Методические указания по унифицированному методу иммунофлюоресцентного выявления бакуловирусов в воздухе рабочей зоны
(утв. Минздравом СССР 27.04.1984 № 3024-84)
27 апреля 1984 г. № 3024-84
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО УНИФИЦИРОВАННОМУ МЕТОДУ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ БАКУЛОВИРУСОВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Настоящие Методические указания распространяются на определение содержания в воздухе рабочей зоны полиэдров и гранул бакуловирусов, являющихся действующим началом вирусных инсектицидных препаратов, что необходимо при разработке санитарно-гигиенических регламентов, санитарно-гигиеническом контроле, а также в научных исследованиях.
Краткая характеристика бакуловирусных инсектицидов. Известные в настоящее время отечественные вирусные препараты, разрабатываемые или применяемые в качестве инсектицидов против гусениц вредных насекомых, содержат в качестве действующего начала вирусы насекомых семейства бакуловирусов. Вирусы в препаратах представлены в виде телец-включений типа полиэдров или гранул, размеры от 0,3 — 1,5 мк (полиэдры) и до 0,25 — 0,8 мк (гранулы), в которых содержатся различные количества вирионов. Бакуловирусы обладают выраженной специфичностью в отношении насекомого-вредителя.
Вирусные тельца-включения получают из тканей и больных или погибших от вирусной инфекции гусениц соответствующего вида насекомых.
Вирусные препараты представляют собой концентрат-суспензию полиэдров или гранул в 50-процентном глицерине (жидкие формы) или порошок светло-серого цвета, состоящий из соответствующих компонентов действующего начала и наполнителя (каолин, силикон, тальк и т.д.). Препараты содержат полиэдры в концентрации в 9 10 среднем 1 x 10 пдр/мл, или 1 x 10 грн/мл. Применяются путем
опрыскивания (авиа-, тракторного, ранцевого) при норме расхода 100
- 200 мл препарата на 1 га с добавлением поверхностно-активного вещества ОП-7 из расчета 0,6 — 4,0 г на 10 л воды.
По данным КНИИЭИБ, изученные отечественные вирусные энтомопатогенные препараты вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС, вирин-АББ, вирин-КШ, вирин-диприон не токсичны и не патогенны для человека и теплокровных животных. Изученные энтомопатогенные вирусы не репродуцируются в теплокровном организме, не вызывают явной или скрытой инфекции, безопасны в эпидемиологическом отношении. В условиях производства оказывают сенсибилизирующее действие на организм, что может приводить к развитию иммунопатологических состояний у работающих.
Принцип метода. Метод основан на специфическом взаимодействии антигенов (бакуловирусов) с антителами против полиэдров конкретного вируса. Образовывающийся комплекс, соединенный с флюоресцирующим красителем, выявляется в виде локализованного специфического свечения в лучах сине- и УФ-света на люминесцентных микроскопах.
Методика определения бакуловирусов в воздухе основана на использовании иммунофлюоресценции, широко применяемой в медицинской вирусологии для индикации различных вирусов (метод Кунса, 1941). Применяют непрямой вариант метода.
Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно определить концентрацию телец-включений в 1 куб. м воздуха от
2
0,5 x 10 и более.
Избирательность метода. При использовании качественной гипериммунной антисыворотки против полиэдров или гранул определяемого вируса и устранении неспецифического свечения в исследуемых препаратах-отпечатках метод расценивается как высокоспецифический и чувствительный.
Реактивы и материалы. Ацетон. Хлористый натрий х.ч., 0,85-процентный раствор, pH 7,4 - 7,6. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат. Синька Эванса (C H N Na O ). Меченная ФИТЦ сыворотка против глобулинов 34 24 6 4 144 кролика. Специфическая антибакуловирусная сыворотка против
определяемого вируса.
Приборы и посуда. Люминесцентный микроскоп МЛ-2 или МЛ-3. Окуляр с сеткой. Объект-микрометр. Электроаспиратор ПАБ-1 или ПОВ-1. Аналитические аэрозольные фильтры марки АФА-ВП-10. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки Пастера.
Подготовка к определению. До проведения исследования необходимо подготовить люминесцентный микроскоп. При работе на микроскопах МЛ-2, МЛ-3 используют фильтры ФС-1-2, СС-15-2, БСК-8-2. Запирающий фильтр Т-2Н, объектив 90x, окуляры 8x или 10x, сила тока при микроскопии 4 — 4,5 А.
Для микроскопии следует применять нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат х.ч. Чтобы подсчитать количество телец-включений в исследуемой пробе, необходимо определить с помощью объект-микрометра сторону квадрата окулярной сетки, а затем ее площадь. При отсутствии окулярной сетки с помощью объект-микрометра определяют диаметр поля зрения и затем
2
площадь поля зрения по формуле S = пи r . Найденную величину (площадь окулярной сетки или площадь поля зрения) подставляют в
формулу для определения количества телец-включений в исследуемой пробе (см. ниже).
Отбор проб воздуха. Для отбора проб воздуха применяют приборы ПАБ-1 или ПОВ-1, производительность которых до 150 — 250 л/мин. и 20 — 25 л/мин. соответственно. Эти приборы работают по принципу электростатического или инерционного осаждения частиц аэрозоля из потока исследуемого воздуха на поверхность анализируемых фильтров. Применяют фильтры АФА-ВП-10. Для отсоса воздуха фильтры монтируют на фильтровальной воронке или на патроне для отбора проб пыли и подключают к аспиратору. Рабочая площадь фильтра АФА-ВП-10 равна 10 кв. см. Фильтры изготовлены из перхлорвиниловой ткани ФПП, обладают малым аэродинамическим сопротивлением, что позволяет протягивать воздух с большой скоростью (до 100 л/мин.).
В исследуемых помещениях пробы отбирают в разных местах (5 точек конвертообразно) на уровне 150 — 200 см от пола в зоне дыхания людей. На каждую пробу пропускают не менее 100 л воздуха (5 мин. при скорости 20 л/мин.).
После аспирации воздуха аналитические фильтры снимают, кладут лицевой стороной (с отпечатком аэрозоля) вверх на предметные стекла, которые помещают в чашки Петри на две стеклянные палочки. На дно чашек наливают ацетон и закрывают их. В парах ацетона фильтры обесцвечиваются. Когда фильтр станет прозрачным, предметные стекла с зафиксированными на них отпечатками аэрозоля можно хранить при 4 °C до проведения исследования (не более 30 сут.).
Ход анализа. Исследованию подвергают зафиксированные на предметных стеклах отпечатки аэрозоля, полученные на обесцвеченных аналитических фильтрах. На стекла с отпечатками наносят водный раствор (1:10000) синьки Эванса на 15 мин., затем стекла промывают в проточной воде и подсушивают на воздухе (для ускорения подсушивания можно применять комнатный вентилятор). На высушенный препарат наносят специфическую антиполиэдренную антивирусную иммунную сыворотку в рабочем разведении, выдерживают 20 мин. во влажной камере при 37 °C. Сыворотку смывают в проточной воде, препарат подсушивают и наносят антивидовую меченную ФИТЦ сыворотку на 20 мин. при 37 °C, затем промывают в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентном микроскопе. При наличии в отпечатках телец-включений бакуловирусов они будут выявляться в микроскопе по яркому специфическому желто-зеленому свечению. Более интенсивно светятся тельца-включения по их периферии в виде яркого ободка полиэдров или гранул на общем красноватом фоне препарата.
В случае получения отпечатков на нескольких фильтрах можно проводить окраску каждого или группы отпечатков разными специфическими иммунными сыворотками и таким образом осуществлять экспресс-идентификацию выявляемого бакуловируса. Этим способом также выявляется степень серологического родства видов бакуловирусов.
Обработка результатов анализа. Кроме визуального определения телец-включений бакуловирусов (качественный анализ) можно провести количественный анализ на единицу объема.
Подсчитывают число телец-включений в 100 — 500 полях зрения, при этом общее количество подсчитанных частиц должно быть не менее 400. Затем определяют среднее количество включений в одном поле зрения или в одном квадрате окулярной сетки.
Число включений в 1 куб. м воздуха (M) определяют по формуле:
aSn
a — среднее число включений в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
S — площадь мембранного фильтра, кв. мм;
V — объем пропущенного воздуха, приведенный к нормальным условиям, л;
S — площадь квадрата окулярной сетки (поле зрения); 1
n — переводной коэффициент на 1 куб. м, равный 10.
Пример. Для анализа получены предметные стекла с отпечатками аэрозоля. Препараты покрасили по непрямому методу Кунса, как описано выше. При просмотре препаратов под люминесцентным микроскопом установлено, что в одном квадрате окулярной сетки обнаруживается в среднем 0,5 включений со специфическим свечением (полиэдров); a = 0,5. Сторона квадрата окулярной сетки при объективе 90x, окуляре 8x равна 0,12 мм (определили с помощью объект-микрометра). Площадь квадрата окулярной сетки S = 0,0144 1 4 кв. мм; площадь мембранного фильтра S = 10 кв. см, т.е. 10 кв.
мм; объем пропущенного воздуха V = 100 л; n = 10.
Определяем число включений в 1 куб. м воздуха:
4
0,5 x 10 x 10
M = -------------- = 34722,2. 100 x 0,0144
Таким образом, в 1 куб. м воздуха рабочей зоны содержится 4 около 3,5 x 10 определяемых полиэдров.
Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые при работе с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).