---
title: "\"ГОСТ ISO/TS 15495/IDF/RM 230-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко, молочные продукты и питание для детей раннего возраста. Руководящие указания для количественного определения меламина и циануровой кислоты методом жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS)\""
number: "ГОСТ ISO/TS 15495/IDF/RM 230-2012"
issuer: "Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/standart-gost-isots-15495idfrm-230-2012"
---

## "ГОСТ ISO/TS 15495/IDF/RM 230-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко, молочные продукты и питание для детей раннего возраста. Руководящие указания для количественного определения меламина и циануровой кислоты методом жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS)"

# "ГОСТ ISO/TS 15495/IDF/RM 230-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко, молочные продукты и питание для детей раннего возраста. Руководящие указания для количественного определения меламина и циануровой кислоты методом жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS)"

(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.11.2012 N 1670-ст)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия - национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 N 236).
> Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции" (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 N 80).
> Документ [введен](#p100009) в действие с 01.01.2014.


<a id="p100001"></a>Введен в действие
Приказом Федерального
агентства по техническому
регулированию и метрологии
от 29 ноября 2012 г. N 1670-ст

<a id="p100002"></a>**МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ**

<a id="p100003"></a>**МОЛОКО, МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИТАНИЕ**
**ДЛЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА**

<a id="p100004"></a>**РУКОВОДЯЩИЕ УКАЗАНИЯ**
**ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕЛАМИНА И ЦИАНУРОВОЙ**
**КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - ТАНДЕМНОЙ**
**МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ (LC-MS/MS)**

<a id="p100005"></a>Milk, milk products and infant formulae. Guidelines for the
quantitative determination of melamine and cyanuric
acid by LC-MS/MS

<a id="p100006"></a>**(ISO/TS 15495/IDF/RM 230, IDT)**

<a id="p100007"></a>**ГОСТ ISO/TS 15495/IDF/RM 230-2012**

<a id="p100008"></a>МКС 67.100.99

<a id="p100009"></a>Дата введения
1 января 2014 года


### <a id="p100010"></a>Предисловие


<a id="p100011"></a>Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"


### <a id="p100012"></a>Сведения о стандарте


<a id="p100013"></a>1 ПОДГОТОВЛЕН Секретариатом ТК 470/МТК 532 "Молоко и продукты переработки молока" и ООО НТК "Молочная Индустрия"
<a id="p100014"></a>2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
<a id="p100015"></a>3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 15 ноября 2012 г. N 42-2012)
<a id="p100016"></a>За принятие проголосовали:


| <a id="p100017"></a>Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | <a id="p100018"></a>Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | <a id="p100019"></a>Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
| --- | --- | --- |
| <a id="p100020"></a>Казахстан | <a id="p100021"></a>KZ | <a id="p100022"></a>Госстандарт Республики Казахстан |
| <a id="p100023"></a>Киргизия | <a id="p100024"></a>KG | <a id="p100025"></a>Кыргызстандарт |
| <a id="p100026"></a>Россия | <a id="p100027"></a>RU | <a id="p100028"></a>Росстандарт |
| <a id="p100029"></a>Таджикистан | <a id="p100030"></a>TJ | <a id="p100031"></a>Таджикстандарт |
| <a id="p100032"></a>Узбекистан | <a id="p100033"></a>UZ | <a id="p100034"></a>Узстандарт |


<a id="p100035"></a>4 Настоящий стандарт идентичен международному документу ISO/TS 15495/IDF/RM 230 Milk, milk products and infant formulae - Guidelines for the quantitative determination of melamine and cyanuric acid by LC-MS/MS [Молоко, молочные продукты и питание для детей раннего возраста. Руководящие указания для количественного определения меламина и циануровой кислоты методом жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (LC-MS|MS)].
<a id="p100036"></a>Международный документ разработан подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной федерацией по молочному животноводству (IDF).
<a id="p100037"></a>Перевод с английского языка (en).
<a id="p100038"></a>Официальные экземпляры международного документа, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.
<a id="p100039"></a>Сведения о соответствии ссылочных межгосударственных стандартов международным стандартам приведены в [приложении ДА](#p101018).
<a id="p100040"></a>Степень соответствия - идентичная (IDT)
<a id="p100041"></a>5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1670-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 15495/IDF/RM 230-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 года
<a id="p100042"></a>**6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ**

<a id="p100043"></a>Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет


### <a id="p100044"></a>Введение


<a id="p100045"></a>Международная организация по стандартизации ИСО (ISO) является всемирной федерацией национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
<a id="p100046"></a>Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в Директивах ISO/IEC, часть 2.
<a id="p100047"></a>Основная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на голосование. Для опубликования их в качестве международного стандарта требуется одобрение не менее 75% комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
<a id="p100048"></a>При других обстоятельствах, особенно при наличии настоятельных требований рынка, технический комитет может решить опубликовать другие типы нормативных документов:
- <a id="p100049"></a>общедоступные технические условия ISO (ISO/PAS), представляющие собой соглашение между техническими экспертами рабочей группы ISO и публикуемые при условии получения одобрения более чем 50% голосов членов головного технического комитета, принимавших участие в голосовании;
- <a id="p100050"></a>технические условия ISO (ISO/TS), представляющие собой соглашение между членами технического комитета и публикуемые при условии утверждения 2/3 голосов членов комитета, принимавших участие в голосовании.
<a id="p100051"></a>Документы ISO/PAS или ISO/TS пересматриваются через три года с целью принятия решения либо о продлении их действия на следующие три года, либо о пересмотре и публикации в качестве международного стандарта, либо прекращении действия. Если принимается решение о продлении действия ISO/PAS и ISO/TS, они должны быть пересмотрены через следующие три года, когда они должны быть либо преобразованы в международный стандарт, либо отменены.
<a id="p100052"></a>Следует учитывать возможность того, что некоторые элементы международного стандарта могут быть предметом патентного права. ISO не несет ответственности за идентификацию любого из таких патентных прав.
<a id="p100053"></a>Международный документ ISO/TS 15495|IDF/RM 230 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34 "Пищевые продукты" подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" и Международной федерацией по молочному животноводству (IDF). Международный документ публикуется совместно с ISO и IDF.
<a id="p100054"></a>IDF (Международной федерацией по молочному животноводству ММФ (IDF) является некоммерческой организацией, представляющей всемирное молочное производство. Членами IDF являются Национальные комитеты каждой страны-члена, а также региональные ассоциации по молочному животноводству, которые имеют подписанное официальное соглашение о совместной деятельности с IDF. Каждый член IDF имеет право быть представленным в постоянных комитетах IDF, осуществляющих техническую работу. IDF сотрудничает с ISO по вопросам разработки стандартных методов анализа и отбора проб молока и молочных продуктов.
<a id="p100055"></a>Основная задача постоянных комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты международных стандартов, принятые Постоянными комитетами, рассылаются Национальным комитетам для утверждения до опубликования в качестве международных стандартов. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее 50% национальных комитетов IDF, принимающих участие в голосовании.
<a id="p100056"></a>Следует иметь в виду, что некоторые элементы международных стандартов могут быть объектом патентных прав. IDF не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав.
<a id="p100057"></a>ISO/TS 15495/IDF/RM 230 был подготовлен Международной молочной федерацией IDF (ММФ) и Техническим комитетом ISO/TC 34 "Пищевые продукты" подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты". Опубликован совместно IDF и ISO.
<a id="p100058"></a>Вся работа по разработке международного документа была выполнена совместной рабочей группой по Определению меламина постоянного комитета по Методам анализа добавок и примесей под руководством лидеров проекта, д-ра С.Е. Холройда (S.E. Holroyd) (Новая Зеландия) и д-ра Т. Делатуа (T. Delatour) (Швейцария).


### <a id="p100059"></a>1 Область применения


<a id="p100060"></a>Настоящий стандарт устанавливает руководящие указания для количественного определения меламина и циануровой кислоты в молоке, сухих молочных продуктах и питании для детей раннего возраста методом жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением - тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS).
<a id="p100061"></a>Примечание - Примеры методов LC-MS/MS приведены в [приложениях A](#p100127) и [B](#p100643).


### <a id="p100062"></a>2 Нормативные ссылки


<a id="p100063"></a>Следующие ссылочные документы обязательны для применения данного документа. Для датированных ссылок применяется только указанное издание. Для недатированных ссылок применяется самое последнее издание указанного документа (включая все изменения).
<a id="p100064"></a>ISO 3534 (all parts) Statistics - Vocabulary and symbols (Статистика. Словарь и обозначения)
<a id="p100065"></a>ISO 5725-1 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 1. Общие принципы и определения)


### <a id="p100066"></a>3 Термины и определения


<a id="p100067"></a>В настоящем стандарте применены термины по ISO 3534, ISO 5725-1, а также следующие термины с соответствующими определениями.
<a id="p100068"></a>3.1 содержание меламина (melamine content): Массовая доля вещества, определенная с помощью методов, установленных в настоящем стандарте.
<a id="p100069"></a>*Примечание* - Содержание меламина выражают в миллиграммах на килограмм продукта.

<a id="p100070"></a>3.2 содержание циануровой кислоты (cyanuric acid content): Массовая доля вещества, определенная с помощью методов, установленных в настоящем стандарте.
<a id="p100071"></a>*Примечание* - Содержание циануровой кислоты выражают в миллиграммах на килограмм продукта.

<a id="p100072"></a>3.3 максимальный предел (maximum limit, ML): Максимальное содержание меламина или циануровой кислоты, допускаемое или приемлемое в молоке, продукции из сухого молока или молочных смесей для детей раннего возраста.
<a id="p100073"></a>*Примечание* - ML может быть пределом, установленным на национальном, международном уровнях или на определенном уровне решения таких проблем.


### <a id="p100074"></a>4 Сущность метода


<a id="p100075"></a>Пробу приводят в гомогенное состояние или разбавляют в случае порошкообразных проб. К пробе для анализа добавляют подходящий растворитель, чтобы осадить белки из матрицы и экстрагировать меламин и циануровую кислоту. После центрифугирования аликвотное количество надосадочной жидкости анализируют методом LC-MS/MS.
<a id="p100076"></a>Применительно к настоящему стандарту LC-MS/MS обозначает любой метод, соединяющий высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) или сверхпроизводительную жидкостную хроматографию (UPLC), либо с обнаружением на спектрометре с тремя квадрупольными линзами, либо с обнаружением на масс-спектрометре с ионной ловушкой. Хроматографическое разделение основано на жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILIC), чтобы обеспечить хорошее разделение меламина и циануровой кислоты. Ионизация вещества сопровождается ионизацией электрораспылением (ESI), а детекторы функционируют в выбранном режиме мониторинга реакции (SRM).
<a id="p100077"></a>Примечание - Можно использовать другие достаточно эффективные методы ионизации. Также можно использовать другие анализаторы массы, постольку поскольку они согласуются с критериями эффективности (идентификационные точки) по [[1]](#p101034).

<a id="p100078"></a>Количественное определение меламина и циануровой кислоты основано на разбавлении с использованием внутренних стандартов стабильного изотопа для обоих определяемых веществ (аналитов).


### <a id="p100079"></a>5 Отбор проб


<a id="p100080"></a>Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 707/IDF 50 [[2]](#p101035). Важно, чтобы лаборатория получила действительно репрезентативную пробу, без повреждений и изменений в результате транспортирования или хранения.


### <a id="p100081"></a>6 Подготовка пробы для анализа


<a id="p100082"></a>Масса пробы для анализа или дополнительного разбавления должна быть представительной для исследуемого продукта и позволять эффективную экстракцию определяемых веществ (аналитов).
<a id="p100083"></a>Стандарты с мечеными изотопами следует вводить непосредственно в сухую или влажную пробу на первом этапе анализа.
<a id="p100084"></a>Концентрация добавленных внутренних стандартов должна быть величиной такого же порядка, как концентрация меламина и циануровой кислоты. Экстракцию можно выполнить в объеме растворителя не менее 5 см3 на грамм материала пробы, чтобы получить конечную массовую долю органического растворителя в экстракционной смеси не менее 70%. Экстракцию следует вести в течение не менее 5 мин либо при энергичном встряхивании, либо с помощью ультразвука в сочетании с перемешиванием. Затем пробу центрифугируют в определенных условиях и фильтруют через шприцевой фильтр.
<a id="p100085"></a>Можно применять другие способы при условии соответствия критериям эффективности и соответствия валидации требованиям, установленным в настоящем стандарте.


### <a id="p100086"></a>7 Проведение анализа



#### <a id="p100087"></a>7.1 Анализ LC-MS/MS. Хроматография

<a id="p100088"></a>Выполняют разделение с помощью жидкостной хроматографии, используя колонку, предназначенную для этой цели.
<a id="p100089"></a>Минимальное приемлемое время удерживания для меламина и циануровой кислоты должно вдвое превосходить время удерживания, соответствующее свободному объему колонки. Время удерживания в экстракте пробы должно соответствовать времени удерживания калибровочного стандарта в пределах установленного интервала времени удерживания.
<a id="p100090"></a>Отношение времени удерживания определяемого вещества (аналита) к времени удерживания внутреннего стандарта должно соответствовать отношению времени удерживания калибровочных стандартов к времени удерживания внутреннего стандарта в пределах +/- 2,5%.

#### <a id="p100091"></a>7.2 Анализ LC-MS/MS. Масс-спектрометрия

<a id="p100092"></a>Масс-спектрометрическое определение меламина и циануровой кислоты должно осуществляться предпочтительно посредством применения прибора LC-MS/MS с тремя квадрупольными линзами.
<a id="p100093"></a>Количественное определение и идентификация должны достигаться в режиме SRM. При использовании прибора с тремя квадрупольными линзами для каждого соединения, должно использоваться не менее двух MRM-переходов массы для определения аналита, тогда как не менее одного перехода должно использоваться для внутреннего стандарта. Также рекомендуется, чтобы для внутреннего стандарта наблюдалось два MRM-перехода.
<a id="p100094"></a>Наиболее подходящий переход (наиболее интенсивный) должен использоваться для количественного определения (квантификатор), а второй для подтверждения (квалификатор). Необходимо проверить отношение интенсивности квалификатора к интенсивности квантификатора (Rq/Q) и применить критерии допусков в зависимости от значения Rq/Q [(таблица 1)](#p100096).

<a id="p100095"></a>Таблица 1

<a id="p100096"></a>Коэффициент допустимого отклонения для отношения
интенсивности квалификатора к интенсивности
квантификатора (Rq/Q)


| <a id="p100097"></a>Rq/Q<br>(% квантификатора) | <a id="p100098"></a>Допуск (отн. в %) |
| --- | --- |
| <a id="p100099"></a>> 50 | <a id="p100100"></a>+/- 20 |
| <a id="p100101"></a>> 20 до 50 | <a id="p100102"></a>+/- 25 |
| <a id="p100103"></a>> 10 до 20 | <a id="p100104"></a>+/- 30 |
| <a id="p100105"></a><= 10 | <a id="p100106"></a>+/- 50 |



### <a id="p100107"></a>8 Критерии рабочих характеристик



#### <a id="p100108"></a>8.1 Общие положения

<a id="p100109"></a>Каждой лаборатории следует подтвердить вводимый метод, чтобы продемонстрировать соответствие поставленным целям. Для валидации рекомендуется процедура, установленная по [[1]](#p101034). Максимальные и минимальный пределы рабочих характеристик, взятых из этой процедуры, определены в [8.2](#p100110) и [8.5](#p100116).

#### <a id="p100110"></a>8.2 Требуемая минимальная чувствительность

<a id="p100111"></a>Требуемый предел квантификации (LoQ) должен быть не менее чем в 10 раз ниже максимального предела (ML), чтобы обеспечить надежный диапазон при ML.

#### <a id="p100112"></a>8.3 Достоверность и воспроизведение

<a id="p100113"></a>Следуя данному руководству, достоверность и воспроизведение обычно попадают в интервал между 95% и 105%. Для приемки аналитических методов правильность и выход должны быть в интервале между 80% и 110%.

#### <a id="p100114"></a>8.4 Повторяемость

<a id="p100115"></a>Коэффициент вариаций повторяемости обычно составляет от 3% до 6%, с пределом < 15%.

#### <a id="p100116"></a>8.5 Внутрилабораторная воспроизводимость

<a id="p100117"></a>Коэффициент вариаций внутрилабораторной воспроизводимости обычно составляет от 5% до 10%, с пределом < 15%.


### <a id="p100118"></a>9 Протокол испытаний


<a id="p100119"></a>Протокол испытаний должен содержать, как минимум, следующую информацию:
<a id="p100120"></a>a) все сведения, необходимые для полной идентификации пробы;
<a id="p100121"></a>b) использованный метод отбора проб, если он известен;
<a id="p100122"></a>c) использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
<a id="p100123"></a>d) все детали процедур, не установленных в настоящем стандарте или считающихся необязательными, наряду с описанием всех событий, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;
<a id="p100124"></a>e) полученный(е) результат(ы) испытания;
<a id="p100125"></a>f) если проверялась повторяемость (сходимость), то полученный конечный результат.





<a id="p100126"></a>Приложение A
(справочное)

<a id="p100127"></a>*ПРИМЕР* A - КОРОВЬЕ МОЛОКО И СУХИЕ МОЛОЧНЫЕ СМЕСИ ДЛЯ ДЕТЕЙ
**РАННЕГО ВОЗРАСТА. ОДНОВРЕМЕННОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ**
**МЕЛАМИНА И ЦИАНУРОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ**
**ХРОМАТОГРАФИИ С ИОНИЗАЦИЕЙ ЭЛЕКТРОРАСПЫЛЕНИЕМ**
**И ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ**

<a id="p100128"></a>A.1 Область применения
<a id="p100129"></a>В данном приложении установлен подтвержденный внутри лаборатории метод количественного определения меламина и циануровой кислоты в коровьем молоке и сухих молочных смесях для детей раннего возраста методом жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) с использованием режима мониторинга выбранных реакций.
<a id="p100130"></a>Положительная идентификация меламина и циануровой кислоты в пробе проводится согласно критериям подтверждения по [[1]](#p101034).
<a id="p100131"></a>Количественное определение осуществляют с помощью изотопного разбавления, используя меченый (13C<sub>3</sub>, 15N<sub>3</sub>)-меламин и меченую (13C<sub>3</sub>, 15N3)-циануровую кислоту в качестве внутренних стандартов (IS). Дополнительные технические подробности можно найти в данных валидации и результатах квалификационных испытаний, см. ссылку [[3]](#p101036).
<a id="p100132"></a>Метод позволяет осуществить точное количественное определение при следующих сообщаемых пределах, и более:
<a id="p100133"></a>a) содержание меламина и циануровой кислоты в коровьем молоке при массовой концентрации от 0,05 до 0,10 мг/кг соответственно;
<a id="p100134"></a>содержание меламина и циануровой кислоты в молочных смесях для детей раннего возраста при массовой концентрации от 0,05 мг/кг до 0,10 мг/кг, соответственно;
<a id="p100135"></a>b) содержание меламина и циануровой кислоты в молочных смесях для детей раннего возраста при массовой концентрации 1,00 мг/кг.
<a id="p100136"></a>A.2 Термины и определения
<a id="p100137"></a>См. [раздел 3](#p100066).
<a id="p100138"></a>A.3 Сущность метода
<a id="p100139"></a>Методика анализа включает разбавление пробы в водном растворе ацетонитрила, что приводит к осаждению. После центрифугирования надосадочную жидкость анализируют методом LC-MS/MS в режиме SRM, работая как в режиме ионизации с получением положительных ионов, так и в режиме ионизации с получением отрицательных ионов. Переключение полярности выполняется в рамках одного опыта.
<a id="p100140"></a>A.4 Реактивы
<a id="p100141"></a>Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду равноценной чистоты.
<a id="p100142"></a>*Примечание* - Номера по CAS приведены для каждого реактива.

<a id="p100143"></a>Перед использованием химических веществ см. соответствующие справочники или перечни безопасности, утвержденные в установленном порядке.
<a id="p100144"></a>A.4.1 Вода для хроматографического анализа (CAS No. 7732-18-5).
<a id="p100145"></a>A.4.2 Ацетонитрил (CH3CN), градиентной чистоты для хроматографического анализа (CAS No. 75-05-8).
<a id="p100146"></a>A.4.3 Ацетат аммония (CH3COONH4), GR для анализа (CAS No. 631-61-8).
<a id="p100147"></a>A.4.4 Циануровая кислота (CNOH)3, массовая доля > 98% (CAS No. 108-80-5).
<a id="p100148"></a>A.4.4.1 Исходный стандартный раствор циануровой кислоты, массовой концентрацией 0,25 мг циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100149"></a>Берут навеску с точностью до 0,1 мг, 63,8 мг циануровой кислоты [(A.4.4)](#p100147) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 250 см3 [(A.5.12)](#p100211), сделав соответствующую поправку на примеси согласно результатам анализа, приведенным в сертификате. Растворяют и доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144). Примерно в течение 15 мин воздействуют ультразвуком до полного растворения.
<a id="p100150"></a>Хранят исходный стандартный раствор циануровой кислоты при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий исходный стандартный раствор готовят еженедельно.
<a id="p100151"></a>A.4.4.2 Рабочий раствор циануровой кислоты I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100152"></a>Пипеткой добавляют 4 см3 исходного стандартного раствора циануровой кислоты [(A.4.4.1)](#p100148) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Рабочий раствор I циануровой кислоты хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор I готовят еженедельно.
<a id="p100153"></a>A.4.4.3 Рабочий раствор циануровой кислоты II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг циануровой кислоты на миллилитр.
<a id="p100154"></a>Пипеткой добавляют 1 см3 рабочего раствора I циануровой кислоты [(A.4.4.2)](#p100151) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Рабочий раствор II циануровой кислоты хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор II готовят еженедельно.
<a id="p100155"></a>A.4.4.4 Рабочий раствор циануровой кислоты III, соответствующий 200 нг циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100156"></a>Пипеткой добавляют 0,5 см3 рабочего раствора циануровой кислоты I [(A.4.4.2)](#p100151) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Рабочий раствор III циануровой кислоты хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор III готовят еженедельно.
<a id="p100157"></a>A.4.5 Меченая циануровая кислота (13C<sub>3</sub>H315N<sub>3</sub>O<sub>3</sub>), изотопная чистота: 13C<sub>3</sub> = 99%; кольцо 15N<sub>3</sub> > 98%; химическая чистота >= 90% по массе, 100 мкг/см3 в воде - 1,2 см3.
<a id="p100158"></a>A.4.5.1 Исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты, соответствующий массовой концентрации 100 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100159"></a>Готовый к применению исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты имеется в продаже. Хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100160"></a>Необходимо использовать IS (внутренний стандарт) одной и той же партии для приготовления стандартных градуировочных растворов, описанных в [A.6.2](#p100215), и введения в экстракты в соответствии с методикой экстракции, описанной в [A.9.1](#p100378).
<a id="p100161"></a>A.4.5.2 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг меченой циануровой кислоты на миллилитр.
<a id="p100162"></a>Пипеткой добавляют 1 см3 от исходного стандартного раствора меченой циануровой кислоты [(A.4.5.1)](#p100158) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Рабочий раствор меченой циануровой кислоты I хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100163"></a>A.4.5.3 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100164"></a>Пипеткой добавляют 0,5 см3 рабочего раствора меченой циануровой кислоты I [(A.4.5.2)](#p100161) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Рабочий раствор меченой циануровой кислоты II хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100165"></a>A.4.5.4 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты III, соответствующий массовой концентрации 200 нг меченой циануровой кислоты на миллилитр.
<a id="p100166"></a>Пипеткой добавляют 0,5 см3 рабочего раствора меченой циануровой кислоты I [(A.4.5.2)](#p100161) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Рабочий раствор меченой циануровой кислоты III хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100167"></a>A.4.6 Меламин (C<sub>3</sub>H<sub>6</sub>N<sub>6</sub>), > 99% по массе (CAS No. 108-78-1).
<a id="p100168"></a>A.4.6.1 Исходный стандартный раствор меламина, соответствующий массовой концентрации 0,25 мг меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100169"></a>Взвешивают с точностью до 0,1 мг 62,5 мг меламина [(A.4.6)](#p100167) и помещают в мерную колбу с одной меткой вместимостью 250 см3 [(A.5.12)](#p100211). Растворяют и доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144). Обрабатывают ультразвуком в течение не менее 15 мин до полного растворения. Хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий исходный раствор готовят еженедельно.
<a id="p100170"></a>A.4.6.2 Рабочий раствор меламина I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг меламина на миллилитр.
<a id="p100171"></a>Пипеткой добавляют 4 см3 исходного стандартного раствора меламина [(A.4.6.1)](#p100168) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меламина I при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор меламина I готовят еженедельно.
<a id="p100172"></a>A.4.6.3 Рабочий раствор меламина II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100173"></a>Пипеткой добавляют 1 см3 рабочего раствора меламина I [(A.4.6.2)](#p100170) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меламина II при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор меламина II готовят еженедельно.
<a id="p100174"></a>A.4.6.4 Рабочий раствор меламина III, соответствующий массовой концентрации 200 нг меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100175"></a>Пипеткой добавляют 0,5 см3 рабочего раствора меламина I [(A.4.6.2)](#p100170) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меламина III при комнатной температуре в защищенном от света месте. Свежий рабочий раствор меламина III готовят еженедельно.
<a id="p100176"></a>A.4.7 Меченый меламин [13C<sub>3</sub>N<sub>3</sub>(15NH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>], изотопная чистота: 13C<sub>3</sub> = 99%; амино-15N<sub>3</sub> = 98%; химическая чистота >= 98% по массе, 100 мг/см3 в воде - 1,2 см3, например, CNLM-8150-1.2 [<1>](#p100178).

<a id="p100177"></a>

---

<a id="p100178"></a><1> CNLM-8150-1.2 - это торговая марка продукции, поставляемой лабораториями изотопов при Кембридже. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

<a id="p100179"></a>A.4.7.1 Исходный раствор меченого меламина, соответствующий концентрации 10 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100180"></a>Хранят раствор при комнатной температуре в защищенном от света месте. Необходимо использовать IS (внутренний стандарт) одной и той же партии для приготовления стандартных градуировочных растворов в [A.6.2](#p100215) и введения в экстракты в соответствии с методикой экстракции, описанной в [A.9.1](#p100378).
<a id="p100181"></a>A.4.7.2 Рабочий раствор меченого меламина I, соответствующий массовой концентрации 20 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100182"></a>Пипеткой добавляют 1 см3 исходного раствора меченого меламина [(A.4.7.1)](#p100179) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меченого меламина I при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100183"></a>A.4.7.3 Рабочий раствор меченого меламина II, соответствующий массовой концентрации 2 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100184"></a>Пипеткой добавляют 0,5 см3 рабочего раствора меченого меламина I [(A.4.7.2)](#p100181) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 5 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меченого меламина II при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100185"></a>A.4.7.4 Рабочий раствор меченого меламина III, соответствующий массовой концентрации 200 нг меченого меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100186"></a>Пипеткой добавляют 0,5 см3 рабочего раствора меченого меламина I [(A.4.7.2)](#p100181) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 [(A.5.12)](#p100211). Доводят до метки водой [(A.4.1)](#p100144) и перемешивают. Хранят рабочий раствор меченого меламина III при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100187"></a>A.5 Аппаратура
<a id="p100188"></a>Стеклянная посуда (например мерные колбы, [A.5.12](#p100211)), используемая для приготовления стандартных исходных и рабочих растворов, может загрязниться, особенно меламином, и требует очистки и промывки следующим образом:
<a id="p100189"></a>a) стеклянную посуду моют вручную теплой водопроводной водой с лабораторным моющим средством;
<a id="p100190"></a>b) стеклянную посуду вручную моют лабораторным ершиком;
<a id="p100191"></a>c) тщательно споласкивают все стекло, включая стеклянные пробки теплой водопроводной водой, затем дистиллированной водой три раза;
<a id="p100192"></a>d) споласкивают стеклянную посуду этиловым спиртом A и дают просохнуть на воздухе.
<a id="p100193"></a>Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
<a id="p100194"></a>A.5.1 Конические пробирки из полипропилена, вместимостью 50 см3.
<a id="p100195"></a>A.5.2 Центрифуга, оснащенная ротором, приспособленная под пробирки вместимостью 50 см3, с ускорением 4000g.
<a id="p100196"></a>A.5.3 Мерные пипетки вместимостью 0,5, 1 и 4 см3, по ISO 835 [[4]](#p101037), класс A (или AS).
<a id="p100197"></a>A.5.4 Автоматическая микропипетка по ISO 8655-2 [[5]](#p101038), точная, прецизионная, калиброванная пользователем.
<a id="p100198"></a>A.5.5 Нейлоновый шприцевой фильтр, пористость 0,22 мкм.
<a id="p100199"></a>A.5.6 Система дегазации (если она не является частью оборудования для LC-MS/MS).
<a id="p100200"></a>A.5.7 Аналитические весы, обеспечивающие считывания с точностью до 0,1 мг.
<a id="p100201"></a>A.5.8 Устройство для ультразвуковой обработки.
<a id="p100202"></a>A.5.9 Пробирки.
<a id="p100203"></a>A.5.10 Оборудование для LC-MS/MS.
<a id="p100204"></a>HPLC Agilent 1100 [<1>](#p100206) в сочетании с масс-спектрометром 4000 QTrap [<2>](#p100207) с тремя квадрупольными линзами, оснащенный источником ионизации Turbolon $Spray®$ [<2>](#p100207).

<a id="p100205"></a>

---

<a id="p100206"></a><1> HPLC Agilent 1100 это торговое наименование прибора, поставляемого Agilent. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении в отношении данной продукции. Можно использовать аналогичную продукцию при условии получения равноценных результатов.
<a id="p100207"></a><2> 4000 QTrap и Turbulon Spray это торговые наименования приборов, поставляемых Applied Biosystems. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении со стороны ISO или IDF в отношении данной продукции. Можно использовать аналогичную продукцию при условии получения равноценных результатов.

<a id="p100208"></a>A.5.11 Колонка HPLC, TSKgel Amide-80 [<3>](#p100210), диаметр 2,0 мм, длина 250 мм, ВД 5 мкм.

<a id="p100209"></a>

---

<a id="p100210"></a><3> TSKgel Amide-80 это торговое наименование прибора, поставляемого Tosoh Bioscience. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящим стандартом и не свидетельствует о предпочтении в отношении данной продукции. Можно использовать аналогичную продукцию при условии получения равноценных результатов.

<a id="p100211"></a>A.5.12 Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 5, 10, 50, 100, 250 и 1000 см3 по ISO 1042 [[6]](#p101039), класс A.
<a id="p100212"></a>A.6 Подготовка реактивов
<a id="p100213"></a>A.6.1 Водный раствор ацетонитрила [соотношение 70 (ацетонитрил) + 30 (вода)]
<a id="p100214"></a>С помощью мерных цилиндров переносят 70 см3 ацетонитрила [(A.4.2)](#p100145) и 30 см3 воды [(A.4.1)](#p100144) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100 см3 [(A.5.12)](#p100211) и перемешивают. Хранят при комнатной температуре в течение не более одной недели.
<a id="p100215"></a>A.6.2 Калибровочные кривые для меламина и циануровой кислоты
<a id="p100216"></a>A.6.2.1 Стандартные растворы меламина и циануровой кислоты (от 0 до 2,00 мг/дм3) с соответствующими IS (внутренними стандартами) (при уровне 1,00 мг/дм3)
<a id="p100217"></a>Готовят по отдельности пять смешанных стандартных растворов, каждый в мерной колбе с одной меткой вместимостью 5 см3 [(A.5.12)](#p100211) в диапазоне концентраций от 0 до 2,00 мг/дм3 и добавляют соответствующий IS (внутренний стандарт) на уровне 1,00 мг/дм3, как показано в [таблице A.1](#p100219).

<a id="p100218"></a>Таблица A.1

<a id="p100219"></a>Стандартные смеси меламина и циануровой кислоты
в соотношении 1:5


<table>
<colgroup><col width="56%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100220"></a>Наименование показателя</td><td colspan="5"><a id="p100221"></a>Стандартный раствор</td></tr>
<tr><td><a id="p100222"></a>1</td><td><a id="p100223"></a>2</td><td><a id="p100224"></a>3</td><td><a id="p100225"></a>4</td><td><a id="p100226"></a>5</td></tr>
<tr><td><a id="p100227"></a>Рабочий раствор меламина II <a href="#p100172">(A.4.6.3)</a>, мкл</td><td><a id="p100228"></a>0</td><td><a id="p100229"></a>25</td><td><a id="p100230"></a>50</td><td><a id="p100231"></a>75</td><td><a id="p100232"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100233"></a>Рабочий раствор циануровой кислоты II <a href="#p100153">(A.4.4.3)</a>, мкл</td><td><a id="p100234"></a>0</td><td><a id="p100235"></a>25</td><td><a id="p100236"></a>50</td><td><a id="p100237"></a>75</td><td><a id="p100238"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100239"></a>Рабочий раствор меченого меламина II <a href="#p100183">(A.4.7.3)</a>, мкл</td><td><a id="p100240"></a>50</td><td><a id="p100241"></a>50</td><td><a id="p100242"></a>50</td><td><a id="p100243"></a>50</td><td><a id="p100244"></a>50</td></tr>
<tr><td><a id="p100245"></a>Рабочий раствор меченой циануровой кислоты II <a href="#p100163">(A.4.5.3)</a>, мкл</td><td><a id="p100246"></a>50</td><td><a id="p100247"></a>50</td><td><a id="p100248"></a>50</td><td><a id="p100249"></a>50</td><td><a id="p100250"></a>50</td></tr>
<tr><td><a id="p100251"></a>Раствор ацетонитрил-вода <a href="#p100213">(A.6.1)</a>, мкл</td><td><a id="p100252"></a>4 900</td><td><a id="p100253"></a>4 850</td><td><a id="p100254"></a>4 800</td><td><a id="p100255"></a>4 750</td><td><a id="p100256"></a>4 700</td></tr>
<tr><td colspan="6"><a id="p100257"></a>Это соответствует:</td></tr>
<tr><td><a id="p100258"></a>концентрации аналитов в сумме, нг/см3</td><td><a id="p100259"></a>0</td><td><a id="p100260"></a>10</td><td><a id="p100261"></a>20</td><td><a id="p100262"></a>30</td><td><a id="p100263"></a>40</td></tr>
<tr><td><a id="p100264"></a>концентрации IS в сумме, нг/см3</td><td><a id="p100265"></a>20</td><td><a id="p100266"></a>20</td><td><a id="p100267"></a>20</td><td><a id="p100268"></a>20</td><td><a id="p100269"></a>20</td></tr>
<tr><td><a id="p100270"></a>содержанию аналитов (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100271"></a>0,00</td><td><a id="p100272"></a>0,50</td><td><a id="p100273"></a>1,00</td><td><a id="p100274"></a>1,50</td><td><a id="p100275"></a>2,00</td></tr>
<tr><td><a id="p100276"></a>содержанию IS (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100277"></a>1,00</td><td><a id="p100278"></a>1,00</td><td><a id="p100279"></a>1,00</td><td><a id="p100280"></a>1,00</td><td><a id="p100281"></a>1,00</td></tr>
</table>


<a id="p100282"></a>Хранят пять полученных стандартных растворов при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
<a id="p100283"></a>A.6.2.2 Стандартные растворы меламина (от 0 до 0,20 мг/дм3) и циануровой кислоты (от 0 до 0,30 мг/дм3) с соответствующими IS (внутренними стандартами) (на уровне 0,10 мг/дм3)
<a id="p100284"></a>Готовят по отдельности пять смешанных стандартных растворов, каждый в мерной колбе с одной меткой вместимостью 5 см3 [(A.5.12)](#p100211), в диапазоне концентраций меламина от 0 до 0,20 мг/дм3 и в диапазоне массовых концентраций циануровой кислоты от 0 до 0,30 мг/дм3 с соответствующим IS (внутренний стандарт) для обоих аналитов, добавленных при концентрации 0,10 мг/дм3, как показано в таблице A.2.

<a id="p100285"></a>Таблица A.2

<a id="p100286"></a>Стандартные смеси меламина и циануровой кислоты
в соотношении 6:10


<table>
<colgroup><col width="56%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100287"></a>Наименование показателя</td><td colspan="5"><a id="p100288"></a>Стандартные растворы</td></tr>
<tr><td><a id="p100289"></a>6</td><td><a id="p100290"></a>7</td><td><a id="p100291"></a>8</td><td><a id="p100292"></a>9</td><td><a id="p100293"></a>10</td></tr>
<tr><td><a id="p100294"></a>Рабочий раствор меламина III <a href="#p100174">(A.4.6.4)</a>, мкл</td><td><a id="p100295"></a>0</td><td><a id="p100296"></a>25</td><td><a id="p100297"></a>50</td><td><a id="p100298"></a>75</td><td><a id="p100299"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100300"></a>Рабочий раствор циануровой кислоты III <a href="#p100155">(A.4.4.4)</a>, мкл</td><td><a id="p100301"></a>0</td><td><a id="p100302"></a>50</td><td><a id="p100303"></a>75</td><td><a id="p100304"></a>100</td><td><a id="p100305"></a>150</td></tr>
<tr><td><a id="p100306"></a>Рабочий раствор меченого меламина III <a href="#p100185">(A.4.7.4)</a>, мкл</td><td><a id="p100307"></a>50</td><td><a id="p100308"></a>50</td><td><a id="p100309"></a>50</td><td><a id="p100310"></a>50</td><td><a id="p100311"></a>50</td></tr>
<tr><td><a id="p100312"></a>Рабочий раствор меченой циануровой кислоты III <a href="#p100165">(A.4.5.4)</a>, мкл</td><td><a id="p100313"></a>50</td><td><a id="p100314"></a>50</td><td><a id="p100315"></a>50</td><td><a id="p100316"></a>50</td><td><a id="p100317"></a>50</td></tr>
<tr><td><a id="p100318"></a>Раствор ацетонитрил-вода <a href="#p100213">(A.6.1)</a>, мкл</td><td><a id="p100319"></a>4 900</td><td><a id="p100320"></a>4 825</td><td><a id="p100321"></a>4 775</td><td><a id="p100322"></a>4 725</td><td><a id="p100323"></a>4 650</td></tr>
<tr><td><a id="p100324"></a>Это соответствует:</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100325"></a>концентрации меламина, нг/см3</td><td><a id="p100326"></a>0</td><td><a id="p100327"></a>1</td><td><a id="p100328"></a>2</td><td><a id="p100329"></a>3</td><td><a id="p100330"></a>4</td></tr>
<tr><td><a id="p100331"></a>концентрации циануровой кислоты, нг/см3</td><td><a id="p100332"></a>0</td><td><a id="p100333"></a>2</td><td><a id="p100334"></a>3</td><td><a id="p100335"></a>4</td><td><a id="p100336"></a>6</td></tr>
<tr><td><a id="p100337"></a>концентрации IS (меламина или циануровой кислоты), нг/см3</td><td><a id="p100338"></a>2</td><td><a id="p100339"></a>2</td><td><a id="p100340"></a>2</td><td><a id="p100341"></a>2</td><td><a id="p100342"></a>2</td></tr>
<tr><td><a id="p100343"></a>содержанию меламина (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100344"></a>0,00</td><td><a id="p100345"></a>0,05</td><td><a id="p100346"></a>0,10</td><td><a id="p100347"></a>0,15</td><td><a id="p100348"></a>0,20</td></tr>
<tr><td><a id="p100349"></a>содержанию циануровой кислоты (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100350"></a>0,00</td><td><a id="p100351"></a>0,10</td><td><a id="p100352"></a>0,15</td><td><a id="p100353"></a>0,20</td><td><a id="p100354"></a>0,30</td></tr>
<tr><td><a id="p100355"></a>содержанию IS (меламин и циануровая кислота, эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100356"></a>0,10</td><td><a id="p100357"></a>0,10</td><td><a id="p100358"></a>0,10</td><td><a id="p100359"></a>0,10</td><td><a id="p100360"></a>0,10</td></tr>
</table>


<a id="p100361"></a>Хранят полученные стандартные растворы при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
<a id="p100362"></a>A.6.3 Растворы для жидкостной хроматографии
<a id="p100363"></a>A.6.3.1 Подвижная фаза A: водный раствор ацетата аммония, 10 ммоль/см3.
<a id="p100364"></a>Переносят 0,77 г ацетата аммония [(A.4.3)](#p100146) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1 000 см3 [(A.5.12)](#p100211). Растворяют в ~50 см3 воды [(A.4.1)](#p100144). Доводят до метки водой и перемешивают. Фильтруют раствор через фильтр пористостью 0,22 мкм.
<a id="p100365"></a>A.6.3.2 Подвижная фаза B: ацетонитрил.
<a id="p100366"></a>Используют ацетонитрил специальной марки для хроматографии (HPLC) [(A.4.2)](#p100145).
<a id="p100367"></a>A.7 Отбор проб
<a id="p100368"></a>Отбор проб не является частью метода, установленного в данном приложении. Рекомендуемый метод отбора проб описан в ISO 707/IDF 50 [[2]](#p101035).
<a id="p100369"></a>Важно, чтобы в лаборатории была получена репрезентативная проба, которая не претерпела повреждений и изменений в процессе транспортирования и хранения.
<a id="p100370"></a>Сырое молоко хранят при температуре 4 °C или в замороженном состоянии, если анализ не будет проводиться непосредственно по получении.
<a id="p100371"></a>A.8 Подготовка проб для анализа
<a id="p100372"></a>A.8.1 Сухая молочная смесь для детей раннего возраста
<a id="p100373"></a>Готовят гомогенную лабораторную пробу путем переноса ее в емкость для пробы вместимостью, в два раза превышающей объем лабораторной пробы. Немедленно закрывают емкость.
<a id="p100374"></a>Тщательно перемешивают, многократно встряхивая и переворачивая емкость.
<a id="p100375"></a>A.8.2 Коровье молоко
<a id="p100376"></a>Доводят пробу до комнатной температуры. Перед тем, как взять навеску для анализа, убеждаются, что проба гомогенная осторожным перевертыванием емкости несколько раз.
<a id="p100377"></a>A.9 Проведение анализа
<a id="p100378"></a>A.9.1 Методика экстракции
<a id="p100379"></a>Взвешивают с точностью до 0,01 г, 1 г коровьего молока [(A.8.2)](#p100375) или сухой молочной смеси [(A.8.1)](#p100372) в конической пробирке вместимостью 50 см3 [(A.5.1)](#p100194).
<a id="p100380"></a>a) Вплоть до концентрации 2 мг/кг долей меламина и циануровой кислоты с тем и другим внутренними стандартами, добавленными в концентрации 1 мг/кг, вносят в навеску для анализа 50 мкл рабочего раствора меченого меламина I [(A.4.7.2)](#p100181) и 50 мкл рабочего раствора меченой циануровой кислоты I [(A.4.5.2)](#p100161). Тщательно перемешивают, пока внесенные объемы полностью не абсорбируются матрицей.
<a id="p100381"></a>b) Для уровней содержания меламина до 0,2 мг/кг и циануровой кислоты до 0,3 мг/кг с тем и другим внутренними стандартами, добавленными в концентрации 0,1 мг/кг, вносят в пробу для анализа 50 мкл рабочего раствора меченого меламина II [(A.4.7.3)](#p100183) и 50 мкл рабочего раствора меченой циануровой кислоты II [(A.4.5.3)](#p100163). Тщательно перемешивают, пока внесенные объемы полностью не абсорбируются матрицей.
<a id="p100382"></a>Затем добавляют 5 см3 воды [(A.4.1)](#p100144) в коническую пробирку, подготовленную либо как в [a)](#p100380), либо как в [b)](#p100381). Перемешивают, так чтобы в пробе не оставалось сгустков. Добавляют 5 см3 ацетонитрила [(A.4.2)](#p100145). Энергично встряхивают в течение не менее 1 мин.
<a id="p100383"></a>Добавляют 30 см3 ацетонитрила [(A.4.2)](#p100145) и 10 см3 воды [(A.4.1)](#p100144). Энергично встряхивают в течение не менее 5 мин, так чтобы в пробе не оставалось сгустков. В идеале лучше использовать автоматический шейкер. Центрифугируют полученный раствор при ускорении 4000g при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы получить прозрачную надосадочную жидкость.
<a id="p100384"></a>Если надосадочная жидкость не будет прозрачной, переносят аликвотное количество жидкости в другую пробирку и снова центрифугируют при 8500g при комнатной температуре в течение не менее 10 мин, используя настольную центрифугу.
<a id="p100385"></a>Переносят от 0,5 до 1 см3 прозрачной надосадочной жидкости в пробирку для хроматографического анализа. Продолжают анализ LC-MS/MS [(A.9.3)](#p100388).
<a id="p100386"></a>A.9.2 Холостой опыт
<a id="p100387"></a>Чтобы компенсировать, при необходимости, загрязнение меламином и циануровой кислотой в процессе подготовки пробы, используют холостую пробу, подготовленную без добавления матрицы. Анализируют холостую пробу наряду с каждой серией обычных проб.
<a id="p100388"></a>A.9.3 Анализ LC-MS/MS
<a id="p100389"></a>A.9.3.1 Условия HPLC (ВЭЖХ)

<table>
<colgroup><col width="14%"><col width="31%"><col width="55%"></colgroup>
<tr><td rowspan="8"></td><td><a id="p100390"></a>Подвижная фаза A:</td><td><a id="p100391"></a>раствор ацетата аммония <a href="#p100363">(A.6.3.1)</a>;</td></tr>
<tr><td><a id="p100392"></a>подвижная фаза B:</td><td><a id="p100393"></a>ацетонитрил <a href="#p100365">(A.6.3.2)</a>;</td></tr>
<tr><td><a id="p100394"></a>вводимый объем:</td><td><a id="p100395"></a>5 мкл;</td></tr>
<tr><td><a id="p100396"></a>колонка:</td><td><a id="p100397"></a>TOSOH TSKgel Amide-80, диаметр 2,0 мм, длина 250 мм, внутренний диаметр 5 мкм;</td></tr>
<tr><td><a id="p100398"></a>температура:</td><td><a id="p100399"></a>комнатная температура;</td></tr>
<tr><td><a id="p100400"></a>скорость потока:</td><td><a id="p100401"></a>0,25 см3/мин;</td></tr>
<tr><td><a id="p100402"></a>градиент:</td><td><a id="p100403"></a>градиент LC как описано в <a href="#p100407">таблице A.3</a>;</td></tr>
<tr><td><a id="p100404"></a>отводной клапан:</td><td><a id="p100405"></a>поток HPLC направляется на детектор масс-спектрометра в течение от 3,0 до 13,5 мин</td></tr>
</table>


<a id="p100406"></a>Таблица A.3

<a id="p100407"></a>Градиент LC, используемый для анализа меламина
и циануровой кислоты


| <a id="p100408"></a>Время,<br>мин | <a id="p100409"></a>A,<br>% | <a id="p100410"></a>B,<br>% |
| --- | --- | --- |
| <a id="p100411"></a>0 | <a id="p100412"></a>10 | <a id="p100413"></a>90 |
| <a id="p100414"></a>8 | <a id="p100415"></a>10 | <a id="p100416"></a>90 |
| <a id="p100417"></a>13 | <a id="p100418"></a>65 | <a id="p100419"></a>35 |
| <a id="p100420"></a>14 | <a id="p100421"></a>90 | <a id="p100422"></a>10 |
| <a id="p100423"></a>15 | <a id="p100424"></a>90 | <a id="p100425"></a>10 |
| <a id="p100426"></a>15,5 | <a id="p100427"></a>10 | <a id="p100428"></a>90 |
| <a id="p100429"></a>25 | <a id="p100430"></a>10 | <a id="p100431"></a>90 |


<a id="p100432"></a>В таких условиях время удерживания циануровой кислоты составляет ~6,4 мин, а время удерживания меламина ~11,5 мин (см. [рисунки A.1](#p100629) - [A.3](#p100633)).
<a id="p100433"></a>A.9.3.2 Параметры MS (масс-спектрометрии)
<a id="p100434"></a>Параметры MS получают посредством ввода шприцем со скоростью 5 мкл/мин по отдельности рабочий раствор меламина I [(A.4.6.2)](#p100170) и рабочий раствор циануровой кислоты I [(A.4.4.2)](#p100151), оба в концентрации 20 мкг/см3, в поток HPLC со скоростью 0,25 см3/мин, используя Т-образный соединитель. Поток HPLC составляет 50% подвижной фазы A [(A.6.3.1)](#p100363) и 50% подвижной фазы B [(A.6.3.2)](#p100365). [Таблицы A.4](#p100436) - [A.6](#p100500) дают рабочие условия приборов для анализа меламина и циануровой кислоты.

<a id="p100435"></a>Таблица A.4

<a id="p100436"></a>Типичные параметры MS для меламина


<table>
<colgroup><col width="31%"><col width="69%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100437"></a>Параметр</td><td><a id="p100438"></a>Применяемый прибор Biosystems Sciex 4000 QTrap</td></tr>
<tr><td><a id="p100439"></a>Тип ионизации</td><td><a id="p100440"></a>Электрораспыление (ESI)</td></tr>
<tr><td><a id="p100441"></a>Напряжение электрораспыления</td><td><a id="p100442"></a>3,5 кВ</td></tr>
<tr><td><a id="p100443"></a>Полярность</td><td><a id="p100444"></a>Положительные ионы</td></tr>
<tr><td><a id="p100445"></a>Температура блока источника ионизации</td><td><a id="p100446"></a>500 °C</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100447"></a><a id="p100448"></a>Газ<br>Защитный газ: 69 кПа (10 psl (фунтов на дюйм));</td></tr>
<tr><td><a id="p100449"></a>газ источника ионов 1: 207 л3кПа (30 фунтов на дюйм);</td><td><a id="p100450"></a><a id="p100451"></a><a id="p100452"></a>газ источника ионов 2: 207 кПа (30 фунтов на дюйм)<br>Потенциал декластеризации (DP)<br>60 B</td></tr>
<tr><td><a id="p100453"></a>Потенциал на входе (EP)</td><td><a id="p100454"></a>10 B</td></tr>
<tr><td><a id="p100455"></a>Потенциал столкновений на выходе (CXP)</td><td><a id="p100456"></a>15 A</td></tr>
<tr><td><a id="p100457"></a>Давление газа CID (SRM)</td><td><a id="p100458"></a>0,8 Па (6 мTorr), азот</td></tr>
<tr><td><a id="p100459"></a>Ширина пика (для каждого перехода)</td><td><a id="p100460"></a>0,5 Th</td></tr>
<tr><td><a id="p100461"></a>Разрешение</td><td><a id="p100462"></a>Единица (обе квадрупольные линзы)</td></tr>
<tr><td><a id="p100463"></a>Время сканирования (для каждого перехода)</td><td><a id="p100464"></a>100 мс</td></tr>
<tr><td><a id="p100465"></a>Переключение положительный/отрицательный в тройнике T</td><td><a id="p100466"></a>8 мин</td></tr>
<tr><td></td><td><a id="p100467"></a>Таблица A.5</td></tr>
</table>


<a id="p100468"></a>Типичные параметры MS для циануровой кислоты


| <a id="p100469"></a>Параметр | <a id="p100470"></a>Применяемый прибор Biosystems Sciex 4000 QTrap |
| --- | --- |
| <a id="p100471"></a>Тип ионизации | <a id="p100472"></a>Электрораспыление (ESI) |
| <a id="p100473"></a>Напряжение электрораспыления | <a id="p100474"></a>3,5 кВ |
| <a id="p100475"></a>Полярность | <a id="p100476"></a>Отрицательные ионы |
| <a id="p100477"></a>Температура блока источника ионизации | <a id="p100478"></a>500 °C |
| <a id="p100479"></a>Газ | <a id="p100480"></a><a id="p100481"></a><a id="p100482"></a>Защитный газ: 69 кПа (10 фунтов на дюйм);<br>газ источника ионов 1: 207 кПа (30 фунтов на дюйм);<br>газ источника ионов 2: 207 кПа (30 фунтов на дюйм) |
| <a id="p100483"></a>Потенциал декластеризации (DP) | <a id="p100484"></a>40 B |
| <a id="p100485"></a>Потенциал на входе (EP) | <a id="p100486"></a>10 B |
| <a id="p100487"></a>Потенциал столкновений на выходе (CXP) | <a id="p100488"></a>15 B |
| <a id="p100489"></a>Давление газа CID (SRM) | <a id="p100490"></a>0,8 Па (6 мТорр, азот) |
| <a id="p100491"></a>Ширина пика (для каждого перехода) | <a id="p100492"></a>0,7 Th |
| <a id="p100493"></a>Разрешение | <a id="p100494"></a>Единица (обе квадрупольные линзы) |
| <a id="p100495"></a>Время сканирования (для каждого перехода) | <a id="p100496"></a>100 мс |
| <a id="p100497"></a>Переключение положительный/отрицательный в тройнике T | <a id="p100498"></a>8 мин |


<a id="p100499"></a>Таблица A.6

<a id="p100500"></a>Реакции перехода, наблюдаемые для анализа меламина
и циануровой кислоты и их соответствующих внутренних
стандартов (IS) и соотношения площадей пиков с допустимым
пределом приемки по [[1]](#p101034)


<table>
<colgroup><col width="33%"><col width="24%"><col width="24%"><col width="19%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100501"></a>Аналит</td><td colspan="2"><a id="p100502"></a>Реакции перехода (m/z) <sup><a href="#p100522">a</a></sup> для:</td><td rowspan="2"><a id="p100503"></a>Отношение площадей пиков +/- предел (%)</td></tr>
<tr><td><a id="p100504"></a>количественного определения</td><td><a id="p100505"></a>подтверждения аналита</td></tr>
<tr><td><a id="p100506"></a>Меламин</td><td><a id="p100507"></a>$127,0 \rightarrow 85,1(26)$</td><td><a id="p100508"></a>$127,0 \rightarrow 68,0(45)$</td><td><a id="p100509"></a>0,28 +/- 25</td></tr>
<tr><td><a id="p100510"></a>Меченый меламин [13C<sub>3</sub>N<sub>3</sub>(15NH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>] (IS)</td><td><a id="p100511"></a>$133,0 \rightarrow 89,1(26)$</td><td><a id="p100512"></a>$133,0 \rightarrow 71,1(45)$</td><td><a id="p100513"></a>0,19 +/- 25</td></tr>
<tr><td><a id="p100514"></a>Циануровая кислота</td><td><a id="p100515"></a>$128,0 \rightarrow 42,1(30)$</td><td><a id="p100516"></a>$128,0 \rightarrow 85,2(14)$</td><td><a id="p100517"></a>0,55 +/- 20</td></tr>
<tr><td><a id="p100518"></a>Меченая циануровая кислота (13C<sub>3</sub>H315N<sub>3</sub>O<sub>3</sub>) (IS)</td><td><a id="p100519"></a>$134,0 \rightarrow 44,1(30)$</td><td><a id="p100520"></a>$133,0 \rightarrow 88,9(14)$</td><td><a id="p100521"></a>0,52 +/- 20</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100522"></a><sup>a</sup> Энергия столкновений (в электрон-вольтах) приведена в скобках.</td></tr>
</table>


<a id="p100523"></a>Примечание - В зависимости от используемого детектора MS, соотношения площадей пиков по диагностическим реакциям перехода могут отличаться от приведенных в [таблице A.6](#p100500).

<a id="p100524"></a>A.9.3.3 Тест-контроль прибора
<a id="p100525"></a>Необходимо убедиться, что аппаратура LC-MS/MS работает в таких условиях, в которых метод остается соответствующим назначению. Это включает ввод калибранта низкой концентрации (например, стандартного раствора 7, [таблица A.2](#p100286)) для проверки адекватности чувствительности прибора.
<a id="p100526"></a>A.9.4 Калибровка и анализ проб
<a id="p100527"></a>Количественно меламин и циануровую кислоту определяют с помощью внешней калибровки. Вводят стандартные растворы ([A.6.2.1](#p100216) или [A.6.2.2](#p100283)) в каждой серии обычных проб.
<a id="p100528"></a>A.9.5 Подтверждение
<a id="p100529"></a>Меламин и циануровая кислота считаются идентифицированными в пробе, если выполняются все критерии подтверждения [a)](#p100530) - [c)](#p100532) строго в соответствии с определениями по [[1]](#p101034):
<a id="p100530"></a>a) Сигнал обнаруживается при двух диагностических реакциях перехода, выбранных для каждого аналита и при двух диагностических реакциях перехода, выбранных для их соответствующих внутренних стандартов (IS). Отношение сигнал-шум для каждого диагностического иона должно быть >= 3:1;
<a id="p100531"></a>b) Отношение хроматографического времени удерживания аналита к времени удерживания соответствующего внутреннего стандарта, т.е. относительное время удерживания аналита, соответствует отношению усредненного времени удерживания градуировочных растворов в пределах +/- 2,5% допуска;
<a id="p100532"></a>c) Соотношение площадей пиков от различных реакций перехода, записанных для каждого аналита находится в пределах допусков, установленных критериями по [[1]](#p101034), приведенными в [таблице A.6](#p100500).
<a id="p100533"></a>A.10 Расчеты и обработка результатов
<a id="p100534"></a>A.10.1 Расчеты
<a id="p100535"></a>Соответствующее программное обеспечение облегчает построение шаблона на заказ, который затем служит для проверки линейности градуировочных кривых, чтобы рассчитать отношения площадей пиков, полученных по различным реакциям перехода (как определено в [таблице A.6](#p100500)), чтобы подтвердить присутствие или отсутствие аналитов, и дать окончательные результаты, выраженные в миллиграммах на килограмм.
<a id="p100536"></a>*Примечание* - Градуировочная кривая будет такого типа:

<a id="p100537"></a> $\alpha = bw + a,$ 

<a id="p100538"></a>где $\alpha$ - отношение площадей;
<a id="p100539"></a>b - наклон;
<a id="p100540"></a>w - массовая доля;
<a id="p100541"></a>a - отсекаемый отрезок.

<a id="p100542"></a>Рассчитывают содержание аналита wa, мг/кг (где аналитом является меламин, wa = wm; где аналитом является циануровая кислота, wa = wc), используя следующее уравнение:

<a id="p100543"></a> $w_{a} = \frac{(A_{a}/A_{IS}) - a}{b} \times \frac{m_{IS}}{m_{a} \times 1000} ,$ 

<a id="p100544"></a>где Aa - площадь пика аналита в пробе;
<a id="p100545"></a>AIS - площадь пика внутреннего стандарта (IS) в пробе;
<a id="p100546"></a>a - отсекаемый отрезок линии регрессии для реакции перехода, используемой для количественного определения;
<a id="p100547"></a>b - наклон линии регрессии для реакции перехода, используемой для количественного определения;
<a id="p100548"></a>mIS - масса, в нанограммах, внутреннего стандарта (IS), добавленного в пробу для анализа [(A.9.1)](#p100378);
<a id="p100549"></a>ma - масса, в граммах, пробы для анализа [(A.9.1)](#p100378).
<a id="p100550"></a>A.10.2 Обработка результатов
<a id="p100551"></a>Результаты выражают для аналита(ов) с точностью до второго знака после запятой.
<a id="p100552"></a>A.11 Показатели точности метода
<a id="p100553"></a>A.11.1 Линейность
<a id="p100554"></a>Тестируемые диапазоны линейности представлены в [перечислениях a)](#p100555) и [b)](#p100556):
<a id="p100555"></a>a) меламин: от 0 до 0,20 мг/кг и от 0 до 2,00 мг/кг (эквивалентно содержанию в пробах) соответственно;
<a id="p100556"></a>b) циануровая кислота: от 0 до 0,30 мг/кг и от 0 до 2,00 мг/кг (эквивалентно содержанию в пробах) соответственно.
<a id="p100557"></a>Калибровка следует линейной модели, остатки равномерно распределены, а коэффициенты отклика стабильны в рассматриваемых диапазонах массовых долей.
<a id="p100558"></a>A.11.2 Пределы обнаружения
<a id="p100559"></a>LoD (отношение сигнал-шум, равное 3) составляют 0,03 мг/кг для меламина и 0,05 мг/кг для циануровой кислоты соответственно, как в коровьем молоке, так и в сухой молочной смеси.
<a id="p100560"></a>A.11.3 Предел квантификации
<a id="p100561"></a>LoQ составляют 0,05 мг/кг для меламина и 0,10 мг/кг для циануровой кислоты, соответственно, как в коровьем молоке, так и в сухой молочной смеси.
<a id="p100562"></a>A.11.4 Пределы принятия решения и возможности выявления в сухой молочной смеси (PIF)
<a id="p100563"></a>Предполагая, что максимальный предел (ML) составляет 1 мг/кг в PIF, пределы принятия решения, $w_{CC_{\alpha}}$ , и возможности выявления, $w_{CC_{\beta}}$ , представлены в [перечислениях a)](#p100564) и [b)](#p100565):
<a id="p100564"></a>a) для меламина: $w_{CC_{\alpha}} = 1,03\text{мг}/\text{кг}$ , $w_{CC_{\beta}} = 1,05\text{мг}/\text{кг}$ ;
<a id="p100565"></a>b) для циануровой кислоты: $w_{CC_{\alpha}} = 1,04\text{мг}/\text{кг}$ , $w_{CC_{\beta}} = 1,09\text{мг}/\text{кг}$ .
<a id="p100566"></a>A.11.5 Эффективность
<a id="p100567"></a>Как для меламина, так и для циануровой кислоты, эффективность, скорректированная по внутренним стандартам, была в диапазоне от 99% до 116%.
<a id="p100568"></a>A.11.6 Прецизионность
<a id="p100569"></a>Значения для предела относительной повторяемости и предела относительной внутрилабораторной воспроизводимости были получены в ходе небольшого межлабораторного исследования на базе ISO 5725-1 и ISO 5725-2 [[7]](#p101040), но не соответствовали всем требованиям.
<a id="p100570"></a>A.11.6.1 Предел относительной повторяемости
<a id="p100571"></a>Типичные значения относительной повторяемости, полученные методом, описанным в настоящем стандарте, приведены в [таблице A.7](#p100573).

<a id="p100572"></a>Таблица A.7

<a id="p100573"></a>Типичные значения относительной повторяемости


<table>
<colgroup><col width="20%"><col width="14%"><col width="33%"><col width="32%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100574"></a>Аналит</td><td><a id="p100575"></a>Матрица</td><td><a id="p100576"></a>Относительное значение повторяемости,<br>%</td><td><a id="p100577"></a>Диапазон содержания,<br>мг/кг</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100578"></a>Меламин</td><td><a id="p100579"></a>CM</td><td><a id="p100580"></a>6</td><td><a id="p100581"></a>От 0,05 до 0,15</td></tr>
<tr><td><a id="p100582"></a>PIF</td><td><a id="p100583"></a>12</td><td><a id="p100584"></a>От 0,05 до 0,15</td></tr>
<tr><td><a id="p100585"></a>PIF</td><td><a id="p100586"></a>4</td><td><a id="p100587"></a>От 0,5 до 1,5</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100588"></a>Циануровая кислота</td><td><a id="p100589"></a>CM</td><td><a id="p100590"></a>8</td><td><a id="p100591"></a>От 0,1 до 0,2</td></tr>
<tr><td><a id="p100592"></a>PIF</td><td><a id="p100593"></a>11</td><td><a id="p100594"></a>От 0,1 до 0,2</td></tr>
<tr><td><a id="p100595"></a>PIF</td><td><a id="p100596"></a>5</td><td><a id="p100597"></a>От 0,5 до 1,5</td></tr>
</table>


<a id="p100598"></a>A.11.6.2 Предел относительной внутрилабораторной воспроизводимости
<a id="p100599"></a>Типичные значения относительной внутрилабораторной воспроизводимости, полученные методом, описанном в настоящем стандарте, приведены в [таблице A.8](#p100601).

<a id="p100600"></a>Таблица A.8

<a id="p100601"></a>Типичные значения относительной
внутрилабораторной воспроизводимости


<table>
<colgroup><col width="20%"><col width="14%"><col width="33%"><col width="32%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100602"></a>Аналит</td><td><a id="p100603"></a>Матрица</td><td><a id="p100604"></a>Относительная внутрилабораторная воспроизводимость,<br>%</td><td><a id="p100605"></a>Диапазон содержания,<br>мг/кг</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100606"></a>Меламин</td><td><a id="p100607"></a>CM</td><td><a id="p100608"></a>13</td><td><a id="p100609"></a>От 0,05 до 0,15</td></tr>
<tr><td><a id="p100610"></a>PIF</td><td><a id="p100611"></a>15</td><td><a id="p100612"></a>От 0,05 до 0,15</td></tr>
<tr><td><a id="p100613"></a>PIF</td><td><a id="p100614"></a>6</td><td><a id="p100615"></a>От 0,5 до 1,5</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100616"></a>Циануровая кислота</td><td><a id="p100617"></a>CM</td><td><a id="p100618"></a>10</td><td><a id="p100619"></a>От 0,1 до 0,2</td></tr>
<tr><td><a id="p100620"></a>PIF</td><td><a id="p100621"></a>31</td><td><a id="p100622"></a>От 0,1 до 0,2</td></tr>
<tr><td><a id="p100623"></a>PIF</td><td><a id="p100624"></a>13</td><td><a id="p100625"></a>От 0,5 до 1,5</td></tr>
</table>


<a id="p100626"></a>A.12 Примеры хроматограмм

<a id="p100627"></a> ![9 Протокол испытаний](https://i.bukva.ai/9I4GpAWN/img_0.png) 

<a id="p100628"></a>*Примечание* - m/z - массовые числа ионов.

<a id="p100629"></a>Рисунок A.1 - Пример хроматограмм LC-MS/MS меламина (MEL)
и циануровой кислоты (CA) из экстракта коровьего молока,
меченого изотопами, при концентрации меток: MEL = 0,05 мг/кг
(IS = 0,1 мг/кг); CA = 0,10 мг/кг (IS = 0,1 мг/кг)



<a id="p100630"></a> ![9 Протокол испытаний](https://i.bukva.ai/9I4GpAWN/img_1.png) 

<a id="p100631"></a>Рисунок A.2 - Пример хроматограмм LC-MS/MS меламина (MEL)
и циануровой кислоты (CA) из экстракта меченой сухой
молочной смеси для детей раннего возраста при концентрации
меток: MEL 0,05 мг/кг (IS 0,1 мг/кг);
CA 0,10 мг/кг (IS 0,1 мг/кг)



<a id="p100632"></a> ![9 Протокол испытаний](https://i.bukva.ai/9I4GpAWN/img_2.png) 

<a id="p100633"></a>Рисунок A.3 - Пример хроматограмм LC-MS/MS меламина (MEL)
и циануровой кислоты (CA) из экстракта меченой сухой
молочной смеси для детей раннего возраста при концентрации
меток: MEL 0,50 мг/кг (IS 1,0 мг/кг);
CA 0,50 мг/кг (IS 1,0 мг/кг)

<a id="p100634"></a>A.13 Протокол испытания
<a id="p100635"></a>Протокол испытания методом A должен включать по крайней мере следующую информацию:
<a id="p100636"></a>a) все сведения, необходимые для полной идентификации пробы;
<a id="p100637"></a>b) использованный метод отбора проб, если он известен;
<a id="p100638"></a>c) использованный метод испытания со ссылкой на данное приложение (ISO/TS 15495/IDF/RM 230:2010, приложение A);
<a id="p100639"></a>d) подробное описание процедур, не установленных в данном приложении или рассматриваемых, как дополнительные, наряду с описанием всех случайностей, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;
<a id="p100640"></a>e) полученный результат(ы) испытания;
<a id="p100641"></a>f) если проверялась повторяемость (сходимость), то конечный результат.





<a id="p100642"></a>Приложение B
(справочное)

<a id="p100643"></a>*ПРИМЕР* B - КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕЛАМИНА И ЦИАНУРОВОЙ
**КИСЛОТЫ В СУХОЙ МОЛОЧНОЙ СМЕСИ ДЛЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА**
**И КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**
**С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИНЕЙНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ**
**С ИОННОЙ ЛОВУШКОЙ**

<a id="p100644"></a>B.1 Область применения
<a id="p100645"></a>Данное приложение устанавливает метод, включающий определение меламина и циануровой кислоты в сухой молочной смеси для детей раннего возраста и в коровьем молоке с использованием метода линейной тандемной масс-спектрометрии с ионной ловушкой (LC-MS/MS), с источником ионизации электрораспылением в режиме мониторинга выбранных реакций (SRM). Количественное определение выполняется с помощью изотопного разбавления, используя меченые (13C3, 15N3)-меламин и меченую (13C3, 15N3)-циануровую кислоту в качестве внутренних стандартов (IS).
<a id="p100646"></a>B.2 Термины и определения
<a id="p100647"></a>См. [раздел 3](#p100066).
<a id="p100648"></a>B.3 Сущность метода
<a id="p100649"></a>Меланин и циануровую кислоту одновременно экстрагируют в ацетонитрил, осаждая белки. После центрифугирования надосадочную жидкость берут для последующего анализа LC-MS/MS с ионной ловушкой в режиме SRM. Меламин и циануровую кислоту анализируют отдельно в положительном и отрицательном режимах соответственно.
<a id="p100650"></a>B.4 Реактивы
<a id="p100651"></a>Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду аналогичной чистоты.
<a id="p100652"></a>*Примечание* - Номера по CAS приведены для каждого реактива.

<a id="p100653"></a>Перед использованием химических веществ см. соответствующие справочники или перечни безопасности, утвержденные местными органами.
<a id="p100654"></a>B.4.1 Вода, для хроматографического анализа (CAS No. 7732-18-5).
<a id="p100655"></a>B.4.2 Ацетонитрил (CH3CN), градиентной чистоты для хроматографического анализа (CAS No. 75-05-8).
<a id="p100656"></a>B.4.3 Ацетат аммония (CH3COONH4), GR для анализа (CAS No. 631-61-8).
<a id="p100657"></a>B.4.4 Раствор муравьиной кислоты (CH2O2), соответствующий 1% кислоты по объему (CAS No.64-18-6).
<a id="p100658"></a>Пипеткой добавляют 10 см3 муравьиной кислоты (CAS No. 64-18-6, марки ACS) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000 см3 [(B.5.8)](#p100706). Доводят до метки водой [(B.4.1)](#p100654) и перемешивают.
<a id="p100659"></a>B.4.5 Циануровая кислота (CNOH)3, массовая доля > 98% (CAS No. 108-80-5).
<a id="p100660"></a>B.4.5.1 Исходный стандартный раствор циануровой кислоты, соответствующий массовой концентрации 0,1 мг циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100661"></a>Берут навеску с точностью до 0,1 мг, 20 мг циануровой кислоты [(B.4.5)](#p100659) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 200 см3 [(B.5.8)](#p100706). Растворяют и доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(B.4.4)](#p100657). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение 10 мин.
<a id="p100662"></a>Исходный стандартный раствор циануровой кислоты можно хранить до 10 сут при температуре 4 °C. Свежий исходный стандартный раствор готовят каждые 10 дней.
<a id="p100663"></a>B.4.5.2 Рабочий раствор циануровой кислоты, соответствующий концентрации 10 мкг циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100664"></a>Пипеткой приливают 10 см3 исходного стандартного раствора циануровой кислоты [(B.4.5.1)](#p100660) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100 см3 [(B.5.8)](#p100706). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(B.4.4)](#p100657). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.
<a id="p100665"></a>Рабочий раствор циануровой кислоты можно хранить до 10 сут при температуре 4 °C. Свежий исходный стандартный раствор готовят каждые 10 дней.
<a id="p100666"></a>B.4.6 Меченая циануровая кислота (13C<sub>3</sub>H315N<sub>3</sub>O<sub>3</sub>), изотопная чистота: 13C<sub>3</sub> = 99%; кольцо 15N<sub>3</sub> > 98%; химическая чистота 90% по массе, 100 мкг/см3 в воде - 1,2 см3.
<a id="p100667"></a>B.4.6.1 Исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты, соответствующий концентрации 100 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100668"></a>Исходный стандартный раствор меченой циануровой кислоты можно купить в готовом для использования виде в Лаборатории Изотопов при Кембридже (Cambridge Isotope Laboratories) [<1>](#p100670) (чистота 90% по массе). Хранят этот исходный раствор при комнатной температуре в защищенном от света месте.

<a id="p100669"></a>

---

<a id="p100670"></a><1> Лаборатории изотопов при Кембридже являются примером подходящего поставщика. Эта информация приведена только для удобства пользователей данного документа и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного реактива. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

<a id="p100671"></a>B.4.6.2 Рабочий раствор меченой циануровой кислоты, соответствующий массовой концентрации 10 мкг меченой циануровой кислоты на кубический сантиметр.
<a id="p100672"></a>Пипеткой приливают 1,1 см3 исходного стандартного раствора меченой циануровой кислоты [(B.4.6.1)](#p100667) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10 см3 [(B.5.8)](#p100706). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(B.4.4)](#p100657) и перемешивают.
<a id="p100673"></a>Рабочий раствор меченой циануровой кислоты используют в качестве внутреннего стандарта IS. Хранят раствор при температуре 4°C.
<a id="p100674"></a>B.4.7 Меламин (C<sub>3</sub>H<sub>6</sub>N<sub>6</sub>), массовая доля > 98% (CAS No. 108-78-1).
<a id="p100675"></a>B.4.7.1 Исходный стандартный раствор меламина, соответствующий массовой концентрации 0,1 мг меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100676"></a>Взвешивают с точностью до 0,1 мг, 20 мг меламина [(Б.4.7)](#p100674) и переносят в мерную колбу с одной меткой вместимостью 200 мл [(Б.5.8)](#p100706). Растворяют и доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(Б.4.4)](#p100657). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.
<a id="p100677"></a>Исходный стандартный раствор меламина можно хранить до 10 сут при температуре 4 °C. Готовят свежий исходный стандартный раствор каждые 10 дней.
<a id="p100678"></a>B.4.7.2 Рабочий раствор меламина I, соответствующий массовой концентрации 10 мкг меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100679"></a>Пипеткой приливают 10 см3 исходного стандартного раствора меламина [(B.4.7.1)](#p100675) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100 см3 [(B.5.8)](#p100706). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(B.4.4)](#p100657). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.
<a id="p100680"></a>Рабочий раствор меламина I можно хранить до 10 сут при температуре 4 °C. Готовят свежий рабочий раствор I каждые 10 дней.
<a id="p100681"></a>B.4.7.3 Рабочий раствор меламина II, соответствующий массовой концентрации 1 мкг меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100682"></a>Пипеткой приливают 1 см3 исходного стандартного раствора меламина I [(B.4.7.2)](#p100678) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10 см3 [(B.5.8)](#p100706). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(B.4.4)](#p100657). Обрабатывают ультразвуком до полного растворения в течение не менее 10 мин.
<a id="p100683"></a>Рабочий раствор меламина II можно хранить до 10 сут при температуре 4 °C. Готовят свежий рабочий раствор II каждые 10 дней.
<a id="p100684"></a>B.4.8 Меченый меламин [13C<sub>3</sub>N<sub>3</sub>(15NH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>], изотопная чистота: 13C<sub>3</sub> = 99%; амино-15N<sub>3</sub> = 98%; химическая чистота >= 98% по массе, 100 мкг/см3 в воде - 1,2 см3.
<a id="p100685"></a>B.4.8.1 Исходный стандартный раствор меченого меламина, соответствующий массовой концентрации 100 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100686"></a>Исходный раствор изотопа имеется в продаже. Хранят исходный стандартный раствор при комнатной температуре в защищенном от света месте.
<a id="p100687"></a>B.4.8.2 Рабочий раствор меченого меламина, соответствующий концентрации 10 мкг меченого меламина на кубический сантиметр.
<a id="p100688"></a>Пипеткой приливают 1 см3 исходного стандартного раствора меченого меламина [(B.4.8.1)](#p100685) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 10 см3 [(B.5.8)](#p100706). Доводят до метки раствором муравьиной кислоты [(B.4.4)](#p100657).
<a id="p100689"></a>Рабочий раствор меченого меламина используется в качестве внутреннего стандарта (IS). Хранят раствор при температуре 4 °C.
<a id="p100690"></a>B.5 Аппаратура
<a id="p100691"></a>Стеклянная посуда (например, мерные колбы, [B.5.8](#p100706)), используемая для приготовления стандартных исходных и рабочих растворов, может загрязниться, особенно меламином. Поэтому всю стеклянную посуду следует мыть лабораторным детергентом, споласкивать дистиллированной водой и затем сушить на воздухе.
<a id="p100692"></a>Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
<a id="p100693"></a>B.5.1 Центрифужные пробирки, конические, из полипропилена, вместимостью 50 см3, например, 21008-169 [<1>](#p100699).
<a id="p100694"></a>B.5.2 Центрифуга, оснащенная ротором, приспособленная под пробирки вместимостью 50 см3, с ускорением 4 000g, например, RC6 [<2>](#p100700).
<a id="p100695"></a>B.5.3 Колонка HPLC, ZIC-HILIC [<3>](#p100701), 2,1 мм x 150 мм, 5 мкм, 20 нм.
<a id="p100696"></a>B.5.4 Пластиковые шприцы, вместимостью 3 см3, Norm-Ject [<1>](#p100699).
<a id="p100697"></a>B.5.5 Шприцевые фильтры, Acrodisc 13 мм, мембрана из нейлона 0,2 мкм, например, 28143-985 [<1>](#p100699).

<a id="p100698"></a>

---

<a id="p100699"></a><1> 21008-169, Norm-Ject (53548-014) и 281343-985 - это торговые наименования продукции, поставляемой VWR. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.
<a id="p100700"></a><2> RC6 - это торговое наименование продукции, поставляемой Sorvall. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.
<a id="p100701"></a><3> ZIC-HILIC - это торговое наименование продукции, поставляемой Merck и имеющейся в Nest Group, article Q150454. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

<a id="p100702"></a>B.5.6 Насос HPLC Surveyor MS [<4>](#p100704) соединенный с линейным масс-спектрометром LTQ-XL [<4>](#p100704) с ионной ловушкой, оснащенный источником ионизации электрораспылением.

<a id="p100703"></a>

---

<a id="p100704"></a><4> Surveyor MS и LTQ-XL - это торговые наименования продукции, поставляемой ThermoElectron. Эта информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не свидетельствует о предпочтении в отношении данного продукта. Можно использовать аналогичные продукты, при условии получения равноценных результатов.

<a id="p100705"></a>B.5.7 Аналитические весы, обеспечивающие считывания с точностью до 0,1 мг.
<a id="p100706"></a>B.5.8 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 10, 100, 200 и 1000 см3, ISO 1042 [[6]](#p101039), класс A.
<a id="p100707"></a>B.6 Приготовление реактивов
<a id="p100708"></a>B.6.1 Градуировочная кривая для меламина и циануровой кислоты
<a id="p100709"></a>B.6.1.1 Стандартные растворы для меламина (от 0 до 5 мг/дм3) с соответствующим внутренним стандартом меламина IS (при концентрации 100 мг/дм3)
<a id="p100710"></a>Готовят стандартные растворы меламина в шести отдельных мерных колбах с одной меткой вместимостью 10 см3 [(B.5.8)](#p100706) в соответствии с [таблицей B.1](#p100712). Хранят стандартные растворы меламина при температуре 4 °C.

<a id="p100711"></a>Таблица A.9

<a id="p100712"></a>Стандартные растворы меламина


<table>
<colgroup><col width="48%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="8%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100713"></a>Наименование показателя</td><td colspan="6"><a id="p100714"></a>Стандартный раствор</td></tr>
<tr><td></td><td><a id="p100715"></a>1</td><td><a id="p100716"></a>2</td><td><a id="p100717"></a>3</td><td><a id="p100718"></a>4</td><td><a id="p100719"></a>5</td><td><a id="p100720"></a>6</td></tr>
<tr><td><a id="p100721"></a>Рабочий раствор меламина I <a href="#p100678">(B.4.7.2)</a>, мкл</td><td><a id="p100722"></a>0</td><td><a id="p100723"></a>0</td><td><a id="p100724"></a>100</td><td><a id="p100725"></a>200</td><td><a id="p100726"></a>450</td><td><a id="p100727"></a>700</td></tr>
<tr><td><a id="p100728"></a>Рабочий раствор меламина II <a href="#p100681">(B.4.7.3)</a>, мкл</td><td><a id="p100729"></a>0</td><td><a id="p100730"></a>150</td><td><a id="p100731"></a>0</td><td><a id="p100732"></a>0</td><td><a id="p100733"></a>0</td><td><a id="p100734"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100735"></a>Рабочий раствор меченого меламина (IS) <a href="#p100687">(B.4.8.2)</a>, мкл</td><td><a id="p100736"></a>150</td><td><a id="p100737"></a>150</td><td><a id="p100738"></a>150</td><td><a id="p100739"></a>150</td><td><a id="p100740"></a>150</td><td><a id="p100741"></a>150</td></tr>
<tr><td><a id="p100742"></a>Ацетонитрил <a href="#p100655">(B.4.2)</a>, мкл</td><td><a id="p100743"></a>9850</td><td><a id="p100744"></a>9700</td><td><a id="p100745"></a>9750</td><td><a id="p100746"></a>9650</td><td><a id="p100747"></a>9400</td><td><a id="p100748"></a>9150</td></tr>
<tr><td><a id="p100749"></a>Это соответствует:</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100750"></a>концентрации меламина, нг/см3</td><td><a id="p100751"></a>0</td><td><a id="p100752"></a>15</td><td><a id="p100753"></a>100</td><td><a id="p100754"></a>200</td><td><a id="p100755"></a>450</td><td><a id="p100756"></a>700</td></tr>
<tr><td><a id="p100757"></a>концентрации меченого меламина (IS), нг/см3</td><td><a id="p100758"></a>150</td><td><a id="p100759"></a>150</td><td><a id="p100760"></a>150</td><td><a id="p100761"></a>150</td><td><a id="p100762"></a>150</td><td><a id="p100763"></a>150</td></tr>
<tr><td><a id="p100764"></a>содержанию меламина (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100765"></a>0,00</td><td><a id="p100766"></a>0,10</td><td><a id="p100767"></a>0,66</td><td><a id="p100768"></a>1,33</td><td><a id="p100769"></a>3,00</td><td><a id="p100770"></a>4,66</td></tr>
<tr><td><a id="p100771"></a>содержанию меламина IS (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100772"></a>1,00</td><td><a id="p100773"></a>1,00</td><td><a id="p100774"></a>1,00</td><td><a id="p100775"></a>1,00</td><td><a id="p100776"></a>1,00</td><td><a id="p100777"></a>1,00</td></tr>
</table>


<a id="p100778"></a>B.6.1.2 Стандартные растворы для циануровой кислоты (от 0 до 5 мг/дм3) с соответствующим внутренним стандартом циануровой кислоты (IS) (при концентрации 0,66 мг/дм3)
<a id="p100779"></a>Готовят смешанные стандартные растворы циануровой кислоты в шести отдельных мерных колбах с одной меткой вместимостью 10 см3 [(B.5.8)](#p100706) в соответствии с [таблицей B.2](#p100781). Хранят стандартные растворы циануровой кислоты при температуре 4 °C.

<a id="p100780"></a>Таблица A.10

<a id="p100781"></a>Стандартные растворы циануровой кислоты


<table>
<colgroup><col width="48%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="8%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100782"></a>Наименование показателя</td><td colspan="6"><a id="p100783"></a>Стандартный раствор</td></tr>
<tr><td></td><td><a id="p100784"></a>1</td><td><a id="p100785"></a>2</td><td><a id="p100786"></a>3</td><td><a id="p100787"></a>4</td><td><a id="p100788"></a>5</td><td><a id="p100789"></a>6</td></tr>
<tr><td colspan="7"><a id="p100790"></a><a id="p100791"></a>Рабочий раствор циануровой кислоты <a href="#p100663">(Б.4.5.2)</a>, мкл<br>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100792"></a>25</td><td><a id="p100793"></a>100</td><td><a id="p100794"></a>200</td><td><a id="p100795"></a>550</td><td><a id="p100796"></a>700</td><td><a id="p100797"></a>Рабочий раствор меченой циануровой кислоты IS <a href="#p100671">(Б.4.6.2)</a>, мкл</td><td><a id="p100798"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100799"></a>100</td><td><a id="p100800"></a>100</td><td><a id="p100801"></a>100</td><td><a id="p100802"></a>100</td><td><a id="p100803"></a>100</td><td><a id="p100804"></a>Ацетонитрил <a href="#p100655">(Б.4.2)</a>, мкл</td><td><a id="p100805"></a>9900</td></tr>
<tr><td><a id="p100806"></a>9875</td><td><a id="p100807"></a>9800</td><td><a id="p100808"></a>9700</td><td><a id="p100809"></a>9350</td><td><a id="p100810"></a>9200</td><td><a id="p100811"></a>Это соответствует:</td><td></td></tr>
<tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><a id="p100812"></a>концентрации циануровой кислоты, нг/см3</td><td><a id="p100813"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100814"></a>25</td><td><a id="p100815"></a>100</td><td><a id="p100816"></a>200</td><td><a id="p100817"></a>550</td><td><a id="p100818"></a>700</td><td><a id="p100819"></a>концентрации циануровой кислоты IS, нг/см3</td><td><a id="p100820"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100821"></a>100</td><td><a id="p100822"></a>100</td><td><a id="p100823"></a>100</td><td><a id="p100824"></a>100</td><td><a id="p100825"></a>100</td><td><a id="p100826"></a>содержанию циануровой кислоты (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100827"></a>0,00</td></tr>
<tr><td><a id="p100828"></a>0,17</td><td><a id="p100829"></a>0,66</td><td><a id="p100830"></a>1,33</td><td><a id="p100831"></a>3,66</td><td><a id="p100832"></a>4,66</td><td><a id="p100833"></a>содержанию циануровой кислоты IS (эквивалентно пробе), мг/кг</td><td><a id="p100834"></a>0,66</td></tr>
<tr><td><a id="p100835"></a>0,66</td><td><a id="p100836"></a>0,66</td><td><a id="p100837"></a>0,66</td><td><a id="p100838"></a>0,66</td><td><a id="p100839"></a>0,66</td><td></td><td><a id="p100840"></a>B.6.2 Растворы для жидкостной хроматографии</td></tr>
</table>

<a id="p100841"></a>B.6.2.1 Подвижная фаза A, водный раствор ацетата аммония, 10 ммоль/дм3 в 1 + 1 смеси ацетонитрила с водой.
<a id="p100842"></a>Переносят 0,77 г ацетата аммония в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000 см3 [(B.5.8)](#p100706). Добавляют 500 см3 воды [(B.4.1)](#p100654) и растворяют ацетат аммония. Доводят до метки ацетонитрилом [(B.4.2)](#p100655) и перемешивают. Фильтруют раствор через фильтр пористостью 0,2 мкм [(B.5.5)](#p100697).
<a id="p100843"></a>B.6.2.2 Подвижная фаза B, ацетонитрил.
<a id="p100844"></a>Используют ацетонитрил [(B.4.2)](#p100655).
<a id="p100845"></a>B.7 Отбор проб
<a id="p100846"></a>Отбор проб не является частью метода, установленного в данном приложении. Рекомендуемый метод отбора проб - по ISO 707/IDF 50 [[2]](#p101035).
<a id="p100847"></a>Важно, чтобы в лаборатории была получена действительно репрезентативная проба, которая не претерпела повреждений и изменений в процессе транспортирования и хранения.
<a id="p100848"></a>Сырое молоко хранят при температуре 4 °C или в замороженном состоянии, если анализ не будет проводиться непосредственно по получении.
<a id="p100849"></a>B.8 Подготовка проб для анализа
<a id="p100850"></a>B.8.1 Сухая молочная смесь для детей раннего возраста
<a id="p100851"></a>Готовят гомогенную лабораторную пробу путем переноса ее в емкость для пробы вместимостью, в два раза превышающей объем лабораторной пробы. Немедленно закрывают емкость. Тщательно перемешивают, многократно встряхивая и переворачивая емкость.
<a id="p100852"></a>B.8.2 Коровье молоко
<a id="p100853"></a>Доводят пробу до комнатной температуры. Перед тем, как взять навеску для анализа, убеждаются, что проба гомогенная осторожным перевертыванием емкости несколько раз.
<a id="p100854"></a>B.9 Проведение
<a id="p100855"></a>B.9.1 Методика экстракции
<a id="p100856"></a>Взвешивают с точностью до 0,01 г 3,00 г молочной смеси для детей раннего возраста [(B.8.1)](#p100850) или коровьего молока [(B.8.2)](#p100852) в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 [(B.5.1)](#p100693). Добавляют 300 мкл рабочего раствора меченого меламина (IS) [(B.4.8.2)](#p100687). Добавляют 200 мкл рабочего раствора меченой циануровой кислоты (IS) [(B.4.6.2)](#p100671). Затем добавляют 19,5 см3 ацетонитрила [(B.4.2)](#p100655) и энергично встряхивают, пока не убедятся в отсутствии сгустков.
<a id="p100857"></a>Анализируемый раствор обрабатывают ультразвуком в течение 5 мин, затем перемешивают в течение 5 мин. Центрифугируют раствор для анализа при 4000g при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирают примерно 2 см3 надосадочной жидкости пластиковым шприцем и фильтруют через шприцевой фильтр [(B.5.5)](#p100697) в пробирку для анализа HPLC.
<a id="p100858"></a>B.9.2 Анализ LC-MS/MS
<a id="p100859"></a>Вводят раствор в хроматограф/масс-спектрометр (LC/MS) для анализа.
<a id="p100860"></a>*Примечание* - Меламин и циануровую кислоту обнаруживают по отдельности в разных прогонах на LC/MS.

<a id="p100861"></a>B.9.2.1 Условия HPLC

<table>
<colgroup><col width="39%"><col width="61%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100862"></a>Подвижная фаза A:</td><td><a id="p100863"></a>раствор ацетата аммония <a href="#p100841">(B.6.2.1)</a>;</td></tr>
<tr><td><a id="p100864"></a>подвижная фаза B:</td><td><a id="p100865"></a>ацетонитрил <a href="#p100843">(B.6.2.2)</a>;</td></tr>
<tr><td><a id="p100866"></a>вводимый объем:</td><td><a id="p100867"></a>10 мкл;</td></tr>
<tr><td><a id="p100868"></a>колонка:</td><td><a id="p100869"></a>ZIC-HILIC, 2,1 x 150 мм, 5 мкм, 20 нм;</td></tr>
<tr><td><a id="p100870"></a>температура:</td><td><a id="p100871"></a>комнатная температура;</td></tr>
<tr><td><a id="p100872"></a>скорость потока:</td><td><a id="p100873"></a>0,4 см3/мин;</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100874"></a><a id="p100875"></a>градиент:<br>См. <a href="#p100879">таблицу B.3</a>;</td></tr>
<tr><td><a id="p100876"></a>отводной клапан:</td><td><a id="p100877"></a>поток HPLC направляется на детектор масс-спектрометра в течение 4 - 9 мин.</td></tr>
<tr><td></td><td><a id="p100878"></a>Таблица A.11</td></tr>
</table>


<a id="p100879"></a>Градиент LC, используемый при анализе меламина
или циануровой кислоты


| <a id="p100880"></a>Время,<br>мин | <a id="p100881"></a>A,<br>% | <a id="p100882"></a>B,<br>% |
| --- | --- | --- |
| <a id="p100883"></a>0 | <a id="p100884"></a>3 | <a id="p100885"></a>97 |
| <a id="p100886"></a>2 | <a id="p100887"></a>3 | <a id="p100888"></a>97 |
| <a id="p100889"></a>2,5 | <a id="p100890"></a>20 | <a id="p100891"></a>80 |
| <a id="p100892"></a>11 | <a id="p100893"></a>20 | <a id="p100894"></a>80 |
| <a id="p100895"></a>11,5 | <a id="p100896"></a>3 | <a id="p100897"></a>97 |
| <a id="p100898"></a>16 | <a id="p100899"></a>3 | <a id="p100900"></a>97 |


<a id="p100901"></a>Условия HPLC для анализа меламина и циануровой кислоты идентичны. В таких условиях время удерживания как для меламина, так и для циануровой кислоты составляет ~5 мин.
<a id="p100902"></a>B.9.2.2 Параметры MS
<a id="p100903"></a>Настройка на анализируемое вещество выполняется посредством впрыскивания шприцем по отдельности стандартного раствора меламина и стандартного раствора циануровой кислоты в концентрации 10 мкг/см3. Скорость впрыскивания шприцем поддерживают постоянной на уровне 5 мкл/мин, используя тройник при скорости потока HPLC, равной 0,4 мл/мин. Поток HPLC выдерживают в соотношении 20% A и 80% B. Условия работы прибора для анализа меламина и циануровой кислоты приведены в [таблицах B.4](#p100905) - [B.6](#p100949).

<a id="p100904"></a>Таблица A.12

<a id="p100905"></a>Типичные параметры MS для меламина


| <a id="p100906"></a>Параметры | <a id="p100907"></a>Линейная ионная ловушка LTQ-XL |
| --- | --- |
| <a id="p100908"></a>Тип ионизации | <a id="p100909"></a>Электрораспыление (ESI) |
| <a id="p100910"></a>Напряжение электрораспыления | <a id="p100911"></a>5 кВ |
| <a id="p100912"></a>Полярность | <a id="p100913"></a>Положительные ионы |
| <a id="p100914"></a>Температура передаточной трубки | <a id="p100915"></a>350 °C |
| <a id="p100916"></a>Газ | <a id="p100917"></a><a id="p100918"></a><a id="p100919"></a>Защитный газ: 60 условных единиц;<br>вспомогательный газ: 20 условных единиц;<br>продувочный газ: 0 |
| <a id="p100920"></a>Ток распыления | <a id="p100921"></a>5,6 мкА |
| <a id="p100922"></a>Напряжение капилляра | <a id="p100923"></a>20 В |
| <a id="p100924"></a>Максимальное время ввода | <a id="p100925"></a>100 мс |


<a id="p100926"></a>Таблица A.13

<a id="p100927"></a>Типичные параметры MS для циануровой кислоты


| <a id="p100928"></a>Параметры | <a id="p100929"></a>Линейная ионная ловушка LTQ-XL |
| --- | --- |
| <a id="p100930"></a>Тип ионизации | <a id="p100931"></a>Электрораспыление (ESI) |
| <a id="p100932"></a>Напряжение электрораспыления | <a id="p100933"></a>4 кВ |
| <a id="p100934"></a>Полярность | <a id="p100935"></a>Отрицательные ионы |
| <a id="p100936"></a>Температура передаточной трубки | <a id="p100937"></a>400 °C |
| <a id="p100938"></a>Газ | <a id="p100939"></a><a id="p100940"></a><a id="p100941"></a>Защитный газ: 60 условных единиц;<br>вспомогательный газ: 20 условных единиц;<br>продувочный газ: 0 |
| <a id="p100942"></a>Ток распыления | <a id="p100943"></a>4,3 мкА |
| <a id="p100944"></a>Напряжение капилляра | <a id="p100945"></a>14 В |
| <a id="p100946"></a>Максимальное время ввода | <a id="p100947"></a>100 мс |


<a id="p100948"></a>Таблица A.14

<a id="p100949"></a>Реакции перехода, наблюдаемые в ионной ловушке в процессе
анализа меламина, циануровой кислоты и их соответствующих
внутренних стандартов


<table>
<colgroup><col width="50%"><col width="50%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100950"></a>Аналит</td><td><a id="p100951"></a>Реакции перехода (m/z) <sup><a href="#p100960">a</a></sup></td></tr>
<tr><td><a id="p100952"></a>Меламин</td><td><a id="p100953"></a>$127,0 \rightarrow 85,1(24)$</td></tr>
<tr><td><a id="p100954"></a>Меченый меламин [13C<sub>3</sub>N<sub>3</sub>(15NH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>] (IS)</td><td><a id="p100955"></a>$133,1 \rightarrow 89,1(24)$</td></tr>
<tr><td><a id="p100956"></a>Циануровая кислота</td><td><a id="p100957"></a>$128,0 \rightarrow 85,0(24)$</td></tr>
<tr><td><a id="p100958"></a>Меченая циануровая кислота (13C<sub>3</sub>H315N<sub>3</sub>O<sub>3</sub>) (IS)</td><td><a id="p100959"></a>$134,0 \rightarrow 88,9(24)$</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100960"></a><sup>a</sup> Энергии столкновений (в электрон-вольтах) приведены в скобках.</td></tr>
</table>


<a id="p100961"></a>B.10 Расчет и обработка результатов
<a id="p100962"></a>B.10.1 Расчеты
<a id="p100963"></a>*Примечание* - Градуировочная кривая типа

<a id="p100964"></a> $\alpha = bw + a,$ 

<a id="p100965"></a>где $\alpha$ - соотношение площадей;
<a id="p100966"></a>b - наклон;
<a id="p100967"></a>w - массовая доля;
<a id="p100968"></a>a - отсекаемый отрезок.

<a id="p100969"></a>Рассчитывают содержание аналита, wa, в миллиграммах на килограмм (если определяют меламин, wa = wm; если определяют циануровую кислоту, wa = wc), с использованием следующего уравнения:

<a id="p100970"></a> $w_{a} = \frac{\alpha - a}{b} \times \frac{20}{m \times 1000} ,$ 

<a id="p100971"></a>где a - отсекаемый отрезок линии регрессии;
<a id="p100972"></a>b - наклон линии регрессии;
<a id="p100973"></a>m - масса, в граммах, анализируемой пробы [(B.9.1)](#p100855).
<a id="p100974"></a>B.10.2 Обработка результатов
<a id="p100975"></a>Результаты для аналита(ов) выражают с точностью до двух знаков после запятой.
<a id="p100976"></a>B.11 Рабочие характеристики
<a id="p100977"></a>B.11.1 Линейность
<a id="p100978"></a>Градуировочная кривая для меламина линейна в диапазоне концентраций от 0 до 5 мг/кг (эквивалент содержания в пробе). Для циануровой кислоты кривая линейна на участке от 0 до 7 мг/кг (эквивалент содержания в пробе).
<a id="p100979"></a>B.11.2 Выход аналита
<a id="p100980"></a>В 16 проб молочной смеси для детей раннего возраста добавили меламин и циануровую кислоту в количестве, кратном 0,1; 0,5; 1,0 и 1,5 от максимального уровня (ML).
<a id="p100981"></a>Средний выход меламина составил 99%, а циануровой кислоты - 105%.
<a id="p100982"></a>B.11.3 Пределы обнаружения
<a id="p100983"></a>LoD (отношение сигнал-шум составляет 3) для определения содержания меламина равны 0,08 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,07 мг/кг в коровьем молоке, соответственно.
<a id="p100984"></a>LoD для определения содержания циануровой кислоты равны 0,10 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,07 мг/кг в коровьем молоке соответственно.
<a id="p100985"></a>B.11.4 Пределы количественного анализа
<a id="p100986"></a>LoQ (самый низкий достоверный уровень) для определения содержания меламина равны 0,11 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,10 мг/кг в коровьем молоке соответственно.
<a id="p100987"></a>LoQ для определения содержания циануровой кислоты равны 0,13 мг/кг в молочных смесях для детей раннего возраста и 0,10 мг/кг в коровьем молоке соответственно.
<a id="p100988"></a>B.11.5 Пределы принятия решения и возможности детектирования в молочной смеси для детей раннего возраста для меламина и циануровой кислоты
<a id="p100989"></a>Учитывая, что максимальный предел (ML) составляет 1 мг/кг в молочной смеси, пределы принятия решения $w_{CC_{\alpha}}$ и возможности детектирования $w_{CC_{\beta}}$ были рассчитаны после повышения концентрации 20 проб молочной смеси при ML, равном 1 мг/кг; результаты приведены в [a)](#p100990) и [b)](#p100991).
<a id="p100990"></a>g) Для меламина: $w_{CC_{\alpha}} = 1,06\text{мг}/\text{кг}$ , $w_{CC_{\beta}} = 1,16\text{мг}/\text{кг}$ ;
<a id="p100991"></a>h) Для циануровой кислоты: $w_{CC_{\alpha}} = 1,11\text{мг}/\text{кг}$ , $w_{CC_{\beta}} = 1,19\text{мг}/\text{кг}$ .
<a id="p100992"></a>ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Эти значения получены в условиях повторяемости и должны быть проверены в условиях воспроизводимости, прежде чем пользоваться ими.
<a id="p100993"></a>B.11.6 Прецизионность
<a id="p100994"></a>B.11.6.1 Повторяемость
<a id="p100995"></a>Типичные значения повторяемости, полученные одним и тем же оператором в одной и той же лаборатории с помощью данного метода, следующие:
<a id="p100996"></a>i) для меламина: 8% в интервале содержания от 0,5 до 1,5 мг/кг;
<a id="p100997"></a>j) для циануровой кислоты: 9% в интервале содержания от 0,5 до 1,5 мг/кг.
<a id="p100998"></a>*Примечание* - Эти значения были рассчитаны как коэффициент вариации и повторяемости CVr для серии анализов. Три серии анализов были выполнены при концентрациях 0,5, 1,0 и 1,5 мг/кг. В этих трех случаях CVr для каждой серии составил 8% для меламина и 9% для циануровой кислоты.

<a id="p100999"></a>B.11.6.2 Воспроизводимость
<a id="p101000"></a>Не определялась.
<a id="p101001"></a>B.12 Результаты анализа проб в рисунках
<a id="p101002"></a>См. [Рисунки B.1](#p101005) и [B.2](#p101008).

<a id="p101003"></a> ![9 Протокол испытаний](https://i.bukva.ai/9I4GpAWN/img_3.png) 

<a id="p101004"></a>*Примечание* - m/z - массовые числа ионов.

<a id="p101005"></a>Рисунок B.1 - Хроматограмма LC-MS/MS меламина (MEL)
из экстракта детской молочной смеси NIST при концентрации
введенного вещества: MEL = 0,50 мг/кг



<a id="p101006"></a> ![9 Протокол испытаний](https://i.bukva.ai/9I4GpAWN/img_4.png) 

<a id="p101007"></a>*Примечание* - m/z - массовые числа ионов.

<a id="p101008"></a>Рисунок B.2 - Хроматограмма LC-MS/MS циануровой кислоты (CA)
из экстракта детской молочной смеси NIST при концентрации
введенного вещества: CA = 0,50 мг/кг

<a id="p101009"></a>B.13 Протокол испытания
<a id="p101010"></a>Протокол испытания должен включать, как минимум, следующую информацию:
<a id="p101011"></a>k) все сведения, необходимые для полной идентификации пробы;
<a id="p101012"></a>l) использованный метод отбора проб, если известен;
<a id="p101013"></a>m) использованный метод анализа, со ссылкой на данное приложение (ISO/TS 15495/IDF/RM 230:2010, приложение B);
<a id="p101014"></a>n) все детали операций, не установленные в данном приложении или рассматриваемые как необязательные, наряду с описанием случайностей, которые могли повлиять на результат(ы) анализа;
<a id="p101015"></a>o) полученные результаты испытания;
<a id="p101016"></a>p) если проверена повторяемость, то конечный полученный результат.





<a id="p101017"></a>Приложение ДА
(справочное)

<a id="p101018"></a>**СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫХ**
**СТАНДАРТОВ МЕЖДУНАРОДНЫМ СТАНДАРТАМ**

<a id="p101019"></a>Таблица ДА.1


<table>
<colgroup><col width="54%"><col width="19%"><col width="26%"></colgroup>
<tr><td><a id="p101020"></a>Обозначение и наименование ссылочного международного стандарта</td><td><a id="p101021"></a>Степень соответствия</td><td><a id="p101022"></a>Обозначение ссылочного межгосударственного стандарта</td></tr>
<tr><td><a id="p101023"></a>ISO 3534 (все части) Статистика. Словарь и обозначения <a href="#p101032">&lt;1&gt;</a></td><td><a id="p101024"></a>-</td><td><a id="p101025"></a><a href="#p101029">&lt;*&gt;</a></td></tr>
<tr><td><a id="p101026"></a>ISO 5725-1 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 1. Общие принципы и определения</td><td><a id="p101027"></a>-</td><td><a id="p101028"></a><a href="#p101030">&lt;**&gt;</a></td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p101029"></a><a id="p101030"></a>&lt;*&gt; Соответствующий межгосударственный стандарт по версии ISO 3534 отсутствует.<br>&lt;**&gt; Соответствующий межгосударственный стандарт по версии ISO 5725-1 отсутствует.</td></tr>
</table>



<a id="p101031"></a>

---

<a id="p101032"></a>**<1> ISO 3534-1:2006, ISO 3534-2:2006, ISO 3534-3:1999.**






## <a id="p101033"></a>БИБЛИОГРАФИЯ



1. <a id="p101034"></a>Решение Комиссии EC 2002/657/EC, 2002 Official Journal of the European Communities, L2218-36, 12 August 2002, изменяющее Директиву Совета 96/23/EC в отношении выполнения аналитических методов и интерпретации результатов, измененной последний раз Решением Комиссии 2005/34 от 11 января 2005 г.
2. <a id="p101035"></a>ISO 707/IDF 50 Milk and products - Guidance on sampling (Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб)
3. <a id="p101036"></a>Desmarchelier A., Guillamon Cuadra M., Delatour T., Mottier P. Simultaneous quantitative determination of melamine and cyanuric acid in cow's milk and milk-based infant formula by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, pp. 7186 - 7193 (Одновременное количественное определение меламина и циануровой кислоты в коровьем молоке и молочных смесях для детей раннего возраста методом жидкостной хроматографии с ионизацией распылением и тандемной масс-спектрометрии)
4. <a id="p101037"></a>ISO 835 Laboratory glassware - Graduated pipettes (Посуда лабораторная стеклянная. Мерные градуированные пипетки)
5. <a id="p101038"></a>ISO 8655-2 Piston-operated volumetric apparatus - Part 2: Piston pipettes (Устройства мерные, приводимые в действие поршнем. Часть 2. Пипетки, приводимые в действие поршнем)
6. <a id="p101039"></a>ISO 1042 Laboratory glassware - One-mark volumetric flasks (Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой)
7. <a id="p101040"></a>ISO 5725-2 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2. Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения)
   <a id="p101041"></a>------------------------------------------------------------------