ГОСТ Р ИСО 20184-2-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования замороженных тканей. Часть 2. Выделенные белки
Актуально на 03.11.2026.
Как цитировать: "ГОСТ Р ИСО 20184-2-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования замороженных тканей. Часть 2. Выделенные белки". ГОСТ Р ИСО 20184-2-2021. https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-iso-20184-2-2021
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2021 № 1049-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 01.04.2022.
Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 октября 2021 г. № 1049-ст
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO
ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЦЕССАМ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАМОРОЖЕННЫХ ТКАНЕЙ
Molecular in vitro diagnostic examinations. Specifications for pre-examination processes for frozen tissue. Part 2. Isolated proteins
Дата введения 1 апреля 2022 года
1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» (Ассоциация «ФЛМ») (Комитетом по молекулярной диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний «ФЛМ») на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы ин витро»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 октября 2021 г. № 1049-ст
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20184-2:2018 «Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования замороженных тканей. Часть 2. Изолированные белки» (ISO 20184-2:2018 «Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for frozen tissue — Part 2: Isolated proteins», IDT).
Международный стандарт разработан Техническим комитетом ИСО/ТК 212 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro» Международной организации по стандартизации (ISO).
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА.
Дополнительные сноски в тексте стандарта, выделенные курсивом, приведены для пояснения текста оригинала
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)
Молекулярная диагностика in vitro, включая молекулярную патологию, позволила добиться значительного прогресса в медицине. Ожидается дальнейший прогресс в области новых технологий анализа нуклеиновых кислот, белков и метаболитов в тканях и жидкостях человеческого организма. Однако в процессе сбора, транспортирования, хранения и обработки образцов профиль и/или целостность молекул может претерпеть радикальные изменения, что приводит к ненадежности или даже невозможности диагностики в связи с тем, что результаты исследования не будут соответствовать реальному состоянию пациента, будут отражать искаженный профиль, в результате процессов, произошедших с образцом до проведения исследования. Следовательно, стандартизация всего процесса, начиная от сбора образцов и заканчивая исследованием белков, необходима. Были проведены исследования с целью установления главных факторов, влияющих на эти процессы. Настоящий стандарт был разработан на основе таких исследований, чтобы регламентировать и стандартизировать этапы работы с замороженными тканями, изучение белков которых планируется проводить на так называемом преаналитическом этапе.
Белковые профили тканей и параметры белок-белкового взаимодействия могут претерпеть значительные изменения до и во время (например, из-за влияния интракорпоральной ишемии), а также после взятия образцов (например, из-за влияния экстракорпорального хранения). Причиной изменений являются, например, индукция и подавление генов, разрушение белков. Количество видов белков может быть различным в тканях разных доноров/пациентов. На экспрессию генов могут повлиять использованный метод лечения, вмешательство (хирургическое вмешательство, биопсия), препараты, применяемые для анестезии или даже лечения сопутствующего заболевания, а также различные условия окружающей среды, в которой находится ткань после изъятия из организма.
Следовательно, крайне важно принять особые меры к тому, чтобы минимизировать упомянутые изменения и модификации в белковом профиле ткани, предназначенной для последующего исследования.
Требования настоящего стандарта не применимы к тканям, прошедшим предварительную химическую стабилизацию перед замораживанием. Кроме того, требования настоящего стандарта не применимы к иммуногистохимическому исследованию белка. В настоящем стандарте используют следующие слова:
- «должен/должна/должно» — указывает на требование;
- «следует» — указывает на рекомендацию;
- «мог/могла/могло бы» — указывает на разрешение;
- «может/могут» — указывает на способность или возможность.
Настоящий стандарт устанавливает требования к обработке, документационному обеспечению и хранению замороженных образцов тканей, предназначенных для проведения исследования выделенных белков, перед проведением молекулярного анализа.
Требования настоящего стандарта распространяются на любые молекулярные диагностические исследования in vitro, в ходе которых исследуют выделенные из замороженной ткани белки, выполняемые медицинскими лабораториями и лабораториями молекулярной патологии. Стандарт также предназначен для использования в лабораториях, разработчиками и производителями средств диагностики in vitro, биобанками, учреждениями и коммерческими организациями, выполняющими биомедицинские исследования, и регулирующими органами.
Примечание - Международные, национальные или региональные регламенты и требования также могут быть применены к конкретным процессам, рассматриваемым в настоящем стандарте.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных — последнее издание (включая все изменения)]:
ISO 15189:2012, Medical laboratories — Requirements for quality and competence (Медицинские лаборатории. Специальные требования к качеству и компетентности)
В настоящем стандарте применены термины по ИСО 15189, а также следующие термины с соответствующими определениями.
Терминологические базы данных ИСО и МЭК доступны по следующим адресам:
- платформа онлайн-просмотра ИСО по адресу: http://www.iso.org/obp;
- электропедия МЭК по адресу: http://www.electropedia.org/.
3.1 аликвота (aliquot): Часть от большего количества гомогенного материала, при взятии которого допустима незначительная погрешность выборки.
Примечание 1 — Данный термин обычно применим к жидкостям. Ткани гетерогенны и, как следствие, аликвота тканей не может быть взята.
Примечание 2 — Определение составлено на основе информации из «Золотой книги» — сборника химической терминологии. Международный союз теоретической и прикладной химии. Версия 2.3.3. 2014; МСТПХ, 1990, 62, 1193 [Номенклатура для отбора проб в аналитической химии (Рекомендации, 1990)] с. 1206; и МСТПХ 1990, 62, 2167 [Словарь терминов химии атмосферы (Рекомендации, 1990)] с. 2173.
3.2 температура окружающей среды (ambient temperature): Нерегулируемая температура окружающего воздуха.
3.3 аналит (analyte): Компонент, представленный в наименовании измеряемой величины.
3.4 аналитические характеристики методики (analytical test performance): Точность, полнота и чувствительность метода исследования для оценки искомого аналита.
Примечание - Также допускается применять другие характеристики метода исследования, такие как надежность, повторяемость.
3.5 экстракорпоральное хранение (холодовая ишемия) (cold ischemia): Хранение (содержание) образца от момента извлечения из организма до стабилизации и фиксации.
3.6 диагноз (diagnosis): Заключение о состоянии здоровья или наличии заболевания по его признакам и/или симптомам; процесс постановки диагноза может включать обследования и исследования для отнесения состояния пациента к принятым классификациям и номенклатуре болезней, что позволяет принимать медицинские решения по прогнозу и лечению.
3.7 исследование, аналитический опыт (examination, analytical test): Комплекс операций, объектом которых является определение значения или характеристики свойств.
Примечание - Процессы, которые начинаются с исследования выделенного аналита (образца) и включают в себя все виды тестирования параметров или химических манипуляций для количественного или качественного исследования.
[ИСО 15189:2012, 3.7, изменен — определение используется без примечаний]
3.8 макроскопическое исследование (grossing, gross examination): Выявления изменений в органах или тканях невооруженным глазом для получения диагностической информации при подготовке к дальнейшему микроскопическому исследованию.
3.9 гомогенный (homogeneous): Однородный по структуре и составу.
3.10 процесс подготовки, преаналитический этап, преаналитический рабочий процесс (preexamination processes, preanalytical phase, preanalytical workflow): Процесс, который начинается в хронологическом порядке с клинического запроса, включающий в себя проверку запроса, подготовку и идентификацию пациента, сбор образцов, транспортирование в клиническую или морфологическую лабораторию, выделение аналита и заканчивается началом аналитического исследования.
Примечание 1 — Преаналитический этап включает в себя подготовительные процессы, влияющие на планируемое исследование.
[ИСО 15189:2012, 3.15, изменен — слова «преаналитический этап» добавлены в качестве термина, примечание 1 к данному пункту добавлено и определение расширено]
3.11 первичная проба/образец (primary sample/specimen): Дискретная порция биологической жидкости, выдыхаемого воздуха, волос или тканей, взятая для исследования, изучения или анализа одной или нескольких величин, а также свойств, которые предполагается экстраполировать на целое.
[ИСО 15189:2012, 3.16, изменен — термин и определение используются здесь без примечаний, имеющихся в источнике] <*>
<*> В Российской Федерации для характеристики биологических жидкостей используют термин «первичная проба (проба)», для характеристики биологических тканей — термин «образец».
3.12 белок (protein): Тип биологических макромолекул, состоящих из одной или нескольких цепей с определенной последовательностью аминокислот, соединенных пептидными связями.
3.13 профиль белка (protein profile): Число отдельных белковых молекул, которые присутствуют в образце и могут быть определены без каких-либо потерь, ингибирования и интерференции.
3.14 виды белков (protein species): Определенное количество белков, химически четко соответствующих одному пятну на высокоэффективной двумерной схеме гель-электрофореза.
3.15 посттрансляционные модификации (PTM, post translational modifications): Химические изменения первичной структуры белка, часто имеющие решающее значение для придания белку биологической активности.
[Энциклопедия психофармакологии, 2010]
3.16 комнатная температура (room temperature): Температура в диапазоне от 18 °C до 25 °C.
Примечание - В национальных правилах и требованиях возможны другие определения.
3.17 проба (sample): Одна или несколько частей, которые взяты из первичного образца.
[ИСО 15189:2012, 3.24, изменен — ПРИМЕР удален] <*>
<*> В настоящем стандарте используется понятие «фрагмент» как часть образца вместо пробы как части первичной образца.
3.18 стабильность (stability): Характеристика материала пробы/образца, описывающая ее/его способность сохранять значения свойства в определенных пределах в течение определенного периода времени при хранении в установленных условиях.
Примечание - Для процессов, описанных в настоящем стандарте, аналитом является выделенный белок.
[Руководство ИСО 30:2015, 2.1.15, изменен — слова «стандартный образец» заменены на слова «материал образца», слово «характеристика» заменено на слово «характеристика, описывающая способность», также изменено примечание 1].
3.19 хранение (storage): Длительный период прерывания преаналитического этапа исследования образца или аналита, или его производных, таких как окрашенные препараты на стекле или образцы ткани в парафиновых блоках, в соответствующих условиях при условии сохранения свойств.
Примечание - Долгосрочное хранение обычно осуществляется в лабораторных хранилищах или в биобанках.
3.20 валидация (validation): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены.
Примечание 1 — Термин «валидирован» используют для обозначения соответствующего статуса.
[ИСО 9000:2015, 3.8.13, изменен — примечания 1 и 3 удалены]
3.21 верификация (verification): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что установленные требования были выполнены.
Примечание 1 — Термин «верифицирован» используют для обозначения соответствующего статуса.
[ИСО 9000:2015, 3.8.12, изменен — примечания 1 и 2 не должны приниматься во внимание]
Примечание 2 — Подтверждение может включать такие действия, как:
- выполнение альтернативных расчетов;
- сравнение новой разработанной спецификации с аналогичной уже испытанной;
- проведение испытаний и демонстраций;
- рецензирование документов до момента публикации.
3.22 интракорпоральная ишемия (некритическое хранение) (warm ischemia): Состояние ткани или органа во время хирургических или диагностических манипуляций (длительность и интервалы, степень).
3.23 рабочий процесс (workflow): Последовательные действия, необходимые для выполнения задачи.
Общие сведения о системах менеджмента качества медицинских лабораторий и, в частности, информация о контроле качества сбора, приема и обработки образцов (включая предотвращение перекрестного загрязнения) описаны в ИСО 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6 или ИСО/МЭК 17020:2012, раздел 8 и 7.2. Должны соблюдаться требования к лабораторному оборудованию, реагентам и исходным материалам в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.3; ИСО 15189:2012, 5.5.1.2 и 5.5.1.3, а также могут применяться требования ИСО/МЭК 17020:2012, 6.2.
Все этапы диагностического рабочего процесса могут влиять на конечный результат исследования. Таким образом, весь рабочий процесс, включая стабилизацию биомолекул и условия хранения образцов, должен быть верифицирован и валидирован. Этапы рабочего процесса, которые не всегда поддаются контролю (например, интракорпоральная ишемия), должны быть задокументированы. Должна быть проведена оценка риска неконтролируемых этапов, включая их потенциальное влияние на результаты аналитических тестов, и приняты меры по предотвращению последствий для обеспечения требуемых аналитических характеристик методики.
Стабильность конкретных белков, подлежащих исследованию, и их посттрансляционные модификации (если это важно для анализа) следует исследовать в течение всего процесса, предшествующего исследованию, до его разработки и реализации (например, путем проведения эксперимента или исследования во временной динамике; см. также приложение А и [8]).
До стабилизации тканей путем заморозки количество протеина, конформации и образованные им связи могут существенно изменяться, например из-за индукции или подавления генов, разрушения РНК и изменения биохимического пути и энергетического статуса. Эти эффекты могут возникать из-за слишком длительной экстракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения, и средней температуры окружающей среды до заморозки. Кроме того, эти изменения могут варьироваться в тканях разных доноров/пациентов.
Как правило, чем больше продолжительность экстракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения и чем выше температура окружающей среды до заморозки образца тканей, тем больше риск того, что может произойти изменение белкового профиля.
Примечание — Продолжительное экстракорпоральное хранение вызывает изменение количества белка (например, цитокератина 18) и фосфопротеида (например, phospho-p42/44) [8], [9]. Хранение образца на мокром льду уменьшает этот эффект [10]. Количество белка и посттрансляционные модификации также могут варьироваться в зависимости от происхождения и типа тканей, исходного заболевания, хирургической процедуры, препаратов, вводимых для обезболивания или лечения сопутствующего заболевания, а также от различных условий окружающей среды после удаления тканей из тела пациента.
Поскольку интракорпоральную ишемию сложно стандартизировать, ее продолжительность должна быть задокументирована. Если невозможно избежать экстракорпорального хранения, продолжительность и температуру окружающей среды, в которой находится упакованный образец, следует отобразить в документации. Если образец транспортируют в другое помещение для заморозки, то продолжительность и условия транспортирования следует задокументировать.
Инструкции по технике безопасности при транспортировании и санитарной обработке должны соблюдаться в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.2.3 и 5.4.5, а также ИСО 15190.
В течение всего процесса, предшествующего исследованию, должны соблюдаться меры предосторожности во избежание перекрестной контаминации между различными образцами, например путем использования одноразовых материалов, когда это возможно, или соответствующих процедур очистки между обработкой различных образцов.
Если медицинское изделие для диагностики in vitro, изготавливаемое в промышленных условиях и находящееся в обращении, не используется в соответствии с инструкциями производителя, ответственность за его использование и эксплуатационные характеристики возлагается на пользователя.
5 Внелабораторная преаналитика
5.1 Сбор образцов
5.1.1 Общие положения
При сборе образцов рекомендуется учитывать требования к ним (например, патологоанатомические изменения органов при определенном заболевании, их размеры), зависящие от того, какое именно молекулярное исследование предполагается проводить (см. также раздел 6).
См. также ИСО 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2 Информация о доноре/пациенте
Документация должна содержать идентификационный номер, который может быть представлен в виде кода <*>.
<*> В Российской Федерации действует законодательство о защите персональных данных, которое в ряде случаев может накладывать ограничение на использование персональных данных донора/пациента в качестве идентификатора, в связи с чем рекомендуется указывать идентификатор пациента/донора в деперсонализированном виде.
Следует в том числе фиксировать в документации следующую информацию:
a) соответствующее состояние здоровья донора/пациента [например, отсутствие заболевания, тип заболевания, сочетанные и сопутствующие болезни, демографические данные (например, возраст и пол)];
b) информацию о плановом медицинском лечении и специальной подготовке перед взятием ткани (например, применение анестетиков, медикаментов, проведение хирургических или диагностических процедур);
c) полученное в установленном порядке согласие от донора/пациента.
5.1.3 Информация об образце
В документации в числе прочего должна быть зафиксирована следующая информация:
a) время от начала ишемии до извлечения из тела перевязки/пережатия сосудов (обычно время пережатия артерии).
Примечание - Не требуется в случае проведения биопсии малого участка ткани для замораживания;
b) время и дата извлечения ткани из организма и метод извлечения (например, толстоигольная биопсия; резекция; медицинское изделие, используемое для биопсии);
c) тип ткани; орган, из которого она взята; состояние ткани (например, поражена или не поражена болезнью), включая информацию о любых маркировках, нанесенных в операционной или вне ее, сделанных хирургом, рентгенологом или патологоанатомом.
Если заморозку ткани выполняют за пределами лаборатории, возникает необходимость задокументировать этапы, описанные в 6.2 и 6.3, в которых требуется оценка патологии.
В документацию также следует включить сведения об ответственном лице, осуществившем сбор образца.
5.1.4 Обработка образцов
Ткани, заморозку которых необходимо осуществить с целью дальнейшей диагностики, могут быть взяты из большего образца ткани или они могут быть небольшим образцом — например, взятым при биопсии во время эндоскопического исследования или во время хирургического вмешательства, когда постановка диагноза по результатам исследования замороженного образца должна осуществляться быстро.
Примечание - Ткани, взятые после смерти, могут замораживаться с целью дальнейшей диагностики. Однако сохранность белка зависит от времени, прошедшего с момента смерти до вскрытия и температуры хранения тела после смерти.
Любые дополнения к образцу или его изменения после изъятия из тела [например, маркировка для правильного расположения образца (с помощью чернил, швов, надрезов)] должны быть отражены в сопроводительных документах.
Для постановки патологоанатомического диагноза взятие образца должно проводиться под наблюдением или руководством врача-патологоанатома, имеющего медицинскую квалификацию (например, действующий сертификат специалиста) (см. 6.2).
Если образец был взят не для постановки патологоанатомического диагноза, то оценка и взятие образцов могут быть выполнены другим квалифицированным специалистом, а также на основании представленной документации.
Заморозка образца или части, взятой из образца, может быть выполнена в лаборатории или вне ее.
Неправильное хранение может отразиться на белковом профиле; в связи с этим следует отдавать предпочтение способу заморозки, позволяющему уменьшить его срок.
a) Если заморозка образца или его части осуществляется вне лаборатории, следует без промедления выполнить указания 6.2.
b) Если заморозка образца или фрагмента происходит в лаборатории, свежие образцы ткани необходимо доставить в лабораторию. Указания, описанные в 5.2 для свежих образцов ткани, должны быть выполнены без промедления.
5.2 Требования к транспортированию свежих тканей
5.2.1 Общие положения
Если для заморозки образца необходимо транспортирование в лабораторию, тогда лаборатории и клиническому или хирургическому отделению рекомендуется вместе составить протокол процедуры транспортирования образца.
5.2.2 Подготовка к транспортированию
Должны быть выполнены следующие указания:
a) выбирают и используют контейнер (например, холодильную камеру, бокс для хранения и транспортирования, вакуумную упаковку) в соответствии с правилами перевозки;
b) выбирают и используют для транспортирования процедуры, направленные на стабилизацию (например, методы охлаждения).
Примечание - Случайное замораживание ткани (например, при неправильном использовании способов охлаждения) может привести к деградации РНК после ее оттаивания. Это также может повлиять на морфологические характеристики;
c) упакованный образец маркируют (например, регистрационным номером, штрихкодом, указанием типа образца, размера органа, из которого он был взят) и дополнительно документируют [в соответствии с требованиями 5.1.2 - 5.1.4 и 5.2.2 a) и b)].
Несколько образцов, взятых от одного и того же пациента/донора, имеющих сходные признаки (макроскопический вид, тип ткани, наличие или отсутствие заболевания, анатомическое расположение), могут быть помещены в один контейнер/отделение внутри контейнера.
После взятия из организма образцы следует переместить в контейнер немедленно. Затем контейнер следует держать на ледяной бане или при температуре от 2 °C до 8 °C, чтобы минимизировать изменения белкового профиля.
Температуру окружающей среды, в которой находится контейнер в период экстракорпорального хранения (например, температура в разных помещениях, транспорте), рекомендуется задокументировать. Если не проводят измерение температуры, ее следует принять равной температуре окружающей среды, комнатной температуре или температуре в диапазоне от 2 °C до 8 °C.
5.2.3 Требования к транспортированию образцов
Контроль температуры следует осуществлять соответствующим образом.
Если образец еще не заморожен, транспортирование следует осуществлять немедленно на мокром льду или при температуре от 2 °C до 8 °C, чтобы минимизировать изменения белкового профиля.
Примечание — Существуют доказательства того, что белки в тканях могут быть стабилизированы при транспортировании в полиэтиленовых пакетах в вакууме при температуре от 0 °C до 4 °C, прежде чем образцы будут подготовлены к хранению в биобанке или использованы для гистологической оценки [11].
Соблюдение процедуры транспортирования установленным требованиям должно быть задокументировано. Любые расхождения с протоколом должны быть описаны и задокументированы.
6 Внутрилабораторная преаналитика
6.1 Информация о приеме образца
Фамилия, имя, отчество (Ф.И.О.) лица, принявшего образец, должно быть задокументировано. Дата и время доставки образца и иные условия (например, маркировка; условия транспортирования, включая температуру; тип ткани и размер образца; факт протечки/разрушения контейнера) должны быть задокументированы. Любые расхождения с установленными требованиями к транспортированию (см. 5.2) должны быть отражены в сопроводительном документе.
Должно быть проверено, соответствует ли образец информации в представленном сопроводительном документе. В процедуру проверки следует включить проверку клинической информации (см. 5.1.1 и 5.1.3) об образце, сведения о госпитализации и/или о доноре/пациенте, имени пациента, дате рождения пациента.
6.2 Оценка патологии образца и отбор фрагментов образца
Оценка и документирование патологического биопсийного и операционного материала и отбор его части для дальнейшей обработки должны осуществляться квалифицированным патологоанатомом, имеющим, например, соответствующую квалификацию специалиста, или под его наблюдением.
Могут применяться региональные, национальные правила или требования.
Факторы, влияющие на выбор образца (фрагмента) для исследования белка:
a) выбор подходящих частей образца для молекулярных и гистологических исследований, а также для возможных дальнейших исследовательских целей должен проводиться специалистом, имеющим медицинскую квалификацию (например, сертификат патологоанатома), гарантирующую, что отбор образца для исследования белка не приведет к невозможности гистологического анализа. Для молекулярного исследования следует выбирать подходящие части ткани, что означает по возможности не использовать части, которые могут потенциально сделать молекулярное исследование невозможным — например, те, в которых наблюдается кровотечение или некроз.
Примечание — Отбор подходящих частей образцов также может осуществляться вне лаборатории, например в операционной, если это допускают национальные правила (см. 5.1.4).
При макроскопическом исследовании операционного материала до и/или после заморозки следует проверять представленную клиническую информацию (см. 5.1.2 и 5.1.3) об образце (к примеру, тип, размер, учетный номер), номер истории болезни пациента или данные о доноре, имя пациента, его дату рождения и тип ткани. Должно быть соответствующим образом составлено описание операционного материала и всех результатов исследований, удовлетворяющее рекомендациям и указаниям соответствующих организаций здравоохранения и отражающее клиническую информацию и возникающие вопросы. Должно быть указано, из какого органа или ткани был взят материал, при необходимости могут быть описаны край резекции и важные сведения о других областях, которые могут быть необходимы при последующем проведении микроскопической оценки; могут быть сделаны фотографии. Репрезентативные фрагменты от образца для гистологического исследования должны браться при макроскопическом исследовании в соответствии с конкретными рекомендациями и указаниями соответствующих организаций здравоохранения.
Примечание - Данная оценка или документирование может проводиться также и вне лаборатории, например в операционной;
b) если для образца ткани, взятого из трупа, не требуется постановка гистологического диагноза, может быть проведено документирование этого образца, а также оценка, взятие и документирование фрагментов не только патологоанатомом, но и другим квалифицированным специалистом;
c) если требуется постановка диагноза для образца, который планируют заморозить, выбранная часть образца должна быть подвергнута заморозке (см. 6.3) в подходящей морозильной среде. Использование той или иной морозильной среды должно быть задокументировано. Замороженные срезы должны оцениваться специалистом, имеющим медицинскую квалификацию (сертифицированным патологоанатомом). Для определения или выделения тех или иных клеточных особенностей заболевания рекомендуется применять микродиссекцию ткани.
6.3 Заморозка образца или фрагмента
6.3.1 Заморозка образца или фрагментов должна быть проведена немедленно после забора. Следует выбрать наиболее оптимальный метод заморозки (см. 6.3.2) для образца или фрагменты в соответствии с дальнейшим их использованием и эксплуатационным режимом.
Пробирка должна быть маркирована до ее предварительного охлаждения.
6.3.2 Ниже описаны три возможные процедуры заморозки.
a) Мгновенная заморозка [12] - этому методу следует отдавать предпочтение, так как он обеспечивает наилучшую степень сохранности морфологии материала в замороженных образцах ткани. Изопентан (C5H12, также известен как метилбутан или 2-метилбутан) для использования в процедуре быстрой заморозки должен быть охлажден предварительно до температуры от минус 160 °C до минус 80 °C включительно. Предварительное охлаждение может проводиться с помощью жидкого азота (минус 196 °C), сухого льда (минус 80 °C), с помощью морозильных камер, обеспечивающих охлаждение до минус 80 °C, или специальных морозильных аппаратов, поддерживающих температуру изопентана на отметке ниже или равной минус 80 °C, с функцией контроля скорости охлаждения или без нее. Изопентан должен быть охлажден в пробирке или другой таре (например, стеклянной мензурке), устойчивой к большим и резким перепадам температуры. Объем предварительно охлажденного изопентана должен быть как минимум в 10 раз более объема образца или фрагмента. Для быстрой заморозки образец ткани должен быть целиком погружен в предварительно охлажденный изопентан.
После заморозки образец ткани должен быть помещен в предназначенную для него предварительно охлажденную маркированную криопробирку. Пробирка должна быть закрыта в соответствии с инструкцией изготовителя. Если в нижней части пробирки наблюдается осадок ткани, изопентан следует заменить на новый.
Изопентан — чрезвычайно летучая и легковоспламеняющаяся при комнатной температуре и давлении жидкость. В связи с этим следует обеспечить в лаборатории хорошую вентиляцию. Изопентан в пробирке следует охладить.
b) Быстрая заморозка — ткань должна быть заморожена на предварительно охлажденной металлической пластине или в металлической емкости, размещенной на поверхности жидкого азота или на сухом льду. Поверхность металла должна быть предварительно охлаждена до температуры от минус 196 °C до минус 80 °C включительно. Металлическая пластина или емкость может быть закреплена с помощью подходящего штатива и зажима. Также фрагмент может быть заморожен прямо в жидком азоте или даже в промаркированной и закрытой пробирке для хранения, помещенной в жидкий азот или сухой лед. Однако медленная заморозка может вызвать разрушение мембран клеток в образце из-за увеличения концентрации солей и образования кристаллов, что может серьезно повлиять на структуры тканей и органов. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, следует очистить емкость или пластину между замораживанием образцов или фрагментов.
Примечание — Для заморозки в жидком азоте характерно возникновение эффекта Лейденфроста [13], вызванного кипением жидкого азота вокруг ткани, имеющей относительно высокую температуру. Это затрудняет передачу теплоты от образца к жидкому азоту; еще больше передача теплоты затруднена, если образец помещен в контейнер с наклеенной этикеткой.
c) Получение замороженных срезов — если необходима заморозка тканей для быстрой диагностики замороженных срезов, ткань следует немедленно транспортировать в лабораторию свежей. Выбранная часть образца должна быть заморожена на специализированных металлических решетках, которые устанавливают на криостат в подходящей морозильной среде. Использование той или иной морозильной среды должно быть задокументировано. Металлическая решетка, на которой располагается ткань, и морозильную среду замораживают посредством погружения металла в жидкий азот или сухой лед до тех пор, пока ткань не будет заморожена. После получения замороженных срезов рекомендуется удалить остатки с металлической сетки, не допуская оттаивания, и поместить на длительное хранение в предварительно охлажденную пробирку.
Примечание - Использование замораживающей среды может отрицательно сказываться на качестве масс-спектрометрии белков: разделение на колонке может давать худшие результаты.
6.3.3 Действия до, во время и после процедуры заморозки должны выполняться в соответствии со следующим алгоритмом:
a) задокументировать процедуру заморозки (например, заморозка в жидком азоте; мгновенная заморозка в изопентане, охлажденном жидким азотом или сухим льдом; заморозка в подходящей морозильной среде; заморозка с контролируемой скоростью охлаждения);
b) задокументировать время и дату заморозки (для определения времени задержки: временной интервал равен промежутку времени между взятием из тела до замораживания образца или фрагмента);
c) убедиться до заморозки, что размер ткани образца, которую требуется заморозить, соответствует размеру выбранной криопробирки, поскольку размер ткани определяет размер контейнера; в связи с этим рекомендуется, чтобы образец/фрагмент не превышал 1 см в одном измерении;
d) контейнер для хранения образца в замороженном виде должен:
-
иметь достаточный объем для хранения образца или фрагмента данного размера;
-
быть сертифицирован для использования при температуре хранения;
-
надежно закрываться, лучше всего закручивающейся крышкой; контейнер с откидной крышкой использоваться не должен.
Примечание - Контейнер может взорваться при взятии образца или фрагмента при хранении в жидком азоте;
e) маркировка должна соответствовать установленным условиям хранения в заморозке.
Примечание - Подходящими видами маркировки являются, например, самоклеящиеся этикетки, рукописная маркировка, радиочастотная идентификация (RFID), предварительно маркированная упаковка, которая была верифицирована для использования по такому назначению;
f) маркировка упаковки должна обеспечивать возможность отслеживать образцы и фрагменты надлежащим образом. Следовательно, маркировка должна содержать следующую минимальную информацию:
-
о доноре/пациенте, у которого был взят образец; уникальный учетный номер образца/фрагмента и дату, когда он был взят; эта информация может быть оформлена в виде кода (уникального для каждого образца/пробы);
-
основные сведения о, например, типе ткани, состоянии ткани — поражена (например, опухолью) или нет — в случае, если система отслеживания образца не может отразить эту информацию при идентификации образца/фрагмента, использованного в 6.3.3 f) 1);
-
уникальный учетный номер каждой упаковки [может быть включен в 6.3.3 f) 1)];
g) документацию типов, количества и описание образца(ов).
Следует учитывать, что при некоторых заболеваниях, таких как опухоли, молекулярные особенности могут неодинаково наблюдаться во всем образце ткани. Поэтому важно, чтобы часть образца ткани, используемой для молекулярного исследования, оценивалась специалистом, имеющим медицинскую квалификацию (например, сертифицированным патологоанатомом). В связи с этим следует отразить в документации, какой аспект заболевания фактически наблюдается в образце ткани, используемом для молекулярного исследования (например, различные молекулярные механизмы могут быть задействованы в центре или на периферии опухолевой ткани, также опухоли могут состоять из областей, для которых оценка дифференцировки варьируется).
6.4 Требования к хранению
Должна поддерживаться постоянная температура ниже или равная минус 70 °C. Следует внедрить и использовать системы мониторинга и контроля.
Морозильные камеры или емкости с жидким азотом должны иметь систему оповещения об изменении температуры.
Во время извлечения образца(ов) или фрагментов может возникать значительное изменение температуры. В связи с этим время извлечения следует сокращать настолько, насколько возможно, чтобы избежать оттаивания образцов.
Происходящие изменения температуры, которые могут привести к случайному оттаиванию образца(ов) или фрагментов, предназначенных для обработки или дальнейшего хранения, должны быть задокументированы.
Следует предусмотреть резервные криохранилища.
Расположение хранения, температура хранения, время и дата изъятия из системы хранения любых образцов или фрагментов должны быть задокументированы.
6.5 Выделение общего белка
6.5.1 Общие положения
Гистологическую характеристику клеточного состава и патологических изменений образца или фрагментов следует выполнять (например, на срезах, окрашенных гематоксилином) в соответствии с признанной на международном уровне гистопатологической классификацией (например, классификация опухолей ВОЗ/МАИР [14]). Если образец или фрагмент используют для молекулярной диагностики, фракция клеток-мишеней должна быть оценена до выделения белка. Количество клеток-мишеней должно быть достаточным для проведения исследования. Если образец используют не для диагностики, а, например, для научных исследований, рекомендуется использовать аналогичный подход.
Не должно допускаться оттаивание образца до его гомогенной дисперсии в лизирующем буфере, содержащем вещества, ингибирующие разложение или модификацию белков, таких как ингибиторы протеаз, киназ или фосфатаз. Образец следует тщательно измельчить или нарезать на мелкие части в замороженном состоянии и тщательно диспергировать в лизирующем буфере, содержащем вышеупомянутые ингибирующие вещества. Поэтому последующая гомогенизация замороженного образца или фрагмента в лизирующем буфере должна быть проведена сразу после помещения ткани в лизирующий буфер.
Если обработанный образец или фрагмент содержит морозильную среду, то это должно быть задокументировано.
Все инструменты, например пинцет, используемые в работе с замороженным образцом/фрагментом для его гомогенизации, криосреза или переноса в буфер для лизиса, должны быть очищены, чтобы минимизировать загрязнение протеазой, киназой или фосфатазой, а также следует охладить их перед использованием как минимум до температуры минус 20 °C. Гистологи должны быть в перчатках. Соответствующие части микротома, включая многоразовое лезвие, должны очищаться после изготовления срезов каждого замороженного образца ткани/фрагмента. Следует рассмотреть возможность использования новых одноразовых лезвий на микротоме, чтобы избежать перекрестной контаминации.
Если есть сомнения в правильной идентификации образца или фрагмента, должна быть проведена верификация идентификации.
Выделение белка является ключевым этапом диагностического рабочего процесса, которому должно быть уделено особое внимание во время валидации всего рабочего процесса.
6.5.2 Использование промышленных наборов
При использовании наборов реагентов, находящихся в обращении, предназначенных для выделения белка из замороженных тканей, должны соблюдаться инструкции производителя по их использованию.
6.5.3 Использование собственных протоколов лабораторий
6.5.3.1 Если набор используют не в соответствии с его назначением, но в целях, определенных пользователем, должны быть написаны и использованы соответствующие инструкции пользователя.
6.5.3.2 Если лаборатория использует свой собственный протокол, отличающийся от протокола производителя набора, то должна быть проведена валидация в целях подтверждения, что он пригоден для этой цели.
Использование реагентов из наборов разных производителей может привести к ухудшению результатов, т.к. эти реагенты могут быть несовместимы. Компоненты для диагностического тестирования следует использовать вместе только в том случае, если компоненты совместимы и проведена валидация их совместной работы.
6.6 Количественная и качественная оценка выделенных белков
Количественную и качественную оценку белка следует проводить в соответствии с указаниями производителя диагностического набора или, при отсутствии, в соответствии с общепринятыми физическими, химическими или биохимическими методами (например, вестерн-блоттинг [15], метод Бредфорда [16]) и/или в соответствии с подходящими методами контроля в процессе исследования.
Такие методы, применяемые для определения чистоты и целостности, могут включать в себя один или несколько нижеприведенных методов, в зависимости от конкретного исследования:
a) электрофорез с лаурилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и окраска в кумасси синий или серебряный;
d) Вестерн-блоттинг (например, бета-актин).
Определение общей концентрации белка может включать один или несколько нижеприведенных методов, в зависимости от конкретного обследования:
b) метод с бицинхониновой кислотой (BCA);
6.7 Хранение выделенного общего белка
Следует соблюдать инструкции по хранению выделенного белка, указанные производителем конкретного набора для выделения белка. Если инструкции организации, проводящей исследование, являются более строгими, они должны соблюдаться.
Если инструкции от поставщика набора для выделения белка отсутствуют и если не используются собственные валидированные процедуры выделения белка, лаборатории следует немедленно провести анализ выделенных белков. Если анализ белка не может быть проанализирован без промедления, лаборатория должна иметь верифицированные процедуры хранения выделенного белка.
Примечание - Хранение на мокром льду в течение короткого периода времени (т.е. 2 ч) может быть допустимо при определенных обстоятельствах.
Длительное хранение (т.е. в течение нескольких лет) следует осуществлять при температуре ниже или равной минус 70 °C.
Для длительного хранения следует брать аликвоты выделенного белка, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. Аликвоты не следует дополнительно разбавлять, чтобы избежать снижения стабильности белка. Следует избегать более двух циклов замораживания и оттаивания, вместо этого используют аликвоты. Липофизированные белки могут храниться в течение нескольких лет при температуре плюс 4 °C или минус 20 °C.
Примечание - На стабильность белка влияют многие факторы, включая пройденные циклы замораживания и оттаивания, уровень pH, концентрацию белка, солевой режим и др. Оптимальные условия для хранения конкретных белков могут различаться для разных белков.
Следует избегать непреднамеренной лиофильной сушки выделенного белка во время длительного хранения, возникающей из-за испарения воды, так как белок может разлагаться, а восстановление из емкости для хранения может быть затруднительным или даже невозможным. Поэтому во избежание испарения воды при длительном хранении следует использовать соответствующие емкости для хранения, такие как криоконтейнер, тип емкости для хранения и крышки следует задокументировать.
Для долгосрочного хранения следует утвердить валидированный регламент выбора и уникальной маркировки сосуда для хранения выделенного белка или полученных из него аликвот.
Должна быть обеспечена возможность отслеживания, например, с помощью считываемых RFID, 1D- или 2D-штрихкодов или предварительно маркированных емкостей для хранения с уникальными кодами, предоставленными производителями, подходящими для низких температур хранения.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКА, ДЕМОНСТРИРУЮЩЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БЕЛКОВ ВО ВРЕМЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ <*>
<*> Исследование выполнено проектом EU FP7 SPIDIA, финансированным седьмой рамочной программой Европейского союза [FP7/2007-2013] по грантовому соглашению № 222916. Для получения дополнительной информации см. www.spidia.eu. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Фосфорилирование и дефосфорилирование являются ключевыми механизмами внутри- и межклеточной передачи сигнала и отражают статус активации клетки. Определение специфических профилей фосфопротеинов необходимо для разработки таргентных терапий, борющейся с нарушениями в системе сигнальных путей у больных раком. Тем не менее имеющиеся знания о влиянии факторов, предшествующих исследованию, таких как время, прошедшее до замораживания ткани, на изменения белка и фосфопротеина очень ограничены.
Результаты данного исследования дают представление о различиях, возникающих у пациентов, а также колебаниях белковых и фосфопротеиновых профилей в клинических образцах тканей во время преаналитического этапа. Как будет показано ниже, результаты данной экспериментальной работы, используя в качестве примеров ткани кишечника и печени человека, ясно показывают, что существует необходимость стандартизировать сбор замороженных тканей и последующее выделение и хранение белков и фосфопротеинов перед количественным анализом. Стандартизация должна подразумевать отражение в документации длительности интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения. Хотя результаты, полученные для интракорпоральной ишемии, здесь не приведены (см. дополнительные источники информации), приведенные данные указывают, что продолжительность экстракорпорального хранения влияет на белковые профили. Таким образом, существует риск того, что из-за различий в продолжительности интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения, а также других параметров процесса подготовки результаты исследования могли бы стать ненадежными, а значимые биомаркеры для лечения пациентов могли бы быть пропущены или неверно истолкованы.
В эксперименте использовались ткани кишечника и печени человека для оценки с учетом временной динамики влияния длительного экстракорпорального хранения на количество белков и фосфопротеинов в образцах до заморозки. Результаты показали, что количество белка и фосфопротеина изменилось до стабилизации тканей путем заморозки.
Эти изменения были различны у разных пациентов и в случае разных типов ткани. Например, усиление экспрессии фосфо-p42/44 митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) в образцах кишечника наблюдалось у одних пациентов и не наблюдалось у других. Эти выраженные различия у разных пациентов препятствовали установлению в группе пациентов общих тенденций повышения или снижения экспрессии большинства белков. Однако количество некоторых белков, таких как цитокератин 18, значительно изменялось после резекции в образцах у большинства пациентов в сравнении с исходным индивидуальным уровнем. И напротив, было установлено, что количество глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и \beta - \text{актина} стабильно в течение длительного периода экстракорпорального хранения.
Ткани кишечника и печени человека собирали в разных больницах, применяя один рабочий процесс. Время между перевязкой сосуда (t1) и хирургической резекцией (t2) определяется как экстракорпоральная ишемия (1). Время между хирургической резекцией и заморозкой, как правило, являющееся временем транспортирования (2) в патологоанатомическую лабораторию, определяется как экстракорпоральное хранение (4). В целях изучения влияния временной динамики был выполнен эксперимент, заморозка в котором проводилась с задержкой (3); в момент t3 был изготовлен образец сравнения, далее материалы хранились во влажной камере при комнатной температуре, и в разные моменты времени (от t4 до t8) образцы замораживались, что в результате привело к задержке времени экстракорпорального хранения (5).
Чтобы изучить влияние экстракорпорального хранения на количество белка и фосфопротеинов, в ходе плановых хирургических процедур были взяты образцы доброкачественных тканей кишечника и печени человека. Образцы были доставлены при комнатной температуре в Институт патологии для дальнейшей работы. Каждый образец был разделен на фрагменты размером минимум 5 мм x 5 мм x 5 мм, которые были подвергнуты процедуре мгновенной заморозки в жидком азоте. Образец сравнения был заморожен немедленно по прибытии в лабораторию патологии (см. рисунок А.1, t3). Все остальные фрагменты хранили во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 — 360 мин, имитируя в рамках эксперимента задержку до заморозки (см. рисунок А.1).
1 — время интракорпоральной ишемии; 2 — транспортирование; 3 — время, на которое была отложена заморозка в рамках эксперимента; 4 — экстракорпоральное хранение; 5 — продленное экстракорпоральное хранение в рамках эксперимента; 6 — различные временные точки, в которые проводилось замораживание образцов в лаборатории в рамках эксперимента; 7 — молекулярный анализ; t — время; t0 — начало операции; t1 — лигирование сосуда; t2 — хирургическая резекция; t3 — заморозка образца сравнения; t4 — заморозка образца 1; t5 — заморозка образца 2; t6 — заморозка образца 3; t7 — заморозка образца 4; t8 — заморозка образца 5
Рисунок А.1 — Схема краткого обзора процедуры взятия ткани
Как референсные методы анализа количества отдельных белков и некоторых фосфорилированных белков применялись метод обращенно-фазового микроматричного анализа белков (RPPA) и вестерн-блоттинг. Использованные антитела приведены в таблице А.1.
Антитела, использованные для анализа с использованием RPPA и вестерн-блоттинга
Чтобы исследовать влияние длительности экстракорпорального хранения на белковые профили, образцы доброкачественных тканей человека (n = 11) были собраны во время плановых операций и доставлены в лабораторию патологии, где по их прибытии были начаты эксперименты с контролем временной динамики. После выделения белка было проведено количественное исследование стабильности выбранных белков с помощью противофазного белкового чипа (RPPA) с 23 специфическими антителами, семь из которых направлены против фосфорилированных эпитопов, а один распознает расщепленный белок. Белки были отобраны на основе их потенциального участия в критических клеточных функциях или сигнальных путях, таких как структура клетки, пролиферация и выживание, реакция на стресс, гипоксия, апоптоз и адгезия. Предполагается, что, проанализировав расщепление белка и посттрансляционные модификации (фосфорилирование), можно надежно определить потенциальные колебания уровней белка и фосфопротеина во время хранения.
Рисунок А.2 показывает степень выраженности сигнала трех репрезентативных белков (phospho-p44/42-MAPK, GAPDH, \beta - \text{актина} ). Изображенные графики типа диаграмм размаха показывают среднюю нормированную выраженность сигнала и процент относительно образца сравнения (см. рисунок А.1, t3), который принят за 1,0.
X — время, мин; Y — относительная средняя степень выраженности
Рисунок А.2 — Анализ белков и фосфопротеинов во время отсроченного в рамках эксперимента экстракорпорального хранения
Для phospho-p44/42-MAPK (p-p44/42-MAPK) выражены изменения количества фосфопротеина во время экстракорпорального хранения, тогда как количества GAPDH и \beta - \text{актина} не сильно изменялись во временной динамике в эксперименте.
А.2.4 Дополнительный источник информации
Gündisch , S., Hauck, S., Sarioglu, H. et al. Изменчивость уровней белка и фосфопротеина в клинических образцах ткани на преаналитическом этапе. Journal of Proteome Research. 2012 Dec 7; 11(12):5748-62.
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНЫХ СТАНДАРТОВ НАЦИОНАЛЬНЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение ссылочного международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего национального стандарта |
| ISO 15189:2012 | IDT | ГОСТ Р ИСО 15189-2015 «Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности» |
| Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандартов: - IDT — идентичные стандарты. | ||
| [1] | ISO Guide 30:1992, Terms and definitions used in connection with reference materials (Термины и определения, используемые в области стандартных образцов) |
|---|---|
| [2] | ISO 9000:2005, Quality management systems — Fundamentals and vocabulary (Системы менеджмента качества. Основные положения и словарь) |
| [3] | ISO 15190, Medical laboratories — Requirements for safety (Лаборатории медицинские. Требования безопасности) |
| [4] | ISO/IEC 17020:2012, Conformity assessment — Requirements for the operation of various types of bodies performing inspection (Оценка соответствия. Требования к работе различных типов органов инспекции) |
| [5] | ISO 17511:2003, In vitro diagnostic medical devices — Measurement of quantities in biological samples — Metro-logical traceability of values assigned to calibrators and control materials (Медицинские изделия для диагностики in vitro. Количественные измерения в биологических образцах. Метрологическая прослеживаемость величин, заданных для калибраторов и контрольных материалов) |
| [6] | Jungblut P., Thiede B., Zimny-arndt U. Resolution power of two-dimensional electrophoresis and identification of proteins from gels. Electrophoresis. 1996, 17 pp. 839 — 847 |
| [7] | Stolerman I.P. ed. Encyclopedia of Psychopharmacology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany, 2010 |
| [8] | Gündisch S. HAUCK, S., SARIOGLU, H. et al. Variability of protein and phosphoprotein levels in clinical tissue specimens during the preanalytical phase. J. Proteome Res. 2012 Dec 7, 11 (12) pp. 5748 — 5762 |
| [9] | Espina V., Edmiston K.H., Heiby M. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol. Cell. Proteomics. 2008 Oct, 7 (10) pp. 1998 — 2018 |
| [10] | Gündisch S., Grundner-Culemann K, Wolff С Delayed times to tissue fixation result in unpredictable global phosphoproteome changes. J. Proteome Res. 2013, 12 (10) pp. 4424 — 4434 |
| [11] | Condelli V., Lettini G., Patitucci G. Validation of vacuum-based refrigerated system for biobanking tissue preservation: analysis of cellular morphology, protein stability, and RNA quality. Biopreserv. Biobank. 2014, 12 (1) pp. 35 — 45 |
| [12] | Mager S.R., Oomen M.H., Morente M.M. Standard operating procedure for the collection of fresh frozen tissue samples. Eur. J. Cancer. 2007, 43 (5) pp. 828 — 834 |
| [13] | Gottfried B.S., Lee C.J., Bell K.J. The Leidenfrost Phenomenon: Film Boiling of Liquid Droplets on a Flat Plate. Int. J. Heat Mass Transfer. 1966, 9 pp. 1167 — 1187 |
| [14] | WHO/IARC Classification of Tumours on. http://whobluebooks.iarc.fr/ |
| [15] | Gallagher SR 2010, Protein blotting: Immunoblotting, current protocols Essential Laboratory Techniques. 4:8.3.1 — 8.3.36.  2010 by John Wiley and Sons, Inc. |
| [16] | Olson BJ. SC, Markwell J. Assays for determination of protein concentration. Current protocols essential laboratory techniques, Unit 3.4,  2010 by John Wiley and Sons, Inc., DOI: 10.1002/0471140864.ps0304s48 |