Методические указания по определению остаточных количеств биопрепарата вирин-ЭКС на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом
(утв. Минздравом СССР 26.01.1980 № 2128-80)
26 января 1980 г. № 2128-80
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БИОПРЕПАРАТА ВИРИН-ЭКС
НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ <*>
<*> Разработаны В.И. Трусовым, В.Л. Васильевой (КНИИЭИБ).
Характеристика анализируемого инсектицида. Вирин-ЭКС - энтомопатогенный препарат - вирусный инсектицид. Предназначается для борьбы с гусеницами капустной совки на капусте, сахарной свекле и других сельскохозяйственных культурах. Действующим началом препарата является вирус ядерного полиэдроза, относящийся к группе бакуловирусов. В препарате вирус находится в виде вирионов, заключенных в полиэдры (многогранники), представляющие собой кристаллизованный кремнийсодержащий белок. Внутри каждого
полиэдра заключено 10 — 20 вирионов. Размеры полиэдров 0,5 — 5 мк. Препарат — суспензия полиэдров в 50-процентном глицерине. Титр не 9
менее 1 x 10 пдр/мл. Могут быть сухие формы. Применяется путем опрыскивания сельскохозяйственных культур, повреждаемых капустной
совкой.
Действующее начало препарата - вирус ядерного полиэдроза КС при введении в организм экспериментальных животных всеми известными путями не репродуцируется и не вызывает скрытой или явной инфекции. Вирус не репродуцируется в культурах клеток
позвоночных.
Препаративные формы инсектицидов (сухие и жидкие) не токсичны для человека и теплокровных животных при однократном и множественном воздействии различными путями. В связи с низкой токсичностью ЛД для крыс и мышей при пероральном введении не 50 8 определяется. Токсичная доза для куриного эмбриона 0,5 x 10 пдр/эмбр. В эксперименте показано, что вирин-ЭКС - слабый
аллерген. ПДК в воде рыбохозяйственных водоемов 1 мг/л.
Принцип метода. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров ВЯП-КС) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентном микроскопе в виде ярко-зеленого свечения ободка полиэдров.
При условии централизованного изготовления иммунных антиполиэдренных сывороток иммунофлюоресцентный метод является экспресс-методом, высокочувствительным и специфичным.
Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно 2 определить количество полиэдров в диапазоне от 0,5 x 10 до 1 x 11 10 пдр/мл субстрата.
Избирательность метода. Метод высокочувствительный и специфичный. Способен дифференцировать различные виды полиэдров. Чувствительность метода в большой степени зависит от качества приготовленных гипериммунных сывороток.
Реактивы и материалы. Ацетон. Физиологический раствор (0,85-процентный NaCl), pH 7,4 — 7,6. Спирт этиловый. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сахароза. Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, нистатин). Мертиолят. Синька Эванса. Меченная изотиоцинатом флюоресцеина ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготавливается в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). Специфическая антиполиэдренная кроличья сыворотка.
Поскольку централизованное производство антиполиэдренных сывороток еще не налажено, необходимо изготавливать сыворотки в лабораторных условиях. Материалом для иммунизации служит взвесь очищенных полиэдров капустной совки, извлеченных из препарата методом дифференциального центрифугирования и разделения в градиенте плотности сахарозы, как описано на примере вирин-КШ.
Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Окулярная сетка. Объект-микрометр. Центрифуга (до 5000 об./мин.). pH-Метр. Мембранные фильтры № 2, 3. Пробирки бактериологические. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские. Фильтр Зейтца.
Подготовка к определению. При отсутствии централизованного изготовления специфических иммунных антиполиэдренных сывороток основная подготовительная работа сводится к приготовлению этих сывороток в лабораторных условиях. Следующий подготовительный этап — отбор проб, их подготовка и хранение. Описание приводится ниже.
Накануне исследования следует отъюстировать микроскоп, установить фильтры.
Для подсчета полиэдров в исследуемом объеме необходимо определить площадь квадрата окулярной сетки (S) с помощью объект-микрометра, помещенного на предметный столик микроскопа вместо препарата. Определяют сторону квадрата окулярной сетки. При отсутствии окулярной сетки определяют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения (D). Площадь вычисляют по формуле:
2
Отбор проб. После обработки сельскохозяйственных культур вирусными инсектицидами вирионы и полиэдры не проникают внутрь растений. Они находятся на поверхности растительных объектов и почвы. Для взятия проб с поверхности растительных объектов (листья, плоды) нужно заготовить заранее марлевые салфетки размером 5 x 5 см, уложить их в чашки Петри или бумажные пакеты и простерилизовать (в таком виде они могут долго храниться). С помощью этих салфеток можно брать пробы методом смыва (протирания) влажной салфеткой более или менее гладкой поверхности растения (головки капусты, листья капусты, свеклы) порядка 100 кв. см. Для этого пинцетом берут салфетку, смачивают в стерильном физиологическом растворе (pH 7,4 — 7,6), избыток отжимают и тщательно протирают исследуемую площадь. Затем салфетку переносят в колбу с физиологическим раствором (100 мл). Энергично встряхивают 3 — 5 мин., салфетку отжимают пинцетом и удаляют.
При исследовании неровных поверхностей (ягоды, фрукты, плоды) или поверхностей мелких объектов (трава) делают нарезки исследуемых объектов, заполняют ими трафарет площадью 100 кв. см. Общая площадь нарезки будет равна 100 кв. см. Затем измельченные нарезки помещают в колбы с физиологическим раствором (pH 7,4 — 7,6) в соотношении 1:10 и ставят на магнитную мешалку на 10 — 15 мин. или встряхивают 10 — 15 мин. Пробы фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, а затем пропускают через фильтр Зейтца с мембранными пластинками № 2 или 3 с помощью вакуумного насоса. По окончании фильтрации фильтр подсушивают на фильтровальной бумаге при 4 °C. Пробы собирают в количестве не меньше 6 в различных точках исследуемого участка в зависимости от целей исследований.
Ход анализа. Исследованию подвергаются мембранные фильтры, через которые были пропущены полученные пробы (смывы с растительных объектов). Фильтр переносят на обезжиренное предметное стекло лицевой стороной (осадком) кверху. Стекло с фильтром помещают в чашку Петри на две стеклянные палочки. На фильтр пипеткой осторожно наливают ацетон. Фильтр обесцвечивают, и препарат фиксируется к стеклу. Препарат подсушивают до полного испарения ацетона (образовавшаяся пленка должна быть прозрачна). Для устранения неспецифического свечения препарат обрабатывают синькой Эванса, водный раствор которой в разведении 1:10000 наносят на препарат. Время обработки зависит от типа пробы и составляет от 1 до 15 мин. Препарат промывают в проточной воде, подсушивают на воздухе. Препарат должен иметь слабо-голубую окраску. На высушенный препарат наносят иммунную кроличью сыворотку против полиэдров капустной совки, предварительно разведенную физиологическим раствором (1:10). Помещают в термостат во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) при 37 °C на 15 — 20 мин. Затем сыворотку смывают в течение 2 мин. проточной водой, препарат подсушивают на воздухе, после чего на него наносят ослиную антикроличью меченую сыворотку в рабочем разведении, указанном на ампуле. Снова выдерживают в термостате 15 — 20 мин. при 37 °C с последующим промыванием в проточной воде.
После подсушивания препарат готов к просмотру. Просмотр можно проводить в любом люминесцентном микроскопе, а также в обычном световом с применением опак-иллюминатора и люминесцентной установки ОИ-17, ОИ-18. Изложенный метод окраски позволяет выявить даже единичные полиэдры по их специфическому свечению. Ободок полиэдров имеет ярко-зеленое свечение на общем красноватом фоне препарата.
Контроли: препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической сывороткой; препараты, приготовленные из проб, взятых на необработанных участках. Контрольные препараты специфического свечения не имеют.
Обработка результатов анализа. Предлагаемый метод позволяет сделать качественное, а также количественное заключение о загрязненности вирусным препаратом растительных объектов. Для количественного анализа число полиэдров (M) на фильтрах подсчитывают по формуле:
6
aS x 10
1
a — среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;
S — площадь квадрата окулярной сетки, кв. мм (площадь поля зрения);
S — площадь мембранного фильтра, кв. мм; 1 6
V — объем профильтрованной суспензии, мл.
Для более точного подсчета числа полиэдров в квадрате окулярной сетки проводят подсчет по 32 квадратам на 3 различных участках фильтра при общем числе подсчитанных полиэдров не менее 600. Затем вычисляют среднее арифметическое значение (a). Определение площади квадрата окулярной сетки описано выше.
Пример. Число полиэдров в 32 квадратах при первом подсчете составило 420, при втором 395, при третьем 427. Вычисляем
(420 + 395 + 427)
a = ----------------- = 13. 32 x 3
S = 0,041 кв. мм - площадь поля зрения (определили по объект- 2 2 микрометру); S = пи r = 3,14 x (17,5) = 961,6; V = 500 мл.
1
6 6
13 x 961,6 x 10 125008 x 10 6
M = ---------------- = ------------ = 6,1 x 10 пдр/мл.
0,041 x 500 20,5
Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые при работе с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).