--- title: "\"Методические указания по определению гранул вируса гранулеза яблонной плодожорки на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом\"" number: "2352-81" issuer: "Министерство здравоохранения СССР" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-2352-81" --- ## "Методические указания по определению гранул вируса гранулеза яблонной плодожорки на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом" # "Методические указания по определению гранул вируса гранулеза яблонной плодожорки на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом" (утв. Минздравом СССР 30.03.1981 N 2352-81)
Утверждены
Минздравом СССР
30 марта 1981 г. N 2352-81 **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРАНУЛ ВИРУСА ГРАНУЛЕЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ**
**НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ <*>**
--- <*> Подготовили В.И. Касьяненко, В.И. Трусов, В.Л. Васильева, А.С. Нещерет (КНИИЭИБ). Краткая характеристика препарата. Вирин-ГЯП - вирусный энтомопатогенный препарат - вирусный инсектицид. Предназначается для борьбы с гусеницами яблонной плодожорки в яблоневых садах. Действующее начало препарата - вирус гранулеза семейства бакуловирусов, находящийся в препарате в белковых тельцах-включениях сферической формы (гранулах), образующихся в клетках тканей больных вирозом гусениц. Размеры гранул 393,9 x 207,7 нм. Гранулы содержат одну, реже две вирусные частицы (вирионы). Препарат - водная суспензия гранул с титром не менее 9 1 x 10 грн/мл. Применяется путем опрыскивания яблоневых деревьев против гусениц всех возрастов. Вирин-ГЯП не опасен для позвоночных животных с точки зрения возможной инфекционности или токсичности при однократном или множественном воздействии различных доз препарата. В связи с низкой токсичностью ЛД не определяется. Пероральное введение 50 даже максимальных доз не приводит к гибели животных. Принцип метода. Метод основан на специфической реакции взаимодействия антигена (гранулы) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентный микроскоп в виде специфического ярко-зеленого свечения комплекса антиген - антитело ободка гранул. При условии изготовления качественных иммунных антигранулезных сывороток иммунофлюоресцентный метод является экспресс-методом, высокочувствительным и специфичным. Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно 2 11 определить от 1 x 10 до 1 x 10 гранул в 1 мл субстрата. Реактивы и материалы. Ацетон. Хлорид натрия (pH 7,1 - 7,2), 0,85-процентный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Мертиолят. Меченная изотиоционатом флюоресцеина ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовленная в Институте эпидемиологии и микробиологии им. И.Ф. Гамалеи). Специфическая антигранулезная кроличья сыворотка. Адъювант Фрейнда. Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Окулярная сетка. Объект-микрометр. Центрифуга (до 12 тыс. об./мин.). Термостат (37 °C). pH-Метр. Колбы. Пробирки бактериологические. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские. Способ приготовления иммунных сывороток в лабораторных условиях. В качестве инъекционного материала используют суспензию 9 очищенных гранул в растворе NaCl с титром не менее 1 x 10 грн/мл. Гранулы извлекают из препарата вирин-ГЯП следующим образом. Препарат диспергируют на магнитной мешалке в течение 20 мин. Затем проводят дифференциальное центрифугирование при 1,5 тыс. об./мин. для осаждения крупных частиц тканей гусениц 15 мин. Супернатант отсасывают пипеткой, размешивают на магнитной мешалке и центрифугируют при 2,5 тыс. об./мин. для осаждения микроорганизмов 10 мин. Осаждают гранулы центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 1 ч. Осадок гранул ресуспендируют в физиологическом растворе и полученную суспензию обрабатывают антибиотиками из расчета 500 - 1000 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл взвеси. Перед инъекцией взвесь гранул отмывают от антибиотиков центрифугированием при 12 тыс. об./мин. и ресуспендируют в стерильном 0,85-процентном растворе NaCl. Одна из возможных схем иммунизации следующая: 3-кратное с интервалом в 3 дня подкожное обкалывание. При первой инъекции вводится 2 мл смеси антигена с адъювантом (1:1), при второй - 4 мл, при третьей - 6 мл смеси. Реиммунизация через 2 недели. Одна инъекция 6 мл смеси подкожно. Забор крови через неделю после реиммунизации. Сыворотку надо хранить с консервантом (мертиолят 1:10000) при температуре 20 °C либо лиофилизировать. При отсутствии адъюванта и ограниченном количестве вируса можно рекомендовать следующий способ иммунизации: 2-кратное субконъюнктивальное введение с недельным интервалом. Реиммунизация через месяц. При каждой инъекции вводят по 0,5 мл суспензии гранул под конъюнктиву каждого глаза. Подготовка к определению. Накануне исследования следует отъюстировать микроскоп, установить фильтры. Для подсчета гранул по форме, приводимой ниже, необходимо с помощью объект-микрометра определить сторону квадрата окулярной сетки, затем и ее площадь (S). При отсутствии окулярной сетки определяют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения и вычисляют площадь его по формуле: 2 S = пи r . Отбор проб. Пробы с растительных объектов (листья, плоды) отбирают в стерильные бумажные пакеты. Площадь поверхности плодов (яблок) определяют по формуле: 2 S = пи r . Площадь поверхности листьев определяют следующим образом. Обводят на бумаге контур листа. По крайним точкам контура строят прямоугольник и измеряют его площадь. Затем определяют массу прямоугольника и массу вырезанного контура листа. Из полученной пропорции вычисляют площадь листа. Из листьев делают нарезки и помещают их в колбу с подщелоченным 0,85-процентным раствором NaCl в соотношении 1:10. Колбу энергично встряхивают 10 - 15 мин., отстаивают 10 мин., надосадок центрифугируют 1 ч при 12000 об./мин., ресуспендируют в 1 мл воды. Пробы с плодов можно брать методом смыва. Для этого пинцетом берут салфетку 5 x 5 см, смазывают в 0,85-процентном растворе NaCl (pH 7,4 - 7,6), избыток отжимают и тщательно протирают исследуемую площадь. Затем салфетку переносят в колбу с раствором NaCl (100 мл), энергично встряхивают 3 - 5 мин., салфетку отжимают пинцетом и удаляют. Полученные смывы фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, затем центрифугируют при 5 тыс. об./мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды. Ход анализа. Аликвоту исследуемой суспензии 0,02 мл наносят на заранее размеченное предметное стекло площадью 4 кв. см. Высушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 10 мин. Для гашения неспецифического свечения препарат обрабатывают синькой Эванса, для чего используют ее водный раствор в разведении 1:10000. Время обработки не менее 10 мин. Препарат промывают в проточной воде, высушивают на воздухе. Препарат должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят иммунную сыворотку против гранул яблонной плодожорки, предварительно разведенную 1:10 0,85-процентным раствором NaCl. Помещают в термостат во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) при 37 °C. Через 20 мин. сыворотку смывают проточной водой, препарат подсушивают на воздухе, после чего наносят ослиную антикроличью меченную ФИТЦ сыворотку в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают в термостате 20 мин. с последующим промыванием в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру, который можно проводить в любом люминесцентном микроскопе, а также в обычном световом с применением опак-иллюминатора и люминесцентной установки ОИ-17, ОИ-18. Изложенный метод окраски позволяет выяснить даже единичные гранулы по их специфическому свечению. Ободок гранул имеет ярко-зеленое свечение на общем темном фоне препарата. Контролем служат: препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической сыворотки; препараты, приготовленные из проб, взятых на необработанных участках. Обработка результатов анализа. Число гранул на 1 кв. см исследуемой поверхности (M), определяют по формуле: aSn M = -----, S VS 1 п где: a - среднее число гранул в одном квадрате окулярной сетки; S - площадь мазка, кв. мм; S - площадь квадрата окулярной сетки (площадь поля зрения), 1 кв. мм; V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл; S - площадь исследуемой поверхности, кв. см; п n - разведение. Гранулы подсчитывают не менее чем в 50 квадратах окулярной сетки. Пример. Для анализа взяли лист с обработанного препаратом дерева. Определили площадь его поверхности: S = 70 кв. см x 2 = п 140 кв. см (70 кв. см - площадь одной стороны листа). Сделали смыв с листа и обработали описанным способом. Полученный препарат покрасили. При просмотре препарата из смыва в люминесцентном микроскопе подсчитали общее количество гранул в 50 квадратах окулярной сетки (SUM = 335). Отсюда 50 SUM 50 335 a = ----- = --- = 6,7. 50 50 Площадь мазка S = 20 мм x 20 мм = 400 кв. мм. Площадь квадрата окулярной сетки определили с помощью объект-микрометра (S = 0,01 кв. мм). Объем нанесенной на стекло суспензии V = 0,02 мл. Разведение n = 1, т.к. полученный осадок гранул из смыва ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды. 6,7 x 400 4 M = ----------------- = 9,8 x 10 гранул на 1 кв. см. 0,01 x 0,02 x 140 Требования безопасности. При работе по определению остаточных количеств препарата вирин-ГЯП на растительных объектах соблюдаются общепринятые санитарно-гигиенические правила, рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные). ---