ГОСТ ISO 9231-2015. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочные продукты. Определение содержания сорбиновой и бензойной кислот в молоке и молочных продуктах
(введен в действие Приказом Росстандарта от 16.06.2016 № 642-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Документ введен в действие с 01.07.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 июня 2016 г. № 642-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СОРБИНОВОЙ И БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТ В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ
Milk and milk products. Determination of sorbic and benzoic acids in milk and dairy products
(ISO 9231/IDF 139:2008, Milk and milk products — Determination of the benzoic and sorbic acids contents, IDT)
Дата введения 1 июля 2017 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием «Республиканский научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию»
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 февраля 2015 г. № 75-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 июня 2016 г. № 642-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 9231-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 9231/IDF 139:2008 «Молоко и молочные продукты. Определение бензойной и сорбиновой кислот» («Milk and milk products — Determination of the benzoic and sorbic acids contents»).
Международный стандарт ISO 9231/IDF 139 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34 «Пищевые продукты», Подкомитетом SC 5 «Молоко и молочные продукты» и Международной молочной федерацией (IDF). Документ издается совместно ISO и IDF.
В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международный стандарт актуализированы.
В стандарт внесены незначительные редакционные изменения.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта в связи с особенностями системы межгосударственной стандартизации.
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международного стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном органе по техническому регулированию и метрологии.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания бензойной и сорбиновой кислот в молоке и молочных продуктах.
Метод применим для молока, сухого молока, йогурта и других кисломолочных продуктов, для сыра и плавленого сыра и позволяет определять содержание сорбиновой и бензойной кислот в концентрациях более 5 мг/кг.
2 Нормативные ссылки
Для применения данного стандарта необходимы следующие документы, которые представлены в виде ссылок. Для ссылок на публикации с указанием года их издания действительны только указанные издания. Для ссылок на публикации без указания года издания действительно последнее издание приведенной публикации (включая поправки и изменения).
ISO 1042 Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой
3 Термины и определения
Для целей настоящего стандарта применяются следующие термины и определения:
3.1 содержание бензойной и сорбиновой кислот: Количество бензойной и сорбиновой кислот в миллиграммах на килограмм молока или молочного продукта, определенное по настоящему стандарту.
4 Сущность метода
Жиры и белки удаляют из слабого щелочного раствора продукта осаждением растворами Карреза. Надосадочную жидкость фильтруют и добавляют метанол. Бензойную и сорбиновую кислоты разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с применением обращенно-фазовой колонки C18, измеряя поглощение на длинах волн 227 и 250 нм.
5 Реактивы
Используют только реагенты признанной аналитической чистоты и дистиллированная или деионизированная вода или вода соответствующей чистоты.
5.1 Метанол (CH3OH)
5.2 Растворы для осаждения (растворы Карреза 1, 2)
5.2.1 Раствор гексацианоферрата калия (II)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 (6.3) помещают 10,6 г гексацианоферрата (II) калия трехводного (K4[Fe(CN)6] 3H2O) и растворяют в воде. Доводят водой до метки и перемешивают.
Примечание - 100 см3 раствора достаточно для проведения 40 анализов.
5.2.2 Раствор ацетата цинка
Растворяют 21,9 г ацетата цинка двухводного [(CH3COO)2Zn 2H2O] и 32 см3 уксусной кислоты (CH3COOH) в воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 (6.3).
Доводят водой до метки и перемешивают.
Если двухводный ацетат цинка полностью не растворяется, нагревают колбу и ее содержимое на водяной бане (6.2) при температуре 70 °C и постоянном перемешивании. После растворения двухводного ацетата цинка раствор охлаждают до комнатной температуры. Доводят водой до метки и перемешивают.
Примечание - 100 см3 раствора достаточно для проведения 40 анализов.
5.3 Фосфатный буферный раствор, pH 6,7
Растворяют 2,5 г дигидрофосфата калия (KH2PO4) и 2,5 г гидрофосфата калия трехводного (K2HPO4·3H2O) в 1 дм3 воды и перемешивают. Полученный раствор фильтруют с помощью системы фильтрации растворителей (6.8).
5.4 Подвижная фаза для ВЭЖХ
Смешивают 10 объемных частей метанола (5.1) с 90 объемными частями раствора фосфатного буфера (5.3). Излишки газа удаляют легким вакуумом.
5.5 Раствор гидроокиси натрия, c(NaOH) = 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 (6.3) помещают 4,0 г гранул гидроокиси натрия и растворяют в воде (6.3). Доводят водой до метки и перемешивают.
5.6 Серная кислота, c(H2SO4) = 0,5 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 500 см3 (6.3), содержащую 250 см3 воды, осторожно вносят 15 см3 концентрированной серной кислоты с массовой долей от 95 до 98% и охлаждают. Полученный раствор доводят водой до метки и перемешивают.
5.7 Стандартные растворы сорбиновой и бензойной кислот
5.7.1 Основной стандартный раствор
В мерную колбу вместимостью 100 см3 (6.3) помещают 50 мг сорбиновой кислоты и 50 мг бензойной кислоты и растворяют в метаноле (5.1). Доводят метанолом (5.1) до метки и перемешивают.
Основной стандартный раствор годен в течение трех недель при хранении в холодильнике при температуре 4 — 7 °C.
5.7.2 Рабочий стандартный раствор
Для получения водно-метанольного раствора с объемными долями 50% смешивают 500 см3 метанола (5.1) с 500 см3 воды.
В день проведения испытания пипеткой отбирают 5 см3 основного раствора (5.7.1) и помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3 (6.3). Доводят 50% водно-метанольным раствором до метки и перемешивают. Полученный рабочий раствор содержит 10 мкг/см3 сорбиновой и бензойной кислот.
6 Аппаратура и оборудование
6.1 Весы аналитические с наименьшим пределом взвешивания 1 мг и ценой деления 0,1 мг.
6.2 Водяная баня с возможностью поддерживания температуры (70 +/- 2) °C.
6.3 Мерные колбы вместимостью 100, 250, 500 и 1000 см3, соответствующие требованиям ISO 1042 для класса A.
6.4 Жидкостной хроматограф, оснащенный насосом высокого давления с верхним пределом давления не менее 4,37 мПа (6000 PSI), двухволновым УФ-детектором или УФ-детектором с диодной матрицей, самописцем или интегратором.
Двухволновой детектор должен иметь длину оптического пути, равную 1 см, и возможность измерения оптической плотности на длине волны 227 нм — для бензойной кислоты и 250 нм — для сорбиновой кислоты.
6.5 Колонка для ВЭЖХ, изготовленная из нержавеющей стали, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4 мм, заполненная обращенно-фазовым кремниевым сорбентом с привитыми октадецильными группами, например, Micro-Bondapak C18 <1> или ее аналог.
<1> Micro-Bondapak C18 
доступное коммерческое название продукта. Эта информация дана для удобства пользователей стандарта, но не является рекомендацией названного продукта.
6.6 Шприц для ВЭЖХ.
6.7 Набор мембранных фильтров для водных проб с размерами пор фильтра 0,45 мкм.
6.8 Система фильтрации растворов, включая мембранные фильтры для водных растворов, размером пор 0,45 мкм.
6.9 Ультразвуковая баня.
7 Отбор проб
В лабораторию направляется репрезентативная проба без повреждений или изменений во время транспортировки или при хранении.
Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора приведен в [1].
При хранении испытуемого образца необходимо принимать меры, не допускающие порчи образца и изменения его состава.
8 Подготовка анализируемой пробы
8.1 Йогурты или другие кисломолочные продукты
Перед началом анализа образец гомогенизируют, осторожно нагревая при температуре 40 °C при постоянном перемешивании. В мерную колбу вместимостью 100 см3 (6.3) помещают 20 +/- 0,1 г гомогенизированного образца.
8.2 Другие молочные продукты
В стеклянный лабораторный стакан вместимостью 20 см3 помещают 3 +/- 0,1 г пробы. Испытуемый образец полностью диспергируют в 10 см3 воды, добавляя воду небольшими порциями при постоянном перемешивании стеклянной палочкой.
Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 (6.3), дважды ополоснув стакан 5 см3 воды.
9 Проведение измерений
9.1 Осаждение жиров и белков и очистка
К испытуемой пробе (по 8.1 или 8.2) прибавляют 25 см3 раствора гидроокиси натрия (5.5) и перемешивают. Колбу и ее содержимое помещают в ультразвуковую баню (6.9) на 15 мин. или нагревают на водяной бане (6.2) при температуре 70 °C в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры.
К испытуемому раствору при постоянном перемешивании добавляют раствор серной кислоты (5.6) и доводят pH раствора до 8 +/- 1 ед. pH. Для осаждения жиров и белков добавляют 2 см3 раствора гексацианоферрата (II) калия (5.2.1) и 2 см3 раствора ацетата цинка (5.2.2). Энергично встряхивают и оставляют полученную суспензию для отстаивания на 15 мин. Затем добавляют 40 см3 метанола и перемешивают. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры.
Метанолом (5.1) доводят раствор до метки и снова перемешивают. Раствор оставляют на 15 мин. Надосадочную жидкость фильтруют при помощи мембранных фильтров (6.7).
9.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
ВЭЖХ-анализ проводят при комнатной температуре с использованием подвижной фазы (5.4) и скоростью потока 1,2 см3/мин. Перед началом анализа в течение 30 мин. хроматографическую систему промывают элюирующим раствором до установления стабильной нулевой линии.
Затем хроматографируют прозрачный раствор пробы, подготовленной по 9.1, и рабочий градуировочный раствор (5.7.2), инжектируя равные объемы в диапазоне от 5 до 20 мм3. Выходящий из колонки элюат анализируют УФ-детектором при длинах волн 227 и 250 нм, используя последовательное детектирование при настройках на две длины волны или одновременное двухволновое детектирование.
Примечание - Для проверки линейности градуировочного графика проводят точечную градуировку.
Количество метанола в стандартных растворах и испытуемом образце намного выше, чем в подвижной фазе, что в некоторых случаях может повлиять на форму и разделение пиков. В таких случаях проверяют форму и разделение пиков, сравнивая их с пиками, полученными при хроматографировании стандартного раствора (5.7.1), в котором метанол (5.1) замещен на мобильную фазу (5.4) в эквивалентном количестве.
В данных условиях ориентировочное время удерживания бензойной и сорбиновой кислот составляет 5,5 и 7 мин. соответственно. Если пики выходят за пределы градуировочного графика, образец разбавляют необходимым объемом 50% водного метанола и вводят в хроматограф от 5 до 20 мм3 полученного раствора для получения пиков нужной высоты.
Чтобы определить, элюируются ли в пробе какие-либо мешающие компоненты одновременно с сорбиновой кислотой, проверяют отношение УФ-сигналов при длине волны 250 и 227 нм.
В ходе анализа молока или сухого молока на хроматограмме после 8 мин. удерживания появляется третий пик. Этот пик соответствует природному продукту — гиппуровой кислоте. Пик гиппуровой кислоты может частично накладываться на сорбиновую кислоту. Поэтому разрешение сорбиновой и гиппуровой кислот на колонке должно быть больше 1.
10 Обработка результатов
Содержание сорбиновой кислоты ws и/или бензойной кислоты wb, выраженное в миллиграммах на килограмм, рассчитывают по формуле:
w_{s}(w_{b}) = \frac{H_{ts} \cdot m_{s} \cdot V_{1}}{H_{st} \cdot m \cdot V_{2}} \cdot 1000 ,
где Hts — высота или площадь пика, в соответствующих единицах, полученные для испытуемого раствора (см. 9.2);
Hst — высота или площадь пика, в соответствующих единицах, полученные для рабочего стандартного раствора (см. 9.2);
ms — масса, в микрограммах, введенного рабочего стандартного раствора (5.7.2);
m — масса, в граммах, испытуемого образца (см. 8.1 или 8.2);
V1 — объем, в см3, экстракта, приготовленного в 9.1 (= 100 см3);
V2 — объем, в мм3, введенного испытуемого раствора;
1000 — коэффициент пересчета миллилитров в микролитры.
Результаты испытания представляют с точностью до целого числа.
11 Прецизионность метода
11.1 Межлабораторные испытания
Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут быть не применимы для иных, отличных от указанных, матриц и уровней содержания кислот.
Значения повторяемости и воспроизводимости были получены на основании результатов двух межлабораторных испытаний, проводимых в 1984 и 2004 годах (см. приложение A). Испытания проводились на образцах с уровнем содержания бензойной и сорбиновой кислот в пределах от 6 до 920 мг/кг.
11.2 Повторяемость
Абсолютная разность между результатами двух параллельных испытаний, полученными с использованием одного и того же метода в одной и той же пробе в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором, использующим то же самое оборудование, в короткий интервал времени, не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению: (2,235 + 0,031 \cdot \overline{w_{s}})(\text{или}\overline{w_{b}})\text{мг}/\text{кг} , более чем в 5% случаев.
11.3 Воспроизводимость
Абсолютная разность между результатами двух отдельных испытаний, полученными с использованием одного и того же метода в одной и той же пробе в различных лабораториях различными операторами, использующими различное оборудование, не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению: ((8,987 + 0,130 \cdot \overline{w_{s}}))(\text{или }w_{b})\text{мг}/\text{кг} , более чем в 5% случаев.
12 Оформление результатов
Протокол испытания должен содержать как минимум следующую информацию:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
b) используемый метод отбора проб;
c) используемый метод испытания со ссылкой на этот стандарт;
d) все рабочие детали, не установленные в этом стандарте или рассматриваемые как факультативные, вместе с деталями всех нюансов, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;
e) полученные результаты анализа и, если выполняется условие повторяемости, окончательный средний результат.
РЕЗУЛЬТАТЫ МЕЖЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ
Значения повторяемости и воспроизводимости были получены на основании результатов двух международных межлабораторных испытаний, проводимых в 1984 [4] и 2004 [6] годах соответственно.
Результаты, полученные в ходе этих испытаний, были подвергнуты статистическому анализу в соответствии с [2] <> и [3] <>. Данные прецизионности приведены в таблице A.1.
<**> В Российской Федерации действуют ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения», ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений», ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений» и ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода».
Статистические результаты межлабораторных испытаний
| Параметр | Бензойная кислота | Сорбиновая кислота | |||||
| 1984 [[4]](#p100320) | 1984 [[4]](#p100320) | 2004 [[6]](#p100324) | 2004 [[6]](#p100324) | 1984 [[4]](#p100320) | 2004 [[6]](#p100324) | 2004 [[6]](#p100324) | |
| Образцы | A a | B a | C b | D b | B+ c | C b | D b |
| Количество лабораторий | 14 | 14 | 9 | 14 | 14 | 14 | 14 |
| Количество выбывших лабораторий | 2 | 2 | 1 | 1 | 3 | 1 | 0 |
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбывших | 12 | 12 | 8 | 13 | 11 | 13 | 14 |
| Среднее значение, мг/кг | 26,4 | 40,6 | 7,61 | 35,0 | 36,1 | 920 | 57,0 |
| Повторяемость, r, мг/кг | 2,0 | 3,8 | 1,6 | 4,4 | 3,4 | 30,5 | 4;5 |
| Повторяемость относительно среднего значения, rrel, % | 7,7 | 9,4 | 20,5 | 12,7 | 9,4 | 3,3 | 7,8 |
| Стандартное отклонение повторяемости, sr, % | 0,7 | 1,3 | 0,6 | 1,6 | 1,2 | 10,8 | 1,6 |
| RSDr, % | 2,7 | 3,3 | 7.2 | 4.5 | 3,3 | 1:2 | 2,8 |
| Воспроизводимость, R, мг/кг | 13,5 | 15,3 | 11,0 | 9,9 | 12,1 | 128.9 | 18,6 |
| Воспроизводимость относительно среднего значения, Rrel, % | 51,1 | 37,7 | 144 | 28,4 | 33.5 | 14,0 | 32,6 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости, sR, мг/кг | 4,8 | 5,4 | 3,9 | 3,5 | 4,3 | 45,6 | 6,6 |
| RSDR, % | 18,1 | 13,3 | 50,9 | 10,0 | 11,9 | 5,0 | 11,5 |
| a Образцы A и B: Ароматизированный йогурт. b Образцы C и D: Плавленый сыр (дополнительную информацию см. в литературном источнике [[6]](#p100324)). c В ходе подготовки пробы добавлена сорбиновая кислота до концентрации 40 мг/кг. | |||||||
Используя линейный регрессионный анализ, была получена следующая линейная регрессия x = b + ay с коэффициентом корреляции 0,9973486 для n = 7, s = 0,8249 и t0,95 = 2,57 (см. рисунок A.1)
для сорбиновой кислоты r = 2,2354088 + 0,0307787\overline{w_{s}} и
для бензойной кислоты r = 2,2354088 + 0,0307787\overline{w_{b}}
Рисунок A.1 — Повторяемости как функция среднего значения
Используя линейный регрессионный анализ, была получена следующая линейная регрессия, x = b + ay с коэффициентом корреляции 0,9989653, для n = 7, s = 2,1815 и t0,95 = 2,57 (см. рисунок A.2)
для сорбиновой кислоты R = 8,9874655 + 0,1304663\overline{w_{s}} и
для бензойной кислоты R = 8,9874965 + 0,1304663\overline{w_{b}} .
Y — воспроизводимость, R (мг/кг)
Рисунок A.2 — Воспроизводимость как функция среднего значения
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНЫХ СТАНДАРТОВ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование межгосударственного стандарта |
| ИСО 707 | IDF 50 | - | <*>, <1> |
| ISO 1042:1998 | - | <*> |
| ISO 5725-2:1994 | - | <*>, <2> |
| <*> Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов. | ||
<1> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».
<2> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».