ГОСТ Р ИСО 19001-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем с диагностическими реагентами in vitro, применяемыми для окрашивания биологических материалов

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 21.10.2021 № 1215-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р ИСО 19001-2013"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-iso-19001-2013" "ГОСТ Р ИСО 19001-2013. Национальный стандарт Российской Федерации. Изделия медицинские для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем с диагностическими... (ут"
  n1["ГОСТ Р ИСО 19001-2021"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-iso-19001-2021" "ГОСТ Р ИСО 19001-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем с диагностическими... (ут"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 октября 2021 г. № 1215-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЕДИЦИНСКИЕ ИЗДЕЛИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ IN VITRO

ИНФОРМАЦИЯ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМАЯ ИЗГОТОВИТЕЛЕМ С ДИАГНОСТИЧЕСКИМИ РЕАГЕНТАМИ IN VITRO, ПРИМЕНЯЕМЫМИ ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

In vitro diagnostic medical devices. Information supplied by the manufacturer with in vitro diagnostic reagents for biological material staining

(ISO 19001:2013, In vitro diagnostic medical devices — Information supplied by the manufacturer with in vitro diagnostic reagents for staining in biology, IDT)

ГОСТ Р ИСО 19001-2021

ОКС 11.040.55

11.100.10

Дата введения 1 апреля 2022 года

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» (Ассоциация «ФЛМ»), на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы ин витро»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 октября 2021 г. № 1215-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 19001:2013 «Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем вместе с диагностическими реагентами in vitro, применяемыми для окрашивания в биологии» (ISO 19001:2013 «In vitro diagnostic medical devices — Information supplied by the manufacturer with in vitro diagnostic reagents for staining in biology», IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ТК 212 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro» Международной организации по стандартизации (ИСО).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2012 (пункт 3.5).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВЗАМЕН ГОСТ Р ИСО 19001-2013

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает требования к информации, предоставляемой изготовителями с реагентами, применяемыми для окрашивания биологических материалов. Требования относятся к изготовителям, поставщикам и продавцам красителей, красок, хромогенных реагентов и других реактивов, применяемых для окрашивания в гистологии и цитологии, включая бактериологию, гематологию, гистохимию; используемых в медицинских лабораториях как для плановых задач, так и для исследовательских. Требования к информации, предоставляемой изготовителями, устанавливаемые настоящим стандартом, являются необходимым условием получения сравнимых и воспроизводимых результатов во всех сферах окрашивания биологических материалов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных — последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 80000-1, Quantities and units — Part 1: General (Величины и единицы. Часть 1. Общие положения)

ISO 80000-9, Quantities and units — Part 9: Physical chemistry and molecular physics (Величины и единицы. Часть 9. Физическая химия и молекулярная физика)

ISO 18113-1, In vitro diagnostic medical devices — Information supplied by the manufacturer (labelling) — Part 1: Terms, definitions and general requirements [Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования]

ISO 18113-2, In vitro diagnostic medical devices — Information supplied by the manufacturer (labelling) — Part 2: In vitro diagnostic reagents for professional use [Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 2. Реагенты для диагностики in vitro для профессионального применения]

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими им определениями:

3.1 антитело (antibody): Специфический иммуноглобулин, образованный B-лимфоцитами в ответ на воздействие иммуногенным веществом и способный связываться с ним.

Примечание 1 — Молекула иммуногенного вещества содержит одну или несколько частей с характерным химическим составом, эпитоп.

3.2 блокирующий реагент (blocking reagent): Реагент (реактив), используемый для уменьшения фона, присущего образцу перед окрашиванием.

3.3 хромогенный реагент (chromogenic reagent): Реагент (реактив), взаимодействующий с химическими группами, присутствующими или вызванными в клетках и тканях, с образованием окрашенного соединения in situ.

Пример - Типичные хромогенные реактивы:

a) соль диазония;

b) реактив Шиффа.

3.4 красящее вещество (dye): Окрашенное органическое соединение, которое, будучи растворенным в подходящем растворителе, способно придать цвет материалу.

3.5 флюорохром (fluorochrome): Реагент, испускающий видимый свет при облучении возбуждающим светом более короткой длины волны.

Примечание 1 — Любой из различных флуоресцентных веществ, используемых в биологических окрашиваниях для получения флуоресценции в образце.

3.6 реагент для диагностики in vitro (in vitro diagnostic reagent): Химические, биологические или иммунологические компоненты, растворы или препараты, предназначенные изготовителем для применения в качестве медицинского изделия для диагностики in vitro.

[ИСО 18113-1]

3.7 информация, предоставляемая изготовителем (маркировка) (information supplied by the manufacturer, labelling): Письменное, напечатанное или графическое изображение:

• закрепленное на медицинском изделии или на его упаковке или обертке или
• предоставленное для применения с медицинским изделием;
• связанное с идентификацией, техническим описанием и применением медицинского изделия для диагностики in vitro, но не включающее в себя транспортные документы.

Пример - Этикетки, инструкции по применению.

Примечание 1 — Каталоги не являются маркировкой медицинских изделий.

[ИСО 18113-1]

3.8 этикетка (label): Печатная, рукописная или графическая информация, помещенная на медицинском изделии для диагностики in vitro или на его упаковке.

Примечание 1 — Этикетка, постоянно закрепленная на медицинском изделии, рассматривается как маркировка.

[ИСО 18113-1]

3.9 лектин (lectin): Белок неиммуногенного происхождения с двумя или несколькими связывающими участками, который распознает и связывается со специфическими остатками сахаридов.

3.10 моноклональное антитело (monoclonal antibody): Антитело, способное специфически взаимодействовать с одиночным эпитопом определенного иммуногенного вещества.

3.11 поликлональные антитела (polyclonal antibody): Смесь антител, способных специфически взаимодействовать с определенным иммуногенным веществом.

3.12 окрашивание (staining): Придание цвета материалу с помощью реакции с красителем или хромогенным реагентом.

3.13 краситель, краска (stain): Раствор одного или нескольких красящих веществ в определенных концентрациях в определенном растворителе, используемый для окрашивания.

Примечание 1 — Краска может быть приготовлена прямым растворением красящего вещества в растворителе или разведением готового основного раствора подходящими агентами.

3.14 основной раствор красителя (stock solution of stain): Стабильный определенный раствор одного или нескольких красящих веществ в более высокой концентрации, чем используемая при окраске.

Примечание - Стабильность означает постоянство свойств красящего вещества даже в присутствии других красящих веществ.

3.15 зонд нуклеиновой кислоты (nucleic acid probe): Одно- или двухцепочечный олигонуклеотид или полинуклеотид определенной длины, комплементарный специфическим последовательностям нуклеотидов в нуклеиновых кислотах.

4 Требования к информации, предоставляемой изготовителем

4.1 Общие требования

4.1.1 Взаимодействие с поставщиком

Когда изготовитель использует материалы от поставщика, то он обязан удостовериться в том, что поставщик соответствует требованиям систем обеспечения качества, описанным в ИСО 9001 и ИСО 13485.

4.1.2 Предупреждения и меры предосторожности

Изготовитель реагентов (реактивов), используемых для окрашивания биологических материалов, должен предоставить информацию относительно предупреждений и мер предосторожности в соответствии с ИСО 18113-1 и ИСО 18113-2.

4.1.3 Форма информации, предоставляемой изготовителем

Форма информации, предоставляемой изготовителем вместе с реагентами, используемыми для окрашивания биологических материалов, должна соответствовать ИСО 80000-1 и ИСО 80000-9. Кроме того, в соответствующих случаях должны соблюдаться требования, указанные в 4.1.4 - 4.1.6 в отношении различных реагентов, используемых для окрашивания биологических материалов.

4.1.4 Информация, предоставляемая изготовителем с реагентами, используемыми для окрашивания биологических материалов

Информация, предоставляемая изготовителем с реагентами, используемыми для окрашивания биологических материалов, должна соответствовать ИСО 80000-1, ИСО 80000-9, ИСО 18113-1 и ИСО 18113-2. Должна быть приведена информация о мерах предупреждения и предосторожности. Кроме того, если это применимо, требования, установленные в 4.1.2 - 4.1.4, должны быть применены к различным реагентам, используемым для окрашивания биологических материалов.

4.1.5 Наименование реагента

Наименование реагента должно включать в себя регистрационный номер в CAS и номер индекса красителя, если это применимо.

Примечание 1 — Регистрационные номера в CAS являются регистрационными номерами в Химической справочной службе (CAS). Они представляют собой уникальные числовые кодовые номера веществ, получивших индекс, присвоенный химическим веществам в Химической справочной службе.

Примечание 2 — Индекс красителя состоит из 5-значного номера, номера C.I. и специально составленного наименования большинства красящих веществ.

4.1.6 Описание реагента

Описание реагента должно включать в себя соответствующие физико-химические данные, сопровождаемые сведениями, относящимися к каждой партии. Данные должны содержать, по крайней мере, следующую информацию:

a) молекулярную формулу, включая противоион;

b) молярную массу (г/моль) точно обозначенную, с включением противоиона или без него;

c) допускаемые пределы интерферирующих веществ;

d) обслуживание и хранение.

Для окрашенных органических соединений данные должны содержать:

e) молярную абсорбцию (вместо этого может быть приведено содержание молекулы чистого красящего вещества, но не содержание общего красящего вещества);

f) длину волны или число волн при максимальной абсорбции;

g) данные тонкослойной хроматографии, высокопроизводительной жидкостной хроматографии или высокопроизводительной тонкослойной хроматографии.

4.1.7 Предназначенное применение

В руководстве к изделию должно быть приведено предназначенное применение и описание по окрашиванию биологических материалов и количественные и качественные методики (если это применимо). Информация должна включать следующие сведения:

a) тип(ы) биологического материала и требования по обращению и обработке перед окрашиванием.

Примечание 1 — Информацию о типе биологического материала и его обращении и обработке можно найти в справочнике [15].

Пример:

• возможно ли использовать образцы клеток или тканей или и то и другое;
• возможно ли использовать замороженный или химически фиксированный материал или и то и другое;
• процедура обработки тканей;
• какие фиксирующие материалы могут быть применены.

Примечание 2 — В ссылке [15] приведены процедуры использования во время испытания красящего вещества, красителя, хромогенного реагента, флюорохрома, антитела и зонда нуклеиновой кислоты, используемых для окрашивания биологических материалов;

b) детали соответствующей методики реакции, использованной изготовителем для исследования реактивности красящего вещества, краски, хромогенного реактива, флюорохрома, антитела, зонда нуклеиновой кислоты или лектина, применяемых для окрашивания в биологических материалах;

c) ожидаемый(е) результат(ы) с учетом исследуемого(ых) типа(ов) биологического материала в соответствии с методикой, указанной изготовителем;

Примеры — См. A.2 и A.3.

d) данные о положительном или отрицательном контроле ткани и об интерпретации результата(ов);

e) ссылки на опубликованные результаты, полученные при использовании реагента для диагностики in vitro по методике, предлагаемой изготовителем.

4.2 Дополнительные требования к реагентам специфических видов

4.2.1 Флюорохромы

Независимо от типа применения, флюорохромы, предлагаемые для окрашивания, должны сопровождаться следующей информацией:

a) избирательность, например, описание мишени(ей), которая(ые) может (могут) быть продемонстрирована(ы) с использованием специфических условий;

b) длины волн света возбуждения и испускания;

c) для флюорохромов, конъюгированных с антителами, отношение количества флюорохрома к белку (соотношение количества вещества F/P) является существенным для количественных определений. Соотношение F/P вычисляют путем раздельного определения концентрации белка и флуорохрома — на основе измерений поглощения, и выражают в виде соотношения этих концентраций.

4.2.2 Соли металлов

Если предлагаются к исследованию металлсодержащие соединения по методике проведения специфической реакции с металлом при окрашивании биологических материалов, должна быть приведена следующая дополнительная информация:

a) системное наименование;

b) чистота (отсутствие примесей).

4.2.3 Антитела

Антитела, предлагаемые для окрашивания биологического материала (образцов), должны сопровождаться следующей информацией, если иное не оговорено национальными нормативными документами:

a) описание антигена (иммуногенного вещества), против которого направлено антитело и, если антиген определен кластером системы дифференциации, — номер CD. Описание должно содержать, если это приемлемо, тип обнаруживаемой макромолекулы, часть которой должна быть обнаружена, клеточная локализация и клетки или ткани, в которых она находится, и любая перекрестная реактивность с другими эпитопами;

b) для моноклональных антител — клон, метод образования (супернатант культуры ткани или асцитическая жидкость), подкласс иммуноглобулина и идентичность легкой цепи.

Примечание — В ссылке [8] содержится обновленная информация о современных иммуногистохимических процедурах;

c) для поликлональных антител — животное-хозяин, и используется ли цельная сыворотка или фракция иммуноглобулина;

d) описание формы (раствор или лиофилизированный порошок), количество общего белка и специфическое антитело, а для раствора — природа и концентрация растворителя или среды;

e) описание любых молекулярных связующих веществ или наполнителей, добавленных к антителу;

f) заявление о чистоте, технике очищения и методах обнаружения примесей.

Пример - Вестерн-блоттинг, иммуногистохимия;

g) соответствующие ссылки на публикации, посвященные применению антитела.

Примечание — Примеры процедур, которые могут использоваться изготовителем или конечным пользователем, приведены в руководстве CLSI I/LA28 [8].

4.2.4 Зонды нуклеиновой кислоты

Зонды нуклеиновой кислоты, предлагаемые для окрашивания биологических материалов, должны сопровождаться следующей информацией, если иное не оговорено национальными нормативными документами:

a) одно- или двухспиральная последовательность оснований в зонде;

b) молярная масса зонда или число оснований и, если приемлемо, число фракций (в процентах) пар оснований гуанин-цитозин;

c) использованный маркер (радиоактивный изотоп или нерадиоактивная молекула), точка прикрепления к зонду (3' и/или 5') и доля вещества в процентах меченого зонда;

d) обнаруживаемая генная мишень (последовательность ДНК или РНК);

e) описание формы (лиофилизированный порошок или раствор) и количество (пг или пмоль) или концентрация [пг/см3 (пг/мл) или пмоль/см3 (пмоль/мл)], если применимо, и, в случае раствора, природа и концентрация растворителя или среды;

f) заявление о чистоте, методиках очистки и методах обнаружения примесей.

Пример - Высокопроизводительная жидкостная хроматография;

g) соответствующие ссылки на публикации, касающиеся источников описания последовательности ДНК [18], [22];

h) наличие любых известных патентов и информации по применению зондов нуклеиновой кислоты.

Приложение A (справочное)

ПРИМЕРЫ ИНФОРМАЦИИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМОЙ ИЗГОТОВИТЕЛЕМ С РЕАГЕНТАМИ, ОБЫЧНО ПРИМЕНЯЕМЫМИ В МЕТОДИКАХ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ

A.1 Общие положения

Следующая информация представляет собой примеры процедур окрашивания и ее не следует рассматривать как единственный способ проведения описанных процедур. Эти процедуры могут быть использованы изготовителем для исследования реактивности красящих веществ и иллюстрируют то, каким образом изготовитель может представить информацию, соответствующую настоящему стандарту.

A.2 Краситель метиловый зеленый — пиронин Y. Пример 1

Информация, предоставленная производителем вместе с красящими веществами, используемыми в данной процедуре для окрашивания (метиловый зеленый или этиловый зеленый и пиронин Y), перечисленными ниже.

A.2.1 Красящее вещество метиловый зеленый

A.2.1.1 Метиловый зеленый краситель

ВНИМАНИЕ — R 36/37/38: Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи; S 26: В случае контакта с глазами немедленно промыть; S 36: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

A.2.1.1.1 Описание продукта (наименование):

• метиловый зеленый (синонимы: двойной зеленый SF, легкий зеленый);
• регистрационный номер CAS: 22383-16-0;
• наименование и номер индекса красителя: основной голубой 20, 42585.

A.2.1.1.2 Состав продукта:

молекулярная формула, включающая противоион: C26H₃₃N32+ 2 BF4-;

молярная масса с противоионом (или без него): 561,17 г/моль (387,56 г/моль);

массовая доля (содержание) метилового зеленого катиона: 85%, определена с помощью метода абсорбционной спектрометрии; допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

• вода: менее 1%;
• неорганические соли: менее 0,1%;
• детергенты: не присутствуют;
• окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживаются с помощью тонкослойной хроматографии;
• индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.

A.2.1.1.3 Обращение и хранение

Стабилен при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре (от 18 °C до 28 °C).

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, соответствующий метиловому зеленому.

A.2.1.2 Красящее вещество этиловый зеленый

ВНИМАНИЕ — R 36/37/38: Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи; S 26: В случае контакта с глазами немедленно промыть; S 36: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

A.2.1.2.1 Описание продукта (наименование):

• этиловый зеленый (синоним: метиловый зеленый);
• регистрационный номер CAS: 7114-03-6;
• наименование и номер индекса красителя: наименование в индексе красителя отсутствует, 42590.

A.2.1.2.2 Состав:

молекулярная формула, включающая противоион: C26H₃₃N32+ 2 BF4-;

молярная масса с противоионом (или без него): 575,19 г/моль (401,58 г/моль);

массовая доля этилового зеленого катиона: 85%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

• вода: менее 1%;
• неорганические соли: менее 0,1%;
• детергенты: отсутствуют;
• окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии;
• индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.

A.2.1.2.3 Обращение и хранение

Стабилен при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с этиловым зеленым.

A.2.1.3 Красящее вещество пиронин Y.

ВНИМАНИЕ — R20/21/22: Вреден при вдыхании, попадании на кожу и проглатывании.

A.2.1.3.1 Описание продукта (название):

• пиронин Y (синонимы: pyronine Y, пиронин G, pyronine G);
• регистрационный номер CAS: 92-32-0;
• наименование и номер индекса красителя: наименование в индексе красителя отсутствует, 45005.

A.2.1.3.2 Состав продукта:

молекулярная формула, включающая противоион: C₁₇H₁₉N₂O+Cl-;

молярная масса с противоионом (или без него): 302,75 г/моль (267,30 г/моль);

массовая доля пиронина Y катиона: 80%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

• вода: менее 1%;
• неорганические соли: менее 0,1%;
• детергенты: отсутствуют;
• окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии;
• индифферентные соединения: 19% растворимого крахмала.

A.2.1.3.3 Обращение и хранение.

Стабилен при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 550 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с пиронином Y.

A.2.2 Предназначенное применение метода окрашивания метиловым зеленым — пиронином Y

Эта процедура используется для демонстрации ДНК (нуклеинов) и РНК (рибосом) в клеточном материале. Это особенно подходит для демонстрации плазменных клеток.

A.2.3 Тип(ы) материала

Краситель метиловый зеленый — пиронин Y применяется для окрашивания свежезамороженных, парафинированных или пластиковых срезов тканей различных видов.

A.2.4 Обращение и обработка перед окрашиванием

A.2.4.1 Возможные фиксирующие средства включают в себя:

жидкость Карноя [этанол (объемная доля 99%) + хлороформ + уксусная кислота (массовая доля 99%), смешанные в объемах (60 + 30 + 10) см3 (мл)]; или

формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом (pH = 7,0); высушивание, очистка, пропитывание и покрытие парафином, приготовление срезов с помощью микротома.

A.2.5 Рабочий раствор

A.2.5.1 Приготовление рабочего раствора [15], [16]

a) Готовят раствор этилового зеленого или метилового зеленого из количества, соответствующего массе 0,15 г чистого красящего вещества, рассчитанного как окрашенный катион (в приведенных выше примерах 0,176 г в каждом случае) в 90 см3 (мл) горячей (температура 50 °C) дистиллированной воды [6], [10], [14].

b) Растворяют количество вещества соответствующее, содержанию по массе 0,03 г пиронина Y, рассчитанного как окрашенный катион (в примере, приведенном выше, 0,038 г) в 10 см3 (мл) фталатного буфера (pH = 4,0) концентрацией 0,1 моль/дм3 (моль/л) [9], [13].

c) Смешивают полученный раствор с раствором этилового зеленого или метилового зеленого.

d) Рабочий раствор стабилен по крайней мере одну неделю при хранении в плотно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

A.2.5.2 Методика окрашивания [12], [16]

a) Депарафинируют срезы.

b) Срезы смачивают.

c) Окрашивают срезы в течение 5 мин при комнатной температуре примерно 22 °C в рабочем растворе.

d) Промывают срезы в двух сменах дистиллированной воды, от 2 до 3 с в каждой.

e) Стряхивают излишки воды.

f) Активируют в трех сменах 1-бутанола.

g) Переносят непосредственно из 1-бутанола в гидрофобную синтетическую смолу.

A.2.6 Ожидаемый(е) результат(ы)

Ожидается получение следующих результатов с типами материалов, перечисленными в A.2.4.1:

• для ядерного хроматина: зеленый (фиксатор Карнов) или голубой (фиксатор формальдегид);
• для нуклеол и цитоплазмы, богатой рибосомами: красный (фиксатор Карнов) или лиловато-красный (фиксатор формальдегид);
• для матрицы хрящей и гранул тучных клеток: оранжевый;
• для мышц, коллагена и эритроцитов: не окрашены.

A.3 Реакция Фельгена-Шиффа. Пример 2

Информация, предоставленная производителем с красителем, используемым для получения хромогенного реагента (парарозанилин — реактив Шиффа), применяемого в процедуре окрашивания.

A.3.1 Краситель, использованный в реакции Фельгена-Шиффа

A.3.1.1 Красящее вещество парарозанилин

ВНИМАНИЕ — Для R 40: Возможный риск необратимых эффектов; для R 22: Не вдыхать пыль; для S 36/37: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

A.3.1.1.1 Описание продукта (наименование):

• парарозанилин (синонимы: основной рубиновый, парафуксин, парамагента, магента 0);
• регистрационный номер CAS: 569-61-9;
• наименование и номер индекса красителя: основной красный 9,42500.

A.3.1.1.2 Состав:

молекулярная формула, включающая противоион: C19H₁₈N₃+Cl-;

молярная масса с противоионом (или без него): 323,73 г/моль (288,28 г/моль);

массовая фракция парарозанилина катиона: 85%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

• вода: менее 1%;
• неорганические соли: менее 0,1%;
• детергенты: не присутствуют;
• окрашенные примеси: метилированные гомологи парарозанилина могут присутствовать в следовых количествах, определяемые с помощью тонкослойной хроматографии, но акридин отсутствует;
• индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.

A.3.1.1.3 Обращение и хранение.

Стабилен при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 542 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует один основной компонент, соответствующий парарозанилину; возможны метилированные гомологи парарозанилина в следовых количествах.

A.3.2 Предназначенное применение реакции Фельгена-Шиффа

Эта процедура используется для демонстрации ДНК в клеточном материале.

A.3.3 Тип(ы) материала

Реакцию Фельгена-Шиффа применяют для парафинированных или пластиковых срезов различных видов тканей или цитологического материала (мазок, отпечаток ткани, культура клеток, монослой).

A.3.4 Обращение и обработка перед окрашиванием

Возможные фиксирующие вещества включают в себя:

• гистологию: формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом (pH = 7,0);
• цитологию:
• жидкий фиксирующий материал: этанол (объемная доля 96%);
• высушенный на воздухе материал;
• формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом;
• метанол + формальдегид (массовая доля 37%) + уксусная кислота (массовая доля 100%), смешанные в объемах (85 + 10 + 5) см3 (мл). Материал, фиксированный в фиксаторе Буина, непригоден для этой реакции.

A.3.5 Процедура окрашивания

A.3.5.1 Процедура окрашивания парарозанилином — реактивом Шиффа [11]

a) Растворяют 0,5 г парарозанилин хлорида в 15 см3 (мл) соляной кислоты концентрацией 1 моль/дм3 (моль/л).

b) Добавляют 85 см3 (мл) водного раствора K2S2O5 (массовая доля 0,5%).

c) Ожидают 24 ч.

d) Взбалтывают 100 см3 (мл) этого раствора с 0,3 г древесного угля в течение 2 мин и фильтруют.

e) Хранят бесцветную жидкость при температуре не ниже 5 °C. Раствор стабилен в течение по крайней мере 12 мес в плотно закрытой посуде.

A.3.5.1.1 Раствор для промывания

a) Растворяют 0,5 г K2S2O5 в 85 см3 (мл) дистиллированной воды.

b) Добавляют 15 см3 (мл) соляной кислоты концентрацией 1 моль/дм3 (моль/л). Раствор готов к немедленному применению и может быть использован в течение 12 ч.

A.3.5.2 Методика окрашивания [19], [20]

a) Депарафинируют парафинированные срезы в ксилене в течение 5 мин, затем промывают в течение 2 мин, сначала в этаноле с объемной долей 99%, а затем в этаноле с объемной долей 50%.

b) Смачивают пластиковые срезы, депарафинируют парафинированные срезы и цитологический материал в дистиллированной воде в течение 2 мин.

c) Гидролизируют материал в 5 моль/дм3 (моль/л) соляной кислоты при температуре 22 °C в течение от 30 до 60 мин (точное время гидролиза зависит от типа материала).

d) Промывают дистиллированной водой в течение 2 мин.

e) Окрашивают реагентом парарозанилин в течение 1 ч.

f) Промывают в трех последовательных сменах промывного раствора, по 5 мин в каждой.

g) Дважды промывают дистиллированной водой, по 5 мин каждый раз.

h) Дегидратируют в этаноле с объемной долей 50%, затем с 70% и наконец в 99%-ном этаноле, по 3 мин каждый раз.

i) Дважды промывают в ксилене, по 5 мин каждый раз.

j) Извлекают в синтетическую гидрофобную смолу.

A.3.6 Ожидаемые результаты

Ожидается получение следующих результатов в реакции Фельгена-Шиффа [19], [20]:

• для ядер клеток (ДНК): красный цвет.

Приложение ДА (справочное)

СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНЫХ СТАНДАРТОВ НАЦИОНАЛЬНЫМ СТАНДАРТАМ

Таблица ДА.1

БИБЛИОГРАФИЯ