---
title: "\"Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства\""
number: "3049-84"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-3049-84"
---

## "Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства"

# "Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства"

(утв. Минздравом СССР 29.06.1984 N 3049-84)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).
> Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32).


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждаю<br>
Заместитель Главного<br>
государственного<br>
санитарного врача СССР<br>
**А.И.ЗАИЧЕНКО**

</div>

<div align="center">

29 июня 1984 г. N 3049-84

</div>


<a id="p100002"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ**
**В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА**

<a id="p100003"></a>В целях дальнейшей интенсификации животноводства и птицеводства, повышения производства мяса и других продуктов животного происхождения в сельском хозяйстве нашей страны применяются антибиотики для стимуляции роста, повышения эффективности откорма скота и птицы, а также в качестве лечебно-профилактических средств. Среди них препараты, содержащие тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, немедицинские антибиотики: гризин, цинкбацитрацин и прочие.
<a id="p100004"></a>Условия применения антибиотиков для выращивания, откорма и лечения сельскохозяйственных животных и птицы регламентированы Инструкцией, утвержденной МСХ СССР в 1980 г., и Методическими [указаниями](https://bukva.ai/docs/metodicheskie-ukazaniya-po-primeneniyu-minselhoz-sssr-ministerstvo) по применению антибиотиков в ветеринарии (М., 1973), соблюдение которых должно гарантировать безопасность для здоровья населения продуктов, полученных от леченных или стимулированных антибиотиками животных. Однако в силу различных причин в пищевых продуктах, полученных от этих животных, в ряде случаев содержатся остатки антибиотиков.
<a id="p100005"></a>Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина и др. обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Присутствие немедицинских антибиотиков (гризина и пр.) отмечено при включении в корма в экспериментальных условиях в превышенных количествах этих препаратов. Материалы научных исследований свидетельствуют о наличии остаточных количеств антибиотиков в мясных, молочных продуктах, яйцах. Вместе с тем длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может вызвать неблагоприятные для здоровья человека последствия - аллергические реакции, дисбактериоз, образование и передачу резистентных форм микробов. Экспериментально установленные при этом уровни неблагоприятного действия антибиотиков на организм позволили обосновать величины максимально допустимого суточного поступления их в организм человека с продуктами питания и сделать вывод, что при санитарном контроле продуктов питания остаточные количества антибиотиков в них не должны допускаться при использовании предлагаемых ниже утвержденных методов исследования в пределах их чувствительности (для хлортетрациклина, пенициллина - 0,01, стрептомицина - 0,5, гризина и цинкбацитрина - 0,1 и 0,002 ЕД на г/мл продукта).
<a id="p100006"></a>Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания антибиотиков должно осуществляться путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб молока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них антибиотиков. Необходимо выявлять хозяйства, поставляющие пищевые продукты, загрязненные антибиотиками, выявлять причины попадания в них антибиотиков и принимать меры для устранения этих нарушений, не допускать снабжения пищевыми продуктами, содержащими остаточные количества антибиотиков, детских учреждений, больниц и т.п.
<a id="p100007"></a>Реализация молока с наличием остаточных количеств антибиотиков решается в каждом конкретном случае представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора.
<a id="p100008"></a>Молоко, содержащее остаточные количества любых антибиотиков, может использоваться в качестве дополнительного кормового средства при откорме молодняка сельскохозяйственных животных.
<a id="p100009"></a>Творог, сметану, яйца, содержащие остаточные количества антибиотиков тетрациклинового ряда, пенициллина, следует направлять на изготовление хлебобулочных и кондитерских изделий с расчетом, чтобы соотношение "загрязненных продуктов" с другими компонентами изделий было не меньшим, чем 1:4 (при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,05 ЕД/г), 1:10 и 1:100 - при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,1 ЕД/г и до 1,0 ЕД/г и более, соответственно.
<a id="p100010"></a>Мясо и субпродукты, содержащие остаточные количества антибиотиков, не следует в необработанном виде реализовывать населению. Такое мясо должно направляться на изготовление мясных, мясо-растительных консервов, за исключением консервов для детского питания, концентратов I и II блюд, вареных и варено-копченых колбас при условии обязательной подсортировки к мясу или компонентам блюд, не содержащих остаточных количеств антибиотиков. Среднерасчетная кратность разведения "загрязненного" антибиотиками мяса незагрязненным должна составлять 17 (по данным Института питания АМН СССР). В каждом конкретном случае вопрос о реализации и использовании мяса с наличием остаточных количеств антибиотиков решается представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора с условием, что при подсортировке кратность соотношения "загрязненных" и незагрязненных продуктов должна зависеть от выявленной концентрации антибиотика, с тем, чтобы в конечном итоге содержание остаточного количества антибиотика было ниже уровня чувствительности утвержденных методов исследования.
<a id="p100011"></a>Например, в образцах мышечной ткани от говяжьей туши N "__", поступившей на забой из с-х "...-ский", выявлено содержание хлортетрациклина на уровне 0,2 ЕД/г. Следовательно, чтобы содержание антибиотика в продукте снизилось до менее 0,01 ЕД/г, мясо от этой туши должно быть направлено на приготовление колбас при условии введения в фарш в размере не более 5% к общей массе продукта. В совхоз должно быть направлено предписание о нарушении инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии или при откорме животных, а к руководителю хозяйства приняты административные меры.
<a id="p100012"></a>При реализации продуктов питания, содержащих остаточные количества стрептомицина, гризина, цинкбацитрацина, должен использоваться такой же подход подсортировки к незагрязненному антибиотиками сырью с учетом выявленной концентрации антибиотика и соответствующей кратностью разведения.
<a id="p100013"></a>Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением антибиотиков в животноводстве и ветеринарии и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью чувствительных методов.
<a id="p100014"></a>В целях систематического контроля в стране за загрязнением продуктов животноводства антибиотиками предлагаются данные "Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства". Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях, нашли микробиологические методы, позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому наиболее специфичны и объективны. Ниже рекомендуются методы определения некоторых антибиотиков:
<a id="p100015"></a>а) тетрациклиновой группы - в молоке, молочных продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, в т.ч. мясе и субпродуктах птицы;
<a id="p100016"></a>б) стрептомицина - в молоке и молочных продуктах, яйцах;
<a id="p100017"></a>в) пенициллина - в молоке и молочных продуктах;
<a id="p100018"></a>г) гризина - в мясе;
<a id="p100019"></a>д) цинкбацитрацина - в мясе.
<a id="p100020"></a>Содержание антибиотиков выявляют микробиологическим методом диффузии в агар по величине торможения роста следующих тест-культур, внесенных в питательные среды:
- <a id="p100021"></a>для тетрациклиновых антибиотиков - Bac. cereus АТСС 11778 (чувствительность - 0,01 ЕД/г/мл);
- <a id="p100022"></a>для стрептомицина - Bac. mycoidis 537 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);
- <a id="p100023"></a>для пенициллина - S. lutea АТСС 9341 (чувст. 0,01 ЕД/г/мл);
- <a id="p100024"></a>для гризина - Bac. cubtilis АТСС 6633 (чувст. 0,5 ЕД/г/мл);

<div align="center">

- <a id="p100025"></a>для цинкбацитрацина - M. flavus АТСС 10240 (чувст. 0,02 ЕД/г/мл).

</div>

<a id="p100026"></a>Молоко рекомендуется исследовать на присутствие остаточных количеств антибиотиков в том случае, когда при предварительном исследовании по [ГОСТ 23454-79](https://bukva.ai/docs/gost-23454-79) в нем обнаружены ингибирующие вещества и исключено наличие химических веществ.


## <a id="p100027"></a>ОТБОР ПРОБ, САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ И ОТЧЕТНОСТЬ


<a id="p100028"></a>Отбор проб молока и молочных продуктов производится по ГОСТ 13928-68 и 9225-68, но не более 50 мл каждой пробы; мяса и мясных продуктов - по [ГОСТ 7269-79](https://bukva.ai/docs/gost-7269-79), но не более 50 г каждой пробы; яйца отбирают в пределах 0,5 - 1% (в зависимости от объема партии).
<a id="p100029"></a>Санитарный контроль за содержанием антибиотиков в молочных, мясных продуктах, яйцах следует проводить не реже 1 раза в квартал. Количество проб для анализа и перечень антибиотиков определяют в зависимости от состояния вопроса в каждой местности. Органы ветнадзора должны информировать санитарно-эпидемиологическую службу о применяемых в данном районе, области в животноводческих хозяйствах антибиотиках в качестве кормовых или лечебных препаратов.
<a id="p100030"></a>В случае обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах необходимо применять административные меры к руководителям хозяйств за нарушение Инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии и при выращивании скота. Врачам по гигиене питания, специалистам ведомственной санитарной службы, ветнадзора следует проводить разъяснительную работу о недопустимости загрязнения пищевых продуктов остаточными количествами антибиотиков.
<a id="p100031"></a>Материалы по результатам исследований продуктов животноводства на загрязнение антибиотиками в целом по району, области, республике должны ежегодно обобщаться и анализироваться в целях принятия конкретных профилактических мер.


## 1. <a id="p100032"></a>АППАРАТУРА


1. <a id="p100033"></a>Автоклав (стерилизатор паровой), ГОСТ 19569-74.
2. <a id="p100034"></a>Бумага масштабно-координатная марки ПЛН, [ГОСТ 334-73](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-gost-334-73-gosstandart-sssr-5) (полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков).
3. <a id="p100035"></a>Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г, ТУ 25.06.1131-75.
    4. <a id="p100036"></a>Весы  лабораторные  общего назначения с наибольшим пределом
<a id="p100037"></a>                  -3
<a id="p100038"></a>взвешивания 1 x 10 - 0,2 кг по ГОСТу 24104-80.
5. <a id="p100039"></a>Водяная баня лабораторная (аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42.1091-63).
6. <a id="p100040"></a>Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090-74.
7. <a id="p100041"></a>Ионометр универсальный (pH-метр) ЭВ-74.
8. <a id="p100042"></a>Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000 куб. см по ГОСТу 10394-72.
9. <a id="p100043"></a>Линейка по [ГОСТу 17435-72](https://bukva.ai/docs/gost-17435-72-gosstandart-sssr).
10. <a id="p100044"></a>Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 куб. см.
11. <a id="p100045"></a>Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 куб. см по ГОСТу 23932-79.
12. <a id="p100046"></a>Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284-78.
13. <a id="p100047"></a>Микроразмельчитель тканей типа РТ-2, МРТУ 04.1.1505-63 (или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147-73 и кварцевый песок).
14. <a id="p100048"></a>Ножницы по ГОСТу 21239-77; скальпель, ГОСТ 21240-77; пинцеты по ГОСТу 31241-77.
15. <a id="p100049"></a>Палочки стеклянные.
16. <a id="p100050"></a>Петля бактериологическая.
17. <a id="p100051"></a>Пробочное сверло 9 мм.
18. <a id="p100052"></a>Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 куб. см по [ГОСТу 20292-74](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20292-74).
19. <a id="p100053"></a>Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932-79.
20. <a id="p100054"></a>Пробирки центрифужные емкостью 10 куб. см.
21. <a id="p100055"></a>Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.
22. <a id="p100056"></a>Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.
23. <a id="p100057"></a>Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878-60.
24. <a id="p100058"></a>Трафарет для вырезания лунок.
25. <a id="p100059"></a>Уровень для установления горизонтальной поверхности.
26. <a id="p100060"></a>Холодильник бытовой по ГОСТу 16317-70.
27. <a id="p100061"></a>Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107-71; центрифуга настольная ЦЛН-2, МРТУ 421742-63.
28. <a id="p100062"></a>Цилиндры мерные на 50, 100, 250, 1000 куб. см по [ГОСТу 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74).
29. <a id="p100063"></a>Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932-79, а также чашки из полимерных материалов.
30. <a id="p100064"></a>Штативы для пробирок на 20 - 40 гнезд по ТУ 64-1-2669-78.


## 2. <a id="p100065"></a>КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД


1. <a id="p100066"></a>Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206-71.
2. <a id="p100067"></a>Мясо-пептонный бульон по [ГОСТу 20730-75](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20730-75-gosstandart-sssr).
3. <a id="p100068"></a>Дрожжевой экстракт (экстракт кормовых дрожжей сухой, производство МНИИВС).
4. <a id="p100069"></a>Мясная вода по ГОСТу 20729-75.
5. <a id="p100070"></a>Панкреатический гидролизат казеина.
6. <a id="p100071"></a>Пепсин медицинский.
7. <a id="p100072"></a>Пептон сухой ферментативный, [ГОСТ 13805-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13805-76).
8. <a id="p100073"></a>Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130 - 140 мг% по ГОСТу 10444.1-75.


## 3. <a id="p100074"></a>РЕАКТИВЫ


1. <a id="p100075"></a>Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975-75.
2. <a id="p100076"></a>Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
3. <a id="p100077"></a>Натрия гидрат окиси (натр едкий), ГОСТ 4328-66, 10% р-р.
4. <a id="p100078"></a>Натрий лимоннокислый, х.ч., [ГОСТ 22280-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-22280-76).
5. <a id="p100079"></a>Калия фосфат однозамещенный, х.ч., ГОСТ 4198-65.
6. <a id="p100080"></a>Калия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 2493-65.
7. <a id="p100081"></a>Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 11773-66.
8. <a id="p100082"></a>Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67.
9. <a id="p100083"></a>Кислота соляная, х.ч., уд. вес 1,18 - 1,19.
10. <a id="p100084"></a>Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233-77.
11. <a id="p100085"></a>Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича.


## 4. <a id="p100086"></a>ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ


<a id="p100087"></a>            Среда N 1

<a id="p100088"></a>Дистиллированная вода - 10,0 мл             Стерилизация автокла-
<a id="p100089"></a>Агар-агар             - 6,0 г +/- 0,1       вированием при 121
<a id="p100090"></a>pH среды              - 8,0                 град. C +/- 1 град. C
<a id="p100091"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

<a id="p100092"></a>            Среда N 2

<a id="p100093"></a>Пептон                - 10,0 г              Стерилизация автокла-
<a id="p100094"></a>Хлористый натрий      - 5,0 г               вированием при 121
<a id="p100095"></a>Агар-агар             - 20,0 г              град. C +/- 1 град. C
<a id="p100096"></a>Мясная вода 1:2       - до 1000 мл          20 мин. +/- 3 мин.
<a id="p100097"></a>pH среды              - 7,0 +/- 0,1

<a id="p100098"></a>            Среда N 3

<a id="p100099"></a>Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 100 мг% - 1000 мл
<a id="p100100"></a>Агар-агар 20,0 +/- 0,1
<a id="p100101"></a>Глюкоза (добавляют  в расплавленный агар 40%  глюкозу в количестве
<a id="p100102"></a>2,5 мл на 100 мл среды)
<a id="p100103"></a>pH среды после стерилизации 6,4 +/- 0,1     Стерилизация автокла-
<a id="p100104"></a>                                            вированием при 121
<a id="p100105"></a>                                            град. C +/- 1 град. C
<a id="p100106"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

<a id="p100107"></a>            Среда N 4

<a id="p100108"></a>Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% - 1000 мл
<a id="p100109"></a>Агар-агар             - 25,0 +/- 0,1 г      Стерилизация автокла-
<a id="p100110"></a>pH среды              - 6,1 +/- 0,1         вированием при 121
<a id="p100111"></a>                                            град. C +/- 1 град. C
<a id="p100112"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

<a id="p100113"></a>            Среда N 5

<a id="p100114"></a>Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% - 1000 мл
<a id="p100115"></a>Агар-агар             - 20,0 +/- 0,1 г      Стерилизация автокла-
<a id="p100116"></a>NaHPO4                - 2,5 +/- 0,05 г      вированием при 121
<a id="p100117"></a>pH среды              - 7,9 +/- 0,1         град. C +/- 1 град. C
<a id="p100118"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

<a id="p100119"></a>            Среда N 6

<a id="p100120"></a>Пептон                - 10,0 +/- 0,1 г      Стерилизация автокла-
<a id="p100121"></a>Натрий хлористый      - 5,0 +/- 0,05 г      вированием при 121
<a id="p100122"></a>Агар-агар             - 20,0 +/- 0,1 г      град. C +/- 1 град. C
<a id="p100123"></a>Мясная вода 1:2       - до 1000 мл          20 мин. +/- 3 мин.
<a id="p100124"></a>pH среды              - 6,5 +/- 0,1

<a id="p100125"></a>            Среда N 7

<a id="p100126"></a>Пептон - 6,0 +/- 0,1 г
<a id="p100127"></a>Панкреатический гидролизат казеина сухой - 4,0  +/-  0,05  г  (или
<a id="p100128"></a>40,0 +/- 1 мл жидкого)
<a id="p100129"></a>Дрожжевой экстракт сухой - 3,0 +/- 0,05  г  (или  30,0  +/-  1  мл
<a id="p100130"></a>жидкого)
<a id="p100131"></a>Мясной экстракт сухой - 1,5 +/- 0,01 г (или 15,0 +/- 0,5 мл мясной
<a id="p100132"></a>воды)
<a id="p100133"></a>Глюкоза               - 1,0 +/- 0,01 г      Стерилизация автокла-
<a id="p100134"></a>Агар-агар             - 20,0 +/- 0,1 г      вированием при 115
<a id="p100135"></a>Вода дистиллированная - до 1000 мл          град. C +/- 3 град. C
<a id="p100136"></a>pH среды              - 6,5 +/- 0,1         20 мин. +/- 3 мин.

<a id="p100137"></a>            Среда N 8

<a id="p100138"></a>Мясная вода 1:2       - 500 +/- 1 мл        Стерилизация автокла-
<a id="p100139"></a>Пептон                - 5,0 +/- 0,05 г      вированием при 121
<a id="p100140"></a>Хлористый натрий      - 2,5 г               град. C +/- 1 град. C
<a id="p100141"></a>Фосфат калия двухзамещенный - 3,0 г         20 мин. +/- 3 мин.
<a id="p100142"></a>Агар-агар             - 6,0
<a id="p100143"></a>Вода дистиллированная - до 1000 мл
<a id="p100144"></a>pH среды              - 7,8 - 8,0


## 5. <a id="p100145"></a>БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ АНТИБИОТИКОВ ИЗ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА


1. <a id="p100146"></a>Физиологический раствор                  Стерилизация автокла-
<a id="p100147"></a>   NaCl - 8,5 г                             вированием при 121
<a id="p100148"></a>   H2O  - до 1л                             град. C +/- 1 град. С
<a id="p100149"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

2. <a id="p100150"></a>Цитратно-солянокислый, pH 5,1 +/- 0,1    Стерилизация автокла-
<a id="p100151"></a>   лимоннокислый натрий     - 20,6 г        вированием при 121
<a id="p100152"></a>   HCl, уд. вес 1,19        - 1,81 мл       град. C +/- 1 град. C
<a id="p100153"></a>   H2O                      - до 1 мл       20 мин. +/- 3 мин.

3. <a id="p100154"></a>2%  раствор  пепсина на цитратно-солянокислом буфере с pH 5,1
<a id="p100155"></a>   +/- 0,1
<a id="p100156"></a>   пепсин медицинский       - 2 г           (Асептично взвешенную
<a id="p100157"></a>   буфер                    - 100 мл        навеску пепсина вносят
<a id="p100158"></a>                                            в стерильный буфер
<a id="p100159"></a>                                            перед проведением
<a id="p100160"></a>                                            анализа)

4. <a id="p100161"></a>Фосфатный буфер pH 6,0
<a id="p100162"></a>   KH2PO4 - 7,72 г или KH2PO4 - 2 г         Стерилизация автокла-
<a id="p100163"></a>   NaHPO4 - 1,78 г     K2HPO4 - 8 г         вированием при 121
<a id="p100164"></a>   H2O    - до 1 л     H2O    - до 1 л      град C +/- 1 град. C
<a id="p100165"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

5. <a id="p100166"></a>2% раствор пепсина на фосфатном буфере с pH 6,0
<a id="p100167"></a>   пепсин медицинский       - 2 г           (Асептично взвешенную
<a id="p100168"></a>   буфер                    - 100 мл        навеску пепсина вносят
<a id="p100169"></a>                                            в стерильный буфер
<a id="p100170"></a>                                            перед проведением
<a id="p100171"></a>                                            анализа)

6. <a id="p100172"></a>Фосфатный буфер pH 7,9 +/- 0,1
<a id="p100173"></a>   K2HPO4 - 16,73 г                         Стерилизация автокла-
<a id="p100174"></a>   KH2PO4 - 0,523 г                         вированием при 121
<a id="p100175"></a>   H2O    - до 1 л                          град. C +/- 1 град. C
<a id="p100176"></a>                                            20 мин. +/- 3 мин.

7. <a id="p100177"></a>Цитратно-солянокислый, pH 3,1 +/- 0,1
<a id="p100178"></a>   I раствор - 22,6 г лимоннокислого натрия растворяют в 1 л воды;
<a id="p100179"></a>   II раствор - 8,2 мл конц. HCl с уд. весом 1,19 растворяют в 1 л
<a id="p100180"></a>дистиллированной воды
<a id="p100181"></a>   Буфер готовят при смешивании двух растворов;
<a id="p100182"></a>   62 мл I раствора + 100 мл II раствора, pH буфера 3,0 +/- 0,1
<a id="p100183"></a>   Стерилизация - 121 град. C +/- 1 град. C 20 мин. +/- 3 мин.


## 6. <a id="p100184"></a>ВЫРАЩИВАНИЕ ТЕСТ-КУЛЬТУР И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ


<a id="p100185"></a>Тест-культурами служат специально отобранные, образующие и необразующие споры, непатогенные или условно патогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотиков в агар.


#### <a id="p100186"></a>6.1 Приготовление спор Bac. cereus ATCC 11778


<a id="p100187"></a>Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 7,1 +/- 0,1) и выращивают при 29,0 +/- 1,0 град. C в течение 20,0 +/- 2,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 8,0 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 200 +/- 1,0 мл 2% МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30 град. C. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80 - 90% спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной воды. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65 - 70 град. C в течение 30,0 +/- 1,0 мин., трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин., каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до получения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,0 +/- 1,0 мин. при 65 - 70 град. C. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4 град. C и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.


#### <a id="p100188"></a>6.2 Приготовление рабочей концентрации Bac. cereus

<div align="center">

**АТСС 11778**

</div>


<a id="p100189"></a>    Небольшое количество (0,2  мл)  споровой  взвеси  Bac.  cereus
<a id="p100190"></a>вносят  в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического
<a id="p100191"></a>раствора и хорошо перемешивают.  По стандарту мутности  на  5  ед.
<a id="p100192"></a>                                                 8
<a id="p100193"></a>полученную  взвесь доводят до концентрации 5 x 10  микробных тел в
<a id="p100194"></a>1 мл.  Затем 0,2 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной  и
<a id="p100195"></a>охлажденной до 60 град. C питательной среды. В итоге нагрузка тест
<a id="p100196"></a>                                            6
- <a id="p100197"></a>культуры в питательной среде составляет 10  спор в 1 мл.


#### <a id="p100198"></a>6.3 Выращивание спор Bac. mycoidis 537


<a id="p100199"></a>Культуру пересевают на скошенный агар (2% МПА, [среда N 2,](#p100092) pH 7,9 +/- 0,1) и выращивают при 37 град. C в течение 20 +/- 2,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,1 +/- 0,1 [(среда N 4).](#p100107) Засеянные матрацы выдерживают при 37 град. C в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 85 +/- 5,0% спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.
<a id="p100200"></a>Полученную взвесь спор прогревают при 65 - 70 град. C в течение 30 мин., а затем поступают так же, как и при получении спор Bac. cereus АТСС 11778, [п. 6.1.](#p100186)

<div align="right">

<a id="p100201"></a>Таблица 1

</div>


<div align="center">

<a id="p100202"></a>**ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ,**<br>
**БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ, РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТОВ**<br>
**АНТИБИОТИКОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ**<br>
**В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ**

</div>



<a id="p100203"></a><a id="p100211"></a><a id="p100226"></a>

| Антибиотик | Текст-микроб | Ориентировочная посевная доза на 1 мл среды | Питательные среды | Буферные растворы | Кол-во среды на чашку | Рабочая концентрация стандарта антибиотика в мкг/мл |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Тетрациклины | Bac. cereus ATCC 11778 | 1 млн. спор | [N 2,](#p100092) [N 3](#p100098) | [N 2,](#p100150) [N 3](#p100154) | 10 мл | 0,05 |
| Стрептоми- | Bac. mycoidis | 20 млн. спор | [N 2,](#p100092) [N 4](#p100107) | [N 4,](#p100161) [N 6](#p100172) | 10 мл | 2,0 |
| цин | 537 |  |  |  |  |  |
| Пенициллин | Sur. lutea ATCC 9341 | 15 млн. микробных тел | [N 7](#p100125) | [N 4,](#p100161) [N 5](#p100166) | 10 мл | 0,05 |
| Гризин | Bac. cubtilis ATCC 6633 | 5 млн. спор | [N 5,](#p100113) [N 6,](#p100119) [N 8](#p100137) | [N 1,](#p100146) [N 7](#p100177) | 10 | 0,4 |
| Цинкбацитрацин | M. flavus ATCC 10240 | 10 млн. микробных тел | [N 6](#p100119) |  | 10 | 0,1 |



#### <a id="p100227"></a>6.4 Приготовление рабочей концентрации

<div align="center">

Bac. mycoidis 537

</div>


<a id="p100228"></a>В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1 - 0,2 мл взвеси спор Bac. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед. разводят споры до 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60 град. C питательную среду из расчета 20 млн. спор в 1 мл среды, т.е. 2 мл 1 млрд. взвеси в 100 мл среды.


#### <a id="p100229"></a>6.5 Выращивание S. lutea АТСС 9341

<div align="center">

и приготовление микробной взвеси

</div>


<a id="p100230"></a>Культуру выращивают в течение 20 +/- 2,0 час. в пробирках со [средой N 7,](#p100125) после чего ее смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4 град. C. Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд. микробных тел так же, как и Bac. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 град. C питательную среду N 7 из расчета 30 млн. микробных тел на 1 мл среды, т.е. 3 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.


#### <a id="p100231"></a>6.6 Выращивание спор Bac. cubtilis АТСС 6633


<a id="p100232"></a>Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 6,5 +/- 0,1) и выращивают при 37 град. C в течение 18 - 20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 +/- 2,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,9 +/- 0,1 [(среда N 5).](#p100113) Выращивают при 37 град. C в течение 7 суток, а затем поступают так же, как при получении спор Bac. cereus АТСС 11778.


#### <a id="p100233"></a>6.7 Приготовление взвеси спор Bac. cubtilis АТСС 6633


<a id="p100234"></a>    В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды
<a id="p100235"></a>добавляют небольшое количество (0,1 - 0,2 мл) споровой взвеси Bac.
<a id="p100236"></a>cubtilis АТСС 6633 и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на
<a id="p100237"></a>                                                       8
<a id="p100238"></a>5 ед.  полученную взвесь доводят до концентрации 5 x 10  спор в  1
<a id="p100239"></a>мл.  Затем  1  мл  данной  взвеси  вносят в 100 мл расплавленной и
<a id="p100240"></a>охлажденной до 60 град. C +/- 1 град. C питательной среды.


#### <a id="p100241"></a>6.8 Выращивание M. flavus АТСС 10240


<a id="p100242"></a>Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6,5 +/- 0,1 [(среда N 6).](#p100119) Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,5 +/- 0,1 при 37 град. C в течение 19 +/- 1,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд. микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 град. C питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.


## 7. <a id="p100243"></a>ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ (РАБОЧИХ) КОНЦЕНТРАЦИЙ СТАНДАРТНЫХ АНТИБИОТИКОВ


<a id="p100244"></a>При определении остаточных количеств антибиотиков для приготовления контрольных концентраций используют стандарты антибиотиков, т.е. очищенные образцы препарата, содержащие строго определенное количество единиц действия в 1 мг.


#### <a id="p100245"></a>7.1 Приготовление рабочей концентрации

<div align="center">

хлортетрациклина (ХТЦ)

</div>


<a id="p100246"></a>Произвольную навеску хлортетрациклина (5 - 15 мг) растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл кислоты) и получают основной раствор. Далее по схеме N 1 на [буфере N 2](#p100150) готовят контрольное разведение антибиотика. Пример. Стандарт ХТЦ содержит 930 ед./мг. Навеску в 10 +/- 0,0001 мг растворяют в 10 +/- 0,0001 мл 0,1 н HCl. Основной раствор содержит 930 ед./мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед./мл.

<div align="right">

<a id="p100247"></a>Схема N 1

</div>



<a id="p100248"></a><a id="p100252"></a><a id="p100257"></a>

| N | Соотношение растворов | Концентрация антибиотиков ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | 1 мл основного раствора + 8,3 буфера pH 5,2 | 100 |
| 2. | 1 мл раствора N 1 + 9 мл буфера pH 5,2 | 10 |
| 3. | 0,1 мл р-ра N 2 + 9,9 мл -"- -"- | 0,1 |
| 4. | 5 мл раствора N 3 + 5 мл -"- -"- | 0,05 |


<a id="p100258"></a>Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.


#### <a id="p100259"></a>7.2 Приготовление контрольной концентрации

<div align="center">

стрептомицина

</div>


<a id="p100260"></a>Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 [(N 4)](#p100161) в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера). Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,9 +/- 0,1 [(буф. N 6)](#p100172) готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед./мл.
<a id="p100261"></a>Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

<div align="right">

<a id="p100262"></a>Схема N 2

</div>



<a id="p100263"></a><a id="p100267"></a><a id="p100272"></a>

| N раствора | Соотношение растворов | Концентрация антибиотика, ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | 1 мл основного раствора + 9 мл буфера pH 7,8 +/- 0,10 | 76 |
| 2. | 1 мл 1 раствора + 9 мл -"- | 7,6 |
| 3. | 1 мл 2 раствора + 3,8 мл -"- | 2,0 |



#### <a id="p100273"></a>7.3 Приготовление контрольной концентрации

<div align="center">

пенициллина

</div>


<a id="p100274"></a>Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (буф. [N 4)](#p100161) в соотношении 1:1, т.е. 1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина - 0,05 ед./мл.

<div align="right">

<a id="p100275"></a>Схема N 3

</div>


<div align="center">

<a id="p100276"></a>**ПРИМЕРНАЯ СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРОВ ПЕНИЦИЛЛИНА**<br>
**ИЗ СТАНДАРТНОГО АКТИВНОСТЬЮ 1586 ЕД./МЛ**

</div>



<a id="p100277"></a><a id="p100281"></a><a id="p100288"></a>

| N растворов | Соотношение растворов | Концентрация антибиотика, ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | 0,6 мл стандартного раствора + 0,4 мл буфера pH 6,0 | 1000 |
| 2. | 0,1 мл раствора + 9,9 мл буфера pH 6,0 | 10 |
| 3. | 1 мл 2 раствора + 9 мл -"- -"- | 1 |
| 4. | 1 мл 3 раствора + 9 мл -"- -"- | 0,1 |
| 5. | 1 мл 4 раствора + 1 мл -"- -"- | 0,05 |



#### <a id="p100289"></a>7.4 Приготовление контрольной концентрации гризина


<a id="p100290"></a>Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина (5 - 15 мг) и растворяют ее в 0,01 н HCl из расчета 1 мг или 1000 ед./мг.
<a id="p100291"></a>Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на [буфере N 7](#p100177) (pH 3,2) по схеме N 4.

<div align="right">

<a id="p100292"></a>Схема N 4

</div>



<a id="p100293"></a><a id="p100297"></a><a id="p100301"></a>

| N растворов | Соотношение растворов | Концентрация антибиотика, ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | 1 мл основного раствора + 9 мл буфера | 100 |
| 2. | 1 мл раствора N 1 + 9 мл -"- | 10 |
| 3. | 4 мл раствора N 2 + 6 мл -"- | 4 |



#### <a id="p100302"></a>7.5 Приготовление контрольной концентрации

<div align="center">

бацитрацина

</div>


<a id="p100303"></a>Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина (10 - 20 мг) и растворяют ее в фосфатном буфере pH 6,0 [(буфер N 4)](#p100161) до получения концентрации 100 ед./мл.
<a id="p100304"></a>Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят (рабочее) контрольное разведение, равное 0,2 ед./мл по схеме N 5.

<div align="right">

<a id="p100305"></a>Схема N 5

</div>



<a id="p100306"></a><a id="p100310"></a><a id="p100314"></a>

| N растворов | Соотношение растворов | Концентрация антибиотика, ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | 1 мл основного раствора + 9 мл буфера | 10 |
| 2. | 2 мл раствора N 1 + 8 мл -"- | 2 |
| 3. | 1 мл раствора N 2 + 9 мл -"- | 0,2 |



## 8. <a id="p100315"></a>ПОДГОТОВКА ЧАШЕК ПЕТРИ


<a id="p100316"></a>Колбы с агаром помещают в кипящую водяную баню. Для определения тетрациклинов используется [среда N 3,](#p100098) стрептомицина - [N 4,](#p100107) пенициллина - [N 7,](#p100125) гризина - [N 8,](#p100137) цинкбацитрацина - [N 6.](#p100119) Расплавленный агар охлаждают до определенной температуры и вносят в него необходимое количество взвеси тест-культуры: аспорогенные культуры (Sar lutea, M. flavus) засевают при температуре среды не выше 48 град. C +/- 2 град. C, а споровые (Bac. cereus, Bac. cubtilis, Bac. mycoidis) при 58 град. +/- 2,0 град. C. Среду перемешивают круговыми движениями и разливают в чашки Петри по 10,0 +/- 0,1 мл, установленные строго на горизонтальном столе.
<a id="p100317"></a>После застывания сред под дно чашек подкладывают трафарет (рис. 1 <*>) и пробочным сверлом N 3 (9 мм) вырезают 6 лунок, вырезанные блоки вынимают скальпелем.

<a id="p100318"></a>

---

<a id="p100319"></a><*> Рисунки не приводятся.


## 9. <a id="p100320"></a>ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ



#### <a id="p100321"></a>9.1 Исследование молока, молочных продуктов, яиц


<a id="p100322"></a>Пробы молока и жидких молочных продуктов по 10,0 +/- 0,1 мл, творога по 10,0 +/- 0,1 г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,0 +/- 0,1 мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - [буфер N 3;](#p100154) для стрептомицина - [буфер N 6;](#p100172) пенициллина - [буфер N 5](#p100166) (см. [раздел 5.](#p100145) Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков). Таким образом, получается разведение 1:2.
<a id="p100323"></a>Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,0 +/- 5,0 град. C в течение 10 +/- 0,1 мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,0 +/- 0,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - [буфер N 3,](#p100154) стрептомицина - [буфер N 6.](#p100172)
<a id="p100324"></a>Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,0 +/- 1 мин. при 37 град. C +/- 0,1 град. C, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,0 +/- 1,0 град. C в течение 20,0 +/- 0,1 мин.
<a id="p100325"></a>Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 +/- 100 об./мин. в течение 10,0 +/- 0,1 мин. Надосадочная жидкость является первым разведение (1:2) и готова для внесения в лунки. Второе разведение (1:4) готовят в химических пробирках: 1,0 +/- 0,1 мл надосадочной жидкости приливают к 1,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).
<a id="p100326"></a>В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,05 +/- 0,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2 - 4 чашки Петри, т.е. на каждое разведение по 1 - 2 чашки.
<a id="p100327"></a>После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 20 +/- 2 часа при температуре 29 +/- 1,0 град. C (при определении тетрациклинов и пенициллина) или при 37 +/- 1,0 град. C (при определении стрептомицина).
<a id="p100328"></a>На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах [(п. 10.1).](#p100339)


#### <a id="p100329"></a>9.2 Исследование мяса и мясных продуктов


<a id="p100330"></a>Навески по 10,0 +/- 0,1 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком (предварительно простерилизованным), приливая 20,0 +/- 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - [буфер N 3,](#p100154) цинкбацитрацина - [N 4,](#p100161) гризина - физиологический раствор (0,85% NaCl). При наличии микроразмельчителя тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,0 +/- 0,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмельчителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.
<a id="p100331"></a>Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,5 +/- 0,5 час.
<a id="p100332"></a>При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 65 +/- 5 град. C 30 мин. для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.
<a id="p100333"></a>Центрифугируют пробы при 3000 об./мин. в течение 20 +/- 1 мин.
<a id="p100334"></a>Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем [п. 9.1](#p100321) (когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из нее разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее - по тексту п. 9.1), либо следующим образом:
<a id="p100335"></a>Надосадочную жидкость в количестве 0,05 +/- 0,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2 - 3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при +4 град. C для преддиффузии.
<a id="p100336"></a>Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 18 +/- 0,5 час. при 29 +/- 1 град. C (определение тетрациклинов) либо при 37 +/- 0,1 град. C (определение гризина и цинкбацитрацина), после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах [(п. п. 10.1,](#p100339) [10.2).](#p100382)


## 10. <a id="p100337"></a>УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ


<a id="p100338"></a>Измеряют зоны задержки роста тест-культур и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах либо по таблицам, составленным В.С. Дмитриевой и С.М. Семеновым (Дмитриева В.С., Семенов С.М. "Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов", М., 1965) [(п. 10.1),](#p100339) или по стандартным кривым [(п. 10.2).](#p100382)


#### <a id="p100339"></a>10.1 Форма записи измерения зон задержки роста

<div align="center">

тест-микробов при расчете активности антибиотиков,<br>
содержащихся в виде остаточных количеств в пищевых<br>
продуктах, по таблицам Дмитриевой В.С.

<a id="p100340"></a>(Примерный образец)

</div>



<a id="p100341"></a><a id="p100348"></a><a id="p100352"></a><a id="p100354"></a><a id="p100358"></a><a id="p100360"></a>

<table>
<colgroup><col width="12%"><col width="20%"><col width="23%"><col width="22%"><col width="23%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">N чашки</td><td colspan="4">Диаметры зон задержки роста тест-микробов в мм</td></tr>
<tr><td>испытуемое разведение (1:3)</td><td>стандартное разведение 0,05 ед./мл (контроль)</td><td>испытуемое разведение (1:6)</td><td>стандартное разведение 0,05 ед./мл (контроль)</td></tr>
<tr><td>1</td><td>20 20 19,5</td><td>16,5 16,5 16,5</td><td>16 16 16,5</td><td>16 16 16</td></tr>
<tr><td>среднее</td><td>19,8</td><td>16,5</td><td>16,1</td><td>16</td></tr>
<tr><td>2</td><td>19 19 19,5</td><td>16 16 16</td><td>17,5 17,0 16,5</td><td>16,5 16,5 16,5</td></tr>
<tr><td>среднее</td><td>19,1</td><td>16</td><td>17</td><td>16,5</td></tr>
</table>


<a id="p100361"></a>В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед./мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.


<a id="p100362"></a><a id="p100365"></a><a id="p100368"></a><a id="p100371"></a>

| Разведение | Зоны в мм | Поправки | Зоны после поправки | Среднее 2-х чашек |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 1:3 | 19,8 19,1 | +0,5 +1,0 | 20,3 20,1 | 20,2 |
| 1:6 | 16,1 17,0 | +1,0 +0,5 | 17,1 17,5 | 17,3 |


<a id="p100372"></a>Определяют разность диаметров зон подавления роста при двух разведениях испытуемого препарата:

<a id="p100373"></a>20,2 - 17,3 = 2,9 мм.

<a id="p100374"></a>По таблице, соответствующей этой разности диаметров зон, находят значение активностей соответствующих диаметров зон подавления роста после поправки. В вертикальном столбце находят целые числа, в горизонтальном - десятые доли. Полученные значения умножают на соответствующие показатели разведения (2 и 4; 3 и 6).

<a id="p100375"></a>2,15 ед./мл x 3 = 6,45 ед./мл (зона 20,2)
<a id="p100376"></a>1,08 ед./мл x 6 = 6,48 ед./мл (зона 17,3)

<a id="p100377"></a>

---

<a id="p100378"></a>среднее 12,93 : 2 = 6,465 ед./мл

<a id="p100379"></a>*Пример* расчета. Если контрольная концентрация больше или меньше 1 ед./мл, то надо соответственно умножить или разделить на кратность этого числа 1 (К = 0,05 ед./мл, кратность = 20).

<a id="p100380"></a>6,465 : 20 = 0,323, соответствует 6,465 x 0,05;
<a id="p100381"></a>К = 2 ед./мл - 6,465 x 2 = 12,93 ед./мл.


#### <a id="p100382"></a>10.2 Построение стандартных кривых

<div align="center">

и расчет концентрации антибиотиков

</div>



##### <a id="p100383"></a>10.2.1 Построение стандартной кривой при определении

<div align="center">

концентрации хлортетрациклина

</div>


<a id="p100384"></a>Для построения стандартной кривой используются рабочие растворы с концентрациями: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл приготовленные по схеме N 6.

<div align="right">

<a id="p100385"></a>Схема N 6

</div>



<a id="p100386"></a><a id="p100389"></a><a id="p100401"></a>

| N р-ра | Содержание растворов | Концентрация в ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | 1 мл основного р-ра + 8,3 буфера pH 5,1 +/- 0,1 [(буфер N 2)](#p100150) | 100 |
| 2. | 1 мл р-ра N 1 + 9 мл буфера pH 5,1 +/- 0,1 (буфер N 2) | 10 |
| 3. | 2 мл р-ра N 2 + 5 мл -"- | 4 |
| 4. | 1 мл р-ра N 3 + 9 мл -"- | 0,4 |
| 5. | 5 мл р-ра N 4 + 5 мл -"- | 0,2 |
| 6. | 5 мл р-ра N 5 + 5 мл -"- | 0,1 |
| 7. | 5 мл р-ра N 6 + 5 мл -"- | 0,05 |
| 8. | 5 мл р-ра N 7 + 5 мл -"- | 0,025 |
| 9. | 2 мл р-ра N 7 + 8 мл -"- | 0,01 |


<a id="p100402"></a>В несколько проб (по 5 г) измельченной мышечной ткани или субпродуктов, не обработанных антибиотиками, вносят раствор антибиотика с вышеперечисленными концентрациями в количестве 5 мл. Перемешивают и оставляют на 18 +/- 1 час. при температуре +4 град. C. Затем центрифугируют при 3500 +/- 500 об./мин. в течение 25 мин. Надосадочная жидкость служит стандартом определенной концентрации антибиотика при построении кривой на полулогарифмической сетке (рис. 2). Надосадочную жидкость соответственно 5 - 6 рабочим концентрациям стандартного антибиотика вносят в количестве 0,05 +/- 0,001 мл в 2 - 3 лунки на 2 параллельных чашках Петри с засеянной тест-микробом средой. Инкубируют чашки, как указано в [п. 9.2.](#p100329)
<a id="p100403"></a>Рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микробов для каждой концентрации рабочего раствора стандарта из двух параллельных чашек и наносят их в виде точек на оси абсцисс. Из этих точек, а также из точек на оси ординат, соответствующих концентрациям рабочих растворов 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл, проводят вертикальные и горизонтальные прямые. Линия, соединяющая точки пересечения указанных прямых, - стандартная кривая <*>. Стандартную кривую строят для каждой партии питательной среды.

<a id="p100404"></a>

---

<a id="p100405"></a><*> При отсутствии образцов мышечной ткани и субпродуктов, не обработанных антибиотиками, для построения стандартной кривой можно пользоваться рабочими растворами стандартного хлортетрациклина, приготовленными на [буфере N 2](#p100150) (р-ры 5, 6, 7, 8, 9), непосредственно внося их в лунки на чашке Петри.


##### <a id="p100406"></a>10.2.2 Построение стандартной кривой для определения

<div align="center">

концентрации гризина

</div>


<a id="p100407"></a>Для построения стандартной кривой при определении гризина используются растворы с концентрациями: 1,6; 1,2; 0,8; 0,6; 0,4; 0,3; 0,2, после их контакта с мышечной тканью или субпродуктами. Указанные концентрации гризина делаются на физрастворе (0,85% NaCl) по схеме N 7.

<div align="right">

<a id="p100408"></a>Схема N 7

</div>



<a id="p100409"></a><a id="p100412"></a><a id="p100425"></a>

| N р-ра | Соотношение растворов | Концентрация в ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1. | р-р 1 мл основного р-ра + 9 мл физ. р-ра | 100 |
| 2. | -"- 8 мл 1 р-ра + 2 мл физраствора | 80 |
| 3. | -"- 6 мл 1 р-ра + 4 мл -"- | 60 |
| 4. | -"- 2 мл 2 р-ра + 8 мл -"- | 16 |
| 5. | -"- 1 мл 3 р-ра + 9 мл -"- | 6,0 |
| 6. | -"- 1 мл 4 р-ра + 9 мл -"- | 1,6 |
| 7. | -"- 1 мл 5 р-ра + 4 мл -"- | 1,2 |
| 8. | -"- 4 мл 7 р-ра + 2 мл -"- | 0,8 |
| 9. | -"- 6 мл 8 р-ра + 2 мл -"- | 0,6 |
| 10. | -"- 3 мл 8 р-ра + 3 мл -"- | 0,4 |
| 11. | -"- 3 мл 9 р-ра + 3 мл -"- | 0,3 |
| 12. | -"- 4 мл 11 р-ра + 2 мл -"- | 0,2 |


<a id="p100426"></a>Далее поступают согласно методу, описанному в [п. 10.2.1](#p100383) настоящего раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значение концентраций контрольных растворов гризина, указанных выше.


##### <a id="p100427"></a>10.2.3 Построение стандартной кривой при определении

<div align="center">

концентрации цинкбацитрацина

</div>


<a id="p100428"></a>Для построения стандартной кривой при определении цинкбацитрацина из основного раствора по схеме N 8 с использованием [буфера N 4](#p100161) готовят рабочие растворы с концентрациями: 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,06; 0,03; 0,02 ед./мл.

<div align="right">

<a id="p100429"></a>Схема N 8

</div>



<a id="p100430"></a><a id="p100433"></a><a id="p100435"></a><a id="p100446"></a>

| N р-ра | Соотношение растворов | Концентрация, ед./мл |
| --- | --- | --- |
| 1 | 2 | 3 |
| 1 раствор | 1 мл основного р-ра + 9 мл фосфатного буфера | 10 |
| 2 раствор | 1 мл 1 р-ра + 9 мл фосфатного буфера | 1 |
| 3 -"- | 4 мл 2 р-ра + 1 мл -"- | 0,8 |
| 4 -"- | 1 мл 3 р-ра + 1 мл -"- | 0,4 |
| 5 -"- | 1 мл 4 р-ра + 1 мл -"- | 0,2 |
| 6 -"- | 1 мл 5 р-ра + 1 мл -"- | 0,1 |
| 7 -"- | 6 мл 6 р-ра + 4 мл -"- | 0,06 |
| 8 -"- | 1 мл 7 р-ра + 1 мл -"- | 0,03 |
| 9 -"- | 2 мл 8 р-ра + 1 мл -"- | 0,02 |


<a id="p100447"></a>Приготовление рабочих концентраций антибиотика и построение стандартной кривой производят согласно методу, описанному в п. [10.2.1](#p100383) данного раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значения концентраций контрольных растворов цинкбацитрацина, указанных выше.


##### <a id="p100448"></a>10.2.4 Расчет активности по стандартной кривой


<a id="p100449"></a>Для экстракта (или его значения) исследуемой пробы рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микроба двух параллельных чашек и наносят его в виде точки на оси абсцисс полулогарифмической сетки. Из этой точки восстанавливают перпендикуляр и проводят его до пересечения со стандартной кривой. Через точку пересечения перпендикуляра со стандартной, параллельно оси абсцисс, проводят прямую до пересечения с осью ординат. Точка пересечения параллельной прямой с осью ординат указывает на активность антибиотика в экстракте исследуемой пробы - "С". Если исследовалось разведение экстракта, то полученный показатель его активности умножают на показатель разведения экстракта.
<a id="p100450"></a>Расчет содержания остаточных количеств антибиотиков в 1 г исследованного продукта (в том случае, когда стандартная кривая построена с использованием стандартных растворов, внесенных в гомогенаты мышечной ткани или субпродуктов) ведется по формуле:

<div align="center">

<a id="p100451"></a>X = C x 1,5,

</div>


<a id="p100452"></a>где: X - активность антибиотика в 1 г продукта;
<a id="p100453"></a>C - активность антибиотика в 1 мл экстракта исследуемой пробы;
<a id="p100454"></a>1,5 - степень разведения пробы буфером, отличная от разведения стандартного гомогената.
<a id="p100455"></a>В случае, когда для построения стандартной кривой использовались чистые растворы стандартного антибиотика, расчет ведут по той же формуле, изменив лишь степень разведения пробы буфером на 3, а именно: X = C x 3. В данном случае в ответе указывают, что стандартная кривая построена с использованием чистых растворов антибиотиков.

<div align="center">

<a id="p100456"></a>**ПРИМЕРНАЯ ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ**<br>
**ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ**<br>
**(ОТДЕЛЬНО ПО ВИДАМ АНТИБИОТИКОВ)**

</div>



<a id="p100457"></a><a id="p100464"></a><a id="p100471"></a><a id="p100473"></a>

<table>
<colgroup><col width="20%"><col width="9%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="12%"><col width="12%"><col width="12%"><col width="12%"></colgroup>
<tr><td rowspan="3">Вид исследуемых продуктов</td><td>Общее число</td><td colspan="6">Положительные результаты</td></tr>
<tr><td rowspan="2">проб</td><td rowspan="2">кол-во проб</td><td rowspan="2">в % к общему кол-ву проб</td><td colspan="4">в том числе в ед./мкг/мл/г</td></tr>
<tr><td>0,01 - 0,05</td><td>0,051 - 0,1</td><td>0,11 - 1,0</td><td>1,1 и более</td></tr>
<tr><td>Мясо Мясопродукты Молоко Творог Сметана Яйца</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td>ВСЕГО:</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
</table>


<a id="p100474"></a>*Примечания.* 1. Для каждой новой партии питательной среды необходимо проверять зоны контрольного разведения стандартного раствора антибиотика.
2. <a id="p100475"></a>Для внесения в лунки берется то рабочее (контрольное) разведение антибиотика, которое дает диаметр задержки роста тест-культуры, приблизительно 17 мм (16 - 18 мм).
3. <a id="p100476"></a>Для внесения в лунки испытуемых разведений одной пробы можно пользоваться одной пипеткой, при этом надо начинать с большего разведения (1:4 или 1:6).
4. <a id="p100477"></a>Каждая партия стандарта пенициллина и стрептомицина отличается своей активностью, и поэтому дается примерная схема приготовления рабочего разведения.
5. <a id="p100478"></a>Стандарты антибиотиков и стандарты мутности можно выписать по следующим адресам:
<a id="p100479"></a>а) г. Москва, 121002,
<a id="p100480"></a>Сивцев Вражек, д. 41,
<a id="p100481"></a>Государственный Институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича;
<a id="p100482"></a>б) г. Москва,
<a id="p100483"></a>Звенигородское шоссе, д. 5,
<a id="p100484"></a>Гос. Научно-контрольный институт ветпрепаратов.



<a id="p100485"></a>

---