ГОСТ ISO 20837-2013. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 № 2133-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» (ТР ЕАЭС 051/2021) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.11.2022 № 188). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Документ введен в действие с 01.07.2015.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 2133-ст
МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ. ТРЕБОВАНИЯ К ПОДГОТОВКЕ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ КАЧЕСТВЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ
Microbiology of food and animal feeding stuffs. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens. Requirements for sample preparation for qualitative detection
Дата введения 1 июля 2015 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. № 44)
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20837:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения).
Международный стандарт разработан техническим комитетом CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» совместно с подкомитетом ISO TC 34/SC 9 «Микробиология» технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).
Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.
Перевод с английского языка (en).
Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.
Степень соответствия — идентичная (IDT)
5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 2133-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20837-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
Введение
Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) обычно выполняется путем указанной ниже последовательности этапов (или одновременного их выполнения):
- гомогенизация образца;
- (культуральное) обогащение исследуемого патогенного микроорганизма и обработка образца;
- выделение нуклеиновых кислот (по выбору);
- амплификация нуклеиновых кислот исследуемого патогенного микроорганизма;
- обнаружение амплифицированной ДНК исследуемого патогенного микроорганизма.
Ссылки на стандарты, относящиеся к культуральному обогащению бактерий из пищевых матриц, приведены в приложении A. Пример специального метода подготовки образца описан в приложении B.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Использование настоящего стандарта может включать применение опасных материалов, операций и оборудования. Данный стандарт не предназначен для рассмотрения всех проблем безопасности, связанных с его использованием. Пользователь настоящего стандарта несет ответственность за применение безопасных и не угрожающих здоровью методов и определение необходимости регламентных ограничений перед использованием стандарта.
1 Область применения
В настоящем стандарте приводятся критерии и примеры подготовки образцов для получения ПЦР-совместимых образцов или нуклеиновых кислот, качество и количество которых достаточны для использования в ПЦР.
В стандарте описаны общие принципы процесса подготовки образцов. Ссылки на стандарты, в которых описано обогащение микроорганизмами, приведены в приложении A, а подробное изложение метода выделения ДНК приведено в приложении B.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, а также в случае необходимости при некоторой адаптации применим к кормам и к пробам окружающей среды.
2 Нормативные ссылки
Следующий ссылочный стандарт является обязательным для применения настоящего стандарта. Для недатированных ссылок применяется только цитируемое издание. Для недатированных ссылок применяется самое последнее издание ссылочного стандарта (включая любые изменения).
ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения)
3 Принцип
3.1 Общие положения
Цель описанных методов подготовки образцов состоит в получении нуклеиновых кислот из пробы обогащенных исследуемых патогенных микроорганизмов, качество и количество которых достаточны для использования в ПЦР.
Примечание - Качество нуклеиновых кислот зависит, например, от химической чистоты, средней длины молекул и структурной целостности выделенных молекул нуклеиновых кислот.
Обогащение и обработка образцов должны обеспечивать обнаружение малого количества целевых микроорганизмов и уменьшение количества веществ, ингибирующих ПЦР. Физические, химические или биохимические процедуры, обладающие меньшим разрушающим эффектом на целостность нуклеиновых кислот, должны обеспечивать получение совместимых с ПЦР-амплификацией образца или раствора нуклеиновых кислот.
3.2 Обогащение и обработка образца
Обработка образцов может начинаться непосредственно с образца или после его обогащения, согласно описанию в перечисленных в приложении A стандартах или в других стандартах, относящихся к данному вопросу.
3.3 Выделение нуклеиновых кислот
Основные принципы выделения нуклеиновых кислот состоят в высвобождении ДНК, присутствующей в бактериях, и одновременном или последующем удалении ингибиторов ПЦР.
Пример метода выделения ДНК приводится в Приложении B. Этот метод является только примером, и должен быть в дальнейшем модифицирован пользователями для соответствия задачам, стоящим перед каждой лабораторией.
4 Общие требования к лаборатории
Обработку образцов следует выполнять в раздельных рабочих зонах согласно требованиям стандарта ISO 22174, 6.3.
5 Реактивы, аппаратура и оборудование
См. приложения A и B настоящего стандарта, а также ISO 22174.
6 Методика
6.1 Обогащение и обработка образцов для выявления бактерий
Обогащение образцов пищевых продуктов следует проводить согласно соответствующим стандартам или другим нормативным документам. Для обогащения можно использовать другие, более совместимые с ПЦР, культуральные среды, если было установлено путем валидации, что они имеют эффективность, сравнимую со средами, описанными в соответствующих стандартах.
Некоторые среды культурального обогащения, рекомендуемые стандартами, содержат меньшее количество ингибирующих ПЦР веществ, чем другие, что должно тщательно учитываться при выборе метода подготовки образцов.
Для некоторых продуктов необходимо принять специальные меры по подавлению роста конкурирующих сопутствующих фоновых микроорганизмов (например, путем добавления селективных добавок или антибиотиков).
Могут быть опробованы менее разрушающие методы, например простое разведение, центрифугирование, гидролиз белка, фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности, иммуномагнитная сепарация и т.д. В случае отсутствия ответа в ПЦР возможно пробное использование более жестких методов, например кипячения, применения хелатирующих добавок или более жестких химикатов, например, хлороформа и этилового спирта, или наборов реагентов с аналогичными функциями. Для снижения содержания жиров в веществах с высоким содержанием жиров могут быть использованы простые физические методы. Для уменьшения эффектов ингибирования, обусловленного высоким содержанием кальция в молочных продуктах, можно использовать хелатирующие агенты.
6.2 Выделение нуклеиновых кислот
6.2.1 Выделение ДНК
6.2.1.1 Высвобождение и очистка ДНК
Допускается комбинация нескольких принципов выделения ДНК. Например, могут быть выполнены следующие этапы:
a) разрушение белков в экстракте клеток с помощью протеаз (например, протеиназы K) и РНК с помощью рибонуклеаз;
b) преципитация образовавшихся пептидов с органическими растворителями (например, со смесью фенола и хлороформа), что позволяет оставить ДНК в водной фазе;
c) очистка раствора ДНК и дальнейшее концентрирование путем преципитации этиловым спиртом в присутствии одновалентных катионов;
d) сбор преципитата ДНК с помощью центрифугирования;
e) промывка ДНК этиловым спиртом и ресуспендирование в буфере (например, буфер трис-(гидроксиметил)аминометан/ЭДТА (Трис-ЭДТА буфер) или Трис-буфер).
Для увеличения выхода ДНК на этапах преципитации можно использовать соосадители ДНК, например гликоген, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или транспортную РНК (тРНК). Допускается использование только соосадителей без нуклеазной активности, ПЦР-ингибирующих/конкурирующих эффектов и без гомологии последовательностей с потенциальными целевыми ПЦР-последовательностями анализируемых микроорганизмов.
Примечание - Использование лиофильной сушки для высушивания осадка ДНК, полученного после этапа преципитации, может привести к перекрестной контаминации.
ДНК может быть высвобождена путем температурного разрушения клеток (например, при кипячении в течение 10 мин). После кипячения охлажденный образец центрифугируют и полученный супернатант используют в ПЦР. Перед кипячением может быть применена ферментативная обработка для улучшения разрушения клеток (например, лизоцим, мутанолизин для грамположительных бактерий), после которой образец инкубируется с протеазами. Для микроорганизмов с исключительно прочной клеточной стенкой (например, Mycobacterium spp.) возможно потребуется использование других методов, например сильной встряски с шариками.
Для выделения нуклеиновых кислот могут быть использованы и другие методы, включая имеющиеся в продаже наборы реагентов, при условии, что получаемые результаты сравнимы.
6.2.1.2 Качество и количество ДНК
Качество и выход ДНК, выделенной данным методом из данной матрицы, должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми применительно к амплификации в ПЦР, при условии достаточного содержания ДНК в матрице. В частности, применяемый метод должен обеспечивать получение фрагментов ДНК, средний размер которых больше или равен размеру исследуемых ПЦР-продуктов.
Концентрацию и чистоту выделенной ДНК можно оценить флуорометрическими методами или с помощью электрофореза в геле. Количественная оценка очищенной ДНК может быть выполнена спектрофотометрическими методами.
Электрофорез в агарозном геле с окраской бромистым этидием и флуоресценцией в ультрафиолетовом (УФ) свете является быстрым способом оценки качества и количества ДНК (см. [1]).
Для некоторых методов подготовки образцов (например, кипячение) необходимо использовать раствор нуклеиновых кислот сразу же после приготовления, так как получаемые нуклеиновые кислоты нестабильны.
В целом следует избегать повторных замораживания и размораживания растворов нуклеиновой кислоты.
Для хранения нуклеиновых кислот с низким количеством копий используют подходящую пластиковую посуду.
Примечание - Некоторые материалы, используемые для изготовления пробирок, способны связывать нуклеиновые кислоты.
6.3 Оценка результатов
Оценка результатов испытания — по ISO 22174, 9.3 и таблица 1.
СТАНДАРТЫ ПО ОБОГАЩЕНИЮ МИКРООРГАНИЗМАМИ (БАКТЕРИЯМИ)
Перечисленные в таблице A.1 стандарты содержат информацию по обогащению микроорганизмами (бактериями).
Специальные стандарты по отдельным микроорганизмам (бактериям)
| Вид микроорганизма | Международный стандарт |
|---|---|
| Salmonella spp. | [6] |
| Staphylococcus aureus | [7] |
| Bacillus cereus | [8] |
| Clostridium perfringens | [9] |
| Campylobacter spp. | [10] |
| Yersinia enterocolitica | [11] |
| Listeria monocytogenes | [12] |
| Escherichia coli O157 | [13] |
| Shigella spp. | [16] |
МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
Данный метод применим для выделения ДНК из грамотрицательных бактерий путем лизиса или кипячения.
Данный метод хорошо известен и широко применялся [1]. Более того, данный метод прошел валидацию в совместном исследовании по обнаружению штаммов Salmonella в образцах сухого молока, прошедших культуральное обогащение на бульоне [2], [3], и совместном исследовании по обнаружению образующих веротоксин-образующей Escherichia coli (VTEC) в рубленом мясе [4], [5].
В данном методе применяется несколько этапов центрифугирования для отбора бактерий. Бактериальные клетки промываются, лизируются с помощью инкубации при температуре от 95 °C до 100 °C, а затем центрифугируются для преципитации остатков клеточных стенок, полисахаридов и белков, что позволяет в итоге получить экстракт нуклеиновых кислот.
Стартовым материалом обычно является питательный бульон для культурального обогащения.
B.4.1 Буфер для промывания, физиологический раствор [ \rho (NaCl) = 9 г/дм3] или фосфатно-солевой буферный раствор, ФСБ ( \rho (NaCl) = 8 г/дм3, \rho (KCl) = 0,2 г/дм3, \rho (Na2HPO4) = 1,44 г/дм3, \rho (KH2PO4) = 0,24 г/дм3; pH = 7,4).
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
B.5.1 Дозаторы с микролитровыми рабочими объемами
B.5.2 Настольная центрифуга, для микролитровых реакционных пробирок, с вместимостью от 1,5 см3 до 2 см3, и регулируемым ускорением до 10000g.
B.5.3 Водяная баня или твердотельный термостат, для микролитровых реакционных пробирок, способных выдерживать нагрев до 100 °C.
B.5.4 Мешалка, например вихревой смеситель.
После обогащения выделяют бактериальную ДНК согласно описанию в B.6.2.
Переносят 1 см3 культуральной среды после обогащения в реакционную пробирку. Центрифугируют суспензию клеток в течение десяти минут при ускорении 10000g (B.5.2). Удаляют супернатант.
Ресуспендируют осадок в 1 см3 буфера для промывки (B.4.1) или воды. Центрифугируют суспензию клеток в течение десяти минут при ускорении 10000g (B.5.2). Удаляют супернатант.
Ресуспендируют осадок в объеме воды от 200 до 250 мкл. Проводят термическое разрушение клеток путем нагрева до температуры 95 °C в течение 20 мин (для Salmonella) или до 100 °C в течение 15 мин (для шигатоксин-продуцирующей Escherichia coli (STEC)).
Переносят реакционные пробирки в ледяную баню для быстрого охлаждения.
Тщательно перемешивают лизат (например, с помощью встряхивателя (B.5.4)). Центрифугируют при температуре от 20 °C до 25 °C в течение 3 мин при ускорении 10000g (Salmonella) или 10 с при ускорении 10000g (STEC).
Переносят супернатант в чистую микролитровую реакционную пробирку.
Если для экстрактов нуклеиновых кислот наблюдается по соответствующим контролям эффект ингибирования, то они должны быть очищены перед использованием в ПЦР.
По выбору вместо методов термического разрушения клеток и необходимой очистки можно использовать имеющиеся в продаже системы выделения и очистки ДНК при условии соблюдения инструкций производителя.
Данный метод широко применяется и является основным методом в молекулярной биологии. Кроме того, данный метод прошел валидацию в совместных межлабораторных испытаниях.
В 1998 году межлабораторное испытание было организовано рабочей группой «ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах» института DIN (Немецким институтом стандартизации). В этом испытании приняли участие двенадцать лабораторий, каждая из которых получила по 20 образцов. Материал образца представлял собой сухое молоко с низким содержанием жира. Часть этого сухого молока была искусственно контаминирована Salmonella (1000 КОЕ на 25 г). Подготовка образцов перед выделением ДНК в лаборатории выполнялась следующим образом: 25 г образца добавлялось к 250 см3 неселективной среды для обогащения (бриллиантовый зеленый 0,002%) и инкубировалось при температуре 37 °C в течение 16 ч. Выделение нуклеиновых кислот начиналось из 1 см3 такого культурального бульона. Экстракты анализировались в ПЦР. Всего было проанализировано 240 образцов; результаты для 1-го образца были признаны ложноотрицательными, для 2-х — ложноположительными; в 14 образцах наблюдалось ингибирование ПЦР.
В 2001 году данный метод прошел валидацию в совместном исследовании, организованном рабочей группой «ПЦР для обнаружения микроорганизмов в пищевых продуктах» в Немецком Федеральном Институте защиты здоровья потребителей и ветеринарной медицины (BgVV) согласно статье 35 Немецкого федерального закона о пищевых продуктах. Участвовали одиннадцать лабораторий. Каждая лаборатория получила десять образцов рубленого мяса, приготовленного из двух основных матриц. В каждом случае пять образцов были равномерно контаминированы известными штаммами STEC/EHEC в дозах от 54 КОЕ/25 г до 308 КОЕ/25 г рубленого мяса. Содержание сопутствующей микрофлоры составляло от 105 КОЕ/г до 106 КОЕ/г, однако иногда было выше этих значений (в результате транспортировки). Образцы 1 — 9 (подготовленные из основного материала) дополнительно имели естественное загрязнение 4 штаммами STEC. Для всех лабораторий было показано 100%-ное обнаружение в ПЦР.
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫХ СТАНДАРТОВ ССЫЛОЧНЫМ МЕЖДУНАРОДНЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение и наименование ссылочного международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
| ISO 22174:2005 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения | - | <*> |
| <*> Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его принятия рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов. | ||