Методические указания по определению ДДВФ в молоке, органах и тканях животных методом газожидкостной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 28.01.1980 № 2136-80)

28 января 1980 г. № 2136-80

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДДВФ В МОЛОКЕ, ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ

---

<*> Разработаны С.М. Тихомировым, В.А. Жаровым (ВНИИВЭА).

Краткая характеристика препарата приведена в Унифицированной методике.

ДСД — 0,004 мг/кг. В молоке, мясе и других продуктах животного происхождения не допускается содержание остатков ДДВФ.

ДДВФ широко применяют для борьбы с мухами и кровососущими двукрылыми насекомыми.

Принцип метода. Метод основан на извлечении ДДВФ из исследуемого материала ацетоном или его водными растворами; очистке путем использования разной растворимости пестицида и коэкстрактивных веществ в водных растворах этанола; переэкстракции в диэтиловый эфир и газохроматографическом определении с применением ТИД.

Метрологическая характеристика. Диапазон определяемых концентраций 0,005 — 3,20 мг/кг (л). Нижняя граница определения 0,12 нг в пробе или 0,005 мг/кг (л). Процент определения для концентраций 0,01; 0,2; 1,8 мг/кг (л) (при p = 0,95 и n = 12) 70 +/- 8; 72 +/- 5; 74 +/- 5% соответственно.

Избирательность метода. Определению ДДВФ не мешают пестициды, применяемые в настоящее время в животноводстве или рекомендуемые для широких производственных испытаний. Пестицид может быть обнаружен в молоке и тканях животных, обработанных хлорофосом или дибромом, так как из этих соединений в результате метаболических превращений может образоваться ДДВФ.

Реактивы и растворы. Азот газообразный особой чистоты. Ацетон х.ч. и его 80-процентный водный раствор. Водород электролитический, полученный с помощью прибора СГС-2. Гексан х.ч. ДДВФ, 80-процентный технический концентрат. Смесь диэтилового эфира и гексана в объемном соотношении 2:3. Стандартный раствор ДДВФ. Спирт этиловый 96-процентный и его 30-процентный водный раствор. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Уголь активированный АГ-2. Эфир диэтиловый х.ч. Инертон AW (0,200 — 0,250 мм) с 15% E-301 или хроматон N-AW-DMCS (0,200 — 0,250 мм) с 20% SE-30.

Приборы и посуда. Хроматограф «Цвет-106» или аналогичный с ТИД. Колонка хроматографическая стеклянная длиной 1 м, диаметром 3 мм, заполненная инертоном A с 15% E-301 или хроматоном N-AW-DMCS с 20% SE-30. Вакуумно-ротационный испаритель. Аппарат для встряхивания. Центрифуга типа ЦЛР-1. Гомогенизатор или измельчитель тканей. Микрошприц на 10 мкл МШ-10. Система газоснабжения типа СГС-2. Весы аналитические лабораторные. Бюретки на 2 и 20 мл с ценой деления 0,01 мл. Воронки делительные. Капилляры стеклянные с запаянным концом длиной 12 — 15 см. Колбы мерные на 100 мл и плоскодонные на 150 мл с притертой пробкой. Пипетки на 1; 5 и 10 мл. Пробирки на 10 мл с притертыми пробками и с делениями. Прибор для перегонки под вакуумом жидкостей с высокой температурой кипения. Стаканы химические на 100 мл. Чашки выпарительные на 100 мл. Фильтры бумажные широкопористые.

Подготовка к определению. Получение очищенного ДДВФ. Очищенный ДДВФ с содержанием 97 +/- 1,5% основного вещества получают из 80-процентного технического концентрата путем трехкратной перегонки при температуре не выше 110 °C под вакуумом (при давлении 6,67 — 133,32 гПа). При первой перегонке отбрасывают первые порции перегнанной жидкости (1/3 от взятого для перегонки концентрата). Перегонку основной фракции прекращают после резкого понижения давления. При второй и третьей перегонках отбрасывают первые порции (1/5 и 1/10 дистиллята соответственно).

Приготовление стандартных растворов. Для приготовления основного раствора в мерной колбе на 100 мл взвешивают три капли очищенного ДДВФ (40 — 50 мг) с точностью до 0,0002 г. Растворяют соединение в 30 — 40 мл диэтилового эфира, затем доливают растворитель до метки. Колбу закрывают пробкой и тщательно перемешивают содержимое. Основной раствор хранят в холодильнике. При хорошей герметичности колбы срок хранения раствора 30 сут.

Для приготовления рабочего раствора рассчитывают объем основного раствора, содержащего 500 мкг ДДВФ. Это количество основного раствора с точностью до 0,005 мл вносят в мерную колбу на 100 мл. Затем доводят общий объем до метки диэтиловым эфиром и тщательно перемешивают содержимое. Концентрация ДДВФ в рабочем растворе равна 5 нг/мкл. Срок хранения в холодильнике 10 сут.

Для приготовления стандартных растворов с помощью бюретки вносят в мерные колбы на 100 мл 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 16 мл рабочего раствора с точностью 0,01 мл. Доливают в колбу диэтиловый эфир до метки и тщательно перемешивают содержимое. Получают стандартные растворы ДДВФ концентрацией 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 нг/мкл. Растворы хранят в холодильнике не дольше 10 сут.

Кондиционирование хроматографической колонки. Вновь приготовленную колонку продувают азотом особой чистоты (35 мл/мин.) при температуре 240 °C в течение 8 ч.

Отбор и хранение проб. Поступившие для анализа органы и ткани животных сразу помещают в морозильную камеру холодильника (температура минус 5 — 16 °C), где их можно хранить не дольше 5 сут. Для анализа органы и ткани разрезают на небольшие кусочки (не более 0,2 г) ножом или ножницами, тщательно перемешивают. Отбирают средние пробы, из которых берут навески 25 г с точностью 0,01 г.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. Пробу органа или ткани (кроме жировой ткани) переносят в сосуд микроизмельчителя тканей. Приливают 25 мл 80-процентного водного раствора ацетона и включают прибор при больших оборотах ротора на 5 мин. Затем приливают к пробе еще 50 мл ацетона той же концентрации и включают прибор на 5 мин. при малых оборотах ротора. Для более полной денатурации белков содержимое сосудов нагревают на водяной бане до начала кипения, а затем охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры.

Пробу жировой ткани растирают в ступке со стеклянным песком и переносят в колбу на 150 мл. Ступку обмывают тремя порциями чистого ацетона по 25 мл, которые приливают к пробе. Жиры растворяют в ацетоне при встряхивании на аппарате в течение 30 мин. В колбу приливают 25 мл охлажденной дистиллированной воды.

Пробу молока вносят в центрифужную пробирку и приливают 75 мл ацетона. Оставляют на 15 мин., периодически стеклянной палочкой перемешивая содержимое пробирки.

В последующем ацетоновые экстракты из молока, органов и тканей отделяют от взвешенных частиц центрифугированием в течение 15 мин. при скорости вращения 2000 об./мин. и при температуре в роторной камере в пределах минус 7,5 — 8,5 °C и фильтрованием через широкопористый бумажный фильтр. Ацетон из фильтрата отгоняют с помощью ротационного вакуумного испарителя при температуре 40 +/- 1 °C и давлении 266,64 — 306,64 гПа в течение 7 мин. Водную фазу переносят в делительную воронку на 150 мл, приливают 60 мл смеси диэтилового эфира с гексаном и встряхивают на аппарате 30 с (120 встряхиваний в 1 мин.). Слоям дают разделиться. Нижний слой сливают и отбрасывают. Верхний слой сливают через горловину воронки в выпарительную чашку, куда предварительно вносят 5 мл 30-процентного этанола.

Растворители испаряют под тягой вытяжного шкафа до образования беловатой пленки на поверхности водно-спиртового раствора, продувая над чашками сухой чистый воздух. Для очистки воздух пропускают через слой (40 см) индикаторного силикагеля и слой (20 см) активированного угля марки АГ-2. Водно-спиртовой остаток переносят на складчатый фильтр и фильтруют в делительную воронку на 50 мл. Выпарительную чашку обмывают 3 мл 30-процентного этанола, который также переносят на фильтр.

К собранному фильтрату добавляют 4 мл дистиллированной воды, 10 мл диэтилового эфира и извлекают ДДВФ встряхиванием 30 с при ранее описанных условиях. Нижний слой после разделения сливают и отбрасывают. К эфирному экстракту добавляют 0,5 — 0,7 г безводного сульфата натрия и оставляют на 5 мин., периодически помешивая содержимое. Обезвоженный экстракт сливают в пробирки с притертыми пробками. Сульфат натрия в воронке промывают 2 мл диэтилового эфира, который приливают к основному экстракту. В пробирку помещают стеклянный капилляр, запаянный в верхней части, и испаряют растворитель до объема 5 мл при температуре 36 °C. Пробирки закрывают пробками и для уменьшения испарения эфира помещают в дробленый лед. В хроматограф вводят 1 — 4 мкл очищенного экстракта.

Если высота пика занимает более 75% ширины бумаги самописца, допустимо разбавление конечного экстракта до 10 мл.

    Условия  хроматографирования.  Хроматограф  "Цвет-106"  с ТИД.
Скорость   протяжки   ленты  самописца  200  мм/ч.  Рабочая  шкала

                -10

электрометра  2 x 10    А. Основная колонка - стеклянная, длиной 1
м  с  внутренним  диаметром 3  мм, заполнена инертоном A  (0,200 -
0,250  мм) с 15% E-301. Температурные режимы: испарителя - 220 °C,
колонки  -  180  °C.  Скорость газа-носителя (азота) - 20 мл/мин.,
водорода  -  18 - 20, воздуха - 299 мл/мин. Время удерживания ДДВФ
2,4  мин. Линейный динамический диапазон детектирования 0,02 - 0,8
нг.  Альтернативная  колонка  заполнена хроматоном N-AW-DMCS с 20%
SE-30.  Температурные  режимы:  испарителя  -  230 °C,  колонки  -
200 °C.  Время  удерживания  ДДВФ  1,2  мин. Линейный динамический
диапазон детектирования  0,02 - 0,8 нг.  Остальные параметры такие

же, как и для основной колонки.

Обработка результатов анализа. Содержание ДДВФ в анализируемой пробе (X, мг/кг) находят по формуле:

                        H C  V
                         p ст

X = -------, H V PK ст а

где:

H — высота пика анализируемой пробы, мм; p

H — высота пика стандарта, мм; ст

C — содержание пестицида в стандарте, нг; ст

V — объем раствора, из которого отбирают аликвоту для инъекции, мл;

V — объем аликвоты, которую вводят в хроматограф, мкл; а

P — навеска анализируемого образца, г;

K — коэффициент степени определения.

Требования безопасности. Соблюдают правила безопасности, рекомендуемые при работе с легковоспламеняющимися растворителями, взрывоопасными газами и высокотоксичными соединениями.

---