Методические указания по определению полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в воде, почве, на растительных объектах и в воздухе иммунофлюоресцентным методом

(утв. Минздравом СССР 27.09.1978 № 1921-78)

27 сентября 1978 г. № 1921-78

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОЛИЭДРОВ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, НА РАСТИТЕЛЬНЫХ

---

<*> Разработали В.Л. Васильева, А.Л. Гураль, М.А. Дяченко, В.И. Трусов (КНИИЭИБ).

Краткая характеристика препарата. Вирин-ЭНШ — вирусный энтомопатогенный препарат — вирусный инсектицид. Предназначается для борьбы с гусеницами непарного шелкопряда в лесах, садах, парках. Действующее начало препарата — полиэдры экспериментального штамма вируса ядерного полиэдроза, относящегося к группе бакуловирусов. Препарат — суспензия полиэдров в 50-процентном глицерине. Применяется методом авиа- или тракторного распыления.

Препарат вирин-ЭНШ и его активное начало не токсичны и не вызывают инфекционных заболеваний людей, домашних или диких животных. В эксперименте показано, что вирин-ЭНШ — слабый аллерген. ПДК в воде рыбохозяйственных водоемов 1 мг/л.

Принцип метода. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется в виде специфического свечения при наблюдении в люминесцентном микроскопе — ярко-зеленое свечение ободка полиэдров.

    Метрологическая  характеристика  метода. Данным методом  можно
                                                         2      11
определить  количество  полиэдров в диапазоне от 0,5 x 10  до 10
полиэдров   в   1   мл  субстрата.  Метод  высокочувствительный  и

специфический. Способен дифференцировать различные виды полиэдров. Чувствительность метода в большой степени зависит от качества приготовленных гипериммунных сывороток.

Реактивы и материалы. Ацетон. Физиологический раствор (0,85-процентный NaCl), pH 7,1 — 7,5. Этиловый спирт. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сахароза. Мертиолят. Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, нистатин).

Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовляемая в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи), специфическая антиполиэдренная кроличья сыворотка.

Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Сетка для подсчета полиэдров. Объект-микрометр. Камера Горяева. Центрифуга (до 5000 об./мин.). Термостат (37 °C). pH-Метр. Мембранные фильтры АФА-ВН-10. Электроаспиратор. Батометр. Пробирки. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские. Цилиндры стеклянные.

Подготовка к определению. При отсутствии централизованного изготовления специфических иммунных антиполиэдренных сывороток основная подготовительная работа сводится к приготовлению этих сывороток в лабораторных условиях.

    Иммунную    антиполиэдренную    сыворотку    получают    путем
внутривенной иммунизации  кроликов  суспензией очищенных полиэдров

           9

с титром 1 x 10  пдр/мл.
    Полиэдры извлекают из препарата вирин-ЭНШ  следующим  образом.
Проводят   3-кратный   отмыв   100   мл   препарата  от  глицерина
физиологическим  раствором  при  5000  об./мин.  в течение 20 мин.

Затем проводят дифференциальное центрифугирование при 300 об./мин. для осаждения крупных частиц тканей насекомых в течение 3 мин. Супернатант осторожно отсасывают пипеткой и центрифугируют 20 мин. при 5000 об./мин. для осаждения полиэдров. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и диспергируют на магнитной мешалке 10 — 15 мин. Дальнейшую очистку ведут в градиенте плотности 20, 30, 40,

50%  сахарозы.  Чистые полиэдры задерживаются на границе 40% и 50%
сахарозы.  Отбирают  пипеткой  этот  слой  и  отмывают полиэдры от
сахарозы  путем 5-кратного разбавления физиологическим раствором с

последующим центрифугированием при 5000 об./мин. 30 мин. Отмывание

проводят   3  раза.  Полученный  осадок  ресуспендируют  в  10  мл
физиологического  раствора.  Титр  определяют  в  камере  Горяева.

                                     9

Рабочее разведение для иммунизации 1 x 10 пдр/мл.

За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывают антибиотиками из расчета 500 — 1000 ед. пенициллина и стрептомицина, 20 ед. нистатина на 1 мл взвеси.

Перед иммунизацией взвесь стерильно отмывают от антибиотиков и ресуспендируют стерильным физиологическим раствором, инъекции проводят трижды с недельным интервалом по 1 — 2 - 2 мл. Реиммунизация через 6 недель — одна инъекция 2,5 мл внутривенно. Взятие крови через 2 недели после реиммунизации. Сыворотку желательно лиофилизировать или хранить с добавлением консерванта (мертиолята 1:10000) при температуре 20 °C.

Накануне исследования следует отъюстировать микроскоп, установить фильтры.

Для подсчета полиэдров в исследуемом объеме необходимо определить площадь квадрата окулярной сетки (S). Ее определяют с помощью объект-микрометра, который помещают на предметный столик микроскопа вместо препарата и при используемом для подсчета полиэдров увеличении определяют сторону квадрата сетки. При отсутствии окулярной сетки определяют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения (D) и вычисляют площадь по формуле:

                                2

S = пи r .

Отбор проб воды. Для санитарно-гигиенического контроля воды открытых водоемов на наличие загрязнения препаратом вирин-ЭНШ изучаются как вода, так и донные отложения. Выбор объектов исследования, частота и сроки отбора определяются целями исследований. При исследовании неглубоких водоемов до 5 м можно ограничиться взятием воды на глубине 2,5 м. Для глубоких водоемов поверхностную пробу берут на глубине 10 — 15 см.

Пробы воды 0,5 л отбирают в стеклянные бутылки, используя батометр, который обычно применяют для взятия проб санитарно-гигиенического контроля.

Пробы донных отложений массой 100 — 200 г отбирают при помощи различных дночерпателей. Пробы переносят в стерильные банки, наклеивают этикетки с указанием места и даты отбора. Общее число проб не менее 6.

После доставки в лабораторию пробы воды можно хранить в холодильнике не более 6 сут., а лучше исследовать сразу. Пробы фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, а затем пропускают через фильтр Зейтца с мембранным фильтром № 2 или 3 с помощью вакуумного насоса. По окончании фильтрации фильтр подсушивают на фильтровальной бумаге. Его можно хранить до анализа длительное время в чашках Петри при температуре 4 °C.

Из осадков донных отложений готовят 10-процентную взвесь на воде, тщательно перемешивают, подщелачивают NaOH до pH 7,4 — 7,6, встряхивают 10 мин. Надосадочную жидкость исследуют так же, как и пробы воды.

Отбор проб почвы. Для отбора проб почвы можно использовать стерильные банки на 0,5 л, закрытые пластмассовыми крышками, стерильные целлофановые или бумажные мешки, помещенные в матерчатые или клеенчатые пакеты. Для отбора поверхностных проб почвы используют совок, нож, ложку. Участки для отбора проб выбирают по показаниям в зависимости от целей исследований, но не более 20 см от поверхности, так как в естественных условиях микроорганизмы хорошо адсорбируются в верхних слоях. На каждом избранном участке берут пробы в 5 точках конвертообразно. Снимают поверхностный слой глубиной 1 — 2 см с площади около 100 кв. см массой по 100 — 150 г. Из 5 проб, отобранных на участке, готовят один образец, который помещают в стерильную тару. Пробу маркируют — ставят дату, указывают место отбора и другие дополнительные сведения. Пробы доставляют в лабораторию. Они могут храниться при температуре 4 °C несколько суток.

В лаборатории почву высыпают на бумагу, освобождают от примесей (щебень, камни и др.), большие комки измельчают шпателем. Образец перемешивают, берут навеску 30 г, переносят во флакон с бусами, куда добавляют 470 мл подщелоченной воды до pH 7,4 — 7,6. Полученную взвесь энергично встряхивают 10 — 15 мин. Отстаивают и через 15 — 20 мин. надосадочную жидкость пропускают через фильтр Зейтца с мембранным фильтром № 2 или 3 и хранят, как описано выше.

Отбор проб с поверхности растительных объектов. Для взятия проб с поверхности растительных объектов (листья, плоды и т.д.) методом смыва используют заготовленные заранее марлевые салфетки размером 5 x 5 см. Пинцетом берут салфетку, смачивают в стерильном физиологическом растворе. Избыток отжимают и тщательно протирают исследуемую площадь (100 кв. см). Затем салфетку переносят в колбочку с физиологическим раствором (100 мл), pH 7,4 — 7,6. Энергично встряхивают 5 мин., салфетку отжимают пинцетом и удаляют. Жидкость пропускают через фильтр Зейтца, как описано выше. Пробы отбирают в количестве не меньше 6 в различных точках исследуемого участка. При исследовании мелких растительных объектов (трава, хвоя и др.) готовят навеску 200 — 300 г. Навески образцов переносят в широкогорлые банки, доливают 200 — 300 мл подщелоченной воды до pH 7,4 — 7,6, тщательно встряхивают 10 — 15 мин., после чего из полученного смыва удаляют растения, отстаивают 2 — 3 мин., надосадок пропускают через фильтр Зейтца и исследуют.

Отбор проб воздуха. Для отбора проб воздуха применяют аспирационные приборы, с помощью которых улавливают частицы аэрозоля. Метод основан на принципе прилипания их к поверхности предметного стекла или к поверхности аналитических фильтров. В первом случае к аспирационному прибору подключают однокаскадный десятищелевой импактор — простое приспособление, разработанное в КНИИЭИБ, позволяющее получить одновременно 10 отпечатков аэрозоля на одном предметном стекле. Во втором случае для получения отпечатков аэрозоля используют аналитические фильтры АФА-ВП-10 или АФА-В-18. Фильтры монтируются на фильтровальной воронке и затем подключаются к аспиратору. В этом случае получают по одному отпечатку на одном фильтре. Скорость отсоса воздуха 20 л/мин. Время отбора пробы 5 мин.

В исследуемых помещениях пробы отбирают в разных местах (5 точек конвертообразно) на уровне 150 см от пола в зоне дыхания людей; предметные стекла с отпечатками аэрозоля фиксируют в ацетоне 15 мин. и хранят до момента исследования. Аналитические фильтры помещают на предметные стекла лицевой стороной вверх и обесцвечивают их в парах ацетона. Для этого стекла с фильтрами помещают в чашку Петри на две стеклянные палочки. На дно чашки наливают ацетон. После обесцвечивания (фильтр должен стать прозрачным) препараты можно хранить при 4 °C до проведения исследования.

Ход анализа. Исследованию подвергаются мембранные фильтры, через которые были пропущены пробы воды, вытяжки из почвы или смывы с растительных объектов, а также отпечатки аэрозоля воздуха. Фильтр переносят на обезжиренное предметное стекло лицевой стороной (осадком) кверху. Стекло с фильтром помещают в чашку Петри на две стеклянные палочки. На фильтр пипеткой осторожно наливают ацетон. Фильтр обесцвечивается, и препарат фиксируется к стеклу. Препарат подсушивают до полного испарения ацетона (образовавшаяся пленка должна быть прозрачна) и проводят окрашивание. Для устранения неспецифического свечения препарат обрабатывают синькой Эванса, водный раствор которой в разведении 1:10000 наносят на препарат. Время обработки зависит от типа пробы и составляет от 1 до 15 мин. Препарат промывают в проточной воде, подсушивают на воздухе. Препарат должен иметь слабо-голубую окраску. На высушенный препарат наносят антиполиэдренную иммунную кроличью сыворотку, предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором. Помещают в термостат во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) при 37 °C на 15 — 20 мин. Затем сыворотку смывают проточной водой 2 мин., препарат подсушивают на воздухе, после чего на препарат наносят ослиную антикроличью меченную ФИТЦ сыворотку в рабочем разведении, указанном на ампуле. Снова выдерживают в термостате при 37 °C 15 — 20 мин. с последующим промыванием в проточной воде.

После подсушивания препарат готов к просмотру. Просмотр можно проводить в любом люминесцентном микроскопе. Метод окраски позволяет выявить даже единичные полиэдры по их специфическому свечению. Ободок полиэдров имеет ярко-зеленое свечение на общем красноватом фоне препарата. Контрольные препараты, приготовленные тем же способом, специфического свечения не имеют.

Обработка результатов анализа. Число полиэдров в объеме исходной суспензии M (если число полиэдра в 1 куб. м воздуха) рассчитывают по формуле:

                              6
                      aS  x 10  x 10
                        1

M = --------------, SV

где:

a — среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;

S — площадь квадрата окулярной сетки (площадь поля зрения), кв. мм;

S — площадь мембранного фильтра, кв. мм; 1 6

    10  - переводной коэффициент;
    V - объем профильтрованной суспензии  или  объем  пропущенного

воздуха, л;

10 — переводной коэффициент на 1 куб. м (учитывается только при анализе воздуха).

Для более точного подсчета полиэдров в квадрате окулярной сетки проводят подсчет по 32 квадратам на 3 различных участках фильтра при общем числе подсчитанных полиэдров не меньше 600. Затем вычисляют среднее арифметическое значение. Определение площади квадрата окулярной сетки описано выше.

Пример. Число полиэдров в 32 квадратах при первом подсчете составило 420, при втором 395, при третьем 427.

    420 + 395 + 427

a = --------------- = 13. 32 x 3

    S = 0,041 кв. мм - площадь поля зрения (определили  по объект-
                 2                2
микрометру); пи r  = 3,14 x (17,5)  = 961,6; V = 500 мл.

                   6

        13 x 961,6 x 10            8
    M = ---------------- = 6,1 x 10  пдр/мл.

       0,041 x 500

Требования безопасности. Препарат вирин-ЭНШ не токсичен и не инфекционен для человека в рекомендуемых нормах. При работе с ним соблюдаются меры безопасности такие, как при работе с малотоксичными веществами.

---