--- title: "\"ГОСТ ISO 21150-2018. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Обнаружение Escherichia coli\"" number: "ГОСТ ISO 21150-2018" issuer: "Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/standart-gost-iso-21150-2018" --- ## "ГОСТ ISO 21150-2018. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Обнаружение Escherichia coli" # "ГОСТ ISO 21150-2018. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Обнаружение Escherichia coli" (введен в действие Приказом Росстандарта от 04.12.2020 N 1253-ст) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов (п. п. 617, 784), а в случае их отсутствия - национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности продукции, предназначенной для детей и подростков" (ТР ТС 007/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 14.03.2023 N 31). > Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия - национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности парфюмерно-косметической продукции" (ТР ТС 009/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22.12.2020 N 177). > Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов (п.п. 701, 715, 736), а в случае их отсутствия - национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности средств индивидуальной защиты" (ТР ТС 019/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 03.03.2020 N 30). > Документ был включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия - национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности парфюмерно-косметической продукции" (ТР ТС 009/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Комиссии Таможенного союза от 23.09.2011 N 799). > Документ [введен](#p100009) в действие с 01.01.2021. Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 4 декабря 2020 г. N 1253-ст **МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ** **ПРОДУКЦИЯ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКАЯ** **МИКРОБИОЛОГИЯ. ОБНАРУЖЕНИЕ ESCHERICHIA COLI** Perfume and cosmetic products Microbiology. Detection of Escherichia coli **(ISO 21150:2015, IDT)** **ГОСТ ISO 21150-2018** МКС 07.100.99; 71.100.70 Дата введения 1 января 2021 года ### Предисловие Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены [ГОСТ 1.0](https://bukva.ai/docs/gost-1-0-2015) "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и [ГОСТ 1.2](https://bukva.ai/docs/gost-1-2-2015) "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены" ### Сведения о стандарте 1 ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в [пункте 5](#p100039) 2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь 3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июля 2018 г. N 110-П) За принятие проголосовали: | Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации | | --- | --- | --- | | Армения | AM | ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения | | Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь | | Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан | | Киргизия | KG | Кыргызстандарт | | Россия | RU | Росстандарт | | Узбекистан | UZ | Узстандарт | 4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 4 декабря 2020 г. N 1253-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 21150-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2021 г. 5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21150:2015 "Косметика. Микробиология. Обнаружение Escherichia coli" ("Cosmetics - Microbiology - Detection of Escherichia coli", IDT). Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов. Международный стандарт разработан техническим комитетом ISO/TC 217 "Косметика" Международной организации по стандартизации (ISO). При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международного и европейского стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном [приложении ДА](#p100374) **6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ** 7 Некоторые элементы настоящего стандарта могут являться объектами патентных прав Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты" ### Введение Микробиологические исследования парфюмерно-косметической продукции должны выполняться на основании соответствующего анализа степени микробиологического риска, для того чтобы обеспечить ее качество и безопасность для потребителей. Проведение анализа микробиологического риска обусловлено несколькими факторами, такими как: - возможное изменение парфюмерно-косметической продукции; - патогенность микроорганизмов; - область нанесения парфюмерно-косметической продукции (волосы, кожа, глаза, слизистые оболочки); - тип потребителей (взрослые, дети, включая детей до трех лет). Для парфюмерно-косметической и другой аналогичной продукции важным является обнаружение кожных болезнетворных микроорганизмов, таких как Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, так как они могут вызвать инфекции на коже человека или в области глаз. Обнаружение других видов микроорганизмов также может представлять интерес, поскольку эти микроорганизмы (включая индикаторы фекального загрязнения, например Escherichia coli) указывают на несоблюдение гигиенических требований в процессе производства. ### 1 Область применения Настоящий стандарт устанавливает общие требования к методу обнаружения и идентификации специфического микроорганизма Escherichia coli в парфюмерно-косметической продукции. Микроорганизмы, рассматриваемые в настоящем стандарте, в зависимости от применяемой национальной практики или требований национальных регламентов в разных странах могут относиться или не относиться к специфическим. Чтобы обеспечить качество и безопасность продукции для потребителя, рекомендуется проводить соответствующий анализ микробиологического риска с целью определения видов парфюмерно-косметической продукции, к которой применим настоящий стандарт. К продукции с низкой степенью микробиологического риска (см. ISO 29621) относится продукция с низкой водной активностью, продукция на спиртовой основе, продукция с крайними значениями pH и т.д. Метод, установленный в настоящем стандарте, основан на обнаружении Escherichia coli в неселективной жидкой среде (бульоне для обогащения), с последующим выделением микроорганизмов на селективной агаризованной среде. Можно применять и другие методы в зависимости от требуемого уровня обнаружения. *Примечание* - Для обнаружения Escherichia coli субкультуры могут быть пересеяны на неселективные питательные среды с последующей поэтапной идентификацией (например, с помощью идентификационных тестов). Из-за большого разнообразия парфюмерно-косметической продукции в рассматриваемой области применения отдельные детали данного метода могут быть непригодными для некоторых видов продукции (например, для нерастворимой в воде продукции). Могут применяться другие стандарты (например, ISO 18415). Можно применять другие методы (например, автоматизированные) вместо приведенных тестов, при условии, что была доказана их равнозначность или подтверждена пригодность должным образом. ### 2 Нормативные ссылки Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения). ISO 21148:2005 <1> Cosmetics - Microbiology - General instructions for microbiological examination (Косметика. Микробиология. Общие указания по микробиологическому контролю) --- <1> Заменен на ISO 21148:2017. Однако для однозначного соблюдения требования настоящего стандарта, выраженного в датированной ссылке, рекомендуется использовать только указанное в этой ссылке издание. EN 12353 Chemical disinfectants and antiseptics - Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity (Средства дезинфицирующие химические и антисептики. Консервация тест-микроорганизмов, используемых для определения бактерицидной (включая микроорганизмы Legionella), микобактерицидной, спорицидной, фунгицидной и вируцидной (включая бактериофаги) активности) ### 3 Термины и определения В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями: 3.1 продукция (product): Часть идентифицированной парфюмерно-косметической продукции, полученная лабораторией для испытания (анализа). 3.2 проба (sample): Часть продукции (не менее 1 г или 1 см3), которая используется при проведении испытаний для приготовления исходной суспензии. 3.3 исходная суспензия (initial suspension): Суспензия (или раствор) пробы в определенном объеме соответствующего бульона для обогащения. 3.4 разведение пробы (sample dilution): Разбавление исходной суспензии. 3.5 специфические микроорганизмы (specified microorganisms): Мезофильные аэробные бактерии или дрожжи, нежелательные в парфюмерно-косметической продукции и признанные патогенными для кожи микроорганизмами, которые способны причинить вред здоровью человека или являются признаком нарушения гигиенических требований в процессе производства. 3.6 Escherichia coli: Грамотрицательные подвижные палочки, образующие гладкие колонии. Примечания 1 Основные характеристики для идентификации: каталазаположительные, оксидазаотрицательные микроорганизмы, ферментирующие лактозу, продуцирующие индол, образующие характерные колонии на селективной среде, содержащей соли желчных кислот. 2 Бактерии вида Escherichia coli могут быть выделены из источников окружающей среды (воздух, вода, почва) и являться индикатором фекального загрязнения. 3.7 бульон для обогащения (enrichment broth): Неселективная жидкая питательная среда, содержащая соответствующие нейтрализаторы и/или диспергирующие вещества, которая прошла проверку пригодности для испытуемой продукции. ### 4 Сущность метода Первым этапом испытания является обогащение в неселективной питательной среде (бульоне) для увеличения числа микроорганизмов без риска ингибирования селективными ингредиентами, которые присутствуют в селективной/дифференциальной питательной среде. Второй этап испытания (выделение) выполняется на селективной среде с последующей идентификацией. Возможное ингибирование роста микроорганизмов пробой должно быть нейтрализовано для обеспечения обнаружения жизнеспособных микроорганизмов [[1]](#p100388). Во всех случаях и независимо от применяемой методики должна быть проверена и доказана нейтрализация антимикробных свойств продукции (см. [раздел 11](#p100232)). #### 5 Разбавители и питательные среды #### 5.1 Общие положения Общие указания приведены в ISO 21148. Если в настоящем стандарте упоминается вода, то это означает, что применяют дистиллированную или очищенную воду, как установлено в ISO 21148. Бульон для обогащения используют для диспергирования пробы и увеличения первоначальной микробной популяции. Он может содержать нейтрализаторы, если испытуемая проба обладает антимикробными свойствами. Эффективность нейтрализации должна быть доказана (см. [раздел 11](#p100232)). Информация относительно подходящих нейтрализаторов приведена в [приложении B](#p100325). Бульон для обогащения (см. [5.3.3.1](#p100114)) или любой из бульонов, приведенных в [приложении A](#p100262), пригоден для контроля наличия Escherichia coli в соответствии с методом настоящего стандарта при условии, что он прошел проверку пригодности в соответствии с [разделом 11](#p100232). Можно использовать другие разбавители и питательные среды, если была доказана их пригодность. #### 5.2 Разбавители для бактериальной суспензии (раствор хлорида натрия с триптоном) ##### 5.2.1 Общие положения Разбавитель используют для приготовления бактериальной суспензии, применяемой в процедуре теста на пригодность (см. [раздел 11](#p100232)). ##### 5.2.2 Состав - Триптон, панкреатический гидролизат казеина - 1,0 г; - хлорид натрия - 8,5 г; - вода - 1 000 см3. ##### 5.2.3 Приготовление Растворяют компоненты в воде, перемешивая их при нагревании. Разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,0 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. #### 5.3 Питательные среды ##### 5.3.1 Общие положения Питательные среды могут быть приготовлены согласно описанию, приведенному ниже, или из сухих питательных сред согласно инструкциям изготовителя. Должны соблюдаться инструкции поставщика среды. *Примечание* - Готовые к применению среды можно использовать, если их состав и/или ростовые свойства сопоставимы с описанными ниже. ##### 5.3.2 Агаризованная среда для теста на пригодность (см. [раздел 11](#p100232)) [агаризованная среда с соево-казеиновым гидролизатом (SCDA) или триптон-соевый агар (TSA)] ###### 5.3.2.1 Состав - Панкреатический гидролизат казеина - 15,0 г; - папаиновый гидролизат соевой муки - 5,0 г; - хлорид натрия - 5,0 г; - агар - 15,0 г; - вода - 1 000 см3. ###### 5.3.2.2 Приготовление Растворяют компоненты или готовую сухую среду в воде, перемешивая при нагревании. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,3 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. ##### 5.3.3 Бульон для обогащения ###### 5.3.3.1 Бульон Эугон (Eugon) LT 100 ###### 5.3.3.1.1 Общие положения Данная среда содержит ингредиенты (лецитин и полисорбат 80), которые нейтрализуют ингибирующие вещества, присутствующие в пробе, а также диспергирующий агент октоксинол 9. ###### 5.3.3.1.2 Состав - Панкреатический гидролизат казеина - 15,0 г; - папаиновый гидролизат соевой муки - 5,0 г; - L-цистин - 0,7 г; - хлорид натрия - 4,0 г; - сульфит натрия - 0,2 г; - глюкоза - 5,5 г; - яичный лецитин - 1,0 г; - полисорбат 80 - 5,0 г; - октоксинол 9 - 1,0 г; - вода - 1 000 см3. ###### 5.3.3.1.3 Приготовление Растворяют компоненты (полисорбат 80, октоксинол 9 и яичный лецитин) последовательно в кипящей воде до их полного растворения. Растворяют в воде остальные компоненты, перемешивая при нагревании. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,0 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. ###### 5.3.3.2 Другие бульоны для обогащения Можно использовать и другие подходящие бульоны для обогащения (см. [приложение A](#p100262)). ##### 5.3.4 Селективная агаризованная среда для выделения Escherichia coli ###### 5.3.4.1 Агаризованная среда МакКонки (MacConkey) ###### 5.3.4.1.1 Состав - Панкреатический гидролизат желатина - 17,0 г; - панкреатический гидролизат казеина - 1,5 г; - пептический гидролизат животной ткани - 1,5 г; - лактоза - 10,0 г; - смесь солей желчных кислот - 1,5 г; - хлорид натрия - 5,0 г; - агар - 13,5 г; - нейтральный красный - 30,0 мг; - кристаллический фиолетовый - 1,0 мг; - вода - 1 000 см3. ###### 5.3.4.1.2 Приготовление Растворяют все твердые компоненты в воде и кипятят в течение 1 мин до их полного растворения. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,1 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. ##### 5.3.5 Селективная агаризованная среда для подтверждения Escherichia coli ###### 5.3.5.1 Агаризованная среда Левина с эозином и метиленовым голубым ###### 5.3.5.1.1 Состав - Панкреатический гидролизат желатина - 10,0 г; - однозамещенный фосфат калия (KH2PO4) - 2,0 г; - агар - 15,0 г; - лактоза - 10,0 г; - эозин Y - 400 мг; - метиленовый голубой - 65 мг; - вода - 1 000 см3. ###### 5.3.5.1.2 Приготовление Растворяют панкреатический гидролизат желатина, однозамещенный фосфат калия и агар в воде при нагревании и дают остыть. Непосредственно перед использованием расплавляют желатинизированную агаризованную среду, добавляют остальные ингредиенты в виде растворов в соответствующих количествах и смешивают, на каждые 100 см3 расплавленной агаризованной среды добавляют: - 5 см3 раствора лактозы с массовой долей 20%; - 2 см3 раствора эозина Y с массовой долей 2% - и 2 см3 раствора метиленового голубого с массовой долей 0,033%. Готовая среда может оказаться непрозрачной. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,1 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. ### 6 Инструменты и стеклянная лабораторная посуда Используют лабораторное оборудование, инструменты и стеклянную посуду в соответствии с ISO 21148. ### 7 Штаммы микроорганизмов Для проверки пригодности условий проведения испытаний используют следующий референсный штамм: Escherichia coli ATCC <1> 8739 (эквивалентный штамм: CIP <2> 53.126, или NCIMB <3> 8545, или NBRC <4> 3972, или KCTC <5> 2571, или другой эквивалентный штамм из национальной коллекции). --- <1> ATCC - American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых культур (микроорганизмов)). <2> CIP - Institut Pasteur Collection (Коллекция института Пастера). <3> NCIMB - National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Национальная коллекция промышленных и морских бактерий) <4> NBRC - National Biological Resource center (Национальный центр биологических исследований). <5> KCTC - Korean Collection for type culture (Корейская коллекция типовых культур). Культуру следует восстановить согласно процедурам, представленным поставщиком референсного штамма. Штамм может храниться в лаборатории согласно EN 12353. ### 8 Обращение с парфюмерно-косметической продукцией и лабораторными пробами При необходимости продукцию, подлежащую испытаниям, хранят при комнатной температуре. Не следует выдерживать в термостате, охлаждать и замораживать продукцию и пробы ни до, ни после анализа. Отбор проб парфюмерно-косметической продукции для анализа следует проводить в соответствии с ISO 21148. Анализируют пробы согласно ISO 21148 и методике, приведенной в [разделе 9](#p100184). ### 9 Методика #### 9.1 Общие рекомендации Приготовление пробы, исходной суспензии и разведений выполняют с соблюдением условий асептики, используя стерильные материалы, оборудование. В случае приготовления исходной суспензии с использованием подходящего солюбилизирующего компонента время между окончанием приготовления суспензии и моментом ее внесения в бульон для обогащения не должно превышать 45 мин, если иное не оговорено в соответствующих протоколах или документах. #### 9.2 Приготовление исходной суспензии в бульоне для обогащения ##### 9.2.1 Общие положения Для обогащения вносят пробу (см. [3.2](#p100070)) хорошо перемешанной испытуемой продукции в количестве не менее 1 г или 1 см3 в бульон для обогащения объемом не менее 9 см3. Отмечают S, точную массу или точный объем пробы. При выполнении метода необходимо осуществлять контроль для гарантии того, что состав (с добавленным в конце приготовления нейтрализатором) и объем бульона соответствуют требованиям (см. [11.3](#p100239)). Примечание - В некоторых случаях (когда это возможно) фильтруют парфюмерно-косметическую продукцию через мембранный фильтр, который затем погружают в бульон для обогащения, что облегчает нейтрализацию антимикробных свойств продукции (см. [11.3](#p100239)). ##### 9.2.2 Водорастворимая продукция Переносят количество S пробы в подходящую лабораторную посуду, содержащую соответствующий объем бульона. ##### 9.2.3 Нерастворимая в воде продукция Переносят количество S пробы продукции в подходящую лабораторную посуду, содержащую соответствующее количество солюбилизирующего компонента (например, полисорбат 80). Диспергируют пробу в солюбилизирующем компоненте и добавляют соответствующий объем бульона. ##### 9.2.4 Фильтруемая продукция Используют мембранный фильтр с номинальным размером пор не более 0,45 мкм. Переносят количество S пробы продукции на мембранный фильтр в фильтровальном аппарате (см. ISO 21148). Сразу же фильтруют и промывают мембранный фильтр, используя определенные объемы воды и/или разбавителя. Переносят и погружают мембранный фильтр в пробирку или колбу подходящего размера, содержащую соответствующий объем бульона. #### 9.3 Инкубация инокулированного бульона для обогащения Инкубируют исходную суспензию, приготовленную в бульоне (см. [9.2](#p100187)), при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 20 ч, но не более 72 ч. #### 9.4 Обнаружение и идентификация Escherichia coli ##### 9.4.1 Выделение Стерильной петлей делают пересев аликвоты инкубированного бульона для обогащения (см. [9.3](#p100202)) на поверхность агаризованной среды МакКонки (см. [5.3.4.1](#p100134)) так, чтобы получить изолированные колонии. Переворачивают чашку Петри и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 24 ч, но не более 48 ч. Проверяют на наличие характерных колоний (см. [таблицу 1](#p100210)). Таблица 1 Морфологические характеристики Escherichia coli на агаризованной среде МакКонки | Селективная среда | Характеристика колоний Escherichia coli | | --- | --- | | Агаризованная среда МакКонки | Кирпично-красные; могут быть окружены зоной преципитации желчи | ##### 9.4.2 Идентификация Escherichia coli ###### 9.4.2.1 Общие положения Проводят дальнейшее изучение подозрительных колоний, выделенных на агаризованной среде МакКонки. Наличие Escherichia coli может быть подтверждено различными биохимическими и культуральными тестами. ###### 9.4.2.2 Окраска по Граму Следуют процедуре, установленной в ISO 21148. Проверяют на наличие грамотрицательных палочек. ###### 9.4.2.3 Культивирование на агаризованной среде Левина с эозином и метиленовым голубым (агаризованная среда ЕМВ) Инокулируют поверхность агаризованной среды Левина с эозином и метиленовым голубым подозрительными изолированными колониями, выращенными на агаризованной среде МакКонки таким образом, чтобы получить изолированные колонии. Переворачивают чашку Петри и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 24 ч, но не более 48 ч. Проверяют на наличие характерных колоний согласно [таблице 2](#p100224). Таблица 2 Морфологические характеристики Escherichia coli на агаризованной среде Левина с эозином и метиленовым голубым | Селективная среда | Характеристика колоний Escherichia coli | | --- | --- | | Агаризованная среда Левина с эозином и метиленовым голубым | Металлический блеск под отраженным светом и сине-черный цвет в проходящем свете | ### 10 Представление результатов (обнаружение Escherichia coli) Если при идентификации колоний подтверждено наличие данного вида, то результат представляют следующим образом: бактерии вида Escherichia coli обнаружены в количестве S пробы. Если после обогащения роста не наблюдалось и/или если идентификация колоний не подтвердила наличие данного вида, то результат представляют следующим образом: бактерии вида Escherichia coli не обнаружены в количестве S пробы. ### 11 Нейтрализация антимикробных свойств продукции #### 11.1 Общие положения Описанные в [11.2](#p100235) и [11.3](#p100239) процедуры демонстрируют, что микроорганизмы могут расти в условиях проведения анализа. #### 11.2 Приготовление инокулята Перед проведением испытания инокулируют поверхность среды с соево-казеиновым гидролизатом (SCDA), или триптон-соевого агара (TSA), или другой подходящей среды (неселективной и не оказывающей нейтрализующего действия) штаммом Escherichia coli. Инкубируют чашки при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 18 - 24 ч. Стерильной петлей штриховыми движениями снимают с поверхности среды выросшие колонии и ресуспендируют в разбавителе (см. [5.2](#p100089)) для приготовления стандартной суспензии с концентрацией 1 x 108 КОЕ/см3 (например, используя спектрофотометр, см. ISO 21148:2005 (приложение C)). Стандартную суспензию и ее разведения используют в течение 2 ч. #### 11.3 Пригодность метода обнаружения ##### 11.3.1 Процедура 11.3.1.1 В пробирках, содержащих по 9 см3 разбавителя (см. [5.2](#p100089)), готовят разведения стандартной суспензии (см. [11.2](#p100235)), чтобы в конечном счете получить концентрацию, равную 100 - 500 КОЕ/см3. Для подсчета окончательного количества жизнеспособных микроорганизмов в разведенной стандартной суспензии вносят 1 см3 суспензии в чашку Петри и заливают 15 - 20 см3 расплавленной агаризованной среды (см. [5.3.2](#p100103)), которая выдерживалась на водяной бане при температуре, не превышающей 48 °C. Дают среде в чашках застыть, а затем инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 20 - 24 ч. 11.3.1.2 Готовят в двух повторностях исходную суспензию пробы в пробирке или колбе, соблюдая выбранные для анализа условия (не менее 1 г или 1 см3 испытуемой продукции и определенный объем бульона для обогащения). Если используют метод мембранной фильтрации (см. [9.2.4](#p100198)), то фильтруют в двух повторностях не менее 1 см3 испытуемой продукции и переносят каждый мембранный фильтр в пробирку или колбу, содержащую бульон для обогащения, в условиях, выбранных для теста. 11.3.1.3 Стерильно вносят 0,1 см3 разведенной стандартной суспензии микроорганизмов в одну пробирку или колбу (тест на пригодность). Перемешивают, затем инкубируют обе пробирки или колбы (тест на пригодность и контроль неконтаминированной пробы) при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 20 - 24 ч. 11.3.1.4 Проводят выделение для каждой пробирки или колбы (тест на пригодность и контроль неконтаминированной пробы). Используя стерильную петлю, делают высев инкубированной смеси методом истощающего штриха (при таких же условиях, как в тесте) на поверхность агаризованной среды МакКонки (приблизительно от 15 до 20 см3), разлитой в чашку Петри (диаметр от 85 до 100 мм). Инкубируют чашки при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 24 - 48 ч. ##### 11.3.2 Интерпретация результатов теста на пригодность Проверяют, что разведенная стандартная суспензия бактерий вида Escherichia coli содержит от 100 до 500 КОЕ/см3. Нейтрализация подтверждается и метод обнаружения является удовлетворительным, если ростовые характеристики Escherichia coli наблюдаются на чашке, которая использовалась в тесте на пригодность, и если отсутствует рост на контрольной чашке. Если обнаружен рост на контрольной чашке (контаминированная продукция), нейтрализация подтверждается и метод обнаружения является удовлетворительным, если бактерии вида Escherichia coli выделены на чашках, используемых в тесте на пригодность. Отсутствие роста на чашках, используемых в тесте на пригодность, указывает на то, что антимикробная активность все еще не нейтрализована и требуется изменение условий метода путем увеличения объема питательного бульона (при этом количество продукции остается тем же), или путем добавления большего количества инактивирующего вещества в бульон для обогащения, или комбинации изменений, которые позволят обеспечить рост Escherichia coli. Если все еще невозможно выделить жизнеспособные культуры несмотря на введение подходящих инактивирующих веществ и значительное увеличение объема бульона, как описано выше, то это указывает на малую вероятность контаминации продукции бактериями вида Escherichia coli. ### 12 Протокол испытания Протокол испытания должен содержать следующую информацию: a) ссылку на настоящий стандарт; b) всю информацию, необходимую для полной идентификации продукции; c) примененный метод; d) полученные результаты; e) все детали приготовления исходной суспензии; f) описание метода с указанием использованных нейтрализующих веществ и питательных сред; g) подтверждение пригодности метода, даже если испытание было выполнено отдельно; h) любые особенности, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробностями, которые могли повлиять на полученные результаты. Приложение A (справочное) **ДРУГИЕ БУЛЬОНЫ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ** A.1 Жидкая лактозная среда с нейтрализирующими и диспергирующими агентами Эта среда содержит ингредиенты: - которые нейтрализуют ингибирующие вещества, присутствующие в пробе, - лецитин и полисорбат 80), - и диспергирующий агент октоксинол 9. A.1.1 Состав - Мясной экстракт - 3,0 г; - панкреатический гидролизат желатина - 5,0 г; - лактоза - 5,0 г; - яичный лецитин - 1,0 г; - полисорбат 80 - 5,0 г; - октоксинол 9 - 1,0 г; - вода - 1 000 см3. A.1.2 Приготовление Растворяют последовательно компоненты (полисорбат 80, октоксинол 9 и яичный лецитин) в кипящей воде до полного их растворения. Растворяют остальные компоненты, перемешивая при нагревании. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации охлаждают среду как можно быстрее. pH должен быть равен 6,9 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. A.2 Жидкая лактозная среда A.2.1 Состав - Мясной экстракт - 3,0 г; - панкреатический гидролизат желатина - 5,0 г; - лактоза - 5,0 г; - вода - 1 000 см3. A.2.2 Приготовление Растворяют компоненты в воде. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации охлаждают среду как можно быстрее, pH должен быть равен 6,9 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. A.3 Среда с соево-казеиновым гидролизатом, лецитином и полисорбатом 80 (бульон SCDLP 80) A.3.1 Состав - Казеиновый пептон - 17,0 г; - соевый пептон - 3,0 г; - хлорид натрия - 5,0 г; - калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,5 г; - глюкоза - 2,5 г; - лецитин - 1,0 г; - полисорбат 80 - 7,0 г; - вода - 1 000 см3. A.3.2 Приготовление Растворяют все компоненты или готовую сухую среду последовательно в кипящей воде до их полного растворения. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,2 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. A.4 Нейтрализирующий бульон D/E (нейтрализирующий бульон Dey/Engley) [[7]](#p100400) A.4.1 Состав - Глюкоза - 10,0 г; - соевый лецитин - 7,0 г; - пятиводный тиосульфат натрия - 6,0 г; - полисорбат 80 - 5,0 г; - панкреатический гидролизат казеина - 5,0 г; - бисульфит натрия - 2,5 г; - дрожжевой экстракт - 2,5 г; - тиогликолят натрия - 1,0 г; - бромкрезоловый пурпурный - 0,02 г; - вода - 1 000 см3. A.4.2 Приготовление Растворяют все компоненты или готовую сухую среду последовательно в кипящей воде до полного растворения. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,6 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. A.5 Модифицированный летиновый (Letheen) бульон A.5.1 Состав - Пепсиновый гидролизат мяса - 20,0 г; - панкреатический гидролизат казеина - 5,0 г; - говяжий экстракт - 5,0 г; - дрожжевой экстракт - 2,0 г; - лецитин - 0,7 г; - полисорбат 80 - 5,0 г; - хлорид натрия - 5,0 г; - бисульфит натрия - 0,1 г; - вода - 1 000 см3. A.5.2 Приготовление Последовательно растворяют полисорбат 80 и лецитин в кипящей воде до полного их растворения. Растворяют остальные компоненты, перемешивая при нагревании. Перемешивают осторожно во избежание пенообразования. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 7,2 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре. Приложение B (справочное)
НЕЙТРАЛИЗАТОРЫ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ КОНСЕРВАНТОВИ ПРОМЫВНЫЕ ЖИДКОСТИ
Консерванты
Химические вещества, способные нейтрализовать антимикробную активность консервантов
Примеры подходящих нейтрализаторов и промывных жидкостей (для методов мембранной фильтрации)
Фенольные соединения:
- парабены;		- феноксиэтанол;- фенилэтанол;
- и другие анилиды
Лецитин, полисорбат 80, конденсат этиленоксида жирного спирта, неионогенные поверхностно-активные вещества
Полисорбат 80, 30 г/дм3, + лецитин, 3 г/дм3.
Конденсат этиленоксида жирного спирта, 7 г/дм3, + лецитин, 20 г/дм3, + полисорбат 80, 4 г/дм3D/E-нейтрализующий бульон a
Промывная жидкость: дистиллированная вода; триптон, 1 г/дм3, + NaCl, 9 г/дм3; полисорбат 80, 5 г/дм3		Четвертичные аммониевые соединения, катионогенные поверхностно-активные вещества
Лецитин, сапонин, полисорбат 80, додецилсульфат натрия
Конденсат этиленоксида жирного спирта
Полисорбат 80, 30 г/дм3, + додецилсульфат натрия, 4 г/дм3, + лецитин, 3 г/дм3.
Полисорбат 80, 30 г/дм3, + сапонин, 30 г/дм3, + лецитин, 3 г/дм3.D/E-нейтрализующий бульон a.Промывная жидкость: дистиллированная вода; триптон, 1 г/дм3, + NaCl, 9 г/дм3; полисорбат 80, 5 г/дм3
Альдегиды, ингредиенты, выделяющие формальдегид
Глицин, гистидин
Лецитин, 3 г/дм3, + полисорбат 80, 30 г/дм3, + L-гистидин, 1 г/дм3.
Полисорбат 80, 30 г/дм3, + сапонин, 30 г/дм3, + L-гистидин, 1 г/дм3, + L-цистеин, 1 г/дм3.D/E-нейтрализующий бульон aПромывная жидкость: полисорбат 80, 3 г/дм3, + L-гистидин, 0,5 г/дм3
Окисляющие соединения
Тиосульфат натрияТиосульфат натрия, 5 г/дм3.
Промывная жидкость: тиосульфат натрия, 3 г/дм3		Изотиазолиноны, имидазолы
Лецитин, сапонин
Амины, сульфаты, меркаптаны, бисульфит натрия, тиогликолят натрияПолисорбат 80, 30 г/дм3, + сапонин, 30 г/дм3, + лецитин, 3 г/дм3.Промывная жидкость: триптон, 1 г/дм3, + NaCl, 9 г/дм3; полисорбат 80, 5 г/дм3
Бигуаниды
Лецитин, сапонин, полисорбат 80Полисорбат 80, 30 г/дм3, + сапонин, 30 г/дм3, + лецитин, 3 г/дм3
Промывная жидкость: триптон, 1 г/дм3, + NaCl, 9 г/дм3; полисорбат 80, 5 г/дм3		Соли металлов (Cu, Zn, Hg), ртутьорганические соединения
Бисульфат натрия, L-цистеин
Сульфгидрильные соединения, тиогликолевая кислота
Тиогликолят натрия, 0,5 или 5 г/дм3.
L-цистеин, 0,8 или 1,5 г/дм3.
D/E-нейтрализующий бульон a. Промывная жидкость: тиогликолят натрия, 0,5 г/дм3
Примечание - См. [ссылки [8]](#p100402) и [[11]](#p100410).
--- a D/E-нейтрализующий бульон (Dey/Engley-нейтрализующий бульон) см. в [приложении A](#p100262). Приложение ДА (справочное) **СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНОГО** **И ЕВРОПЕЙСКОГО СТАНДАРТОВ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ** Таблица ДА.1
Обозначение ссылочного международного (европейского) стандартаСтепень соответствияОбозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта
ISO 21148:2005IDTГОСТ ISO 21148-2013 Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Общие требования к микробиологическому контролю
EN 12353IDTГОСТ EN 12353-2016 Средства химические дезинфицирующие и антисептические. Консервация тест-организмов, используемых для определения бактерицидной (включая Legionella), микобактерицидной, спорицидной, фунгицидной и вируцидной (включая бактериофаги) активности (EN 12353:2013)
Примечание - В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандартов:
- IDT - идентичный стандарт.
## БИБЛИОГРАФИЯ
[1]COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, 1997 published by the European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association (COLIPA) (Руководство по менеджменту качества в микробиологии)
[2]CTFA, Microbiology Guidelines, 2007 published by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association ISBN 1-882621-32-8 (Руководство по микробиологии)
[3]EP, Microbiological Examination of non-sterile products, 4th edition, 2002 published by the European Pharmacopoeia (Микробиологическая экспертиза нестерильной продукции)
[4]FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, 1995 published by the U.S. Food and Drug Administration http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.html (Руководство по бактериологическому анализу)
[5]J.P 14, General Tests - Microbial limit test, 2001 published by the Japanese Pharmacopoeia (Общие испытания. Испытания на предельное содержание микроорганизмов)
[6]USP 28, Microbial limit test (61), 2005 published by the U.S. Pharmacopoeia (Испытания на предельное содержание микроорганизмов)
[7]Atlas, R.M. Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993 (Справочник по микробиологическим средам)
[8]Singer, S. The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media, Cosmetics and Toiletries, 102, December 1987, p. 55 (Применение нейтрализаторов-консервантов в разбавителях и средах для чашек Петри. Косметика и туалетные принадлежности)
[9]ISO 21149Cosmetics - Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria (Косметика. Микробиология. Подсчет и обнаружение аэробных мезофилических бактерий)
[10]ISO 18415Cosmetics - Microbiology - Detection of specified microorganisms and non-specified microorganisms (Косметика. Микробиология. Обнаружение специфических и неспецифических микроорганизмов)
[11]EN 1040Chemical disinfectants and antiseptics - Basic bactericidal activity - Test method and requirements (phase 1) (Средства химические дезинфицирующие и антисептики. Базовая бактерицидная активность. Метод испытания и требования (этап 1))
[12]ISO 29621Cosmetics - Microbiology - Guidelines for the risk assessment and identification of microbiologically low-risk products (Продукция косметическая. Микробиология. Руководящие указания по оценке риска и идентификации продукции с микробиологически низким риском)
УДК 665.57/.58:579.63.083.12(083.74)(476):006.354МКС 07.100.99; 71.100.70IDT
Ключевые слова: продукция парфюмерно-косметическая, микробиологические исследования, микроорганизмы, разбавители, питательные среды, штаммы микроорганизмов
---