Методические указания по определению остаточных количеств препарата вирин-диприон на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом
(утв. Минздравом СССР 12.05.1983 № 2799-83)
12 мая 1983 г. № 2799-83
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРЕПАРАТА ВИРИН-ДИПРИОН
НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ <*>
<*> Подготовили В.Л. Васильева, В.И. Трусов (КНИИЭИБ).
Характеристика препарата. Вирусный препарат вирин-диприон предназначен для борьбы с личинками рыжего соснового пилильщика (РСП) I - III возрастов. Действующее начало препарата - вирус ядерного полиэдроза (ВЯП) кишечного типа, содержащийся в
тельцах-включениях (полиэдрах). Препарат жидкой формы представляет
собой концентрат-суспензию полиэдров темно-серого цвета с беловатым осадком при отстое, состоящим главным образом из полиэдров. Размер полиэдров колеблется от 0,5 до 4 мк, титр 1 x
10 10 пдр/мл. Применяется путем наземного или авиационного опрыскивания сосновых насаждений, пораженных вредителями.
Принцип метода. ИФ-метод выявления остаточных количеств вирусного препарата основан на явлении иммунофлюоресценции, широко используемом в медицинской вирусологии для идентификации микроорганизмов. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров ВЯП рыжего соснового пилильщика) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем ФИТЦ. Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентном микроскопе в виде специфического свечения комплекса антиген — антитело (яркое желто-зеленое свечение полиэдров).
Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно 2 определить от 1 x 10 и более полиэдров в 1 мл субстрата.
Избирательность метода. При условии применения качественных гипериммунных антиполиэдренных сывороток и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфический и высокочувствительный. При условии централизованного изготовления специфической антисыворотки ИФ-метод является экспрессным.
Отбор проб. Если проба состоит из мелких растительных объектов
(хвоя, трава, листья, ягоды), из них готовят навеску 200 - 300 г, помещают в широкогорлые банки, доливают 200 - 300 мл
физиологического раствора с pH 7,4 — 7,6, энергично встряхивают 10
- 15 мин., отстаивают 10 мин., надосадок центрифугируют при -1
скорости вращения 5 тыс. мин. , осадок ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды. Для дальнейшей работы суспензию можно
хранить при температуре 4 °C до 3 сут.
Реактивы и материалы, приборы и посуда. Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика, изготовленная Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ВЯП РСП. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат. Дистиллированная вода. Физиологический раствор (0,15 М NaCl) с pH 7,4 — 7,6. Ацетон. Мертиолат натрия или борная кислота. Синька Эванса. Антибиотики — пенициллин, стрептомицин, 5-нитрооксихинолин. Люминесцентный микроскоп марки МЛ-2 или МЛ-3. Центрифуга ПЛС-1 и др. Пипетки градуированные на 1 и 5 мл. Чашки Петри. Предметные стекла.
Подготовка к определению. Основные реагенты в данном определении — иммунная сыворотка против ядерного полиэдроза рыжего соснового пилильщика, являющегося действующим началом препарата вирусного инсектицида вирин-диприон, а также меченная ФИТЦ сыворотка против глобулинов кролика. Последняя сыворотка изготовляется в Институте им. Н.Ф. Гамалеи. Что касается иммунной сыворотки, то для проведения анализа рекомендуется самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам из препарата вирин-диприон по следующей схеме.
Полиэдры для иммунизации животных извлекают непосредственно из препарата вирин-диприон, можно получать их из больных гусениц соответствующего вида. Очистку и концентрацию полиэдров ведут методами дифференциального центрифугирования и в градиенте плотности сахарозы.
Взвесь полиэдров за сутки до введения животным обрабатывают антибиотиками из расчета 500 - 1000 ед. стрептомицина и пенициллина и 20 мкг/мл 5-нитрооксихинолина. Перед иммунизацией
взвесь стерильно отмывают от антибиотиков, полиэдры ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе. Титр инокулята обычно 9
составлял 1 x 10 пдр/мл. Приготовленным антигеном иммунизируют беспородных кроликов массой по 2,5 - 3 кг по следующей схеме.
Инъекции проводят внутривенно трижды с недельным интервалом по 1,5
- 2,0 — 2,5 мл, реиммунизацию — через 4 недели внутривенно 2,5 мл.
Кровь берут через 10 дней после реиммунизации. Сыворотку хранят с добавлением консерванта (мертиолат 1:10000) при -20 °C. Лучше сыворотку лиофилизировать и хранить при 4 °C. В этих условиях
высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет.
Ход анализа. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 кв. см. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяя ее по отмеченной площади. Препарат подсушивают на воздухе, для фиксации опускают в ацетон на 15 мин., после чего окрашивают синькой Эванса для гашения неспецифического свечения. Используют синьку Эванса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки препарата синькой 10 мин., затем его промывают проточной водой и подсушивают, после чего он должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят антиполиэдренную иммунную сыворотку против ВЯП РСП, предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором, помещают на 20 мин. при 37 °C во влажную камеру, затем смывают проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего наносят ослиную меченную ФИТЦ сыворотку против глобулинов кролика в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают 20 мин. в термостате при 37 °C во влажной камере с последующим промыванием в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентный микроскоп. Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее иммерсионное масло, объектив 90, окуляр 8x. Полиэдры в препарате выявляются по специфическому свечению ярко-желто-зеленого ободка на общем красном фоне.
Контроль: а) препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сывороткой; б) препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных полиэдров. В контрольных препаратах свечения полиэдров не выявляется.
Обработка результатов анализа. Число полиэдров в 1 мл исследуемой суспензии (концентрат смыва со 100 кв. см поверхности или 200 — 300 г навески) M вычисляют по формуле:
aS
a — среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;
S — площадь исследуемого мазка, кв. мм;
V — объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
S — площадь квадрата окулярной сетки, кв. мм. 1
Полиэдры подсчитывают в 100 и более квадратах окулярной сетки.
Пример. Для анализа взяли навеску хвои 200 г с обработанного препаратом дерева, поместили в колбу. Добавили 200 мл подщелоченного физиологического раствора. Встряхивали 15 мин. Затем профильтровали, отцентрифугировали, ресуспендировали осадок в 1 мл дистиллированной воды. Из суспензии приготовили мазок на предметном стекле, как описано выше. При просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали общее число полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки:
SUM = 320, отсюда a = 320 : 150 = 2,13. 150
Площадь мазка известна: S = 20 мм x 20 мм = 400 кв. мм. Сторона квадрата окулярной сетки равна 0,0062 мм (определили с помощью объект-микрометра), т.е. площадь квадрата окулярной сетки
2
S = (0,0062) = 0,00004 кв. мм. 1
Объем нанесенной на стекло суспензии V = 0,02 мл. 9
Таким образом, M = (2,13 x 400) / (0,02 x 0,0004) = 1,1 x 10 , 9 т.е. на 100 кв. см обследованной площади приходится 1,1 x 10 7 полиэдров, на 1 кв. см площади — 1,1 x 10 .
Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы.