---
title: "\"ГОСТ Р ИСО 20397-2-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Массовое параллельное секвенирование. Часть 2. Оценка качества данных секвенирования\""
number: "ГОСТ Р ИСО 20397-2-2023"
issuer: "Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-iso-20397-2-2023"
---

## "ГОСТ Р ИСО 20397-2-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Массовое параллельное секвенирование. Часть 2. Оценка качества данных секвенирования"

# "ГОСТ Р ИСО 20397-2-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Массовое параллельное секвенирование. Часть 2. Оценка качества данных секвенирования"

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 10.08.2023 N 633-ст)

> [!IMPORTANT]
> Документ [введен](#p100011) в действие с 01.03.2024.


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утвержден и введен в действие<br>
Приказом Федерального<br>
агентства по техническому<br>
регулированию и метрологии

</div>

<div align="center">

**от 10 августа 2023 г. N 633-ст**

<a id="p100002"></a>**НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100003"></a>**БИОТЕХНОЛОГИЯ**

<a id="p100004"></a>**МАССОВОЕ ПАРАЛЛЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ**

<a id="p100005"></a>**ЧАСТЬ 2**

<a id="p100006"></a>**ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ДАННЫХ СЕКВЕНИРОВАНИЯ**

<a id="p100007"></a>**Biotechnology. Massively parallel sequencing.**<br>
**Part 2. Quality evaluation of sequencing data**

<a id="p100008"></a>**(ISO 20397-2:2021, IDT)**

</div>


<div align="right">

<a id="p100009"></a>ГОСТ Р ИСО 20397-2-2023

<a id="p100010"></a>ОКС 07.080

</div>


<a id="p100011"></a>Дата введения

<div align="center">

**1 марта 2024 года**

</div>



### <a id="p100012"></a>Предисловие


<a id="p100013"></a>1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Российский институт стандартизации" (ФГБУ "Институт стандартизации") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в [пункте 4](#p100016)
<a id="p100014"></a>2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 326 "Биотехнологии"
<a id="p100015"></a>3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 августа 2023 г. N 633-ст
<a id="p100016"></a>4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20397-2:2021 "Биотехнология. Массовое параллельное секвенирование. Часть 2. Оценка качества данных секвенирования" (ISO 20397-2:2021 "Biotechnology - Massively parallel sequencing - Part 2: Quality evaluation of sequencing data", IDT).
<a id="p100017"></a>Международный стандарт разработан Техническим комитетом ТК 276 "Биотехнология" Международной организации по стандартизации (ИСО)

<div align="center">

<a id="p100018"></a>**5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ**

</div>

<a id="p100019"></a>6 Некоторые элементы настоящего стандарта могут являться объектами патентных прав

<a id="p100020"></a>Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)


### <a id="p100021"></a>Введение


<a id="p100022"></a>Массовое параллельное секвенирование (MPS) - это высокопроизводительный аналитический подход к секвенированию нуклеиновых кислот с использованием массово-параллельной архитектуры, которая позволяет исследовать целые геномы, транскриптомы и специфические мишени из нуклеиновых кислот различных организмов за относительно короткое время.
<a id="p100023"></a>MPS используется во многих областях биологии, позволяя определять и осуществлять высокопроизводительный анализ миллионов и тысяч миллионов нуклеотидных оснований. Биологическая изменчивость полимеров дезоксирибонуклеиновых и рибонуклеиновых кислот живых организмов приводит к трудностям в точном определении их последовательностей. Качество определения последовательности с помощью MPS зависит от многих факторов, в том числе от качества образца, подготовки библиотеки, выбора платформы и качества данных секвенирования.
<a id="p100024"></a>**Анализ данных секвенирования создает значительные сложности в биоинформатике, связанные с хранением данных, временем вычислений и точностью определения вариантов. Одной из основных проблем, возникающих при работе с данными секвенирования, которую в ряде случаев упускают из виду, является мониторинг показателей контроля качества на всех этапах обработки конвейера. Информация о качестве данных необходима для последующего анализа последовательностей. Контроль качества при обработке и анализе данных секвенирования нуклеиновых кислот можно разделить на три этапа: исходные данные, выравнивание и поиск вариантов. В настоящем стандарте приведен список критериев для оценки качества данных секвенирования MPS, а также конкретные рекомендации для различных платформ MPS.**


### <a id="p100025"></a>1 Область применения


<a id="p100026"></a>**Настоящий стандарт устанавливает общие требования и рекомендации по оценке и контролю качества данных массового параллельного секвенирования (MPS). Он охватывает процедуры генерации исходных данных, выравнивания последовательностей и поиска вариантов.**
<a id="p100027"></a>Настоящий стандарт также содержит общие рекомендации по валидации и документированию данных MPS.
<a id="p100028"></a>Настоящий стандарт не относится к процессам, связанным со сборкой de novo.


### <a id="p100029"></a>2 Нормативные ссылки


<a id="p100030"></a>В настоящем стандарте нормативные ссылки отсутствуют.


### <a id="p100031"></a>3 Термины и определения


<a id="p100032"></a>В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.
<a id="p100033"></a>ИСО и МЭК ведут терминологические базы данных для использования в области стандартизации по следующим адресам:
- <a id="p100034"></a>Электропедия МЭК: доступна по адресу: http://www.electropedia.org/;
- <a id="p100035"></a>платформа онлайн-просмотра ИСО: доступна по адресу: http://www.iso.org/obp.
<a id="p100036"></a>3.1 последовательность адаптера; адаптер (adapter sequence, adapter): Синтетический олигонуклеотид известной последовательности, который может быть добавлен к 3' или 5' концам фрагмента нуклеиновой кислоты.
<a id="p100037"></a>*Примечание* - Он обеспечивает участок праймера, а также другие необходимые последовательности для секвенирования вставки.

<a id="p100038"></a>3.2 алгоритм (algorithm): Полностью определенная конечная последовательность инструкций, с помощью которой значения выходных переменных могут быть вычислены из значений входных переменных.
<a id="p100039"></a>[МЭК 60050-351:2013, 351-42-27, изменено - примечания удалены]
<a id="p100040"></a>3.3 распознание нуклеотидов (base calling): Процесс вычисления в массивно-параллельном секвенировании перевода необработанных электрических сигналов в последовательность нуклеотидов.
<a id="p100041"></a>*Примечание* - Применение распознавания нуклеотидов и алгоритмов характеризуется точностью считывания и консенсуса.

<a id="p100042"></a>3.4 биоинформатический конвейер (bioinformatics pipeline): Отдельные программы, сценарии или части программного обеспечения, связанные между собой, в которых необработанные данные или выход одной программы используют в качестве входных данных для следующего этапа обработки данных.
<a id="p100043"></a>*Пример* - Результаты работы программы тримминга базового качества могут быть использованы в качестве входных данных для ассемблера de novo.
<a id="p100044"></a>3.5 эффективность захвата (capture efficiency): Процентное содержание всех секвенированных или картированных ридов, которые перекрывают целевые области.
<a id="p100045"></a>3.6 покрытие; глубина покрытия (coverage, coverage depth): Количество раз, когда определенное положение основания считывается в ходе секвенирования.
<a id="p100046"></a>*Примечание* - Количество прочтений, покрывающих определенную позицию.

<a id="p100047"></a>3.7 ширина покрытия (coverage breadth): Доля генома в собранном/целевом размере генома в циклах секвенирования.
<a id="p100048"></a>3.8 плотность кластеров (cluster density): Количество кластеров для каждой области сканирования.
<a id="p100049"></a>Примечание 1 - Плотность кластеров, применяемая к платформам MPS [(3.30)](#p100092), требует амплификации.
<a id="p100050"></a>*Примечание* 2 - Плотность отдельных кластеров последовательностей, каждый из которых возникает из одной молекулы на некоторых платформах секвенирования.
<a id="p100051"></a>*Примечание* 3 - Плотность кластеров, как правило, выражается в тысячах на мм2.

<a id="p100052"></a>3.9 секвенирование кольцевых консенсусных последовательностей; CCS (circular consensus sequencing, CCS): Режим секвенирования, при котором размер вставки секвенируется несколько раз в амплификации по типу "катящегося кольца", что обеспечивает высокую точность.
<a id="p100053"></a>*Примечание* - В этом режиме допускается использовать несколько проходов от одной и той же молекулы для достижения более высокой точности определения одной молекулы.

<a id="p100054"></a>3.10 диапазон покрытия (coverage range): Диапазон глубины покрытия по всему геному при проведении секвенирования.
<a id="p100055"></a>3.11 вариация числа копий; вариант числа копий; CNV (copy number variation, copy number variant, CNV): Вариант числа копий одного или нескольких участков ДНК или присутствующих в геноме организма.
<a id="p100056"></a>*Примечание* - CNVs - это вставки, делеции, инверсии и дупликации, содержащие не менее 1000 оснований в длину.

<a id="p100057"></a>3.12 дезоксирибонуклеиновая кислота; ДНК (deoxyribonucleic acid, DNA): Полимер дезоксирибонуклеотидов, существующий в двухцепочечной (дцДНК) или одноцепочечной (оцДНК) форме.
<a id="p100058"></a>[ИСО 22174:2005, 3.1.2]
<a id="p100059"></a>3.13 делеция (deletion): Потеря одной (или более) пары нуклеотидных оснований из последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с ее эталонной последовательностью.
<a id="p100060"></a>3.14 уровень дупликации (duplication level): Количество идентичных повторов для каждой последовательности в библиотеке.
<a id="p100061"></a>*Примечание* - Уровень дупликации, как правило, отображается в виде графика, показывающего относительное количество последовательностей с разной степенью дупликации.

<a id="p100062"></a>3.15 гуанин-цитозиновый состав; GC-состав (GC content): Процентное содержание гуанина и цитозина в одной или более последовательности(ях) нуклеиновой кислоты.
<a id="p100063"></a>*Примечание* - Количество гуанина и цитозина в полинуклеиновой кислоте, как правило, выражается в мольной доле (или процентах) от общего количества азотистых оснований. Общее количество азотистых оснований включает в себя общее количество нуклеотидных оснований ридов в результате одного или нескольких циклов MPS.

<a id="p100064"></a>3.16 ген (gene): Последовательность нуклеотидов в ДНК или РНК, кодирующая РНК либо белковый продукт.
<a id="p100065"></a>*Примечание* 1 - Гены признаны основной единицей наследственности.
<a id="p100066"></a>*Примечание* 2 - Ген может состоять из несмежных сегментов нуклеиновых кислот, которые перестраиваются в результате этапа ядерного процессинга.
<a id="p100067"></a>*Примечание* 3 - Ген может включать или быть частью оперона, который содержит элементы для экспрессии гена.

<a id="p100068"></a>3.17 вставка-делеция (индел) (indel): Вставка [(3.18)](#p100070) и/или делеция [(3.13)](#p100059) нуклеотидов в геноме ДНК.
<a id="p100069"></a>*Примечание* - Инделы имеют длину менее 1000 оснований.

<a id="p100070"></a>3.18 вставка (insertion): Добавление одной или нескольких пар нуклеотидных оснований в последовательность ДНК.
<a id="p100071"></a>[ISO/TS 20428:2017, 3.19, изменено - "ДНК" заменено "нуклеиновой кислотой"]
<a id="p100072"></a>3.19 секвенирование (sequencing): Определение порядка и содержания нуклеотидных оснований (аденина, гуанина, цитозина, тимина и урацила) в молекуле нуклеиновой кислоты.
<a id="p100073"></a>*Примечание* - Последовательность, которая, как правило, описывается с 5-го конца по 3-й.

<a id="p100074"></a>[ISO/TS 17822-1:2020, 3.19, изменено - "ДНК" исключена из термина; в определении "ДНК" заменено "нуклеиновой кислотой" и добавлен "урацил"]
<a id="p100075"></a>3.20 выравнивание последовательностей (sequence alignment): Расположение последовательностей нуклеиновых кислот в соответствии с областями сходства.
<a id="p100076"></a>*Примечание* - Выравнивание последовательностей может не требовать эталонного генома/эталонной целевой области нуклеиновой кислоты, и создание сборки может не быть его целью.

<a id="p100077"></a>3.21 исходные данные (raw data): Первичные данные секвенирования, полученные секвенатором без предварительной фильтрации на основе программного обеспечения для целей анализа.
<a id="p100078"></a>3.22 рибонуклеиновая кислота; РНК (ribonucleic acid; RNA): Полимер рибонуклеотидов, возникающий в двухцепочной или одноцепочной форме.
<a id="p100079"></a>*Примечание* - Синтез белков в клетках регулируется генетической информацией, содержащейся в последовательности нуклеотидов в классе РНК, известном как РНК-посредник (мРНК).

<a id="p100080"></a>3.23 рибонуклеотид (ribonucleotide): Нуклеотид, содержащий рибозу в качестве пентозного компонента, образующий основные строительные блоки для РНК.
<a id="p100081"></a>*Примечание* - Рибонуклеотиды состоят из аденилата (AMP), гуанилата (GMP), цитидилата (CMP) или уридилата (UMP).

<a id="p100082"></a>3.24 прочтение (рид); прочтенная последовательность (read, sequence read): Нуклеотидная последовательность, генерируемая устройством секвенирования.
<a id="p100083"></a>*Примечание* - Прочтение (рид) - это выведенная последовательность пар оснований нуклеиновых кислот (или вероятностей пар оснований), соответствующая всему (или части) одному фрагменту нуклеиновой кислоты. Рид допускается использовать для обозначения последовательностей, полученных в результате экспериментов MPS.

<a id="p100084"></a>3.25 тип прочтения (read type): Категория последовательности, которая зависит от того, как разработан и проведен эксперимент по прочтению последовательности.
<a id="p100085"></a>*Пример* - Тип считывания (рида) может быть одноконцевым, парно-концевым, спаренным концевым, непрерывным длинным считыванием, циркулярным консенсусом.
<a id="p100086"></a>3.26 референсная последовательность (reference sequence): Последовательность нуклеиновой кислоты, используемая либо для выравнивания путем картирования ридов последовательности, либо в качестве основы для аннотаций, таких как гены и вариации последовательности.
<a id="p100087"></a>3.27 демультиплексирование (demultiplexing): Вычислительный процесс, обратный процессу мультиплексирования, смешивание двух или более образцов вместе таким образом, чтобы их можно было секвенировать за один цикл на приборе MPS.
<a id="p100088"></a>*Примечание* 1 - Образцы, подлежащие объединению, должны иметь штрихкоды/индексы до смешивания.
<a id="p100089"></a>*Примечание* 2 - Демультиплексирование - это вычислительный алгоритм, который разделяет пул ридов в соответствии с их исходным образцом на основе штрихкода.

<a id="p100090"></a>3.28 картирование (mapping): Сборка последовательностей нуклеиновых кислот против существующей базовой (эталонной) последовательности, чтобы построить консенсусную последовательность.
<a id="p100091"></a>3.29 спаренные концевые риды (mate pairs, mate pair reads): Парные риды, которые соответствуют концам длинного фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, полученного путем сжатия образца на большие фрагменты (более 2 кб или не менее 2 кб).
<a id="p100092"></a>3.30 массовое параллельное секвенирование; MPS (massively parallel sequencing; MPS): Метод секвенирования, основанный на определении полимеризации инкремента на основе шаблона множества независимых молекул ДНК одновременно.
<a id="p100093"></a>*Примечание* - Технология массивно-параллельного секвенирования может обеспечить миллионы или миллиарды коротких прочтений за один цикл.

<a id="p100094"></a>3.31 парно-концевые риды (paired-end reads): Секвенирование ридов обоих концов фрагмента ДНК.
<a id="p100095"></a>*Примечание* - При парно-концевом секвенировании прибор секвенирует оба конца коротких вставок, как правило, от 200 до 800 бит/с.

<a id="p100096"></a>3.32 оценка качества секвенирования; показатель качества Q (quality score, Q score, Phred quality score): Мера качества секвенирования данного нуклеотидного основания.
<a id="p100097"></a>*Примечание* 1 - Q вычисляют по формуле

<a id="p100098"></a>Q = -10log10(p),

<a id="p100099"></a>где p - оценочная вероятность того, что основание названо неверно.
<a id="p100100"></a>*Примечание* 2 - Оценка качества, равная 20, представляет собой вероятность ошибки 1 к 100, что соответствует точности вызова 99%.
<a id="p100101"></a>*Примечание* 3 - Более высокие баллы качества указывают на меньшую вероятность ошибки. Более низкие показатели качества могут привести к тому, что значительная часть ридов окажется непригодной для использования. Низкие показатели качества могут также указывать на ложноположительные вызовы вариантов, что приводит к неточным выводам.

<a id="p100102"></a>3.33 цикл (запуск) (run): Единый технологический цикл секвенсора от момента инициирования до получения исходных данных.
<a id="p100103"></a>3.34 аннотация секвенированной последовательности (sequence annotation): Процесс добавления пояснения, комментария или ссылки на конкретные особенности в последовательности ДНК, РНК или белка с описательной информацией о структуре или функции.
<a id="p100104"></a>*Примечание* - Процесс аннотации секвенированной последовательности можно рассматривать как присвоение метаданных последовательности.

<a id="p100105"></a>3.35 одноконцевой рид (одноконцевое прочтение) (single-end read): Эквивалентное прочтение, получаемое при прочтении фрагмента ДНК с одного конца до другого.
<a id="p100106"></a>3.36 однонуклеотидный вариант; SNV (single nucleotide variant, SNV): Изменение в одном нуклеотиде молекулы нуклеиновой кислоты.
<a id="p100107"></a>3.37 структурная вариация; SV (structural variation, SV): Фрагмент ДНК размером примерно 1000 оснований или больше, который может включать инверсии и сбалансированные транслокации или геномный дисбаланс.
<a id="p100108"></a>*Примечание* - Общие типы структурных вариантов включают в себя варианты числа копий (делеции, вставки, амплификации, дупликации), делеции с нейтральным числом копий (потеря гетерозиготности), инверсии, сегментные дупликации и транслокации (сбалансированные или несбалансированные).

<a id="p100109"></a>3.38 субчтение (subread): Доля прочтения, находящаяся между адаптерами шпильки.
<a id="p100110"></a>3.39 тримминг исходных прочтений (trimming of raw reads): Процедура, направленная на удаление низкокачественных частей или загрязнений последовательности с сохранением самой длинной высококачественной части чтения MPS.
<a id="p100111"></a>3.40 вариации (variation): Отличия одного или нескольких оснований нуклеиновой кислоты в последовательности по отношению к ожидаемому(ым) основанию(ям).
<a id="p100112"></a>3.41 идентификация вариантов (коллинг) (variant calling): Логическое заключение о том, что в определенной позиции нуклеотид исследуемой ДНК отличается от нуклеотида референсной последовательности.
<a id="p100113"></a>3.42 волновод с нулевым режимом; ZMW (zero mode waveguide, ZMW): Оптический волновод, который направляет световую энергию в объем, который по всем измерениям мал по сравнению с длиной волны света.
<a id="p100114"></a>*Примечание* - Полимераза закрепляется на дне этой ZMW, и включение нуклеотидов измеряется по увеличению флуоресценции во время связывания с последующим уменьшением после включения.


### <a id="p100115"></a>4 Исходные данные



#### <a id="p100116"></a>4.1 Общие положения


<a id="p100117"></a>Каждому нуклеотиду в последовательности необходимо присвоить числовое значение (основная оценка качества), которое соотносится с предполагаемой точностью процесса распознавания нуклеотидных оснований (base calling), если это применимо.


#### <a id="p100118"></a>4.2 Файл с исходными данными


<a id="p100119"></a>Для генерации файлов чтения последовательностей следует использовать программное обеспечение и/или конвейеры, специфичные для конкретного прибора. Контролируемые физические параметры, такие как соотношение сигнал/шум, должны быть задокументированы. Также эти физические параметры необходимо контролировать во время каждого эксперимента по секвенированию.
<a id="p100120"></a>Файлы чтения последовательностей должны быть сконфигурированы в соответствующий формат файла, содержащий компиляцию отдельных чтений последовательностей, каждое из которых имеет свой собственный идентификатор, и ассоциированную оценку качества основания для каждого нуклеотида.
<a id="p100121"></a>*Примечание* - Формат FASTQ (или конвертируемый в формат FASTQ) может использоваться в качестве стандартного формата де-факто для последующего анализа качества наборов данных MPS. FASTQ широко признан в качестве кроссплатформенного формата обмена файлами.

<a id="p100122"></a>Файл выходных данных, полученных после проведения секвенирования, и соответствующие метрики качества должны быть проанализированы в последующем биоинформатическом конвейере с использованием соответствующего программного обеспечения.


#### <a id="p100123"></a>4.3 Оценка качества исходных данных



##### <a id="p100124"></a>4.3.1 Общие требования

<a id="p100125"></a>Показатели контроля качества могут отличаться в зависимости от платформы MPS, метода подготовки библиотеки и предполагаемого использования анализа.
<a id="p100126"></a>Результаты секвенирования должны интерпретироваться компетентным персоналом. Интерпретацию выполняют таким образом, чтобы соответствовать уровню качества, соответствующему предполагаемой цели анализа, с учетом статистически достоверного числа повторных прочтений.
<a id="p100127"></a>Инструменты обработки ридов применяют с учетом оценки качества и обрезки необработанных прочтений.

##### <a id="p100128"></a>4.3.2 Базовая статистика

<a id="p100129"></a>Необходимо зарегистрировать основные статистические данные, включая, но не ограничиваясь ими:
<a id="p100130"></a>a) тип платформы;
<a id="p100131"></a>b) тип рида;
<a id="p100132"></a>c) набор для подготовки библиотеки;
<a id="p100133"></a>d) длину рида;
<a id="p100134"></a>e) количество ридов;
<a id="p100135"></a>f) общее содержание GC;
<a id="p100136"></a>g) общую длину последовательностей.

##### <a id="p100137"></a>4.3.3 Показатели качества

<a id="p100138"></a>К показателям контроля качества для оценки исходных данных относятся, но не ограничиваются:
<a id="p100139"></a>a) распределение длины последовательностей;
<a id="p100140"></a>b) на содержание GC последовательности;
<a id="p100141"></a>c) показатель качества:
1) <a id="p100142"></a>качество последовательности оснований;
2) <a id="p100143"></a>показатель качества последовательности.
<a id="p100144"></a>*Примечание* 1 - Низкое качество оценки может указывать на увеличение числа ложноположительных вызовов вариантов;

3) <a id="p100145"></a>все последовательности должны быть помечены как "предупреждение" или "пройдено" для качества последовательности по каждому основанию;
<a id="p100146"></a>d) состав последовательности по нуклеотидам;

<div align="center">

<a id="p100147"></a>e) допустимость соотношения сигнал/шум;

</div>

<a id="p100148"></a>f) уровни дупликаций последовательности;
<a id="p100149"></a>g) уровень перепредставленности последовательностей;
<a id="p100150"></a>h) плотность кластера;
<a id="p100151"></a>i) отношение транзиция/трансверсия для секвенирования целого экзома или целого генома или секвенирования больших ампликонов;
<a id="p100152"></a>g) доля адаптеров/загрязнение (контаминация) последовательности адаптерами;
<a id="p100153"></a>k) загрязняющие вещества (идентификация, количественное определение);
<a id="p100154"></a>l) частота ошибок.
<a id="p100155"></a>*Примечание* 2 - Включает в себя ошибки гомополимера: ошибки в количестве оснований, вызванные тем, когда один нуклеотид встречается в последовательности более одного раза в последовательном порядке;

<a id="p100156"></a>m) анализ k-меров.
<a id="p100157"></a>*Примечание* 3 - В вычислительной геномике k-меры относят ко всем возможным подпоследовательностям (длиной k) из последовательности нуклеиновой кислоты. Перепредставленность k-меров может быть проанализирована для обнаружения потенциальной неправильной сборки генома, если повторяющиеся последовательности ДНК, возможно, были объединены;

<a id="p100158"></a>n) N фрагмент.
<a id="p100159"></a>*Примечание* 4 - Количество и/или процент неоднозначных вызовов;

<a id="p100160"></a>o) повторение растяжки и повторение последовательности;
<a id="p100161"></a>p) распределение нуклеотидов между циклами.


#### <a id="p100162"></a>4.4 Предварительная обработка исходных данных


<a id="p100163"></a>**Предварительная обработка исходных данных может включать следующие вычислительные этапы, если они применимы, но не ограничивается ими:**
<a id="p100164"></a>a) удаление/обрезку некачественных последовательностей/баз;
<a id="p100165"></a>b) демультиплексирование;
<a id="p100166"></a>c) удаление адаптеров/праймеров и загрязнений;
<a id="p100167"></a>d) исправление ошибок;
<a id="p100168"></a>e) фильтрацию дуплицированных ридов;
<a id="p100169"></a>f) обрезку ридов до фиксированной длины;
<a id="p100170"></a>g) вызов CCS-ридов.
<a id="p100171"></a>При использовании данных CCS необходимо получить и отфильтровать риды CCS перед последующим анализом.


### <a id="p100172"></a>5 Выравнивание последовательностей и картирование



#### <a id="p100173"></a>5.1 Общие требования


<a id="p100174"></a>Стратегия выравнивания последовательностей и картирования должна быть выбрана на основании приложения.
<a id="p100175"></a>*Пример* - Существует сплайсированное картирование для РНК и несплайсированное картирование для стратегии картирования секвенирования РНК.
<a id="p100176"></a>Для выравнивания допускается использовать программное обеспечение и инструменты для выравнивания и картирования.
<a id="p100177"></a>Качество выравнивания допускается оценивать визуально, используя соответствующие виды выравнивания, а также используя информацию, представленную в файле выравнивания.
<a id="p100178"></a>Примеры программного обеспечения для выравнивания и картирования последовательностей различного назначения приведены в [приложении C](#p100439).
<a id="p100179"></a>Для картирования используются референсные геномы/референсные целевые области нуклеиновых кислот, которые должны быть тщательно подобраны в зависимости от плана эксперимента.
<a id="p100180"></a>*Примечание* 1 - Изучение содержит версию референсного генома/референсной целевой области нуклеиновой кислоты, выбор различных штаммов в одном организме и выбор геномов с маской, мягкой маской или без маски.
<a id="p100181"></a>*Примечание* 2 - Программное обеспечение для выравнивания и картирования секвенирования с открытым исходным кодом доступно онлайн.


#### <a id="p100182"></a>5.2 Последовательность и формат файла картирования


<a id="p100183"></a>Данные выравнивания последовательностей всегда хранятся в следующих форматах файлов.
<a id="p100184"></a>a) Карта выравнивания последовательностей (SAM) [[17]](#p100486), [[24]](#p100500).
<a id="p100185"></a>*Примечание* 1 - SAM представляет собой текстовый формат с разделителем TAB, состоящий из заголовка, который является необязательным, и секции выравнивания. Каждая строка выравнивания имеет 11 обязательных полей для основной информации о выравнивании, такой как положение сопоставления, и переменное количество необязательных полей для гибкой или специфической для выравнивателя информации.

<a id="p100186"></a>b) Карта двоичного выравнивания (BAM) [[15]](#p100482), [[17]](#p100486).
<a id="p100187"></a>*Примечание* 2 - Это сжатый формат, аналогичный формату SAM в двоичном виде.

<a id="p100188"></a>c) Сжатая карта выравнивания, ориентированная на ссылку (CRAM) [[16]](#p100484).
<a id="p100189"></a>*Примечание* 3 - CRAM - это формат файла чтения секвенирования, который экономит место за счет сжатия данных последовательностей на основе ссылок и предлагает режимы сжатия без потери информации и с потерями.

<a id="p100190"></a>d) Группа экспертов по движущимся изображениям в геномике (MPEG-G) [[3]](#p100458) - [[8]](#p100468).
<a id="p100191"></a>*Примечание* 4 - MPEG-G - это формат представления геномики, основанный на концепции геномной записи, структуре данных, состоящей либо из одного прочтения последовательности, либо из парных прочтений последовательности и связанной с ними информации о секвенировании и выравнивании; она может содержать подробные данные сопоставления и выравнивания, идентификатор одиночного или парного чтения (имя чтения) и значения качества. Геномные записи агрегируются и кодируются в структурах, называемых единицами доступа. Эти структуры представляют собой единицы закодированной геномной информации, к которым можно получить отдельный доступ и проверить их.
<a id="p100192"></a>*Примечание* 5 - MPEG-G определен в серии стандартов ИСО/МЭК 23092.

<a id="p100193"></a>Файл выравнивания должен содержать информацию о расположении, ориентации и качестве каждого чтения (рида) в выравнивании.
<a id="p100194"></a>Для работы с файлами выравнивания могут применяться алгоритмы и инструменты в зависимости от их применения.


#### <a id="p100195"></a>5.3 Контроль качества выравнивания последовательностей и картирование



##### <a id="p100196"></a>5.3.1 Базовая статистика выравнивания


###### <a id="p100197"></a>5.3.1.1 Общие требования

<a id="p100198"></a>Необходимо получить и записать основные статистики выравнивания или картирования.
<a id="p100199"></a>Базовая статистика выравнивания или картирования может отличаться в зависимости от плана эксперимента и типа считывания.

###### <a id="p100200"></a>5.3.1.2 Статистика картирования для одноконцевых ридов

<a id="p100201"></a>a) Общее количество ридов относится к количеству прочтений, которые сопоставлены с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100202"></a>b) Несопоставленные риды означают количество прочтений, которые не удалось сопоставить с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100203"></a>c) Сопоставленные риды означают количество прочтений, выровненных с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100204"></a>d) Уникально сопоставленные риды означают количество прочтений, точно выровненных с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100205"></a>*Примечание* 1 - Уникальность картирования зависит от обстоятельств. Риды, уникально сопоставленные на основе одного набора параметров сопоставления, могут быть многократно сопоставленными прочтениями при другом наборе параметров сопоставления.

<a id="p100206"></a>e) Многохитовые сопоставленные риды означают количество прочтений, выровненных более одного раза с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100207"></a>*Примечание* 2 - Мультихит зависит от специфики картирования.


###### <a id="p100208"></a>5.3.1.3 Статистика картирования для парно-концевых ридов

<a id="p100209"></a>a) Общее количество спаренных концевых ридов относится к количеству парно-концевых прочтений, сопоставленных с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100210"></a>**b) Сопоставленные спаренные концевые риды - число парных ридов, в которых оба были сопоставлены.**
<a id="p100211"></a>c) Частично сопоставленные спаренные концевые риды - число парных прочтений, в которых сопоставлен только один из них.
<a id="p100212"></a>d) Несопоставленные спаренные концевые риды - число парных ридов, которые не удалось сопоставить с эталонной последовательностью или геномом.
<a id="p100213"></a>e) Неправильно сопоставленные спаренные концевые риды - число парных ридов, из которых один был сопоставлен с дискордантной ориентацией.
<a id="p100214"></a>*Примечание* 1 - Также известны под наименованием: несогласованно сопоставленные пары.

<a id="p100215"></a>f) Под правильно сопоставленными спаренными концевыми ридами понимается общее число парных прочтений, из которых оба сопряженных рида были сопоставлены с согласованной ориентацией.
<a id="p100216"></a>*Примечание* 2 - Также известны под наименованием: согласованно сопоставленные пары.


###### <a id="p100217"></a>5.3.1.4 Длина сопоставленного субрида

<a id="p100218"></a>Длина выравнивания субрида с целевой эталонной последовательностью не включает последовательность адаптера.

##### <a id="p100219"></a>5.3.2 Индикаторы качества

<a id="p100220"></a>В зависимости от условий применения рекомендуется использовать следующие параметры контроля качества:
<a id="p100221"></a>a) скорость выравнивания.
<a id="p100222"></a>*Примечание* 1 - Низкое качество картирования может быть результатом неспецифической амплификации, захвата загрязнения внецелевой ДНК или других причин;

<a id="p100223"></a>b) длина фрагмента или длина ДНК/РНК, которая должна быть секвенирована;
<a id="p100224"></a>c) статистика размера вставки для парного прочтения - длина ДНК/РНК, предназначенная для секвенирования между адаптерами.
<a id="p100225"></a>*Примечание* 2 - Пик распределения размера вставки используют для оценки качества;

<a id="p100226"></a>d) уровень дупликации только для секвенирования на основе ампликонов;
<a id="p100227"></a>e) покрытие по назначению, включая глубину, ширину и диапазон покрытия.
<a id="p100228"></a>Примечание 3 - В [приложении B](#p100378) приведен список рекомендуемого покрытия для различных использований;

<a id="p100229"></a>f) смещение AT/GC.
<a id="p100230"></a>*Примечание* 4 - Оценку допускается проводить в соотношении % GC с глубиной секвенирования/покрытием;

<a id="p100231"></a>g) оценка качества картирования;
<a id="p100232"></a>h) эффективность захвата.
<a id="p100233"></a>*Примечание* 5 - Эффективность захвата является наиболее важным параметром контроля качества для секвенирования экзома или других секвенирований на основе захвата мишени;

<a id="p100234"></a>i) средняя или медианная глубина, процент генома, охваченного секвенированием на данной глубине;
<a id="p100235"></a>j) количество дискордантно сопоставленных пар;
<a id="p100236"></a>k) высокое качество выровненных прочтений;
<a id="p100237"></a>l) частота несовпадений;
<a id="p100238"></a>m) точность консенсуса.
<a id="p100239"></a>*Примечание* 6 - Точность консенсуса основывается на выравнивании нескольких секвенированных прочтений и субридов вместе, не обязательно с эталонной последовательностью;

<a id="p100240"></a>n) точность кругового консенсуса.
<a id="p100241"></a>*Примечание* 7 - Точность кругового консенсуса основана на нескольких проходах секвенирования вокруг одной круговой молекулы шаблона. Это используется в CCS;

<a id="p100242"></a>o) точность субридов.
<a id="p100243"></a>*Примечание* 8 - Точность распознавания оснований после картирования.


##### <a id="p100244"></a>5.3.3 Методы оценки качества выравнивания и картирования

<a id="p100245"></a>Для оценки качества выравнивания следует применять подход, основанный на балльной системе оценивания.
<a id="p100246"></a>*Примечание* - Выбор матрицы подсчета баллов зависит от области применения.


#### <a id="p100247"></a>5.4 Постобработка выравнивания


<a id="p100248"></a>Постобработка выравнивания может включать, но не ограничиваться:
<a id="p100249"></a>a) локальное выравнивание вокруг инделов или расчет выравниваний по основанию;
<a id="p100250"></a>b) удаление дубликатов;
<a id="p100251"></a>c) перекалибровку оценок качества оснований;
<a id="p100252"></a>d) среднюю длину ридов после обрезки по качеству оснований.


### <a id="p100253"></a>6 Идентификация вариантов



#### <a id="p100254"></a>6.1 Общие требования


<a id="p100255"></a>6.1.1 Существует четыре основных класса вариантов последовательности (SNV, инделы, CNVs и SVs). Для разных классов вариантов последовательности следует применять различные вычислительные подходы для чувствительной и специфической идентификации.
<a id="p100256"></a>6.1.2 Диапазон программных инструментов и тип необходимой валидации зависят от плана анализа.


#### <a id="p100257"></a>6.2 Файл данных для идентификации вариантов


<a id="p100258"></a>6.2.1 Распознанные варианты должны быть аннотированы с использованием соответствующей спецификации. Спецификация должна содержать метаинформацию, строку заголовка и строки данных, каждая из которых содержит информацию о позиции в геноме и информацию о генотипе образцов для каждой позиции.
<a id="p100259"></a>Пример 1 - Выявленные варианты аннотируются с использованием формата идентификации вариантов (VCF) [[31]](#p100514).
<a id="p100260"></a>*Пример* 2 - Существуют альтернативные спецификации для представления и хранения вариантов:
<a id="p100261"></a>a) геномные конвенции VCF;
<a id="p100262"></a>b) Онтология последовательностей, версия формата вариации генома 1.10;
<a id="p100263"></a>c) Общество по изучению вариаций генома человека, Общество по изучению вариаций генома человека (HGVS), простая версия 15.11;
<a id="p100264"></a>d) Глобальный альянс по геномике и здоровью (GA4GH), форматы файлов.
<a id="p100265"></a>6.2.2 Файлы вариантов должны включать как спецификацию, так и используемую версию.
<a id="p100266"></a>6.2.3 Устройства распознавания вариантов должны быть сконфигурированы на вывод; эталоны, варианты и отсутствие вызовов вместе с местной информацией, по крайней мере в области целевых областей.


#### <a id="p100267"></a>6.3 Показатели качества при определении вариантов


<a id="p100268"></a>Метрики контроля качества должны включать, но не ограничиваться (если применимо):
<a id="p100269"></a>a) пороговые значения для глубины покрытия ридов в позиции варианта;
<a id="p100270"></a>b) оценку качества вариантов;
<a id="p100271"></a>c) смещение цепочек;
<a id="p100272"></a>d) процент аллельных прочтений;
<a id="p100273"></a>e) дополнительные конкретные метрики, относящиеся к точности и чувствительности вызова вариантов, которые могут включать, но не ограничиваются:
1) <a id="p100274"></a>общее число вариантов,
2) <a id="p100275"></a>количество ложноположительных результатов,
<a id="p100276"></a>**3) количество ложноотрицательных вариантов,**
4) <a id="p100277"></a>количество несовпадений аллелей и генотипов,
5) <a id="p100278"></a>соотношение транзиций/трансверсий,
6) <a id="p100279"></a>соотношение гетерозигот/гомозигот (het/hom);
<a id="p100280"></a>f) анализ контаминации перекрестной выборки.


#### <a id="p100281"></a>6.4 Обработка ложноположительных вариантов


<a id="p100282"></a>Ложноположительные варианты должны быть отмечены или отфильтрованы из исходных файлов вариантов на основе нескольких выравниваний последовательностей и метрик контроля качества, связанных с поиском вариантов.


#### <a id="p100283"></a>6.5 Аннотация секвенированной последовательности


<a id="p100284"></a>Варианты могут быть аннотированы для определения их биологической значимости, что позволяет определить функциональные приоритеты и интерпретировать последующие данные.


### <a id="p100285"></a>7 Валидация



#### <a id="p100286"></a>7.1 Общие требования


<a id="p100287"></a>7.1.1 Лаборатории, предлагающие тестирование на основе MPS, должны провести "внутреннюю" валидацию биоинформатического конвейера.
<a id="p100288"></a>7.1.2 Требования к производительности анализа необходимо установить в ходе процедуры валидации и те же спецификации следует использовать для мониторинга производительности анализа при каждой обработке образца.
<a id="p100289"></a>7.1.3 Конкретные параметры контроля качества и обеспечения качества должны оцениваться в ходе валидации и использоваться для определения удовлетворительных характеристик.
<a id="p100290"></a>7.1.4 Каждая лаборатория должна определить критерии и средства мониторинга всех показателей качества для обеспечения оптимальных аналитических характеристик. Метрики качества, используемые для мониторинга, должны быть внесены в документы и периодически проверяться.
<a id="p100291"></a>Рекомендуемые показатели качества и их конкретные значения для некоторых платформ приведены в [приложении A](#p100317).
<a id="p100292"></a>7.1.5 Лаборатории должны предусмотреть конкретные меры по обеспечению сохранности каждого файла данных, созданных в биоинформатическом конвейере, и обеспечению предупреждения или предотвращению использования файлов данных, которые были изменены несанкционированным или непреднамеренным образом.
<a id="p100293"></a>7.1.6 Дополнительная валидация требуется каждый раз, когда в любой компонент биоинформатического конвейера вносят значительные изменения.


#### <a id="p100294"></a>7.2 Валидация показателей качества


<a id="p100295"></a>7.2.1 Валидацию анализа следует проводить на основе уточненной и документированной цели анализа. Необходимо определить целевое назначение измерения и внести его в документы.
<a id="p100296"></a>7.2.2 Лаборатории должны установить приемлемые пороговые значения оценки качества сырой базовой идентификации для анализа во время валидации.
<a id="p100297"></a>7.2.3 Для снижения частоты ложного распознавания следует разработать методы предварительной обработки для удаления некачественных базовых вызовов.
<a id="p100298"></a>7.2.4 Степень смещения GC во всех частях генома, включенных в анализ, должна быть определена в ходе валидации.
<a id="p100299"></a>7.2.5 Параметры качества картирования должны быть установлены в плане валидации и должны показывать, что тест оценивает только те риды, которые отображаются на области, являющиеся мишенью анализа. При необходимости следует установить фазы для фильтрации прочтений, которые отображаются в нецелевых областях.
<a id="p100300"></a>7.2.6 Охват определяется для достижения адекватной чувствительности и специфичности в областях, представляющих интерес.
<a id="p100301"></a>**7.2.7 Каждая лаборатория должна установить минимальные критерии глубины покрытия, характерной для конкретной области в стандартных условиях анализа, в зависимости от цели проведения секвенирования. Для однородного образца последовательность должна быть подтверждена; меньшая глубина допустима. В процессе вызова вариантов по области или редкой последовательности в смешанном образце, составляющем 1%, необходимо глубокое секвенирование.**
<a id="p100302"></a>7.2.8 Требуемый уровень покрытия в целевых областях должен быть определен на этапе валидации (диапазон покрытия). Рекомендуемый диапазон для различных приложений описан в [приложении B](#p100378).
<a id="p100303"></a>7.2.9 Для каждого анализа должны быть установлены приемлемые параметры для максимальной частоты дупликации.
<a id="p100304"></a>7.2.10 Для увеличения количества пригодных для использования данных секвенирования и предотвращения перекосов в долях аллелей следует установить фильтрацию дуплицированных ридов с помощью аналитического конвейера.
<a id="p100305"></a>7.2.11 Каждая лаборатория должна определить допустимый уровень смещения цепочек и изложить конкретные критерии, когда следует проводить альтернативное тестирование.
<a id="p100306"></a>7.2.12 Показатели качества могут быть проверены с помощью соответствующих эталонных стандартов, которые были хорошо охарактеризованы и имеют надежные эталонные последовательности для точного выравнивания, поиска вариантов и т.д.
<a id="p100307"></a>7.2.13 Рекомендуется проведение секвенирования по методу Сэнгера для подтверждения наиболее важной связующей области.


### <a id="p100308"></a>8 Документирование


<a id="p100309"></a>8.1 Лаборатории должны документировать все алгоритмы, программное обеспечение и базы данных, используемые при анализе, интерпретации и представлении результатов MPS. Версия каждого из этих компонентов в общем биоинформатическом конвейере должна быть записана и отслеживаться для каждого результата.
<a id="p100310"></a>8.2 В документации лаборатории должны содержаться сведения о любых пользовательских настройках, которые отличаются от конфигурации по умолчанию, или должно быть указано, какие параметры были изменены.
<a id="p100311"></a>8.3 При необходимости следует указать номер версии эталонной последовательности и подробную информацию.
<a id="p100312"></a>8.4 Лаборатории также должны документировать параметры контроля качества для оптимальной работы.
<a id="p100313"></a>*Пример* - На первичном этапе лаборатория определяет приемлемые критерии, такие как количество прочтений, проходящих через фильтры качества, определенные прибором.
<a id="p100314"></a>8.5 Лаборатории должны фиксировать в протоколах процессы биоинформатики, используемые для сокращения большого набора данных о вариантах до списка причинных генов и/или генов-кандидатов и/или вариантов.
<a id="p100315"></a>8.6 Доказательства соответствия установленным требованиям должны быть также задокументированы.





<a id="p100316"></a>Приложение A
**(справочное)**

<a id="p100317"></a>ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА ДЛЯ КОНКРЕТНЫХ ПРИМЕРОВ ПЛАТФОРМ MPS

<a id="p100318"></a>Для секвенирования нуклеиновых кислот, как правило, используют приведенные далее платформы MPS. Примеры показателей качества, используемые для оценки качества, представлены в [таблице A.1](#p100321).
<a id="p100319"></a>*Примечание* - Секвенирование целого генома человека используют в качестве примера, чтобы обеспечить конкретные значения для каждого показателя качества.

<a id="p100320"></a>Таблица A.1


<table>
<colgroup><col width="21%"><col width="13%"><col width="12%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="14%"><col width="9%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100321"></a>Показатели качества для конкретных платформ MPS</td><td></td><td><a id="p100322"></a>Наименование платформы</td><td><a id="p100323"></a>Формат файла исходных данных</td><td><a id="p100324"></a>Длина рида</td><td><a id="p100325"></a>Оценка качества (H/L)</td><td><a id="p100326"></a>GC-состав</td><td><a id="p100327"></a>Степень дупликации</td></tr>
<tr><td><a id="p100328"></a>Плотность кластеров</td><td><a id="p100329"></a>Степень адаптера</td><td><a id="p100330"></a>$illumina^{®}$ <sup><a href="#p100370">a</a></sup> HiSeq 4000</td><td><a id="p100331"></a>fastq.gz</td><td><a id="p100332"></a>От 50 до 200 bp</td><td><a id="p100333"></a>&gt; Q30</td><td><a id="p100334"></a>От 39% до 42%</td><td><a id="p100335"></a>&lt; 10%</td></tr>
<tr><td><a id="p100336"></a>5 млрд</td><td><a id="p100337"></a>&lt; 3%</td><td><a id="p100338"></a>Thermo FisherProtonTM <sup><a href="#p100371">b</a></sup></td><td><a id="p100339"></a>DAT</td><td><a id="p100340"></a>От 50 до 200 bp</td><td><a id="p100341"></a>&gt; Q20</td><td><a id="p100342"></a>От 39% до 42%</td><td><a id="p100343"></a>NA</td></tr>
<tr><td><a id="p100344"></a>От 60 до 80 млн</td><td><a id="p100345"></a>&lt; 3%</td><td><a id="p100346"></a>BGI <a href="#p100372"><sup>c</sup>/MGI</a> MGISEQ-2000</td><td><a id="p100347"></a>fastq.gz</td><td><a id="p100348"></a>От 50 до 200 bp</td><td><a id="p100349"></a>&gt; Q30</td><td><a id="p100350"></a>От 39% до 42%</td><td><a id="p100351"></a>&lt; 5%</td></tr>
<tr><td><a id="p100352"></a>1,5 млрд</td><td><a id="p100353"></a>&lt; 3%</td><td><a id="p100354"></a>Oxford Nanopore $PromethION^{®}$ <sup><a href="#p100373">d</a></sup></td><td><a id="p100355"></a>F<sub>AST5</sub></td><td><a id="p100356"></a>От 10 до 300 kbp</td><td><a id="p100357"></a>&gt; Q20</td><td><a id="p100358"></a>От 39% до 42%</td><td><a id="p100359"></a>NA</td></tr>
<tr><td><a id="p100360"></a>2560 каналов <sup><a href="#p100375">f</a></sup></td><td><a id="p100361"></a>&lt; 3%</td><td><a id="p100362"></a>$PacBio^{®}SequelII$ <sup><a href="#p100374">e</a></sup></td><td><a id="p100363"></a>bam</td><td><a id="p100364"></a>От 10 до 100 kbp</td><td><a id="p100365"></a>&gt; Q20</td><td><a id="p100366"></a>От 39% до 42%</td><td><a id="p100367"></a>NA</td></tr>
<tr><td colspan="8"><a id="p100368"></a><a id="p100369"></a>8 млн ZMWs <a href="#p100376">&lt;g&gt;</a><br>&lt; 3%</td></tr>
<tr><td colspan="8"><a id="p100370"></a><a id="p100371"></a><a id="p100372"></a><a id="p100373"></a><a id="p100374"></a><a id="p100375"></a><a id="p100376"></a><sup>a</sup> $illumina^{®}$ является торговой маркой биотехнологической компании illumina, Inc. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения указанного продукта со стороны ИСО.<br><sup>b</sup> Thermo Fisher ProtonTM является торговой маркой биотехнологической компании Thermo Fisher Scientific. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения указанного продукта со стороны ИСО.<br><sup>c</sup> MGI является торговой маркой компании, занимающейся секвенированием генома BGI. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения указанного продукта со стороны ИСО.<br><sup>d</sup> Oxford Nanopore $PromethION^{®}$ является торговой маркой Oxford Nanopore Technologies Limited. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения указанного продукта со стороны ИСО.<br><sup>e</sup> $PacBioSequelII^{®}$ является торговой маркой биотехнологической компании Pacific Biosciences. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения указанного продукта со стороны ИСО.<br><sup>f</sup> Oxford Nanopore измеряется с помощью каналов.<br>&lt;g&gt; Pacific Biosciences измеряется в ZMWs (волновод с нулевой модой).</td></tr>
</table>






<a id="p100377"></a>Приложение B
(справочное)

<a id="p100378"></a>ОХВАТ И РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ПРОЧТЕНИЮ ПО ПРИЛОЖЕНИЯМ

<a id="p100379"></a>В [таблице B.1](#p100381) представлены примеры охвата и уровней считывания множеством различных приложений для секвенирования.

<a id="p100380"></a>Таблица B.1

<a id="p100381"></a>Охват и рекомендации по прочтению по приложениям


<table>
<colgroup><col width="21%"><col width="36%"><col width="21%"><col width="23%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100382"></a>MPS тип</td><td><a id="p100383"></a>Приложение</td><td><a id="p100384"></a>Рекомендованное покрытие (E)</td><td><a id="p100385"></a>Рекомендованные риды</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100386"></a>Секвенирование целого генома</td><td><a id="p100387"></a>Гомозиготные однонуклеотидные варианты (SNVs) - однонуклеотидные изменения в генах, когда аллели идентичны</td><td><a id="p100388"></a>15x <sup><a href="#p100435">a</a></sup></td><td><a id="p100389"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100390"></a>Гетерозиготные SNV - однонуклеотидные изменения в генах, когда аллели отличаются друг от друга</td><td><a id="p100391"></a>33x</td><td><a id="p100392"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100393"></a>Мутации вставки/делеции (INDELS) - мутации в геноме, при которых происходит вставка или удаление нуклеотидов</td><td><a id="p100394"></a>60x</td><td><a id="p100395"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100396"></a>Вариация числа копий (CNV) - дисперсия в количестве копий гена у разных людей</td><td><a id="p100397"></a>От 1x до 8x</td><td><a id="p100398"></a>-</td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100399"></a>Секвенирование целого экзома</td><td><a id="p100400"></a>Гомозиготные SNV</td><td><a id="p100401"></a>100x (3x покрытие локального рида) <sup><a href="#p100436">b</a></sup></td><td><a id="p100402"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100403"></a>Гетерозиготные SNVs</td><td><a id="p100404"></a>100x (13x покрытие локального рида) <sup><a href="#p100437">c</a></sup></td><td><a id="p100405"></a>-</td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100406"></a>Целевое секвенирование</td><td><a id="p100407"></a>INDELs</td><td><a id="p100408"></a>Не рекомендовано</td><td><a id="p100409"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100410"></a>SNVs/SVs в целевых областях</td><td><a id="p100411"></a>От 1000 до 10 000 раз</td><td><a id="p100412"></a>-</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100413"></a>Секвенирование РНК. Секвенирование транскриптома</td><td><a id="p100414"></a>16S рРНК ген [[23]](#p100498), [[24]](#p100500)</td><td><a id="p100415"></a>-</td><td><a id="p100416"></a>Минимум 100 на образец</td></tr>
<tr><td><a id="p100417"></a>Профилирование дифференциальной экспрессии - количественное измерение экспрессии генов по нескольким генам для изучения различных уровней экспрессии в образце</td><td><a id="p100418"></a>-</td><td><a id="p100419"></a>От 10 млн до 25 млн</td></tr>
<tr><td><a id="p100420"></a>Альтернативный сплайсинг - идентификация различных вариантов сплайсинга из транскриптов мРНК</td><td><a id="p100421"></a>-</td><td><a id="p100422"></a>От 50 млн до 100 млн (для коротких платформ ридов)<br>От 2 млн до 3 млн (для длинных платформ ридов)</td></tr>
<tr><td><a id="p100423"></a>Аллель-специфическая экспрессия - экспрессия транскрипта, на которую влияет аллель конкретного гена</td><td><a id="p100424"></a>-</td><td><a id="p100425"></a>От 50 млн до 100 млн</td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100426"></a>MPS тип</td><td><a id="p100427"></a>Дифференциальная экспрессия - количественное измерение экспрессии малых РНК для изучения различных уровней экспрессии в образце</td><td><a id="p100428"></a>-</td><td><a id="p100429"></a>От ~ 1 млн до 2 млн</td></tr>
<tr><td><a id="p100430"></a>Обнаружение новых малых РНК</td><td><a id="p100431"></a>-</td><td><a id="p100432"></a>От ~ 5 млн до 8 млн</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100433"></a><a id="p100434"></a>Примечание 1 - Результаты могут быть подтверждены дополнительными экспериментами по протеомике.<br>Примечание 2 - Рекомендуемое покрытие относится к образцам генома человека.</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100435"></a><a id="p100436"></a><a id="p100437"></a>--------------------------------<br><sup>a</sup> 15x означает локальное одинаковое покрытие, это не общее среднее покрытие. Числа приведены для примера.<br><sup>b</sup> 100x - общее среднее покрытие для секвенирования целых экзомов. 3x локальное покрытие рида указывает на локальное покрытие для обнаружения SNPV. Числа приведены для примера.<br><sup>c</sup> 00x - общее среднее покрытие для секвенирования экзома. Покрытие 15x локального рида указывает на локальное покрытие для обнаружения SNPV. Числа приведены для примера.</td></tr>
</table>




<div align="center">

<a id="p100438"></a>Приложение C<br>
(справочное)

<a id="p100439"></a>ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДЛЯ ВЫРАВНИВАНИЯ<br>
И СОПОСТАВЛЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<a id="p100440"></a>В [таблице C.1](#p100442) представлены примеры программного обеспечения для выравнивания и сопоставления последовательностей.

<a id="p100441"></a>Таблица C.1

<a id="p100442"></a>Программное обеспечение для выравнивания<br>
и картирования последовательностей

</div>



<table>
<colgroup><col width="47%"><col width="53%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100443"></a>Описание функций</td><td><a id="p100444"></a>Программное обеспечение/инструменты</td></tr>
<tr><td><a id="p100445"></a>Выравнивание или картирование</td><td><a id="p100446"></a>Blast, Blat, SOAP, BWA, Bowtie2 и т.д.</td></tr>
<tr><td><a id="p100447"></a>Оценка участков сплайсинга в анализе РНК-секвенирования</td><td><a id="p100448"></a>Bowtie2 [[25]](#p100502), BWA [[16]](#p100484), HISAT2 [[14]](#p100480), STAR [[15]](#p100482) и т.д.</td></tr>
<tr><td><a id="p100449"></a>Визуализация для представления выравнивания</td><td><a id="p100450"></a>Bam View [[12]](#p100476), Integrative Genomic Viewer [[30]](#p100512)</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100451"></a><a id="p100452"></a>Примечание 1 - Программное обеспечение регулярно обновляется и значительно зависит/связано с платформами, приложениями и данными о последовательности. Эти примеры актуальны в июне 2020 г.<br>Примечание 2 - Примеры программного обеспечения, перечисленные в данной таблице, являются подходящим доступным программным обеспечением. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения указанного продукта со стороны ИСО.</td></tr>
</table>







## <a id="p100453"></a>БИБЛИОГРАФИЯ



| <a id="p100454"></a>[1] | <a id="p100455"></a>ISO/TS 20428, Health informatics - Data elements and their metadata for describing structured clinical genomic sequence information in electronic health records |
| --- | --- |
| <a id="p100456"></a>[2] | <a id="p100457"></a>ISO 22174:2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and definitions |
| <a id="p100458"></a>[3] | <a id="p100459"></a>ISO/IEC 23092-1:2020, Information technology - Genomic information representation - Part 1: Transport and storage of genomic information |
| <a id="p100460"></a>[4] | <a id="p100461"></a>ISO/IEC 23092-2:2020, Information technology - Genomic information representation - Part 2: Coding of genomic information |
| <a id="p100462"></a>[5] | <a id="p100463"></a>ISO/IEC 23092-3:2020, Information technology - Genomic information representation - Part 3: Metadata and application programming interfaces (APIs) |
| <a id="p100464"></a>[6] | <a id="p100465"></a>ISO/IEC 23092-4:2020, Information technology - Genomic information representation - Part 4: Reference software |
| <a id="p100466"></a>[7] | <a id="p100467"></a>ISO/IEC 23092-5:2020, Information technology - Genomic information representation - Part 5: Conformance |
| <a id="p100468"></a>[8] | <a id="p100469"></a>ISO/IEC 23092-6 [<1>](#p100521), Information technology - Genomic information representation - Part 6: Coding of genomic annotations |
| <a id="p100470"></a>[9] | <a id="p100471"></a>Ardui S. et al. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic acids research. [Online]. March 2018; 46(5) 2159 - 2168 [viewed 2019-09-15]. Available at: https://academic.oup.eom/nar/article/46/5/2159/4833218 |
| <a id="p100472"></a>[10] | <a id="p100473"></a>Aziz N. et al. College of American Pathologiests' Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing Clinical Tests. Arch Pathol Lab Med [Online]. April 2015, 139(4), 481 - 493 [viewed 2018-4-10]. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25152313 |
| <a id="p100474"></a>[11] | <a id="p100475"></a>Carver T. et al. Bamview: viewing mapped read alignment data in the context of the reference sequence. Bioinformatics. [Online]. March 2010; 26(5): 676 - 677 [viewed 2019-01-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2828118/ |
| <a id="p100476"></a>[12] | <a id="p100477"></a>Dunnen J.T. et al. HGVS recommendations for the description of sequence variants: 2016 update. March 2nd 2016. [online]. Human mutation. [viewed May 1st 2020] Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/humu.22981 |
| <a id="p100478"></a>[13] | <a id="p100479"></a>Daehwan K. et al. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. August 2nd 2019. [online]. Springer. [viewed May 1st 2020] Available from: https://www.nature.com/articles/s41587-019-0201-4 |
| <a id="p100480"></a>[14] | <a id="p100481"></a>Dobin A. et al. STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. 25th Oct. 2012 [online] Bioinformatics. [viewed May 1st 2020] Available from: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/29/1/15/272537 |
| <a id="p100482"></a>[15] | <a id="p100483"></a>Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-wheeler transform. May 18th 2009. [online] Bioinformatics. [viewed May 1st 2020]. Available from: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/25/14/1754/225615 |
| <a id="p100484"></a>[16] | <a id="p100485"></a>European Nucleotide Archive (ENA) CRAM. [online]. EMBL-EBI 2019 [viewed 2019-01-15] Available at: https://www.ebi.ac.uk/ena/software/cram-toolkit |
| <a id="p100486"></a>[17] | <a id="p100487"></a>Github. SMA/BAM and related specificaitons. [online]. May 5th 2020 Github. [viewed May 27st 2020] Available from: https://samtools.github.io/hts-specs/ |
| <a id="p100488"></a>[18] | <a id="p100489"></a>Github. The Sequence Ontology Genome Variation Format Version 1.10. May 19th 2014 [viewed May 1st 2020]. Available from: https://github.com/The-Sequence-Ontology/Specifications/blob/master/gvf.md |
| <a id="p100490"></a>[19] | <a id="p100491"></a>Gvcftools. gVCF Conventions. September 2012 [online]. Gvcftools [viewed May 1st 2020] Available from: https://sites.google.com/site/gvcftools/home/about-gvcf/gvcf-conventions Illumina. An introduction to next generation sequencing technology, [online], Illumina. [viewed 2018-4-15]. Available at: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf |
| <a id="p100492"></a>[20] | <a id="p100493"></a>Jennings L.J. et al. Guidelines for Validation of Next-Generation Sequencing-Based Oncology Panels. Journal of Molecular Diagnostics [Online]. May 2017, 19 (3), 341 - 365 [viewed 2018-4-15]. Available at: http://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(17)30025-9/fulltext |
| <a id="p100494"></a>[21] | <a id="p100495"></a>Kuczynski J. et al. "Direct sequencing of the human microbiome readily reveals community differences". Genome biology 11.5 (2010): 210 |
| <a id="p100496"></a>[22] | <a id="p100497"></a>Kuczynski J. et al. "Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns". Nature methods 7.10 (2010): 813 |
| <a id="p100498"></a>[23] | <a id="p100499"></a>Langmead B. Salzberg S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. Nat Methods. [Online]. March 2012; 9 (4) [viewed 2019-1-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22388286 |
| <a id="p100500"></a>[24] | <a id="p100501"></a>LI H. et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. [Online]. 2009 Aug; 25(16): 2078-9. [viewed 2019-01-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19505943 |
| <a id="p100502"></a>[25] | <a id="p100503"></a>Pfeifer S. From next-generation resequencing reads to a high-quality variant data set. Heredity. [Online]. February 2017, 118 (2) [viewed 2018-4-15]. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5234474/ |
| <a id="p100504"></a>[26] | <a id="p100505"></a>Reinert K. et al. Alignment of Next-Generation Sequencing Reads. Annu Rev Genomics Human Genetics [Online]. May 2015, 16: 133 - 151 [viewed 2018-05-25] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052 |
| <a id="p100506"></a>[27] | <a id="p100507"></a>Rhoads A., AU K.F. PacBio Sequencing and its Applications. Genomics Proteomics Bioinformatics [Online]. October 2015; 13 (5): 278 - 289 [viewed 2019-09-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26542840 |
| <a id="p100508"></a>[28] | <a id="p100509"></a>Rouven N. et al. The tole of quality control in targeted next-generation sequencing library preparation. Genomics Preteomics Bioinformatics [online]. March 2016, 14, 200 - 206 [viewed 2018-08-01] Available at: https://www. sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022916301073 |
| <a id="p100510"></a>[29] | <a id="p100511"></a>Samtools organisation and repositories. The variant call format specification. April 2nd 2020. [online] samtoools organisation and repositories, [viewed May 1st 2020]. Available from: https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.3.pdf |
| <a id="p100512"></a>[30] | <a id="p100513"></a>Somak R.O.Y. et al. Standards and Guidelines for Validating Next-Generation Sequencing Bioinformatics Pipeline A Joint Recommendation of the Association for Molecular Pathology and the College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics [Online]. Elsevier. November 2017, 20 (1) [viewed 2018-4-12]. Available at: http://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(17)30373-2/pdf |
| <a id="p100514"></a>[31] | <a id="p100515"></a>Trivedi U. H. et al. Quality control of next generation sequencing without a reference. Front Gene [Online]. May 2014, 5, 111 [viewed 2018-4-10]. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018527/ |
| <a id="p100516"></a>[32] | <a id="p100517"></a>Yan G.U.O. et al. Three stage quality control strategies for DNA re-sequencing data. Briefing in Bioinformatics [Online]. September 2013, 15 (6), 879 - 889 [viewed 2018-04-13] Available at: https://academic.oup.com/bib/article/15/6/879/180439 |
| <a id="p100518"></a>[33] | <a id="p100519"></a>ISO/TS 17822-1:2020, In vitro diagnostic test systems - Nucleic acid amplification-based examination procedures for detection and identification of microbial pathogens - Laboratory quality practice guide |



<a id="p100520"></a>

---

<a id="p100521"></a><1> В стадии подготовки.






<table>
<colgroup><col width="50%"><col width="50%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100522"></a>УДК 615.07:006.354</td><td><a id="p100523"></a>ОКС 07.080</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100524"></a>Ключевые слова: секвенирование, массовое параллельное секвенирование, оценка и контроль качества</td></tr>
</table>




<a id="p100525"></a>

---