 ч хлороводородной кислотой (1:1). Потом кислоту сливают, промывают водой и кипятят 2 — 3 ч с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают обычной водой, а затем и дистиллированной до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 — 6 ч при температуре 130 °C. Обработанный и просушенный силикагель дробят и просеивают через сито № 40. Хранят в склянке с притертой пробкой.

Приготовление пластинок с тонким слоем окиси алюминия. Для приготовления сорбционной массы на 10 пластинок берут 50 г оксида алюминия, просеянного через сито № 40, 5 г сульфата кальция. Оксид алюминия с сульфатом кальция тщательно растирают в фарфоровой ступке, переносят в коническую колбу, прибавляют 150 мл дистиллированной воды и встряхивают до образования однородной массы. Полученную массу наносят тонким слоем на заранее приготовленные стеклянные пластинки. Пластинки сушат в течение 12 — 15 ч при комнатной температуре. Готовые пластинки хранят в эксикаторе.

Построение градуировочного графика для спектрофотометрического

определения.  На  пластинку наносят 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5
мл  стандартного раствора с концентрацией котофора 100 мкг/мл, что
соответствует  2,  5, 10, 20, 30, 50, 70 мкг, и хроматографируют в
смеси  хлороформ  -  гексан (4:1). С целью спектрофотометрирования
пластинка,  снятая с камеры, проявляется не полностью, а частично.

При этом участок опытной площади покрывается листком чистой бумаги и опрыскивается проявляющим реактивом № 3 только область одного из

пятен  (лучше  одна  из  концевых  областей,  например  с  70  мкг
вещества).  Затем  предполагаемые  площади опытных пятен на уровне
стандарта  количественно  вместе  с  оксидом  алюминия переносят в
центрифужные   пробирки.  В  каждую  пробирку  заливают  по  3  мл
хлороформа,  закрывают  корковой пробкой и оставляют на 2 ч. Время
от  времени  смесь  взбалтывают, затем экстракт центрифугируют при

                         -1

частоте  вращения  1500  мин.    в  течение  15  мин.  После этого
хлороформный  слой  центрифугата  осторожно,  не взмучивая осадок,
выливают   в   другую   центрифужную   пробирку  и  объем  доводят
хлороформом  до  3 мл. Затем раствор переливают в кювету на 3 мм и
спектрофотометрируют   при  длине  волны  247  нм.  Строят  график
зависимости   оптической   плотности   от  концентрации  вещества.
Линейность  показаний  наблюдается   в  пределах  2  - 50 мкг. При
содержании  котофора в пробе более 50 мкг необходимо развести ее и

коэффициент разведения учитывать при расчетах.

Отбор проб. Пробы воды, почвы, семян хлопчатника, продуктов питания растительного происхождения и биологического материала нужно транспортировать и хранить в стеклянной или полиэтиленовой таре, причем пробы биоматериала следует хранить при температуре минус 5 — минус 8 °C.

Ход анализа. Экстракция методом ТСХ. Пробу воды (1 л) помещают в делительную воронку и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 50, 30, 30 мл. Объединенный экстракт сливают через воронку с 5 — 7 г безводного сульфата натрия в колбу ротационного испарителя и отгоняют хлороформ до объема 0,1 — 0,2 мл при температуре бани 80 °C.

Навеску воздушно-сухой почвы (100 г) растирают в ступке, просеивают через сито № 5, заливают в конической колбе ацетоном до покрытия пробы и оставляют на ночь. Отфильтрованный объединенный экстракт кипятят на водяной бане при температуре бани 80 °C с активированным углем марки БАУ (5 — 7 г) до исчезновения окраски. Растворитель фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» и безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя. Уголь на фильтрате промывают несколькими порциями ацетона. Ацетон отгоняют с помощью ротационного испарителя до объема 0,1 — 0,2 мл.

Пробу биологического материала (кровь, печень, почки, легкие, селезенка, сердце, мышечная ткань) 5 г тщательно измельчают ножницами, помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 30 мл смеси гексан — ацетон (1:1) и периодически встряхивают в течение часа. Смесь гексан — ацетон сливают, пробу повторно заливают смесью и опять периодически встряхивают 1 ч. Экстракцию повторяют трижды. Объединенные экстракты сушат безводным сульфатом натрия (3 — 5 г) и упаривают при температуре бани 80 °C. К сухому остатку прибавляют 2 мл 1 н хлороводородной кислоты, тщательно ополаскивают стенки колбы. Смывы сливают в делительную воронку, фильтруя через небольшой слой ваты. Колбу трижды ополаскивают 1 мл 1 н соляной кислоты, смывы сливают в ту же делительную воронку. В делительную воронку добавляют 4 мл 1 н раствора едкого натра и перемешивают, а затем по каплям приливают 1 н раствор едкого натра до нейтральной реакции (по индикаторной бумажке). После этого в воронку приливают 10 мл предварительно насыщенного водой хлороформа и встряхивают 1 — 2 мин. Хлороформный экстракт сливают из воронки в колбу через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию хлороформом повторяют трижды. Объединенный хлороформный экстракт отгоняют на ротационном испарителе при температуре бани 80 °C до объема 0,1 — 0,2 мл.

Хроматографирование. Подготовленные экстракты количественно наносят при помощи капиллярной пипетки на хроматографическую пластинку «Силуфол» так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Центр пятна должен быть на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Колбочку с экстрактом 2 — 3 раза смывают небольшими порциями хлороформа, который также наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см от нее наносят стандартные растворы (шприцем или микропипеткой), содержащие 5, 10 или 20 мкг препарата.

    Пластинку     с     нанесенными    растворами    помещают    в
хроматографическую  камеру,  в которую предварительно налита смесь
растворителей  гексан - ацетон (10:3) или четыреххлористый углерод

• диэтиловый эфир (4:1). Край пластинки не должен быть погружен в

раствор  более  чем  на  0,5  см.  После того как фронт подвижного
растворителя  поднимется  на 10 см, пластинку вынимают и оставляют
на   несколько   минут   на   воздухе   для  испарения  подвижного
растворителя.  Пластинку  обрабатывают  с  помощью  пульверизатора
проявляющим  реактивом N 1. После высушивания пластинки на воздухе
ее  обрабатывают  проявляющим  реактивом  N  2.  Зоны  локализации
препарата  обнаруживаются  в  виде  синих  пятен  на желтом фоне с

                   f

Таблица 149

ВЕЛИЧИНЫ R КОТОФОРА F

Система подвижных растворителей	Силикагель КСК	«Силуфол»
Гексан — ацетон (10:3) Четыреххлористый углерод — диэтиловый эфир (4:1)	0,52 +/- 0,01 0,21 +/- 0,01	0,50 +/- 0,01 0,29 +/- 0,01

Количество котофора определяют путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен пестицида на хроматограммах пробы и стандартного раствора.

Экстракция методом УФ-спектрофотометрии. Экстракцию проводят аналогично методу, описанному выше. Размельченные в ступке семена хлопчатника (50 г) трехкратно экстрагируют хлороформом порциями по 50 мл. Хлороформные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную колбочку и выпаривают до полного удаления хлороформа. Содержимое выпарительной колбочки переносят в коническую колбу на 250 мл путем двукратного смыва по 25 мл ацетоном. Затем в эту же колбу добавляют 100 мл ледяной дистиллированной воды. Колбу ставят в морозильную камеру холодильника на 1 ч, затем вынимают и содержимое быстро фильтруют через бумажный фильтр в другую коническую колбу и вновь ставят в морозильную камеру. Через 1 ч колбу снимают, содержимое фильтруют в выпарительную колбочку и имеющийся в фильтрате ацетон выпаривают на ротационном испарителе или водяной бане. Оставшуюся водную фракцию экстракта переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 25 мл. Экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха.

Из средней пробы растительных продуктов (картофель, лук, томаты), размельченных миксером или мясорубкой, отбирают навеску 50 г. Экстракцию проводят трехкратно хлороформом по 100 мл в течение 30 — 40 мин. Полученные экстракты объединяют и выпаривают досуха на ротационном испарителе или водяной бане.

    Хроматографирование   и   спектрофотометрическое  определение.
Колбочку  из-под  экстракта  трехкратно  ополаскивают  по  0,1  мл
хлороформа   и   полученный  смыв  наносят  на  хроматографическую
пластинку,  отступая на 1 см от ее нижнего края. Рядом с пробой на
пластинку  наносят  стандарт  с  известной концентрацией котофора.
Затем  развивают  хроматограмму  в смеси хлороформ - гексан (4:1).
После  завершения  разгонки (10 см) пластинку вынимают из камеры и
высушивают  при  комнатной  температуре  в  течение 10 мин. Покрыв
листком   чистой   бумаги   участок   опытной  площади  пластинки,
обрабатывают  проявляющим  реактивом  N  3  лишь  зону локализации
свидетеля  (R   0,50  -  0,60). Далее поступают, как описано выше,

         f

спектрофотометрируя конечные растворы при длине волны 247 нм. Количество котофора определяют по градуировочному графику.

    Обработка   результатов   анализа.   Содержание   котофора   в
анализируемой  пробе  (X,  мг/л,  мг/кг или мгк/г) рассчитывают по

формуле:

                              A

X = -, P

где:

A — количество котофора, найденное путем сравнения со стандартом (метод ТСХ) или по градуировочному графику (спектрофотометрическое определение), мкг;

---