Методические указания по определению фадеморфа в вишне, огурцах, смородине, яблоках, воде хроматографическими методами

(утв. Минздравом СССР 30.03.1981 № 2366-81)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФАДЕМОРФА В ВИШНЕ, ОГУРЦАХ, СМОРОДИНЕ,

---

<*> Разработаны Д.Б. Гиренко, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС).

Краткая характеристика препарата. Фадеморф — N-(1-формиламино-

2,2,2-трихлорэтил)морфолин.       Брутто-формула      C H O N Cl .
                                                       7 6 2 2  3
Молекулярная  масса 214,5.  Общепринятое  название  - триморфамид.
Химически чистый  препарат  - белое кристаллическое вещество  с т.
пл.  116 - 117 °C.  Растворимость,  г/л:  вода  -  3  (при 10 °C);
толуол  -  100  (при  13 °C); этанол - 1200 (при 23 °C);  ацетон -

600 (при 15 °C).

ДСД 0,05 <> мг/кг. МДУ 0,2 <> (яблоки), 0,1 <> (виноград), 0,2 <> мг/кг (огурцы).

---

<*> Временный норматив.

Принцип метода. Метод основан на извлечении триморфамида из анализируемой пробы органическим растворителем, очистке экстракта в системе жидкость — жидкость и последующем определении хроматографическими методами.

Таблица 161

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Объект исследования	Среднее значение определения, %	Относительное стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего при p = 0,95, n = 3, %
Вода Вишня Яблоки	87 74 72	+/- 2,3 +/- 3,1 +/- 3,8	+/- 3,0 +/- 4,7 +/- 5,1

Примечание. Предел определения: для воды — 0,005 мг/л; растений — 0,02 мг/кг.

Реактивы и растворы. Для экстракции. Ацетон х.ч. Хлороформ ч. Хлороводородная кислота, 10-процентный раствор. Сульфат натрия безводный ч.

Для метода ТСХ. Силикагель для хроматографии КСК. Сульфат кальция ч.д.а. Марганцовокислый калий, 3-процентный раствор. Хлорирующий раствор — смесь равных объемов 2-процентного раствора марганцовокислого калия и 10-процентного раствора хлороводородной кислоты. Готовить под тягой. Проявляющий реагент: 0,1 г о-толидина растворяют в 0,5 мл уксусной кислоты; 0,4 г KI растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Растворы объединяют и разбавляют водой до 100 мл.

Для ГЖХ. Неподвижная фаза 5% SE-30 на хроматоне N-AW или любая аналогичная неполярная фаза. Основной стандартный раствор триморфамида 200 мкг/мл в ацетоне. Хранят в холодильнике в течение 2 мес. Стандартные растворы триморфамида — 1 и 5 мкг/мл в ацетоне. Хранят в холодильнике в течение 2 недель.

Приборы и посуда. Ротационный вакуумный испаритель. Колбы конические на 250 мл. Воронки: химические; делительные. Пипетки. Цилиндр с делениями. Пластинки стеклянные размером 9 x 12 см. Микропипетки. Пульверизатор стеклянный. Камера для хроматографирования. Микрошприцы на 10 мкл. Хроматограф с ДЭЗ или ДПР. Колонка стеклянная, диаметр 3 мм, длина 1 м. Азот газообразный особой чистоты.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. Среднюю пробу овощей и фруктов 25 г (вишня, огурец, смородина и др.) размалывают и помещают в коническую колбу. Пробу заливают 50 мл смеси ацетон — вода (1:1), встряхивают в течение 30 мин. Экстракцию повторяют дважды. Фильтруют раствор в делительную воронку, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, подкисляют водный раствор хлороводородной кислотой до pH 3 — 3,5 и из водного раствора реэкстрагируют фадеморф хлороформом дважды порциями по 30 мл. Органический растворитель (хлороформ) отделяют, сушат безводным сульфатом натрия, упаривают до объема 0,2 — 0,3 мл, досуха доупаривают на воздухе. Остаток в колбе растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют (методы ГЖХ и ТСХ).

Пробу воды (200 мл) помещают в делительную воронку, подкисляют хлороводородной кислотой до pH 3 — 3,5 и экстрагируют фадеморф дважды хлороформом порциями по 20 мл. Экстракт объединяют, сушат безводным сульфатом натрия, упаривают до объема 0,2 — 0,3 мл досуха на воздухе. Остаток в колбе растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют (методы ГЖХ и ТСХ).

    Метод  ГЖХ.  Носитель  -  хроматон   N-AW  (0,16  -  0,20  мм)
силанизированный.  Неподвижная  фаза  -  5%  SE-30 (основная). Для
дополнительной  идентификации  хроматографирование можно проводить
на  колонке  длиной  1  м с неподвижной фазой 15% карбовакса 20 М.

                                                       -12

Скорость  азота  70  мл/мин.  Шкала   электрометра  20 x 10     А.
Линейный  диапазон  детектирования  0,1  -  4 нг. Температура, °C:

колонки — 170; испарителя — 200; детектора — 200.

При указанных температурных условиях время удерживания фадеморфа составляет: на фазе SE-30 — 3,3 мин.; на фазе карбовакс 20 М — 6,1 мин. Вводимый объем 2 — 5 мин.

Обработка результатов анализа при ГЖХ. Количественное определение проводят путем сравнения рассчитываемого пика с пиком, полученным при введении известного количества стандартного раствора, при условии, что пики близки по величине и определение ведется в диапазоне линейности детектора.

Количественную оценку хроматограммы проводят по площади пика, рассчитывая ее как произведение высоты пика на ширину, измеренную на половине высоты.

Количество препарата в пробе (X, мг/кг или мг/л) определяют по формуле:

                          C  V S
                           ст 2

X = ------, S V P ст 1

где:

C — количество препарата во введенном в хроматограф ст стандартном растворе, нг;

S, S — площади пиков соответственно стандартного раствора ст фадеморфа, введенного в хроматограф, и исследуемого раствора, кв. мм;

V — объем экстракта, введенный в хроматограф, мкл; 1

V — общий объем экстракта после упаривания, мл; 2

P — масса или объем анализируемой пробы, г или мл.

Метод ТСХ. Пробу, сконцентрированную до 0,3 мл, с помощью микропипетки количественно переносят на хроматографическую пластинку, смывая колбу эфиром. На эту же пластинку наносят 3 и 6 мкг фадеморфа. Помещают пластинку в камеру, в которую за 30 мин. до хроматографирования налита смесь гексан — ацетон (1:1). После поднятия фронта растворителя на 10 см пластинку вынимают, дают испариться растворителю.

    Помещают  пластинку  в эксикатор на  3  -  5 мин.,  содержащий
хлорирующую  смесь,  затем  высушивают 10  - 15 мин. (для удаления
хлора)   при   комнатной   температуре.   После   высушивания   ее
обрабатывают   раствором   о-толидина.   Фадеморф  проявляется  на
хроматограмме  в виде ярко-синего пятна. Нижний предел обнаружения
1 мкг. Величина R  0,75 +/- 0,05.

             f

Содержание препарата в пробе (X, мг/кг или мл/л) определяют по формуле:

                              A

X = -, P

где:

A — количество препарата, найденное путем сравнения размера и интенсивности пятен пробы и стандартного раствора, мкг;

---