ГОСТ ISO 16958-2018. Межгосударственный стандарт. Молоко, молочные продукты, смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение состава жирных кислот. Метод капиллярной газовой хроматографии

(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.08.2018 № 513-ст)

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 августа 2018 г. № 513-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МОЛОКО, МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ, СМЕСИ АДАПТИРОВАННЫЕ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА И СМЕСИ ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ВЗРОСЛЫХ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ. МЕТОД КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Milk, milk products, infant formula and adult nutritionals. Determination of fatty acids composition. Capillary gas chromatographic method

(ISO 16958/IDF 231:2015, IDT)

ГОСТ ISO 16958-2018

МКС 67.200.10

Дата введения 1 сентября 2019 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи» (ФГБНУ «ФИЦ питания и биотехнологии») на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. № 109-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 августа 2018 г. № 513-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16958-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2019 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16958/IDF 231:2015 «Молоко, молочные продукты, смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение состава жирных кислот. Метод капиллярной газовой хроматографии» («Milk, milk products, infant formula and adult nutritionals — Determination of fatty acids composition — Capillary gas chromatographic method», IDT).

Международный стандарт разработан постоянной комиссией IDF по аналитическим методам оценки химического состава и подкомитетом SC 5 «Молоко и молочные продукты» (ISO/TC 34/SC 5) технического комитета ISO/TC 34 «Продукты пищевые» в сотрудничестве с AOAC INTERNATIONAL.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения отдельных и/или всех жирных кислот в молоке, молочных продуктах, смесях, адаптированных для искусственного вскармливания детей раннего возраста, смесей для энтерального питания взрослых, содержащих молочные жиры и/или растительные масла, обогащенные или не обогащенные маслами, с высоким содержанием длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ДЦ-ПНЖК). Метод также распространяется на группы жирных кислот, содержание которых часто выносится на этикетку [т.е. транс-изомеры жирных кислот (ТЖК), насыщенные жирные кислоты (НЖК), мононенасыщенные жирные кислоты (МНЖК), полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), омега-3, омега-6 и омега-9 жирные кислоты] и/или отдельные жирные кислоты [т.е. линолевая кислота (LA), альфа-линоленовая кислота (ALA), арахидоновая кислота (ARA), эйкозапентаеновая кислота (EPA) и докозагексаеновая кислота (DHA)].

Определение проводят прямой переэтерификацией в матрицах пищевых продуктов без предварительного извлечения жира, что, следовательно, является применимым к жидким образцам или восстановленным водой порошкообразным образцам с массовой долей общего жира более 1,5%.

Жир, извлеченный из продуктов, содержащих менее 1,5% жира по массе, может быть проанализирован таким же методом после предварительного извлечения с использованием методов, указанных в разделе 2. Молочные продукты, такие как мягкие или твердые сыры с уровнем кислотности менее 1 ммоль/100 г жира, можно проанализировать после предварительного извлечения жира с использованием методов, указанных в разделе 2. Для продуктов, обогащенных ПНЖК, рыбным жиром или продуктами из водорослей, испарение растворителей следует проводить при минимально возможной температуре (например, не более 40 °C) для сохранения этих нестойких жирных кислот.

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все изменения к нему).

ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks (Лабораторная посуда. Мерные колбы)

ISO 1735/IDF 5, Cheese and processed cheese products — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method) [Сыры и плавленый сыр. Определение содержания жира. Гравиметрический метод (контрольный метод)]

ISO 1740/IDF 6, Milkfat products and butter — Determination of fat acidity (Reference method) [Молочный жир и масло. Определение кислотности жиров (контрольный метод)]

ISO 14156/IDF 172, Milk and milk products. Extraction methods for lipids and liposoluble compounds (Молоко и молочные продукты. Методы экстракции липидов и жирорастворимых соединений)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание жирных кислот (fatty acids content): Массовая доля отдельных веществ или групп веществ, определяемая в соответствии с процедурой, указанной в настоящем стандарте.

Примечания

1 См. таблицу A.1.

2 Содержание жирных кислот выражается в виде массовой доли в граммах (или миллиграммах) жирных кислот на 100 г продукта (см. таблицу A.1). Результаты определения жирных кислот могут быть преобразованы в другие форматы выражений результатов (см. 10.2).

4 Сущность метода

Добавление раствора внутреннего стандарта к образцу, получение метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) путем прямой переэтерификации с метанольным раствором метилата натрия для жидких образцов; растворение (например, разведение) в воде и прямая переэтерификация метанольным раствором метилата натрия для порошкообразных образцов. Та же процедура переэтерификации применяется к жиру, экстрагированному из различных пищевых продуктов (например, продуктов с низким содержанием жира, сыров).

Разделение МЭЖК проводится с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии. Идентификация МЭЖК проводится путем сравнения со временами удерживания чистых стандартов, количественный анализ проводится с пересчетом на содержание жирных кислот с использованием внутреннего стандарта (C11:0 МЭЖК) и коэффициентов отклика прибора. Проверка эффективности переэтерификации проводится с использованием второго внутреннего стандарта (ТАГ C13:0).

5 Реактивы

Используют только реагенты признанного аналитического качества, если не указано иное.

5.1 н-гексан [CH3(CH2)4CH3], для хроматографии.

5.2 Метанол [CH3OH], для хроматографии.

5.3 Вода, квалификации для ВЭЖХ или эквивалентной.

5.4 Метанольный раствор метилата натрия [CH3ONa], с массообъемной концентрацией 30 или 25%, в зависимости от доступности в стране.

5.5 Переэтерифицирующий раствор (метанольный раствор метилата натрия с массообъемной концентрацией 5% м/об).

В мерную колбу вместимостью 300 см3 вносят 50 см3 раствора метилата натрия 30% об. (или 60 см3 25% об. раствора метилата натрия) и осторожно смешивают с 250 см3 метанола, перемешивая магнитной мешалкой. Удаляют магнитную мешалку, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят до метки метанолом.

Раствор стабилен в течение одной недели при хранении в темном месте при температуре 4 °C. Перед использованием дожидаются, пока температура раствора станет комнатной. Полученного объема раствора достаточно для анализа примерно 40 проб. В случае меньшего количества анализов объем реагента может быть соответствующим образом скорректирован.

Реакцию переэтерификации выполняют при температуре окружающей среды от 20 до 25 °C.

Примечание - Значение объема, указанное в скобках, соответствует раствору с массообъемной концентрацией метилата натрия 25%.

5.6 Цитрат натрия двузамещенный семиводный [HOC(COOH)(CH₂COONa)₂·1,5H₂O].

5.7 Хлорид натрия [NaCl].

5.8 Раствор для нейтрализации (цитрат натрия двузамещенный семиводный 10% об., хлорид натрия 15% об. в воде).

Взвешивают 50,0 г двузамещенного семиводного цитрата натрия и 75,0 г хлорида натрия в мерной колбе вместимостью 500 см3. Растворяют в 450 см3 воды с помощью магнитной мешалки. Удаляют магнитную мешалку, затем доводят до метки водой.

Раствор стабилен в течение одного месяца при хранении в темном месте при температуре 4 °C. В процессе хранения могут образовываться кристаллы соли, однако они исчезают после встряхивания.

Дожидаются, пока температура раствора станет комнатной. Полученного объема раствора достаточно для анализа примерно 40 образцов или более. В случае меньшего количества анализов (или одного анализа) масса и объем раствора могут быть соответствующим образом скорректированы.

5.9 Трет-бутилметиловый эфир (МТБЭ), для хроматографии.

5.10 Метил ундеканоат (C11:0 МЭЖК), с массовой долей основного вещества не менее 99%.

5.11 Тритридеканоин (C13:0 ТАГ), с массовой долей основного вещества не менее 99%.

5.12 C11:0 МЭЖК/C13:0 ТАГ стандартный раствор

В мерную колбу вместимостью 250 см3 взвешивают около 500 мг (с точностью до 0,1 мг) тритридеканоина и 500 мг метил ундеканоата. Растворяют и доводят до отметки МТБЭ.

Раствор стабилен в течение одной недели при хранении в темном месте при температуре 4 °C. Дожидаются, пока температура раствора станет комнатной. Полученного объема раствора достаточно для анализа примерно 40 образцов или более. В случае меньшего количества анализов можно соответствующим образом скорректировать навеску стандартов и объем растворителя.

5.13 Метиловые эфиры октадеценовой кислоты: смесь метиловых эфиров цис- и транс-изомеров C18:1: от транс-4- до транс-16-октадеценовой кислоты (все изомеры) и основные цис-изомеры. Концентрация 2,5 мг/см3 в метиленхлориде.

Примечание — Этот стандарт является коммерчески доступным <1>.

5.14 Метиловые эфиры линолевой кислоты: смесь метиловых эфиров цис- и транс-изомеров C18:2: транс-9, транс-12-октадекадиеновой кислоты (приблизительно 50%), цис-9, транс-12-октадекадиеновой кислоты (приблизительно 20%) транс-9, цис-12-октадекадиеновой кислоты (приблизительно 20%) и цис-9, цис-12-октадекадиеновой кислоты (приблизительно 10%). Концентрация 10 мг/см3 в метиленхлориде.

Примечание - Этот стандарт является коммерчески доступным <1>.

<1> Supelco Inc., торговая марка Sigma Aldrich, каталожный номер 40495-U и каталожный номер 47791, является примером подходящего продукта, доступного на коммерческой основе. Эта информация предоставляется для удобства пользователей этого стандарта. Возможно применение аналогичных продуктов, если может быть показано, что их использование приводит к получению таких же результатов.

5.15 Смесь метиловых эфиров цис- и транс-изомеров линоленовой кислоты (18:3), включающая:

• цис-9, цис-12, цис-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 3%),
• цис-9, цис-12, транс-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 7%),
• цис-9, транс-12, цис-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 7%),
• цис-9, транс-12, транс-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 15%),
• транс-9, цис-12, цис-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 7%),
• транс-9, цис-12, транс-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 15%),
• транс-9, транс-12, цис-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 15%) и
• транс-9, транс-12, транс-15-октадекатриеновой кислоты метиловый эфир (около 30%).

Концентрация 10 мг/см3 в метиленхлориде.

Примечание - Этот стандарт является коммерчески доступным <2>. Данный стандарт содержит все транс-изомеры C18:3 (всего восемь), но их количество и соотношения отличаются от наблюдаемых в рафинированных/дезодорированных маслах и жирах.

<2> Supelco Inc., торговая марка Sigma Aldrich, каталожный номер 47792, является примером подходящего продукта, доступного на коммерческой основе. Эта информация предоставляется для удобства пользователей этого стандарта. Возможно применение аналогичных продуктов, если может быть показано, что их использование приводит к получению таких же результатов.

5.16 Смесь метиловых эфиров конъюгированной октадекадиеновой кислоты: смесь цис-9, транс-11- и цис-10, транс-12-метилоктадекадиеноатов с чистотой не менее 99%.

Примечание - Этот стандарт является коммерчески доступным <3>. Этот стандарт содержит два основных изомера CLA, но соотношение изомеров может варьироваться от партии к партии.

<3> Supelco Inc., торговая марка Sigma Aldrich, каталожный номер 05507, является примером подходящего продукта, доступного на коммерческой основе. Эта информация предоставляется для удобства пользователей этого стандарта. Возможно применение аналогичных продуктов, если может быть показано, что их использование приводит к получению таких же результатов.

5.17 Стандартный раствор смеси цис- и транс-изомеров для качественного анализа.

Для определения времен удерживания (RT) цис- и транс-изомеров (т.е. C18:1, C18:2, C18:3 и CLA) подготавливают стандартный раствор для качественного анализа со стандартами, перечисленными в 5.13 - 5.16. Могут быть использованы любые стандарты, которые имеются в продаже. В мерную колбу вместимостью 50 см3 добавляют каждый стандартный раствор изомеров в равном соотношении. Добавляют гексан, растворяют и доводят до метки. Разбавляют в соответствии с типом используемого инжектора.

5.18 Калибровочный раствор стандартов МЭЖК

5.18.1 Приготовление из индивидуальных стандартов МЭЖК

5.18.1.1 Для приготовления калибровочного раствора используют следующие индивидуальные стандарты МЭЖК (чистотой не менее 99%):

• метиловый эфир масляной кислоты (C4:0);
• метиловый эфир капроновой кислоты (C6:0);
• метиловый эфир каприловой кислоты (C8:0);
• метиловый эфир каприновой кислоты (C10:0);
• метиловый эфир ундекановой кислоты (C11:0);
• метиловый эфир лауриновой кислоты (C12:0);
• метиловый эфир тридекановой кислоты (C13:0);
• метиловый эфир миристиновой кислоты (C14:0);
• метиловый эфир миристолеиновой кислоты (C14:1 цис-9 или n-5);
• метиловый эфир пентадекановой кислоты (C15:0);
• метиловый эфир цис-10-пентадеценовой кислоты (C15:1 цис-10 или n-5);
• метиловый эфир пальмитиновой кислоты (C16:0);
• метиловый эфир цис-9-пальмитолеиновой кислоты (C16:1 цис-9 или n-7);
• метиловый эфир гептадекановой кислоты (C17:0);
• метиловый эфир цис-10-гептадеценовой кислоты (C17:1 цис-10 или n-7);
• метиловый эфир стеариновой кислоты (C18:0);
• метиловый эфир элаидиновой кислоты (C18:1 транс-9 или n-9);
• метиловый эфир олеиновой кислоты (C18:1 цис-9 или n-9);
• метиловый эфир линолеидиновой кислоты (C18:2 все транс-9, 12 или n-6);
• метиловый эфир линолевой кислоты (C18:2 все цис-9, 12 или n-6);
• метиловый эфир арахидовой кислоты (C20:0);
• метиловый эфир гамма-линолевой кислоты (C18:3 все цис-6, 9, 12 или n-6);
• метиловый эфир цис-11-эйкозеновой кислоты (C20:1 цис-11 или n-9);
• метиловый эфир линоленовой кислоты (C18:3 все цис-9, 12, 15 или n-3);
• метиловый эфир генейкозановой кислоты (C21:0);
• метиловый эфир цис-11, 14-эйкозадиеновой кислоты (C20:2 все цис-11, 14 или n-6);
• метиловый эфир бегеновой кислоты (C22:0);
• метиловый эфир цис-8, 11, 14-эйкозатриеновой кислоты (C20:3 все цис-8, 11, 14 или n-6 цис);
• метиловый эфир эруковой кислоты (C22:1 цис-13 или n-9);
• метиловый эфир цис-11, 14, 17-эйкозатриеновой кислоты (C20:3 все цис-11, 14, 17 или n-3);
• метиловый эфир арахидоновой кислоты (C20:4 все цис-5, 8, 11, 14 или n-6);
• метиловый эфир цис-13, 16-докозадиеновой кислоты (C22:2 все цис-13, 16 или n-6);
• метиловый эфир лигноцериновой кислоты (C24:0);
• метиловый эфир цис-5, 8, 11, 14, 17-эйкозапентаеновой кислоты (C20:5 все цис-5, 8, 11, 14, 17 или n-3);
• метиловый эфир нервоновой кислоты (C24:1 цис-15 или n-9);
• метиловый эфир цис-4, 7, 10, 13, 16, 19-докозагексаеновой кислоты (C22:6 все цис-4, 7, 10, 13, 16, 19 или n-3).

Примечание - Приобретение отдельных стандартов МЭЖК является более дорогостоящим, чем стандартная смесь МЭЖК. Кроме того, индивидуальное взвешивание каждого стандарта МЭЖК может дать неточность и требует высокой точности взвешивания.

5.18.1.2 Стандартный раствор 1 — насыщенные МЭЖК

В мерную колбу вместимостью 100 см3 взвешивают около 25 мг (с точностью 0,1 мг) метилового эфира лигноцериновой кислоты (C24:0), 25 мг метилового эфира бегеновой кислоты (C22:0), 25 мг метилового эфира генейкозановой кислоты (C21:0), 25 мг метилового эфира арахидовой кислоты (C20:0), 25 мг метилового эфира стеариновой кислоты (C18:0), 25 мг метилового эфира гептадекановой кислоты (C17:0), 50 мг метилового эфира пальмитиновой кислоты (C16:0), 25 мг метилового эфира пентадекановой кислоты (C15:0), 25 мг метилового эфира миристиновой кислоты (C14:0), 25 мг метилового эфира тридекановой кислоты (C13:0), 25 мг лауриновой кислоты (C12:0), 25 мг метилового эфира каприновой кислоты (C10:0), 25 мг метилового эфира каприловой кислоты (C8:0), 25 мг метилового эфира ундекановой кислоты, 25 мг метилового эфира капроновой кислоты (C6:0) и 25 мг метилового эфира масляной кислоты (C4:0). Доводят до метки гексаном.

Пальмитиновую кислоту отвешивают в двойном количестве. Метиловые эфиры короткоцепочечных жирных кислот (т.е. C4:0, C6:0 и C8:0) являются летучими и отвешиваются в конце процедуры.

5.18.1.3 Стандартный раствор 2 — мононенасыщенные МЭЖК

В мерную колбу вместимостью 100 см3 аккуратно взвешивают около 25 мг (с точностью до 0,1 мг) метилового эфира нервоновой кислоты (C24:1 цис-15 или n-9), 25 мг метилового эфира эруковой кислоты (C22:1 цис-13 или n-9), 25 мг метилового эфира цис-11-эйкозеновой кислоты (C20:1 цис-11 или n-9), 25 мг метилового эфира олеиновой кислоты (C18:1 цис-9 или n-9), 25 мг метилового эфира элаидиновой кислоты (C18:1 транс-9 или n-9), 25 мг метилового эфира цис-10-гептадеценовой кислоты (C17:1 цис-10 или n-7), 25 мг пальмитолеиновой кислоты (C16:1 цис-9 или n-7), 25 мг метилового эфира цис-10-пентадеценовой кислоты (C15:1 цис-10 или n-5) и 25 мг метилового эфира миристолеиновой кислоты (C14:1 цис-9 или n-5). Доводят до метки н-гексаном.

5.18.1.4 Стандартный раствор 3 — полиненасыщенные МЭЖК

В мерную колбу вместимостью 100 см3 взвешивают около 25 мг (с точностью до 0,1 мг) метилового эфира линолеидиновой кислоты (C18:2 все транс-9, 12 или n-6), 25 мг метилового эфира линолевой кислоты (C18:2 все цис-9, 12 или n-6), 25 мг метилового эфира гамма-линолевой кислоты (C18:3 все цис-9, 12 или n-6), 25 мг метилового эфира линоленовой кислоты (C18:3 все цис-12, 15 или n-3), 25 мг метилового эфира цис-11, 14-эйкозадиеновой кислоты (C20:2 все цис-11, 14 или n-6), 25 мг метилового эфира цис-8, 11, 14-эйкозатриеновой кислоты (C20:3 все цис-8, 11, 14 или n-6), 25 мг метилового эфира цис-11, 14, 17-эйкозатриеновой кислоты (C20:3 все цис-11, 14, 17 или n-3), 25 мг метилового эфира арахидоновой кислоты (C20:4 все цис-5, 8, 11, 14 или n-6), 25 мг метилового эфира цис-13, 16-докозадиеновой кислоты (C22:2 все цис-13, 16 или n-6), 25 мг метилового эфира цис-5, 8, 11, 14, 17-эйкозапентаеновой кислоты (C20:5 все цис-5, 8, 11, 14, 17 или n-3) и 25 мг метилового эфира цис-4, 7, 10, 13, 16, 19-докозагексаеновой кислоты (C22:6 все цис-4, 7, 10, 13, 16, 19 или n-3). Доводят до метки н-гексаном.

5.18.1.5 Подготовка калибровочного раствора стандартов МЭЖК

В мерную колбу вместимостью 100 см3 пипеткой вносят 25,0 см3 исходного раствора калибровочного стандартного раствора 1 (по 5.18.1.2), 25,0 см3 исходного раствора калибровочного стандартного раствора 2 (по 5.18.1.3) и 25,0 см3 калибровочного стандартного раствора 3 (по 5.18.1.4). Затем доводят до метки н-гексаном. Разбавляют в соответствии с типом используемого инжектора.

Раствор стабилен в течение примерно шести месяцев при хранении в темном месте при температуре минус 20 °C. Чтобы предотвратить загрязнение стандартного раствора, раствор разливают в разные флаконы (готовые к инъекции) и хранят их при температуре минус 20 °C перед использованием. Каждый флакон используют только один раз, затем выбрасывают.

5.18.2 Приготовление из стандартной смеси МЭЖК

5.18.2.1 Стандартная смесь МЭЖК для количественного анализа

Приобретают стандартную смесь МЭЖК <1>.

<1> Nu-Check-Prep, каталожный номер GLC-Nestle36, является примером подходящего продукта, доступного на коммерческой основе. Эта информация предоставляется для удобства пользователей настоящего стандарта. Возможно применение аналогичных продуктов, если может быть показано, что их использование приводит к получению таких же результатов.

Стандартная калибровочная смесь МЭЖК изготавливается поставщиком путем точного дозирования по массе. Массовая доля в процентах каждого компонента указана в сопроводительном сертификате. Каждая ампула содержит приблизительно 100 мг стандартной смеси МЭЖК для калибровки. Все индивидуальные стандарты МЭЖК содержатся в равных соотношениях в стандартной смеси, за исключением метилового эфира пальмитиновой кислоты (C16:0), который добавляется в двойном количестве.

5.18.2.2 Приготовление калибровочной смеси стандартов МЭЖК

Перед использованием дожидаются нагрева ампулы до комнатной температуры (не более 25 °C) в темном месте без дополнительного нагревания. Вскрывают ампулу стеклянным ножом, используя пипетку Пастера, быстро переносят содержимое ампулы в предварительно тарированную мерную колбу вместимостью 50 см3, взвешивают и доводят до метки н-гексаном. Разбавляют в соответствии с типом используемого инжектора.

Раствор стабилен в течение примерно шести месяцев при хранении в темном месте при температуре минус 20 °C. Чтобы предотвратить загрязнение стандартного раствора, разливают раствор в разные флаконы (готовые к инъекции) и хранят их при температуре минус 20 °C перед использованием. Каждый флакон используют только один раз, затем выбрасывают.

6 Оборудование и лабораторная посуда

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Поскольку определение связано с использованием летучих легковоспламеняющихся растворителей, все используемые электрические приборы должны соответствовать законодательству, касающемуся опасностей при использовании таких растворителей.

6.1 Аналитические весы, подходящие для взвешивания навесок около 1 мг, с точностью 0,1 мг.

6.2 Мерные колбы вместимостью 50, 100, 250, 300 и 500 см3.

6.3 Пипетки с одной меткой вместимостью 2, 5, 10, 25 и 50 см3, класс AS (ISO 1042).

6.4 Пипетки с двумя метками вместимостью 2 и 5 см3 класса AS (ISO 1042).

6.5 Микропипетка вместимостью 200 мм3.

6.6 Дозаторы вместимостью 2, 5 и 10 см3.

6.7 Пробирка диаметром 26 мм, длиной 100 мм, с резьбовой крышкой с вкладкой из фторопласта.

6.8 Миксер типа «вортекс» для пробирок или аналогичный.

6.9 Лабораторная центрифуга, оснащенная адаптерами для пробирок с наружным диаметром 26 мм.

6.10 Газожидкостный хроматограф, оснащенный пламенно-ионизационным детектором и инжектором с делением или без деления потока. Автосемплер и система для интегрирования, предпочтительно управляемые с помощью компьютера.

Рекомендуется использование максимально чистой посуды и крышек во избежание появления примесей на хроматограмме МЭЖК.

6.10.1 Газ-носитель, водород или гелий, чистотой не менее 99,9997%.

Примечание - Использование водорода или гелия в качестве газа-носителя влияет главным образом на продолжительность хроматографии (т.е. при использовании гелия время анализа увеличивается с 10 до 15 мин), но не оказывает существенного влияния на хроматографическое разрешение при оптимизированных условиях.

Другие газы, необходимые для детектора (FID), должны быть свободны от органических примесей (т.е. содержание углеводородов должно быть менее 1 млн-1) и иметь чистоту не менее 99,995%. Возможно использование синтетического или сжатого воздуха. Также возможно использование газогенератора.

6.10.2 Капиллярная колонка с цианопропилполисилоксаном в качестве неподвижной фазы или его эквивалентом (длина 100 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,2 мкм), при использовании которого элюирование МЭЖК происходит главным образом по длине углеродной цепи, а также в зависимости от количества двойных связей.

Следовые количества кислорода и влаги могут повредить полярную фазу колонки. Если чистый газ недоступен, используют фильтрующее устройство для очистки газа.

6.10.3 Пламенно-ионизационный детектор, с возможностью нагрева до температуры на 50 °C выше конечной температуры в термостате колонки.

6.10.4 Инжектор с делением или без деления потока, способный нагреваться до температуры 30 °C выше конечной температуры термостата колонки.

6.10.5 Инжектор для ввода проб непосредственно в колонку, который может быть не нагретым (холодным) или нагретым до температуры на 30 °C выше конечной температуры в термостате колонки.

Примечание - На одном приборе GC достаточно установить один инжектор (т.е. с делением или без деления потока или инжектор для ввода проб непосредственно в колонку).

6.10.6 Шприц для ввода проб вместимостью 10 мм3.

6.10.7 Система для интегрирования.

6.11 Условия газовой хроматографии

Температура термостата и поток газа-носителя зависят от выбранной колонки и от используемого газа-носителя (т.е. водорода или гелия). Выбранные условия должны обеспечить разделение между цис- и транс-зонами для C18:1, C18:2, C18:3 и конъюгированных линолевых кислот (CLA), как показано в приложении B, рисунки B.1, B.2 и B.3.

Примеры в 6.11.1 и 6.11.2 перечисляют применимые условия для правильного разделения и идентификации цис- и транс-изомеров.

6.11.1 Пример 1. Режим ввода с делением потока

Колонка: длина 100 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,2 мкм, капиллярная колонка из плавленого кварца.

Неподвижная фаза: цианопропилполисилоксан.

Тип газа-носителя: гелий.

Давление газа носителя в колонке: 225 кПа (175 — 225 кПа).

Скорость деления потока: 25,5 см3/мин.

Коэффициент разделения потока: 10:1.

Температура инжектора: 250 °C.

Температура детектора: 275 °C.

Программа температуры термостата: начальная температура 60 °C, выдерживается в течение 5 мин, повышается со скоростью 15 °C мин-1 до 165 °C, выдерживается при этой температуре в течение 1 мин и затем поднимается со скоростью 2 °C мин-1 до 225 °C в течение 20 мин.

Количество вводимой пробы: 1,0 мм3.

Пример полного ГЖХ-профиля МЭЖК, полученного с этими условиями, показан на рисунке B.4 (приложение B).

6.11.2 Пример 2. Режим прямого ввода в колонку

Колонка: длина 100 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,2 мкм, капиллярная колонка из плавленого кварца.

Неподвижная фаза: цианопропилполисилоксан.

Тип газа-носителя: водород.

Давление газа в начале колонки: 210 кПа (175 — 225 кПа).

Температура инжектора: «холодный» инжектор.

Температура детектора: 275 °C.

Программа температуры термостата: начальная температура 60 °C, выдерживается в течение 5 мин, повышается со скоростью 15 °C мин-1 до 165 °C, выдерживается при этой температуре в течение 1 мин и затем поднимается со скоростью 2 °C мин-1 до 225 °C в течение 17 мин.

Количество вводимой пробы: 1,0 мм3.

Пример полного ГЖХ-профиля МЭЖК, полученного с этими условиями, показан на рисунке B.5 (приложение B).

6.12 Разрешение между цис- и транс-изомерами C18:1

Разрешение определяют с введением стандартного раствора смеси цис- и транс-изомеров C18:1 МЭЖК для качественного анализа (по 5.17).

Вводят в газовый хроматограф 1,0 мм3 калибровочного раствора (см. 5.13). Определяют ширину пика на половине высоты и расстояние между левым краем хроматограммы и вершиной пика для транс-13/14 C18:1 и цис-9 C18:1 (метиловый эфир олеиновой кислоты). Критерий разрешения R вычисляют по формуле

R = 1,18 \cdot (t_{R2} - t_{R1})/(W(_{\frac{1}{2}})_{1} + W(_{\frac{1}{2}})2) , (1)

где tR₁ - расстояние в сантиметрах между левым краем хроматограммы и вершиной пика 1 (транс-13/14 C18:1);

tR₂ - расстояние в сантиметрах между левым краем хроматограммы и вершиной пика 2 (цис-9 C18:1).

W(_{\frac{1}{2}})1 — ширина пика в сантиметрах на половине высоты пика 1 (транс-13/14 C18:1);

W(_{\frac{1}{2}})2 — ширина пика в сантиметрах на половине высоты пика 2 (цис-9 C18:1).

Разрешение считается достаточным, когда критерий R составляет не менее (1,00 +/- 5)% (см. приложение B, рисунок B.3).

Примечание - В случае недостаточного разрешения, но с R, близким к целевому значению, тонкая настройка условий хроматографии (т.е. незначительная модификация давления, или скорости потока газа-носителя, или температурной программы термостата) может дать приемлемое значение R.

7 Отбор проб

Важно, чтобы лаборатория получила образец, который является репрезентативным и не был поврежден или изменен во время транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, указанного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приводится в [1].

8 Подготовка испытуемого образца

8.1 Жидкое и сухое молоко и детское питание с содержанием жира более 1,5% по массе

Доводят образец до комнатной температуры и энергично встряхивают перед использованием. Убеждаются, что образец является однородным (т.е. хорошо перемешивают).

8.2 Жидкое и сухое молоко и детское питание с содержанием жира менее 1,5% по массе

Доводят образец до комнатной температуры и энергично встряхивают перед использованием. Убеждаются, что образец является однородным (т.е. хорошо перемешивают).

Извлекают жир в соответствии с ISO 14156/IDF 172, обращая внимание на полное выпаривание экстракционного(ых) растворителя(ей) путем нагревания до температуры не выше 40 °C во избежание разложения длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ДЦ-ПНЖК).

Примечание — См. также [2], [3], [6] и [7] для получения подходящих инструкций по методам извлечения жира.

8.3 Сыр

Доводят образец до комнатной температуры. Убеждаются, что образец является однородным (т.е. хорошо перемешивают).

Извлечение жира проводят в соответствии с ISO 1735/IDF 5, обращая внимание на полное удаление экстракционного растворителя путем нагревания жира до температуры не выше 60 °C.

Проверяют кислотность жира в соответствии с ISO 1740/IDF 6 (критерий приемлемости не более 1 ммоль/100 г жира).

Примечание - В присутствии метанольного метилата натрия свободные жирные кислоты не превращаются в метиловые эфиры (МЭЖК). В случае более высокой кислотности (т.е. свободных жирных кислот) не проводится количественная оценка этих жирных кислот с другими.

9 Проведение испытания

9.1 Подготовка пробы

В центрифужную пробирку вместимостью 25 см3 с завинчивающейся крышкой взвешивают с точностью до 0,1 мг такое количества пробы (по 8.1), чтобы в пробирке содержалось приблизительно 50 мг жира (например, для пробы, содержащей 26 г жира на 100 г продукта, соответствующая масса навески составляет приблизительно 190 мг).

Примечание - Для анализа жирных кислот в жире, извлеченном из пищевых продуктов, требуется такое же количество жира (т.е. примерно 50 мг).

Для порошкообразной пробы добавляют 2,0 см3 воды с помощью микропипетки. Для жидкой пробы добавление воды не требуется. Закрывают пробирку, затем аккуратно растворяют пробу, используя вортекс-миксер. Оставляют на 15 мин при комнатной температуре.

Для жира, выделенного из продукта (по 8.2 и 8.3), берут навеску 50 мг (с точностью до 0,1 мг) расплавленного жира в центрифужную пробирку вместимостью 25 см3. Для анализа жирных кислот в образце жира добавление воды не требуется.

Вносят 5 см3 раствора внутреннего стандарта (по 5.12). Добавляют пипеткой 5 см3 5% (массообъемная концентрация) метанольного раствора метилата натрия (по 5.5). Время переэтерификации начинается с добавления первой капли реагента. Герметично закрывают пробирку и хорошо перемешивают в течение 10 с, используя вортекс-миксер.

Через 180 с после начала процесса открывают пробирку и добавляют 2 см3 гексана. Через 210 с после начала прибавляют 10 см3 раствора двузамещенного цитрата натрия и водного раствора хлорида натрия (по 5.8). Время переэтерификации заканчивается после добавления последней капли раствора для нейтрализации. Тщательно перемешивают на вортекс-миксере в течение 30 с. Время переэтерификации не должно превышать 240 с.

Примечание - Важно соблюдать время переэтерификации (240 с). В этих условиях число пробирок не может превышать шести одновременно. Устройство для быстрого дозирования (дозатор) может использоваться для добавления реагентов, но не для добавления внутреннего стандартного раствора, которое требует высокой точности.

Центрифугируют пробирки при 1750 оборотах в минуту [что эквивалентно g = (375 +/- 25)] в течение 5 мин.

В мерную колбу вместимостью 10 см3 добавляют пипеткой 200 мм3 надосадочной жидкости и доводят до метки н-гексаном.

Примечания

1 Коэффициент разбавления рассчитывают только при введении с прямым вводом и без деления потока. При использовании ввода с делением потока уменьшают разбавление до получения желаемых интенсивностей пиков в соответствии с используемым коэффициентом разделения (особое внимание обращают на достаточный и точный уровень детектирования для небольших пиков). Разбавленный раствор образца стабилен в течение двух дней при хранении в темном месте при температуре 4 °C.

2 В хроматограмме образца иногда наблюдают «холм» на базовой линии между пиком растворителя и элюируемым C6:0; это явление вызвано возможным присутствием следовых количеств воды, попавшей в растворитель МТБЭ во время подготовки образца. «Холм» может быть легко удален с хроматограммы добавлением нескольких мг CaCl2 в разбавленный раствор образца перед вводом в ГЖХ.

9.2 Количественное определение

9.2.1 Определение факторов отклика

Трижды вводят 1 мм3 калибровочного раствора (см. 5.18.1.5 или 5.18.2.2).

9.2.2 Исследование анализируемой пробы

Вводят 1 мм3 анализируемой пробы (по 9.1) в газовый хроматограф, применяя те же условия, что и для калибровочного раствора стандартов МЭЖК.

9.2.3 Идентификация жирных кислот

Идентифицируют жирные кислоты на хроматограмме раствора образца, сравнивая времена их удерживания с соответствующими значениями для пиков в стандартном калибровочном растворе (по 5.18) и в качественной стандартном растворе для качественного анализа, содержащем все изомеры ТЖК и CLA (см. 5.13 и 5.17).

Идентификация C18:1 ТЖК

Идентифицируют и группируют все транс-изомеры C18:1 (включая также площадь пика транс-16 C18:1, элюируемого в области цис-C18:1 хроматограммы сразу после цис-9 C18:1 или n-9) в соответствии с приложением B, рисунками B.1 или B.2.

Примечание - Когда присутствует молочный жир, два транс-изомера C18:1 элюируются в области цис-C18:1 (C18:1 транс-15 и C18:1 транс-16), но на капиллярной колонке длиной 100 м выделяется только один изомер (C18:1 транс-16). Второй изомер (C18:1 транс-15), как правило, перекрывается пиком олеиновой кислоты (C18:1 цис-9), и количественная оценка его площади возможна только при использовании предварительного разделения (т.е. ТСХ А+, ВЭЖХ А+) с последующим капиллярным ГЖХ-анализом. Согласно последним данным, было продемонстрировано отсутствие существенной разницы в суммарном количестве C18:1 ТЖК при исключении площади пика C18:1 транс-15 (неразделенный пик) из суммы по сравнению с результатом, полученным после предварительных методов разделения с последующим капиллярным анализом ГЖХ. Часть этого феномена объясняется присутствием некоторых цис-изомеров C18:1 (т.е. цис-6-8), которые элюируются в транс-области C18:1 и, следовательно, добавляются косвенно к сумме ТЖК C18:1. Вклад этих изомеров в сумму ТЖК C18:1 компенсирует тот факт, что C18:1 транс-15 не принимается во внимание.

Идентификация C18:2 ТЖК

Идентифицируют и группируют все транс-изомеры линолевой кислоты (см. приложение B, рисунки B.1, B.2 и B.6). Включают все транс-изомеры, присутствующие в образце молочного жира, в сумму ТЖК C18:2, как показано на рисунках B.1 и B.2.

Идентификация C18:3 ТЖК

Идентифицируют и группируют все ТЖК линоленовой кислоты (см. приложение B, рисунки B.1, B.2 и B.6).

Примечания

1 В случае присутствия в образце молочного жира и/или рыбного жира другой изомер C20:1 элюируется непосредственно перед C20:1 цис-11 (или n-9). В зависимости от разрешения колонки время удерживания этой жирной кислоты может также соответствовать транс-изомеру C18:3 (т.е. C18:3 цис-9, транс-12, цис-15 или C18:3 транс-9, цис-12, цис-15). Когда в соответствующей зоне ТЖК C18:3 имеется только один пик, его правильная идентификация соответствует изомеру C20:1. Когда два, три или четыре пика встречаются в соответствующей зоне для ТЖК C18:3, каждый пик включают в сумму площадей ТЖК C18:3 (см. порядок элюирования и правила группировки ниже). Также могут наблюдаться интерференции между изомерами ТЖК C18:3 [т.е. C18:3 цис-9, цис-12, транс-15; цис-9, транс-12, цис-15 или C18:3 транс-9, цис-12, цис-15 и C20:1 цис-11 (или n-9)]. C20:1 цис-11 (или n-9) может элюироваться с C18:3 цис-9, транс-12, цис-15 (минорный транс-изомер C18:3), но его вклад в общую концентрацию ТЖК C18:3 пренебрежимо мал. Однако если C20:1 цис-11 (или n-9) интерферирует с C18:3 цис-9, цис-12, транс-12 или с C18:3 транс-9, цис-12, цис-15, условия могут быть слегка изменены, чтобы получить достаточное разделение. Интерференция может также быть обнаружена, когда наблюдается неправильное соотношение между C18:3 цис-9, цис-12, транс-15 и C18:3 транс-9, цис-12, цис-15 (соотношение между этими изомерами всегда близко к 5:4).

2 Кинетика образования транс-изомеров C18:3 в рафинированных и дезодорированных маслах была проанализирована с использованием высокополярной капиллярной колонки и хорошо описана в литературе. Они могут использоваться в качестве подтверждающего инструмента для проверки присутствия транс-изомеров C18:3. Чаще всего встречается максимум четыре транс-изомера C18:3.

Вариант 1 — отсутствие изомеров ТЖК C18:3

Нет пика (если обнаружен только один пик, см. комментарий выше о присутствии другого изомера C20:1 в молоке). Наличие одного транс-изомера C18:3 невозможно.

Вариант 2 — присутствие двух изомеров ТЖК C18:3 (C18:3 цис-9, цис-12, транс-15 и C18:3 транс-9, цис-12, цис-15)

Площадь пика C18:3 транс-9, цис-12, цис-15 составляет приблизительно 80% от площади пика C18:3 цис-9, цис-12, транс-15 (или соотношение 5:4). Это отношение всегда является постоянным, когда присутствуют другие транс-изомеры C18:3.

Вариант 3 — наличие трех изомеров ТЖК C18:3 (C18:3 цис-9, цис-12, транс-15; C18:3 цис-9, транс-12, цис-15 C18:3 и транс-9, цис-12, цис-15)

То же, что описано выше для случая 2 (два изомера), но с присутствием C18:3 цис-9, транс-12, цис-15. Площадь пика этого транс-изомера всегда мала, а иногда ниже, чем предел количественного определения (LOQ). В случае совместного элюирования этого транс-изомера с C20:1 цис-11 (n-9) или с другим изомером C20:1 его вклад в сумму ТЖК C18:3 является незначительным.

Вариант 4 — присутствие четырех изомеров ТЖК C18:3 (C18:3 транс-9, цис-12, транс-15; C18:3 цис-9, цис-12, транс-15; C18:3 цис-9, транс-12, цис-15 и C18:3 транс-9, цис-12, цис-15).

То же, что описано выше для случая 3 (три транс-изомера), но с C18:3 транс-9, цис-12, транс-15. Этот изомер образуется при частичной деградации C18:3 цис-9, цис-12, транс-15 и C18:3 транс-9, цис-12, цис-15 (первые два транс-изомера C18:3 встречаются в дезодорированных растительные масла). Когда его количество составляет не менее 50% от площади пика C18:3 цис-9, цис-12, транс-15, можно предположить наличие других транс-изомеров C18:3 и указывать на аномальные условия дезодорации масла (т.е. высокая температура и/или выдержка). См. также приложение B, рисунок B.6, где показан реальный пример образца детского питания, содержащего ТЖК C18:2 и ТЖК C18:3, появляющихся из дезодорированных растительных масел.

Присутствие других транс-изомеров C18:3 может быть подтверждено введением качественной стандартной смеси (см. 5.17).

Для выражения результатов по содержанию ТЖК используют следующие термины:

• ТЖК C18:1 представляет собой сумму транс-позиционных изомеров C18:1;
• ТЖК C18:2 представляет собой сумму транс-изомеров C18:2 (линолевая кислота) в дезодорированных маслах (т.е. C18:2 транс-9, транс-12; C18:2 цис-9, транс-12 и C18:2 транс-9, 12) и в молочном жире (т.е. C18:2 цис-9, транс-13; C18:2 транс-8, цис-12 и C18:2 транс-11, цис-15);
• ТЖК C18:3 представляет собой сумму транс-изомеров C18:3 (линоленовая кислота) в дезодорированных маслах (транс-9, цис-12, транс-15, цис-9, цис-12, транс-15, цис-9, транс-12, цис-15 и транс-9, цис-12, цис-15);
• совокупность ТЖК представляет собой сумму C18:1 ТЖК, C18:2 ТЖК и C18:3 ТЖК.

Примечания

1 Метод предназначен для количественного определения всех ТЖК в пищевых продуктах (т.е. продуктов, происходящих от жвачных животных, процесса гидрирования и/или дезодорации масла). Этот способ не предназначен для определения происхождения ТЖК C18:1 и C18:2 (т.е. натуральных ТЖК или ТЖК искусственного происхождения) в сложных пищевых продуктах, содержащих ТЖК различной природы (т.е. жира от жвачных животных, гидрированного и дезодорированного растительного масла). Оценка может быть проведена с использованием распределения и/или отношения транс-изомеров C18:1 (т.е. C18:1 транс-9 и C18:1 транс-11) в присутствии ТЖК C18:2 и C18:3, образующихся в процессе дезодорации, а также учитывая распределение/количество некоторых жирных кислот в полном профиле жирных кислот. Количественное определение ТЖК, имеющих разное происхождение, является более точным при анализе отдельных ингредиентов.

2 Жирные кислоты с разветвленной цепью (т.е. насыщенные изо- и антеизо-метил-разветвленные жирные кислоты) также присутствуют в молочных жирах, они элюируются с другими текущими жирными кислотами. В чистых молочных жирах разветвленные жирные кислоты, которые наиболее часто встречаются, содержат от 14 до 17 атомов углерода в цепи и составляют от 1 до 2% в профиле молочного жира. Таким образом, эта категория жирных кислот в стандарте не рассматривается. Тем не менее соответствующие площади пиков этих жирных кислот и/или других неидентифицированных жирных кислот могут быть добавлены в сумму «других жирных кислот» (ДЖК). Для их количественного определения может быть использован коэффициент отклика, являющийся средним значением коэффициентов отклика (от C12:0 до C24:0). Для получения дополнительной информации см. приложение B, рисунок B.7.

10 Расчет и оформление результатов

10.1 Расчет

10.1.1 Расчет коэффициента отклика

Определяют площадь пиков, относящихся к каждому метиловому эфиру жирной кислоты, присутствующему в введенной калибровочной стандартной смеси (по 9.2.1), и рассчитывают их соответствующие коэффициенты отклика (Rfi) по отношению к внутреннему стандарту (C11:0) по формуле

Rf_{i} = \frac{m_{i}\prime \cdot A_{0}\prime}{m_{0}\prime \cdot A_{i}\prime} , (2)

где m_{i}\prime — массовая доля МЭЖКi в стандартном калибровочном растворе (по 5.18.1.5 или 5.18.2.2);

A_{0}\prime — площадь пика C11:0 на хроматограмме стандартного калибровочного раствора;

m_{0}\prime — масса C11:0 в стандартном калибровочном растворе (по 5.18.1.5 или 5.18.2.2);

A_{i}\prime — площадь пика МЭЖКi на хроматограмме стандартного калибровочного раствора.

Вариация между тремя инъекциями является оптимальной, когда коэффициенты вариации составляют менее 2%. Пример расчета приведен на рисунке B.8 (приложение B).

Примечание - Коэффициенты отклика, рассчитанные для C18:2 цис-9, 12 (или n-6), могут быть применены для C18:2 CLA (цис-9, транс-11), а рассчитанные для C18:3 цис-9, 12, 15 (n-3) можно применять для транс-изомеров C18:3.

10.1.2 Содержание жирных кислот в продукте

Рассчитывают массовую долю отдельных компонентов, выраженную в г ЖКi/100 г продукта в анализируемой пробе, по формуле

\text{г ЖК}_{i}/100\text{г продукта} = \frac{m_{0} \cdot A_{i} \cdot Rf_{i} \cdot S_{i}(\text{ЖК }) \cdot 100}{A_{0} \cdot m} , (3)

где m0 — масса внутреннего стандарта C11:0, в миллиграммах, добавленного к раствору пробы;

Ai — площадь пика МЭЖКi на хроматограмме пробы;

Rfi — коэффициент отклика, рассчитанный в соответствии с 10.1.1;

Si(ЖК) — стехиометрический фактор для преобразования МЭЖКi в ЖКi (см. приложение B, таблица B.1);

A0 — площадь пика внутреннего стандарта C11:0 на хроматограмме пробы;

m — масса анализируемой пробы, в миллиграммах.

Пример расчета приведен на рисунке B.9 (см. приложение B).

Примечания

1 В случае анализа жирных кислот, определенных в жире, экстрагированном из продуктов, масса анализируемой пробы m соответствует жиру, а не продукту. Следовательно, результаты по жирным кислотам, рассчитанные по данной формуле, выражаются в г ЖК/100 г жира, а не в г ЖК/100 г продукта. Результаты, полученные в г ЖК/100 г жира, можно преобразовать в г ЖК/100 г продукта с показателем извлечения жира (г/100 г), определенным с помощью соответствующего валидированного метода экстракции. Декларируемое содержание жира может быть неточным по сравнению с показателем извлечения жира, и его использование не рекомендуется для выражения жирных кислот в готовых продуктах.

2 Площади пиков, соответствующие неидентифицированным жирным кислотам, можно суммировать и сообщать как сумму других жирных кислот. Доля этих жирных кислот может варьировать от 0 г/100 г до 5 г/100 г жира (т.е. в молочном жире) и, следовательно, может вносить вклад в сумму всех жирных кислот. Пики, соответствующие примесям (материалы и химикаты, примеси в образцах или посторонние пики, появляющиеся в процессе хроматографирования), никогда не следует включать в сумму ДЖК.

10.1.3 Жирные кислоты в общем жире

Вычисляют массовую долю отдельных компонентов, выраженную в г ЖКi/100 г жира в анализируемой пробе, по формуле

\text{г ЖК}_{i}/100\text{г жира} = \frac{\text{г ЖК}_{i}/100\text{г продукта} \cdot 100}{\%\text{жира}} . (4)

Этот расчет может быть выполнен только тогда, когда содержание жира определялось с помощью соответствующего валидированного метода экстракции. Не допускается использовать декларированный показатель содержания жира для выражения содержания жирных кислот в готовых продуктах.

10.1.4 Сумма класса или группы жирных кислот в 100 г продукта

Рассчитывают массовую долю всех жирных кислот, соответствующих классу или группе, в соответствии с таблицей A.1 приложения A путем простого добавления результатов индивидуальных жирных кислот (выраженных в г ЖК/100 г продукта) по формуле

\sum \text{ЖК } = \frac{\sum_{i = 1}^{n} \text{г ЖК}_{i}}{100\text{г продукта}} . (5)

10.1.5 Сумма класса или группы жирных кислот в 100 г жира

Рассчитывают массовую долю всех жирных кислот, соответствующих классу или группе, в соответствии с таблицей A.1 приложения A путем простого добавления результатов по индивидуальным жирным кислотам (выраженных в г ЖК/100 г жира) по формуле

\sum \text{ЖК } = \sum_{i = 1}^{n} \frac{\text{г ЖК}_{i}}{100\text{г жира}} . (6)

10.1.6 Эффективность переэтерификации

Записывают площади двух внутренних стандартных пиков (метил ундеканоат и тритридеканоин) в анализируемых образцах.

Полноту переэтерификации, выраженную в процентах, Pt рассчитывают на основе открываемости тритридеканоина как второго внутреннего стандарта по формуле

Pt = \frac{m_{c11} \cdot A_{c13} \cdot R_{c13} \cdot S_{c13}(\text{ТАГ})}{A_{c11} \cdot m_{c13}} \cdot 100 , (7)

где mc11 — масса в миллиграммах внутреннего стандарта C11:0, добавленного к раствору;

Ac13 — площадь пика внутреннего стандарта C13:0 на хроматограмме;

Rc13 — коэффициент отклика C13:0 относительно C11:0, рассчитанный согласно 10.1.1;

Sc13 — стехиометрический коэффициент для преобразования C13:0 МЭЖК в C13:0 ТАГ (см. приложение B, таблица B.1);

Ac11 — площадь пика внутреннего стандарта C11:0 на хроматограмме;

mc13 — масса в миллиграммах внутреннего стандарта ТАГ C13:0, добавленного к раствору.

Полнота переэтерификации, выраженная как значение открываемое тритридеканоина (C13:0 ТАГ), должна составлять (100,0 +/- 2,0)%. Когда полнота переэтерификации составляет более 102,0% или менее 98,0%, причиной проблемы может быть следующее:

• неполная переэтерификация (т.е. проблема с реагентом/стандартным веществом);
• частичная деградация внутреннего стандарта (стандартов) или проблема их чистоты/стабильности;
• проблема матричного эффекта образца.

Примечание - Анализ эталонного образца может помочь определить, возникает проблема из-за реагентов и/или стандартных веществ или анализируемой пробы.

10.2 Оформление результатов

Результаты, выраженные в г/100 г, записывают с точностью до трех знаков после запятой, результаты, выраженные в мг/100 г, записывают с точностью до одного десятичного знака.

Примечание - Результаты по жирным кислотам, выраженные в г (или мг)/100 г продукта, могут быть преобразованы в другие форматы результатов г (или мг) жирных кислот/100 г жира в соответствии с нормативными документами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

11 Точность

11.1 Межлабораторные испытания

Подробная информация о межлабораторных испытаниях, организованных и разработанных в соответствии с [4] и [5], посвященных точности метода, приведена в приложении C.

Значения пределов повторяемости и воспроизводимости выражаются для уровня вероятности 95% и могут не применяться к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от указанных.

11.2 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми результатами одного теста, полученными с использованием одного и того же метода на идентичном тестовом материале в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого интервала времени, не более чем в 5% случаев должна быть больше значения r, указанного в таблицах C.1 и C.2 приложения C.

11.3 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми результатами одного теста, полученными с использованием одного и того же метода на идентичном испытательном материале в разных лабораториях с разными операторами, использующими различное оборудование, должна быть не более чем в 5% случаев больше значения R, указанного в таблицах C.1 и C.2 приложения C.

11.4 Предел обнаружения

В описанных условиях (чувствительность детектора, шум, разбавление образца и т.д.) оцененный предел обнаружения, выраженный как тройное стандартное отклонение фонового сигнала (шума), составляет около 0,0003 г/100 г продукта.

11.5 Предел количественного определения

Предел количественного определения для каждой жирной кислоты составляет около 0,001 г/100 г продукта. Предел количественной оценки соответствует самому низкому уровню, на котором рассчитывалась робастная повторяемость с удовлетворительными результатами.

12 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать как минимум следующую информацию:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) используемый метод отбора проб, если он известен, со ссылкой на данный стандарт;

c) использованный метод исследований вместе со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все рабочие детали, не указанные в настоящем стандарте или считающиеся опциональными, вместе с подробными сведениями о любых инцидентах, которые могли повлиять на результат(ы) испытаний;

e) полученный(е) результат(ы) испытаний.

Приложение A (справочное)

ГРУППЫ ИЛИ КЛАССЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ

A.1 Группы или классы жирных кислот

A.1.1 Транс-изомеры жирных кислот

Транс-изомеры жирных кислот (ТЖК) представляют собой сумму жирных кислот, содержащих одну или более не конъюгированных двойных связей в транс-конфигурации (только C18:1-, C18:2- и C18:3-транс включаются в сумму).

Примечание - В литературе сообщается о наличии других транс-изомеров, естественным образом содержащихся в молочном жире (например, C16:1-транс), однако их вклад не оказывает значимого влияния на общее количество транс-изомеров жирных кислот в молочных продуктах. Кроме того, их идентификация затруднительна, так как данные изомеры часто подвержены взаимным наложениям с другими изомерами жирных кислот (например, цис- изо- и антеизо-) и, таким образом, нуждаются в предварительном разделении или разделении при особых хроматографических условиях.

A.1.2 Конъюгированные линолевые кислоты

Конъюгированные линолевые кислоты (CLA) — это сумма октадекадиеновых кислот, содержащих конъюгированные двойные связи в цис- или транс-конфигурации; главным образом цис-9, транс-11-октадекадиеновая кислота (т.е. руменовая кислота). CLA не включена в сумму ТЖК.

A.1.3 Насыщенные жирные кислоты

Насыщенные жирные кислоты (НЖК) представляют собой сумму всех жирных кислот без двойных связей.

A.1.4 Мононенасыщенные жирные кислоты

Мононенасыщенные жирные кислоты (МНЖК) представляют собой сумму всех жирных кислот, содержащих одну двойную связь в цис-конфигурации.

A.1.5 Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК)

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) представляют собой сумму всех жирных кислот, содержащих две или более двойных связей в цис-конфигурации.

Примечание - ДЦ-ПНЖК является общим названием для описания длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот. Эти жирные кислоты также включены в ПНЖК (т.е. арахидоновая, эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислоты).

A.1.6 Омега-3 жирные кислоты

Омега-3 жирные кислоты представляют собой сумму цис-полиненасыщенных жирных кислот, в которых первая двойная связь находится у n-3 (\omega - 3) атома углерода, считая от концевой метильной группы.

A.1.7 Омега-6 жирные кислоты

Омега-6 жирные кислоты представляют собой сумму цис-полиненасыщенных жирных кислот, в которых первая двойная связь находится у n-6 (\omega - 6) атома углерода, считая от концевой метильной группы.

A.1.8 Омега-9 жирные кислоты

Омега-9 жирные кислоты представляют собой сумму цис-ненасыщенных жирных кислот, в которых первая двойная связь находится у n-9 (\omega - 9) атома углерода, считая от концевой метильной группы.

A.2 Индивидуальные жирные кислоты

A.2.1 Линолевая кислота

Линолевая кислота (LA) — это незаменимая жирная кислота с 18 углеродными атомами в цепи, содержащая две двойные связи у 9 и 12 атомов углерода (C18:2 полностью \text{цис} - \Delta^{9} , \Delta^{12} ), также именуемая C18:2 n-6 (\omega - 6) .

A.2.2 Линоленовая кислота

Линоленовая кислота (ALA), также именуемая \alpha - \text{линоленовая} кислота, — это незаменимая жирная кислота с 18 углеродными атомами в цепи, содержащая три двойные связи у 9, 12 и 15 атомов углерода (C18:3 полностью \text{цис} - \Delta^{9} , \Delta^{12} , \Delta^{15} ), также именуемая C18:3 n-3 (\omega - 3) .

A.2.3 Арахидоновая кислота

Арахидоновая кислота (ARA) — жирная кислота с 20 углеродными атомами, содержащая четыре двойные связи у 5, 8, 11 и 14 атомов углерода (C20:4 полностью \text{цис} - \Delta^{5} , \Delta^{8} , \Delta^{11} , \Delta^{14} ), также именуемая C20:4 n-6 (\omega - 6) .

A.2.4 Эйкозапентаеновая кислота

Эйкозапентаеновая кислота (EPA) — это условно заменимая жирная кислота (незаменимая для беременных женщин и детей) с 20 углеродными атомами, содержащая пять двойных связей у 5, 8, 11, 14 и 17 атомов углерода (C20:5 полностью \text{цис} - \Delta^{5} , \Delta^{8} , \Delta^{11} , \Delta^{14} , \Delta^{17} ), также именуемая C20:5 n-3 (\omega - 3) .

A.2.5 Докозагексаеновая кислота

Докозагексаеновая кислота (DHA) — это условно заменимая жирная кислота (незаменимая для беременных женщин и детей), с 22 углеродными атомами, содержащая шесть двойных связей у 4, 7, 10, 13, 16 и 19 атомов углерода (C22:6 полностью \text{цис} - \Delta^{4} , \Delta^{7} , \Delta^{10} , \Delta^{13} , \Delta^{16} , \Delta^{19} ), также именуемая C22:6 n-3 (\omega - 3) .

Таблица A.1

Конфигурация и группы жирных кислот

Таблица A.2

Сокращения

Приложение B (справочное)

ПРИМЕРЫ ГАЗОЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Рисунок B.1 — Пример ГЖХ-хроматограммы молочного продукта [увеличенная область C18:1 ТЖК, C18:2 ТЖК, C18:3 ТЖК и конъюгированная линолевая кислота (CLA)] с использованием ввода пробы с делением потока

Рисунок B.2 — Пример ГЖХ-хроматограммы молочного продукта [увеличенная область C18:1 ТЖК, C18:2 ТЖК, C18:3 ТЖК и конъюгированная линолевая кислота (CLA)] с использованием ввода пробы непосредственно в колонку

Рисунок B.3 — Пример ГЖХ-хроматограммы (полное и неполное разделение между C18:1 цис- и транс-изомерами)

Рисунок B.4 — Пример ГЖХ-хроматограммы (стандарт GLC-Nestle36) с использованием ввода пробы с делением потока

Рисунок B.5 — Пример ГЖХ-хроматограммы (стандарт GLC-Nestle36) с использованием ввода пробы непосредственно в колонку

Примечание - Мононенасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты обозначены начиная от крайнего метильного радикала в сторону карбоксильной группы (обозначение n или \omega ).

Рисунок B.6 — Пример ГЖХ-хроматограммы детской смеси (содержащей дезодорированное растительное масло) с использованием ввода пробы с делением потока

Рисунок B.7 — Пример ГЖХ-хроматограмм (увеличенная область) для идентификации жирных кислот с разветвленным углеродным скелетом в молочных продуктах с использованием ввода пробы с делением потока

Таблица B.1

Стехиометрические факторы (Si ЖК) для конвертации метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) в жирные кислоты (FA)

Рисунок B.8 — Пример расчета факторов отклика с использованием программы для работы с электронными таблицами

1,651

C₄:₀

Масляная

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

1,337

C₆:₀

Капроновая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

1,088

C₈:₀

Каприловая

0 000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

1,009

C10:0

Каприновая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,981

C120

Лауриновая

0,53

0,52

0,000

0,000

0,000

0,000

1,0

0,016

0,018

0,969

C14:0

Миристиновая

10,51

10,46

0,006

0,006

0,006

0,000

0,0

0,313

0 349

0,990

C14:1

n-5 (или \omega - 5 )

\Delta 9

Миристолевая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,955

C15:0

Пентадекановая

3,16

3,19

0,002

0,002

0,002

0,000

1,0

0,094

0,105

0,983

C15:1

n-5 (или \omega - 5 )

\Delta 10

Пентадеценовая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,957

C16:0

Пальмитиновая

629,98

631,26

0,382

0,385

0,383

0,002

0,5

18,693

20 862

0,978

C16:1

n-7 (или \omega - 7 )

\Delta 9

Пальмитолеиновая

9,21

9,24

0,006

0,006

0,006

0,000

0,6

0,280

0,312

0,963

C17.0

Маргариновая

3,85

3,89

0,002

0,002

0,002

0,000

1,1

0,116

0 129

0,967

C17:1

n-7 (или \omega - 7 )

\Delta 10

Гептадеценовая

1,72

1,79

0,001

0,001

0,001

0,000

3,2

0053

0,059

0,963

C18:0

Стеариновая

48,62

48,94

0,030

0,030

0,030

0,000

0,8

1,463

1 633

0,963

C18:1 ТЖК

Общие транс

0,95

0,93

0,001

0,001

0,001

0,000

1,1

0,028

0,031

0,957

C18:1

n-9 (или \omega - 9 )

\Delta 9

Олеиновая и другие цис

667,08

673,28

0,406

0,412

0,409

0,004

1,0

19 968

22,286

0,950

C18:2

Общие транс

4,86

4,99

0,003

0,003

0,003

0,000

2,2

0,146

0,163

0,955

C18:2

n-6 (или \omega - 6 )

\Delta 9 , 12

Линоленовая (LA)

1446,38

1458,00

0,878

0,890

0,884

0008

0,9

43,135

48,141

0,955

C18:2 CLA

n-7 (или \omega - 7 )

\Delta 9c/11t

Конъюгированная линоленовая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,932

C18:3

n-6 (или \omega - 6 )

\Delta 6 , 9, 12

Гамма-линоленовая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,967

C18:3

Общие транс

1,03

1,09

0,001

0,001

0,001

0,000

4,4

0032

0,036

0,967

C18:3

n-3 (или \omega - 3 )

\Delta 9 , 12, 15

Альфа-линоленовая (ALA)

63,92

64,68

0,039

0,040

0,040

0,000

1,2

1 935

2,160

0,927

C20:0

Арахидоновая

5,37

5,36

0,003

0,003

0,003

0,000

0,2

0,155

0,174

0,931

C20:1

n-9 (или o-9)

\Delta 11

Эйкозеновая

13,52

13,73

0,008

0,008

0,008

0,000

1,5

0,397

0,443

0,938

C20:2

n-6 (или \omega - 6 )

\Delta 11 , 14

Эйкозадиеновая

2,06

2,10

0,001

0,001

0,001

0,000

1,7

0,061

0,068

0,931

C20:3

n-6 (или \omega - 6 )

\Delta 9 , 11, 14

Эйкозатриеновая (DHGLA)

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,935

C20:3

n-3 (или \omega - 3 )

\Delta 11 , 14, 17

Эйкозатриеновая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,952

C20:4

n-6 (или \omega - 6 )

\Delta 5 , 8, 11, 14

Арахидоновая

2,44

2,50

0,001

0,002

0,002

0,000

2,1

0,073

0082

0,943

C20:5

n-3 (или \omega - 3 )

\Delta 5 , 8, 11, 14, 17

Эйкозапентановая (EPA)

8,38

8,33

0,005

0,005

0,005

0,000

0,0

0246

0275

0,945

C22:0

Бегеновая

3,96

3,88

0,002

0,002

0,002

0,000

1,1

0,116

0,130

0,931

C22:1

n-9 (или \omega - 9 )

\Delta 13

Эруковая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,930

C22:2

n-6 (или \omega - 6 )

\Delta 13 , 16

Докозадиеновая

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,978

C22:6

n-3 (или \omega - 3 )

\Delta 4 , 7, 10, 13, 16, 19

Докозагексаеновая (DHA)

30,08

30,29

0,019

0,019

0,019

0,000

0,9

0,926

1,033

0,932

C24:0

Лигноцериновая

3,71

3,72

0,002

0,002

0,002

0,000

0,6

0,109

0,122

0,926

C24:1

n-9 (или \omega - 9 )

\Delta 15

Нервоновая

0,000

0,000

0,000

0,000

0000

0,000

0,953

OFA

Другие жирные кислоты

42,69

41,37

0,026

0,025

0,026

0,000

1,8

1,248

1,392

Всего

3004,01

3023,54

1,826

1,848

1,837

0,015

0,8

89,601

100,000

Всего трансжирных кислот

0,004

0,004

0,004

0,000

2,1

0,206

0,230

Производительность переэтерификации

99,7

99,5

99,6

0,2

0,2

Экстрагированный жир (%)

Использованный метод

Рисунок B.9 — Пример расчета жирных кислот с использованием программы для работы с электронными таблицами

Приложение C (справочное)

РЕЗУЛЬТАТЫ МЕЖЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ

Межлабораторные испытания прецизионности метода были организованы с 2013 по 2014 г. IDF/ISO и AOAC/SPIFAN, в котором приняли участие 18 лабораторий [16]. Значения, полученные в данных межлабораторных испытаниях, не могут быть применены к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от указанных.

С более подробной информацией по валидации метода можно ознакомиться по адресу http://standards.iso.org/iso/16958.

Для проведения совместного испытания были использованы следующие 12 продуктов:

1 Цельное сухое молоко (26,27% жира);

2 Цельное жидкое молоко (3,55% жира);

3 Цельные сливки (35,27% жира);

4 Масло сливочное (82,93% жира);

5 Мягкий сыр (13,29% жира);

6 Смесь детская сухая (25,67% жира);

7 Сухой молочный белок для питания взрослых (17,44% жира);

8 Смесь детская сухая с частично гидролизованным порошком сои (26,01% жира);

9 Смесь детская молочная сухая на молочной основе (28,38% жира);

10 Смесь детская молочная (жидкая) на молочной основе (готовая к употреблению) (3,57% жира);

11 Высокобелковый продукт (жидкий) для взрослого питания (готовый к употреблению) (3,58% жира);

12 Высокожировой продукт (жидкий) для взрослого питания (готовый к употреблению) (8,61% жира).

В таблицах используются следующие сокращения:

Таблица C.1 содержит данные совместного испытания, рассчитанные в г жирных кислот/100 г продукта для группы маркируемых (выносимых на этикетку) жирных кислот [транс-изомеров жирных кислот (ТЖК), насыщенных жирных кислот (НЖК), мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК), полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), омега-3, омега-6 и омега-9] и индивидуальных жирных кислот [линолевая кислота (LA), \alpha - \text{линоленовая} кислота (ALA), арахидоновая кислота (ARA), эйкозапентаеновая кислота (EPA), докозагексаеновая кислота (DHA)].

Таблица C.1

Данные по прецизионности для группы маркируемых жирных кислот

Таблица C.2 содержит данные совместного испытания, рассчитанные как г жирных кислот/100 г продукта для всех остальных индивидуальных жирных кислот (за исключением приведенных в таблице C.1).

Таблица C.2

Данные по прецизионности для всех остальных индивидуальных жирных кислот