---
title: "\"Временные методические указания по определению биологической активности вирусвакцины из штамма ВНИИБТ против инфекционного ларинготрахеита птиц\""
number: "115-6а"
issuer: "Министерство сельского хозяйства СССР"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-115-6a-minselhoz-sssr-ministerstvo-2"
---

## "Временные методические указания по определению биологической активности вирусвакцины из штамма ВНИИБТ против инфекционного ларинготрахеита птиц"

# "Временные методические указания по определению биологической активности вирусвакцины из штамма ВНИИБТ против инфекционного ларинготрахеита птиц"

(утв. Минсельхозом СССР 17.07.1985 N 115-6а)


<a id="p100001"></a>Утверждены
Министерством сельского
хозяйства СССР
17 июля 1985 г. N 115-6а


## <a id="p100002"></a>ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСВАКЦИНЫ ИЗ ШТАММА ВНИИБТ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ



### 1. <a id="p100003"></a>Общие положения.

<a id="p100004"></a>1.1. В связи с возможным снижением биологической активности (титра) сухой вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц из штамма ВНИИБТ <1> при хранении или транспортировке, перед ее применением аэрозольным методом необходимо определять биологическую активность препарата с целью обеспечения точности дозировки при иммунизации.

<a id="p100005"></a>

---

<a id="p100006"></a><1> Именуемой ниже - вакцина.

<a id="p100007"></a>1.2. На коробке с вакциной указаны количество клоачных доз в ампуле и биологическая активность (титр) вакцины данной серии. Титр вакцины должен быть не ниже 105 ЭИД50/мл (эмбриональных инфекционных доз). В каждой ампуле содержится 2 мл вируса и 2 мл наполнителя.
<a id="p100008"></a>1.3. Работу по определению биологической активности вакцины выполняют вирусологические отделы республиканских, краевых, областных ветеринарных лабораторий, а также зональные специализированные ветеринарные лаборатории (по болезням птиц).
<a id="p100009"></a>1.4. Биологическую активность вакцины определяют методом титрования на куриных эмбрионах с последующей статистической обработкой полученных данных.


### 2. <a id="p100010"></a>Материалы и методы.

<a id="p100011"></a>2.1. Для проведения работы по титрованию вирусвакцины ИЛТ необходимо иметь: бокс с предбоксником, оборудование для вирусологических исследований; стерильные бактериологические пробирки, закрытые ватно-марлевыми или резиновыми пробками; стерильные флаконы на 100 мл; стерильные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл; пипетки Мора на 25 и 50 мл; фарфоровую кружку или стеклянную банку с дезинфицирующим раствором (для отработанных пипеток и других материалов); спиртовку или газовую горелку; ножницы изогнутые глазные остроконечные; пинцеты глазные; шприцы "Рекорд" на 1 мл с инъекционными иглами N 16; подставку с гнездами (ячейками) для куриных эмбрионов; картонные или металлические лотки; пробойники; лейкопластырь или парафин; этиловый спирт; 3%-ный спиртовой раствор йода; раствор дезинфицирующего вещества (1 ... 2%-ный раствор едкого натра или 5%-ный раствор монохлорамина); охлажденный стерильный физиологический раствор, приведенный фосфатным буфером к pH 7,2 ... 7,4; антибиотики (пенициллин, стрептомицин).
<a id="p100012"></a>2.2. Для определения биологической активности вакцины используют 9-дневные куриные эмбрионы с белой скорлупой из хозяйств, благополучных по инфекционному ларинготрахеиту птиц, где не проводится вакцинация против этой болезни.
<a id="p100013"></a>2.3. Куриные эмбрионы заражают соответствующими разведениями вирусвакцины (т.е. вирусом ИЛТ) в аллантоисную полость (см. [п. 3.1](#p100017) и [3.2](#p100021)).
<a id="p100014"></a>2.4. Инструменты, используемые при заражении эмбрионов (пинцет, шприц на 1 мл, иглы, пробойники), стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. В процессе работы пинцеты и пробойники обрабатывают 96°-ным спиртом и фламбируют.
<a id="p100015"></a>2.5. Непосредственно перед заражением эмбрионы овоскопируют, отбирают эмбрионы с хорошей подвижностью и развитой хорионаллантоисной оболочкой (ХАО) и отмечают границу пуги (естественная воздушная полость).


### 3. <a id="p100016"></a>Титрование вирусвакцины.

<a id="p100017"></a>3.1. Разведение вирусвакцины для титрования. Исходное разведение лиофилизированного вируса ИЛТ (вирусвакцины) готовят начиная с разведения 10-1 (без учета наполнителя). Берут 9 ампул вакцины (по 2 мл вируса в ампуле), из которых составляют 3 пробы (по 3 ампулы в каждой пробе), и параллельно их титруют.
<a id="p100018"></a>Содержимое трех ампул (6 мл вируса) растворяют в 60 мл стерильного физиологического раствора (разведение 1:10), содержащего 400 ЕД/мл пенициллина и 400 мкг/мл стрептомицина, затем вируссодержащую суспензию центрифугируют 10 мин при 1 тыс. об/мин. Из надосадочной жидкости готовят возрастающие 10-кратные разведения до 10-7.
<a id="p100019"></a>В ряд соответственно обозначенных стерильных пробирок (по количеству разведений вируса) разливают стерильный физиологический раствор по 9 мл.
<a id="p100020"></a>Из исходного разведения вируса (1:10) отмеряют 1 мл и переносят в следующую пробирку с 9 мл физиологического раствора, при этом пипетка не должна касаться жидкости. Таким образом получают разведение 1:100 (10-2). Использованную пипетку погружают в дезинфицирующий раствор. Другой чистой пипеткой перемешивают вируссодержащую суспензию разведения 10-2 и 1 мл ее переносят в следующую пробирку, получают разведение 10-3, и так до 7-й пробирки (т.е. до разведения 10-7).
<a id="p100021"></a>3.2. Заражение эмбрионов. Каждым разведением вируса, начиная с 10-7 до 10-1, одним стерильным шприцем заражают в аллантоисную полость по 4 эмбриона 9-дневного возраста в дозе 0,2 мл (всего 28 эмбрионов). Для этого яйцо помещают вертикально тупым концом вверх. Поверхность скорлупы в области естественной пуги протирают 96°-ным спиртом и фламбируют. Легким ударом пробойника над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы. Через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу в аллантоисную полость на глубину 2 ... 3 мм ниже границы воздушного мешка. Отверстие в скорлупе после инъекции заклеивают расплавленным парафином или лейкопластырем. Кроме того, 6 эмбрионов оставляют незараженными для контроля.
<a id="p100022"></a>Зараженные и контрольные эмбрионы укладывают в лоток вертикально пугой и помещают в термостат, где инкубируют 144 ч при температуре (37 +/- 0,5) °C и относительной влажности 60 ... 70%. В термостат ставят кювет (объемом 0,5 л) с водой.
<a id="p100023"></a>3.3. Эмбрионы овоскопируют 2 раза в день. Эмбрионы, павшие в течение 24 ч после заражения, во внимание не принимают, их собирают и уничтожают, так как в этот период они могут погибнуть не только от действия вируса. Гибель эмбрионов в последующие дни относят за счет действия вакцинного вируса инфекционного ларинготрахеита (при условии, что посевы из каждого эмбриона на питательные среды МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро останутся стерильными). Через 6 дней все эмбрионы вскрывают. При этом учитывают изменения, характерные для вируса ИЛТ (мелкие серо-белые узелки некроза, рассеянные по всей хорионаллантоисной оболочке или слившиеся в бляшки). В контрольных (незараженных) куриных эмбрионах изменений на ХАО не должно быть.
<a id="p100024"></a>Титр вируса высчитывают по методу Рида и Менча по каждой пробе отдельно. Примерный расчет по этому методу приводится в таблицах 48 и [49](#p100066).

<a id="p100025"></a>Таблица 48

<a id="p100026"></a>Результаты титрования вируса ИЛТ на РЭК


<table>
<colgroup><col width="26%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100027"></a>Исследуемая серия вакцины</td><td colspan="7"><a id="p100028"></a>Разведение исследуемого материала</td></tr>
<tr><td><a id="p100029"></a>10-1</td><td><a id="p100030"></a>10-2</td><td><a id="p100031"></a>10-3</td><td><a id="p100032"></a>10-4</td><td><a id="p100033"></a>10-5</td><td><a id="p100034"></a>10-6</td><td><a id="p100035"></a>10-7</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100036"></a>Серия N 1</td><td><a id="p100037"></a>+</td><td><a id="p100038"></a>+</td><td><a id="p100039"></a>+</td><td><a id="p100040"></a>+</td><td><a id="p100041"></a>+</td><td><a id="p100042"></a>+</td><td><a id="p100043"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100044"></a>+</td><td><a id="p100045"></a>+</td><td><a id="p100046"></a>+</td><td><a id="p100047"></a>+</td><td><a id="p100048"></a>+</td><td><a id="p100049"></a>0</td><td><a id="p100050"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100051"></a>+</td><td><a id="p100052"></a>+</td><td><a id="p100053"></a>+</td><td><a id="p100054"></a>+</td><td><a id="p100055"></a>+</td><td><a id="p100056"></a>0</td><td><a id="p100057"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100058"></a>+</td><td><a id="p100059"></a>+</td><td><a id="p100060"></a>+</td><td><a id="p100061"></a>+</td><td><a id="p100062"></a>0</td><td><a id="p100063"></a>0</td><td><a id="p100064"></a>0</td></tr>
</table>


<a id="p100065"></a>Таблица 49

<a id="p100066"></a>Расчет процента кумулятивной инфекционности

<a id="p100067"></a> ![3. Титрование вирусвакцины.](https://i.bukva.ai/0JFt2TgX/img_0.png) 

<a id="p100068"></a>Знаком "+" обозначены эмбрионы, погибшие после 24 ч инкубации или выжившие, но имеющие характерные для вируса ИЛТ изменения при вскрытии их через 6 сут после заражения; знаком "0" - эмбрионы, не имеющие изменений, свойственных вирусу ИЛТ.
<a id="p100069"></a>Из [таблицы 48](#p100026) видно, что при разных разведениях вируса поражается различное количество эмбрионов. На основании этих данных высчитывают кумулятивную инфекционность вакцины, исходя из того, что если у эмбриона имеются поражения ХАО вирусом в разведении 10-6, то они будут и при более высоких концентрациях вируса. Далее проводят статистический расчет [(табл. 49)](#p100066).
<a id="p100070"></a>Стрелкой показано, в каком направлении следует суммировать абсолютные данные результата титрования (в графах 2 и 3) для подсчета кумулятивных данных (в графах 4 и 5).
<a id="p100071"></a>Процент кумулятивной инфекционности для каждого разведения рассчитывают по формуле

<a id="p100072"></a> $\frac{100\text{а}}{a + b} ,$ 

<a id="p100073"></a>где a - данные графы 5 (т.е. количество эмбрионов с поражением ХАО);
<a id="p100074"></a>b - данные графы 4 (т.е. количество эмбрионов без поражений ХАО).
<a id="p100075"></a>В данном примере процент инфекционности при разведении вируса 10-1 равен

<a id="p100076"></a> $\frac{100 \cdot 20}{20} = 100\%;$ 

<a id="p100077"></a>инфекционности при разведении вируса 10-5 равен

<a id="p100078"></a> $\frac{100 \cdot 4}{4 + 1} = \frac{400}{5} = 80\%$ и т.д.

<a id="p100079"></a>Одна ЭИД50 равна тому количеству вируса, которое вызывает поражение ХАО у 50% эмбрионов.
<a id="p100080"></a>Из [таблицы 49](#p100066) видно, что ни при одном разведении вируса инфекционность не составляет 50%, следовательно, ЭИД50 находится между разведениями 10-5 и 10-6.
<a id="p100081"></a>Разведение вируса, при котором процент инфекционности приближается к 50, но выше этой цифры, называется высшей критической дозой, а если он ниже 50 - низшей критической дозой.
<a id="p100082"></a>В данном примере высшей критической дозой является разведение вируса 10-5 (80% инфекционности), а низшей критической дозой - 10-6 (20% инфекционности).
<a id="p100083"></a>Для расчета коэффициента пропорциональности (X) предложена формула

<a id="p100084"></a> $X = \frac{C - 50}{C - D} ,$ 

<a id="p100085"></a>где X - коэффициент пропорциональности;
<a id="p100086"></a>C - процент инфекционности высшей критической дозы;
<a id="p100087"></a>D - процент инфекционности низшей критической дозы.
<a id="p100088"></a>Подставляем цифровые значения в формулу:

<a id="p100089"></a> $X = \frac{80 - 50}{80 - 20} = \frac{30}{60} = 0,5.$ 

<a id="p100090"></a>Установлено, что ЭИД<sub>50</sub> равна логарифму высшей критической дозы + коэффициент пропорциональности. В данном случае логарифм высшей критической дозы равен 5(10-5), коэффициент пропорциональности - 0,5. Следовательно, при окончательном подсчете ЭИД50 = 5 + 0,5 = 5,5 (т.е. 105,5 ЭИД50/0,2 мл). Для определения биологической активности вирусвакцины в 1 мл к полученному числовому выражению логарифма прибавляют постоянную величину 0,7, т.е. в данном случае ЭИД50 = 5,5 lg + 0,7 lg = 6,2 lg. Значит, титр вируса в 1 мл будет равен 6,2 lg.
<a id="p100091"></a>3.4. Для перевода титра вируса в абсолютные числа находят антилогарифм числа 6,2, пользуясь [приложением](#p100096) к настоящим методическим указаниям (т.е. искомое число антилогарифма в данном примере 6,20, где 6 - характеристика, 20 - мантисса, которая определяется на месте пересечения десятых и сотых цифровых значений в таблице, а характеристика указывает на количество знаков в цифровом выражении). В приведенном примере в 1 мл вакцины содержится 1 585 000 ЭИД50 (это и есть абсолютное число).
<a id="p100092"></a>3.5. Для более точного расчета необходимо провести не менее трех параллельных титрований, так как за биологическую активность вакцины принимается среднеарифметическая величина трех параллельных титрований.
<a id="p100093"></a>Для аэрозольной вакцинации применяют вакцину с титром не ниже 105 ЭИД50/мл.
<a id="p100094"></a>3.6. Результаты титрования записывают в соответствующей книге (журнале) учета. При этом указывают наименование вакцины и учреждения, ее изготовившего, номер серии и дату изготовления, дату поступления на исследование и наименование хозяйства, откуда поступила вакцина, и результат исследования [(1)](https://bukva.ai/docs/115-6a-minselhoz-sssr-ministerstvo-8#p100200).





<a id="p100095"></a>Приложение

<a id="p100096"></a>**АНТИЛОГАРИФМЫ**


<table>
<colgroup><col width="13%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100097"></a>Единицы</td><td colspan="10"><a id="p100098"></a>Десятки</td></tr>
<tr><td><a id="p100099"></a>0</td><td><a id="p100100"></a>1</td><td><a id="p100101"></a>2</td><td><a id="p100102"></a>3</td><td><a id="p100103"></a>4</td><td><a id="p100104"></a>5</td><td><a id="p100105"></a>6</td><td><a id="p100106"></a>7</td><td><a id="p100107"></a>8</td><td><a id="p100108"></a>9</td></tr>
<tr><td><a id="p100109"></a>0</td><td><a id="p100110"></a>1000</td><td><a id="p100111"></a>1259</td><td><a id="p100112"></a>1585</td><td><a id="p100113"></a>1995</td><td><a id="p100114"></a>2512</td><td><a id="p100115"></a>3162</td><td><a id="p100116"></a>3981</td><td><a id="p100117"></a>5012</td><td><a id="p100118"></a>6310</td><td><a id="p100119"></a>7943</td></tr>
<tr><td><a id="p100120"></a>1</td><td><a id="p100121"></a>1023</td><td><a id="p100122"></a>1288</td><td><a id="p100123"></a>1622</td><td><a id="p100124"></a>2042</td><td><a id="p100125"></a>2570</td><td><a id="p100126"></a>3236</td><td><a id="p100127"></a>4074</td><td><a id="p100128"></a>5129</td><td><a id="p100129"></a>6457</td><td><a id="p100130"></a>8123</td></tr>
<tr><td><a id="p100131"></a>2</td><td><a id="p100132"></a>1047</td><td><a id="p100133"></a>1318</td><td><a id="p100134"></a>1660</td><td><a id="p100135"></a>2089</td><td><a id="p100136"></a>2630</td><td><a id="p100137"></a>3311</td><td><a id="p100138"></a>4169</td><td><a id="p100139"></a>5243</td><td><a id="p100140"></a>6607</td><td><a id="p100141"></a>8318</td></tr>
<tr><td><a id="p100142"></a>3</td><td><a id="p100143"></a>1072</td><td><a id="p100144"></a>1349</td><td><a id="p100145"></a>1698</td><td><a id="p100146"></a>2138</td><td><a id="p100147"></a>2692</td><td><a id="p100148"></a>3388</td><td><a id="p100149"></a>4266</td><td><a id="p100150"></a>5370</td><td><a id="p100151"></a>6761</td><td><a id="p100152"></a>8511</td></tr>
<tr><td><a id="p100153"></a>4</td><td><a id="p100154"></a>1096</td><td><a id="p100155"></a>1380</td><td><a id="p100156"></a>1738</td><td><a id="p100157"></a>2188</td><td><a id="p100158"></a>2754</td><td><a id="p100159"></a>3467</td><td><a id="p100160"></a>4365</td><td><a id="p100161"></a>5495</td><td><a id="p100162"></a>6918</td><td><a id="p100163"></a>8710</td></tr>
<tr><td><a id="p100164"></a>5</td><td><a id="p100165"></a>1122</td><td><a id="p100166"></a>1413</td><td><a id="p100167"></a>1778</td><td><a id="p100168"></a>2239</td><td><a id="p100169"></a>2818</td><td><a id="p100170"></a>3548</td><td><a id="p100171"></a>4467</td><td><a id="p100172"></a>5623</td><td><a id="p100173"></a>7079</td><td><a id="p100174"></a>8913</td></tr>
<tr><td><a id="p100175"></a>6</td><td><a id="p100176"></a>1148</td><td><a id="p100177"></a>1445</td><td><a id="p100178"></a>1820</td><td><a id="p100179"></a>2291</td><td><a id="p100180"></a>2884</td><td><a id="p100181"></a>3631</td><td><a id="p100182"></a>4571</td><td><a id="p100183"></a>5754</td><td><a id="p100184"></a>7244</td><td><a id="p100185"></a>9120</td></tr>
<tr><td><a id="p100186"></a>7</td><td><a id="p100187"></a>1175</td><td><a id="p100188"></a>1479</td><td><a id="p100189"></a>1862</td><td><a id="p100190"></a>2344</td><td><a id="p100191"></a>2951</td><td><a id="p100192"></a>3715</td><td><a id="p100193"></a>4677</td><td><a id="p100194"></a>5888</td><td><a id="p100195"></a>7413</td><td><a id="p100196"></a>9333</td></tr>
<tr><td><a id="p100197"></a>8</td><td><a id="p100198"></a>1202</td><td><a id="p100199"></a>1514</td><td><a id="p100200"></a>1905</td><td><a id="p100201"></a>2399</td><td><a id="p100202"></a>3020</td><td><a id="p100203"></a>3802</td><td><a id="p100204"></a>4786</td><td><a id="p100205"></a>6026</td><td><a id="p100206"></a>7586</td><td><a id="p100207"></a>9550</td></tr>
<tr><td><a id="p100208"></a>9</td><td><a id="p100209"></a>1230</td><td><a id="p100210"></a>1549</td><td><a id="p100211"></a>1950</td><td><a id="p100212"></a>2455</td><td><a id="p100213"></a>3090</td><td><a id="p100214"></a>3890</td><td><a id="p100215"></a>4898</td><td><a id="p100216"></a>6166</td><td><a id="p100217"></a>7762</td><td><a id="p100218"></a>9772</td></tr>
</table>


<a id="p100219"></a>*Примечание.* Для определения абсолютного числа соответствующего логарифма необходимо мантиссу (цифру, стоящую после запятой) проантилогарифмировать. С этой целью находят по горизонтали цифру, соответствующую десятым долям, а по вертикали - сотым долям мантиссы, и на пересечении этих цифр находят числовое значение антилогарифма. В дальнейшем, исходя из характеристики (целое число), в полученном числовом выражении отделяют количество цифр на одно больше, чем указано в характеристике.

<a id="p100220"></a>*Пример.* Логарифм числа равняется 6,20. Антилогарифмируют мантиссу 20. Находят по горизонтали цифру 2, а по вертикали - 0. На пересечении этих цифр определяют число - 1585. Согласно характеристике, устанавливают абсолютное число, которое равняется 1 585 000.



<a id="p100221"></a>

---