ГОСТ ISO 16212-2020. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Подсчет дрожжей и плесневых грибов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 24.08.2021 № 767-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов (п. п. 612, 779), а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности продукции, предназначенной для детей и подростков» (ТР ТС 007/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 14.03.2023 № 31). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» (ТР ТС 009/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22.12.2020 № 177). Документ введен в действие с 01.01.2022.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 августа 2021 г. № 767-ст
ПРОДУКЦИЯ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ. ПОДСЧЕТ ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
Perfume and cosmetic products. Microbiology. Detection of yeast and mould
(ISO 16212:2017, Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould, IDT)
07.100.40
Дата введения 1 января 2022 года
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 30 января 2020 г. № 126-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 августа 2021 г. № 767-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16212-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2022 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16212:2017 «Косметика. Микробиология. Подсчет дрожжей и плесневых грибов» («Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould», IDT).
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.
Международный стандарт разработан Техническим комитетом ISO/TC 217 «Косметика» Международной организации по стандартизации (ISO).
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных и европейских стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Настоящий стандарт устанавливает общие требования к методу определения количества дрожжей и плесневых грибов, содержащихся в парфюмерно-косметической продукции, путем подсчета колоний на селективной агаризованной питательной среде после инкубации в аэробных условиях.
Чтобы обеспечить качество и безопасность продукции для потребителя, рекомендуется проводить соответствующий анализ микробиологического риска с целью определения видов парфюмерно-косметической продукции, к которой применим настоящий стандарт. К продукции с низкой степенью микробиологического риска (см. ISO 29621) относится продукция с низкой активностью воды, продукция на водно-спиртовой основе, продукция с крайними значениями pH и т.д.
Из-за большого разнообразия парфюмерно-косметической продукции в рассматриваемой области применения отдельные детали данного метода могут быть непригодными для некоторых видов продукции (например, для нерастворимой в воде продукции). Можно применять другие методы (например, автоматизированные) вместо приведенных тестов при условии, что должным образом была доказана их равнозначность или подтверждена пригодность.
Подсчитанные дрожжи могут быть идентифицированы с помощью соответствующих идентификационных тестов, установленных в стандартах, перечисленных в библиографии. Идентификация подсчитанных плесневых грибов при необходимости может проводиться с помощью других подходящих тестов.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных — последнее издание (включая все его изменения)]:
ISO 21148, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination (Косметика. Микробиология. Общие указания по микробиологическому контролю)
EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity (Средства химические дезинфицирующие и антисептические. Консервация тест-микроорганизмов, используемых для определения бактерицидной (включая микроорганизмы Legionella), микобактерицидной, спорицидной, фунгицидной и вируцидной (включая бактериофаги) активности)
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.
В целях стандартизации ISO и IEC предоставляют терминологические базы данных по следующим ссылкам:
- электропедия IEC: http://www.electropedia.org/;
- онлайн-библиотека стандартов ISO: http://www.iso.org/obp.
3.1 дрожжи (yeast): Одноклеточные грибы, размножающиеся преимущественно вегетативно, почкованием и способные к росту в условиях испытаний, установленных настоящим стандартом.
3.2 плесневые грибы (mould): Микроскопические грибы, образующие мицелий, включая споры и конидии, способные к росту в условиях испытаний, установленных настоящим стандартом.
3.3 продукция (product): Часть идентифицированной парфюмерно-косметической продукции, полученная лабораторией для испытания.
3.4 проба (sample): Часть продукции (см. 3.3) в количестве не менее 1 г или 1 см3, которая используется при проведении испытаний для приготовления исходной суспензии.
3.5 исходная суспензия (initial suspension): Суспензия (или раствор) пробы (см. 3.4) в определенном объеме соответствующего бульона для обогащения.
3.6 разведение пробы (sample dilution): Разбавление исходной суспензии (см. 3.5).
4.1 Общие положения
Настоящий метод предусматривает количественное определение колоний на селективной агаризованной питательной среде. Возможное ингибирование роста грибов пробой должно быть нейтрализовано, чтобы можно было обнаружить все жизнеспособные микроорганизмы (см. [5]). Во всех случаях и вне зависимости от применяемого метода нейтрализация антигрибковых свойств продукции должна быть проверена и подтверждена (см. [6], [8], [9]).
4.2 Подсчет микроорганизмов чашечным методом
Чашечный метод включает следующие этапы:
a) подготовка чашек Петри для глубинного или поверхностного посева с использованием конкретной питательной среды и посев определенного количества исходной суспензии или разведения продукции;
b) инкубация чашек Петри в аэробных условиях при температуре (25 +/- 2,5) °C в течение 3 — 5 сут;
c) подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) и вычисление количества дрожжей и плесневых грибов в одном кубическом сантиметре или грамме продукции.
Примечание - Альтернативные условия инкубации — при температуре (22,5 +/- 2,5) °C в течение 5 — 7 сут при использовании питательной среды, не содержащей антибиотик.
4.3 Мембранная фильтрация
Метод мембранной фильтрации включает следующие этапы:
a) перенос соответствующего количества пробы, приготовленной в соответствии с разделом 12, в фильтровальный аппарат, смоченный небольшим количеством соответствующего стерильного разбавителя. Немедленное фильтрование и промывание — согласно установленной методике (см. 12.3.4). Перенос мембранного фильтра на поверхность конкретной агаризованной питательной среды, как установлено в ISO 21148;
b) инкубация мембранных фильтров в аэробных условиях при температуре (25 +/- 2,5) °C в течение 3 — 5 сут;
c) подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) и вычисление количества дрожжей и плесневых грибов в одном кубическом сантиметре или грамме продукции.
Примечание - Альтернативные условия инкубирования — при температуре (22,5 +/- 2,5) °C в течение 5 — 7 сут при использовании питательной среды, не содержащей антибиотик.
5 Разбавители, нейтрализаторы и питательные среды
5.1 Общие положения
Общие указания приведены в ISO 21148. Если в настоящем стандарте упоминается вода, то это означает, что применяют дистиллированную или очищенную воду, как установлено в ISO 21148.
Для количественного определения дрожжей и плесневых грибов могут применяться разбавители, нейтрализаторы и питательные среды, перечисленные ниже. Могут быть использованы другие разбавители, нейтрализаторы и питательные среды в случае подтверждения их пригодности для этой цели.
5.2 Разбавители и нейтрализующие разбавители
5.2.1 Общие положения
Разбавитель используется для диспергирования пробы. Он может содержать нейтрализаторы, в случае если сама проба обладает антигрибковыми свойствами. Эффективность нейтрализации должна быть подтверждена до подсчета количества микроорганизмов (см. раздел 12). Информация о пригодных для использования нейтрализаторах приведена в приложении D.
5.2.2 Нейтрализующий разбавитель
5.2.2.1 Жидкая питательная среда с гидролизатом казеина, соевым лецитином и полисорбатом 20 (бульон SCDLP 20)
5.2.2.1.1 Состав
| - панкреатический гидролизат казеина | 20,0 г; |
|---|---|
| - соевый лецитин | 5,0 г; |
| - полисорбат 20 | 40 см3; |
| - вода | 960 см3. |
5.2.2.1.2 Приготовление
Растворяют полисорбат 20 в 960 см3 воды, перемешивая при нагревании на водяной бане при температуре (49 +/- 2) °C. Добавляют панкреатический гидролизат казеина и соевый лецитин. Нагревают около 30 мин до получения раствора. Перемешивают питательную среду и разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации значение pH раствора, измеренное при комнатной температуре, должно составлять 7,3 +/- 0,2.
5.2.2.2 Другие нейтрализующие разбавители
При необходимости могут использоваться прочие нейтрализующие разбавители (см. приложения A и D).
5.2.3 Разбавитель
5.2.3.1 Жидкость A
5.2.3.1.1 Состав
| - пептический гидролизат животной ткани | 1,0 г; |
|---|---|
| - вода | 1 000 см3. |
5.2.3.1.2 Приготовление
Растворяют 1 г пептического гидролизата животной ткани в воде и доводят объем до 1 дм3. Нагревают, интенсивно перемешивая. Разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации значение pH раствора, измеренное при комнатной температуре, должно составлять 7,1 +/- 0,2.
5.2.3.2 Другие разбавители
При необходимости могут использоваться прочие разбавители (см. приложение B).
5.3 Разбавитель для дрожжевой суспензии (раствор с триптоном и хлоридом натрия)
5.3.1 Состав
| - триптон, панкреатический гидролизат казеина | 1,00 г; |
|---|---|
| - натрия хлорид | 8,50 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
5.3.2 Приготовление
Растворяют компоненты в воде, перемешивая при нагревании. Разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации значение pH раствора, измеренное при комнатной температуре, должно составлять 7,0 +/- 0,2.
5.4 Питательные среды
5.4.1 Общие требования
Питательные среды могут быть приготовлены из сухих питательных сред в соответствии с инструкциями изготовителя или как описано ниже. Могут применяться уже готовые к использованию питательные среды при условии, что их состав и/или ростовые свойства являются подобными приведенным ниже средам.
5.4.2 Агаризованная среда Сабуро с глюкозой и хлорамфениколом (SDCA)
5.4.2.1 Состав
| - декстроза | 40,0 г; |
|---|---|
| - пептический гидролизат животной ткани | 5,0 г; |
| - панкреатический гидролизат казеина | 5,0 г; |
| - хлорамфеникол | 0,050 г; |
| - агар | 15,0 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
5.4.2.2 Приготовление
Растворяют компоненты (включая хлорамфеникол) или сухую готовую питательную среду в воде, перемешивая при нагревании. Разливают питательную среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют питательную среду в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации значение pH среды, измеренное при комнатной температуре, должно составлять 5,6 +/- 0,2.
Примечание - При работе с известной и не контаминированной бактериями продукцией используют питательные среды без добавления хлорамфеникола.
5.4.3 Другие питательные среды
При необходимости могут использоваться прочие питательные среды (см. приложение C).
5.4.4 Агаризованная среда для культивирования эталонного штамма: агаризованная среда Сабуро с декстрозой (SDA)
5.4.4.1 Состав
| - декстроза | 40,0 г; |
|---|---|
| - пептический гидролизат животной ткани | 5,0 г; |
| - панкреатический гидролизат казеина | 5,0 г; |
| - агар | 15,0 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
5.4.4.2 Приготовление
Растворяют компоненты или сухую готовую питательную среду в воде, перемешивая при нагревании. Разливают питательную среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют питательную среду в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации значение pH среды, измеренное при комнатной температуре, должно составлять 5,6 +/- 0,2.
6 Инструменты и стеклянная лабораторная посуда
Лабораторное оборудование, инструменты и стеклянная посуда должны соответствовать ISO 21148.
Для проверки эффективности нейтрализаторов используется один из эталонных штаммов дрожжей:
- Candida albicans ATCC <1> 10231, или эквивалентный штамм (IP <2> 48.72, или NCPF <3> 3179, или NBRC <4> 1594, или KCTC <5> 17205, TISTR <6> 5779), или другой эквивалентный штамм из национальной коллекции.
<1> ATCC — American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых культур (микроорганизмов)).
<2> IP — Institut Pasteur (Институт Пастера).
<3> NCPF — National Collection of Pathogenic Fungi (Национальная коллекция патогенных грибов).
<4> NBRC — National Biological Resource Center (Национальный центр биологических исследований), NITE. (National Institute of Technology and Evaluation (Национальный институт технологий и оценки)).
<5> KCTC — Korean Collection for Type Culture (Корейская коллекция типовых культур).
<6> TISTR — Thailand Institute of Scientific and Technological Research (Таиландский институт научно-технических исследований).
Выбранный штамм дрожжей считается более восприимчивым к антигрибковому действию, чем плесневые грибы, и может выступать в качестве представительного микроорганизма для грибов (дрожжей и плесени) при подтверждении пригодности методов. Тем не менее в особых случаях определение эффективности нейтрализаторов может при необходимости проводиться на дополнительном эталонном штамме плесневых грибов с использованием соответствующего протокола для приготовления стандартного инокулята (см., например, [3] (подпункт 5.4.1.4)).
Восстановление культуры должно осуществляться в соответствии с процедурами, установленными поставщиком эталонного штамма.
Штаммы могут храниться в лаборатории согласно EN 12353.
8 Обращение с парфюмерно-косметической продукцией и лабораторными пробами
При необходимости продукцию, подлежащую испытаниям, хранят при комнатной температуре.
Не следует выдерживать в термостате, охлаждать или замораживать продукцию (см. 3.3) и пробы (см. 3.4) ни до, ни после испытания.
Отбор проб парфюмерно-косметической продукции для испытания следует проводить в соответствии с ISO 21148. Испытывают пробы в соответствии с ISO 21148 и согласно методике, приведенной в разделе 9.
9.1 Общие рекомендации
Подготовку пробы, приготовление исходной суспензии и разведений выполняют с соблюдением правил асептики, используя стерильные материалы, оборудование. В случае приготовления исходной суспензии время между окончанием приготовления суспензии и моментом ее внесения в питательную среду не должно превышать 45 мин, если иное не установлено в утвержденных протоколах или документах.
9.2 Приготовление исходной суспензии
9.2.1 Общие положения
Исходную суспензию готовят из пробы (количество которой не менее 1 г или 1 см3) хорошо перемешанной испытываемой продукции.
Регистрируют S, точную массу или точный объем пробы.
Исходная суспензия обычно представляет собой разведение 1:10. Больший объем разбавителя может потребоваться, если предполагается высокий уровень контаминации продукции и/или если в растворе с разведением 1:10 все еще проявляются антигрибковые свойства.
9.2.2 Водорастворимая продукция
Переносят количество S пробы продукции в соответствующий объем (например, 9 см3) нейтрализующего разбавителя (см. 5.2.2) или разбавителя (см. 5.2.3).
Регистрируют коэффициент разведения d.
9.2.3 Нерастворимая в воде продукция
Переносят количество S пробы продукции в подходящую лабораторную посуду, содержащую достаточное количество солюбилизирующего компонента (например, полисорбат 80). Растворяют пробу в солюбилизирующем компоненте и добавляют соответствующий объем (например, 9 см3) нейтрализующего разбавителя (см. 5.2.2) или разбавителя (см. 5.2.3).
Регистрируют коэффициент разведения d.
9.3 Методы подсчета
9.3.1 Разведения для методов подсчета
Обычно исходная суспензия является первым разведением, в котором выполняется подсчет. При необходимости готовят серию десятикратных разведений (например, 1:10) из исходной суспензии, используя тот же разбавитель (в зависимости от предполагаемого уровня контаминации продукции).
Как правило, подсчет проводят, используя не менее двух чашек Петри, однако существует возможность использовать только одну чашку Петри при проведении рутинных испытаний или если подсчет выполняется на последовательных разведениях одной и той же пробы или исходя из ранее полученных результатов.
9.3.2 Чашечные методы
9.3.2.1 Метод глубинного посева
В чашки Петри диаметром от 85 до 100 мм добавляют 1 см3 исходной суспензии и/или разведения пробы, приготовленного как при подтверждении метода на пригодность (см. раздел 12), и заливают 15 — 20 см3 расплавленной агаризованной питательной среды (см. 5.4.2), которая выдерживалась на водяной бане при температуре, не превышающей 48 °C. При использовании чашек Петри большего диаметра количество агаризованной питательной среды пропорционально увеличивают.
Перемешивают исходную суспензию и/или разведение пробы с питательной средой, осторожно вращая или наклоняя чашки для ее равномерного распределения. Дают среде в чашках Петри застыть на горизонтальной поверхности при комнатной температуре.
9.3.2.2 Метод поверхностного посева
В чашки Петри диаметром от 85 до 100 мм помещают от 15 до 20 см3 расплавленной агаризованной питательной среды (см. 5.4.2), которая выдерживалась на водяной бане при температуре, не превышающей 48 °C. При использовании чашек Петри большего диаметра количество агаризованной питательной среды пропорционально увеличивают.
Дают чашкам охладиться, среде застыть в них, например поместив их в ламинарный шкаф или в термостат. Распределяют по поверхности среды отмеренное количество, но не менее 0,1 см3, исходной суспензии и/или разведения пробы, приготовленного в соответствии с разделом 12.
9.3.2.3 Метод мембранной фильтрации
Используют мембранный фильтр с номинальным размером пор не более 0,45 мкм.
Переносят соответствующее количество исходной суспензии или разведения пробы, использовавшееся для подтверждения пригодности метода (предпочтительно представительной пробы в количестве не менее 1 г или 1 см3 продукции) на мембранный фильтр.
Сразу же выполняют фильтрацию и промывают мембранный фильтр (в соответствии с методикой теста на пригодность, см. раздел 12).
Переносят мембранный фильтр на поверхность агаризованной питательной среды (см. 5.4.2).
9.3.2.4 Инкубация
Если не установлено иное, переворачивают инокулированные чашки вверх дном и помещают их в термостат, поддерживающий температуру (25 +/- 2,5) °C, на срок от 3 до 5 сут или инкубируют в альтернативных условиях (см. примечания к 4.2 и 4.3). После инкубации чашек следует (по возможности) немедленно приступить к подсчету. В противном случае, если не установлено иное, чашки можно хранить не более 24 ч в холодильнике при температуре (5 +/- 3) °C.
1 В некоторых случаях, если существует вероятность того, что частицы продукции могут быть приняты за колонии, целесообразно подготовить дополнительные чашки, содержащие те же разведения пробы, и агаризованную питательную среду, которые хранят в холодильнике для сравнения с инкубированными чашками.
2 В случае подозрений на присутствие в пробе одновременно дрожжей и плесневых грибов могут проводиться соответствующие промежуточные проверки.
10 Подсчет колоний (чашечный метод и метод мембранной фильтрации)
После инкубации подсчитывают колонии:
- на чашках Петри, содержащих от 15 до 150 колоний; если насчитывается менее 15 колоний, см. 11.2.3;
- на мембранных фильтрах, содержащих от 15 до 150 колоний; если насчитывается менее 15 колоний, см. 11.2.3.
11.1 Метод подсчета для чашечного метода
Вычисляют количество № микроорганизмов, присутствующих в пробе S, используя:
- m — среднее арифметическое число колоний, подсчитанных на двух чашках (формула (1));
- c — количество колоний, подсчитанных на одной чашке (формула (2)) или
- wm — среднее взвешенное число колоний, полученное из двух последовательных разведений (формула (3)) по следующим формулам
где m — среднее арифметическое число колоний, подсчитанных на двух чашках;
V — объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см3;
d — коэффициент разведения, соответствующий разведению при приготовлении исходной суспензии (см. 9.2) или первому разведению, для которого выполняется подсчет;
c — количество колоний, подсчитанных на одной чашке.
Среднее взвешенное число колоний, полученное из двух последовательных разведений \overline{x_{c}} , определяется по формуле
\overline{x_{c}} = \frac{\sum c}{(n_{1} + 0,1n_{2})} ,
где \sum c — сумма колоний, подсчитанных на всех чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений;
n1 — количество чашек, использованных для подсчета количества микроорганизмов в исходной суспензии (или в первом разведении, учитывающемся при выполнении подсчета);
n2 — количество чашек, на которых подсчитано количество микроорганизмов в разведении 1:10 исходной суспензии (или для второго разведения, учитывающегося при выполнении подсчета).
Округляют результат вычислений до двух значащих цифр после запятой. При этом, если последняя цифра менее 5, предшествующая ей цифра не изменяется; если последняя цифра 5 или более, предшествующую цифру увеличивают на единицу. Продолжают последовательно до получения двух значащих цифр. Регистрируют полученное значение N.
11.2 Интерпретация результатов
11.2.1 Необходимо принимать во внимание вариабельность, которая свойственна чашечным методам. Два результата должны рассматриваться как различающиеся только тогда, когда расхождение между ними превышает 50% или когда это расхождение, выраженное логарифмически, превышает 0,3 log.
Для более точного подсчета учитывают только чашки или мембранные фильтры, на которых содержится более 15 и менее 150 колоний. Проверяют, чтобы подсчеты были получены из разведений, подтвердивших пригодность для выбранного метода (см. раздел 12).
11.2.2 В случае, когда количество КОЕ на чашках или мембранных фильтрах составляет более 15 и менее 150, результат представляют следующим образом:
- если S не менее 1 г или 1 см3 и V не менее 1 см3, то количество дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы равно N/S;
- если S менее чем 1 г или 1 см3 и/или V менее чем 1 см3, то количество дрожжей и плесневых грибов в пробе (указывают испытуемое количество пробы, учитывая S и V) равно N,
где значение S соответствует массе или объему пробы (см. 9.2).
Представляют результат в виде числа в интервале между 1,0 и 9,9, умноженного на 10 в соответствующей степени (см. примеры).
11.2.3 В случае, когда количество КОЕ на чашках или мембранных фильтрах составляет менее 15, результат должен быть представлен следующим образом:
- если S не менее 1 г или 1 см3 и V не менее 1 см3, расчетное количество дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы равно N/S;
- если S менее чем 1 г или 1 см3 и/или V менее чем 1 см3, расчетное количество дрожжей и плесени в пробе равно N,
где S соответствует массе или объему пробы (см. 9.2).
Представляют результат в виде числа в интервале между 1,0 и 9,9, умноженного на 10 в соответствующей степени (см. примеры).
11.2.4 Если колонии не обнаружены, результат должен быть представлен следующим образом:
- менее 1/d x V x S дрожжей и плесневых грибов на грамм или кубический сантиметр продукции (S не менее 1 г или 1 см3);
- менее 1/d x V дрожжей и плесневых грибов в пробе S (указывают испытуемое количество пробы, учитывая S и V) (S менее 1 г или 1 см3),
где d — коэффициент разведения исходной суспензии (см. 9.2);
V — равен 1 (для метода глубинного посева и для мембранной фильтрации) или 0,1 (для метода поверхностного посева) (см. пример).
Пример 1 — Две чашки для одного разведения.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 38 и 42.
Формула (1) N = m/(V x d) = 40/(1 x 10-1) = 40/0,1 = 400 или 4 x 102 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Пример 2 — Одна чашка для одного разведения.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 60.
Формула (2) N = c/(V x d) = 60/(1 x 10-1) = 60/0,1 = 600 или 6 x 102 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Пример 3 — Две чашки для двух разведений.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-2: 235 и 282; для разведения 10-3: 31 и 39.
Формула (3) N = wm/(V x d) = 235 + 282 + 31 + 39/1(2 + 0,1 x 2) x 10-2 = 587/0,022 = 26 682.
Округление результата в соответствии с указаниями, приведенными выше, дает 27 000 или 2,7 x 104 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Пример 4 — Два мембранных фильтра для одного разведения.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 18 и 22.
Формула (1) N = m/(V x d) = 20/(1 x 10-1) = 20/0,1 = 200 или 2 x 102 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Пример 5 — Один мембранный фильтр для одного разведения.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 65.
Формула (2) N = c/(V x d) = 65/(1 x 10-1) = 65/0,1 = 650 или 6,5 x 102 аэробных дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Пример 6 — Два мембранных фильтра для двух разведений.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 121 и 105; для разведения 10-2: 15 и 25.
Формула (3) N = wm/(V x d) = 121 + 105 + 15 + 25/1(2 + 0,1 x 2) x 10-1 = 266/0,22 = 1 209.
Округление результата в соответствии с указаниями, приведенными выше, дает 1 200 или 1,2 x 103 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Пример 7 — Две чашки для одного разведения.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 28 и 22.
Формула (1) N = m/(V x d) = 25/(1 x 10-1) = 25/0,1 = 250 или 2,5 x 102 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Расчетное количество составляет 250 или 2,5 x 102 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
S = 1 г; V = 1; результаты подсчета, полученные для разведения 10-1: 0 и 0.
Формула (1) N = <= 1/d x V x S, <= (1/0,1) x 1 x 1, <= 10 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
Расчетное количество составляет менее чем 10 дрожжей и плесневых грибов на кубический сантиметр или грамм пробы.
12 Нейтрализация антигрибковых свойств продукции
12.1 Общие положения
Приведенные ниже методики подтверждают, что микроорганизмы могут расти в условиях проведения испытания.
12.2 Приготовление инокулята
Перед проведением испытаний проводят посев Candida albicans на поверхность неселективной агаризованной питательной среды Сабуро с декстрозой (SDA). Инкубируют чашки при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 18 — 24 ч.
Собирают культуру стерильной петлей с поверхности среды и ресуспендируют в разбавителе (см. 5.2) для приготовления стандартной суспензии с концентрацией около 1 x 106 КОЕ/см3 (количество клеток можно определить, используя спектрофотометр); см. ISO 21148.
Используют данную суспензию и ее разведения в течение 2 ч.
12.3 Пригодность методов подсчета
12.3.1 Принцип выполнения
Смешивают нейтрализованную пробу (исходную суспензию или разведение пробы в зависимости от антигрибковых свойств или растворимости продукции) с разведением эталонного штамма. Высевают на чашку Петри или фильтруют через мембранный фильтр. После инкубации проверяют морфологию колоний и сравнивают полученное количество колоний с количеством колоний на контрольном посеве (без добавления пробы).
Если количество микроорганизмов составляет менее 50% (0,3 log) от количества на контрольном посеве, модифицируют методику (используя другие разбавители, нейтрализаторы или комбинацию того и другого, см. приложение D). При отсутствии роста инокулята результаты испытания признаются недействительными, если только возможная контаминация продукции данным видом микроорганизмов не является маловероятной.
12.3.2 Тест на пригодность метода глубинного посева
Смешивают 9 см3 исходной суспензии и/или разведения(й) пробы в нейтрализующем разбавителе (или в другом разбавителе, см. 5.2) с 1 см3 суспензии микроорганизмов с концентрацией от 1 000 до 3 000 КОЕ/см3. Переносят 1 см3 в чашку Петри (предпочтительно в две чашки) и заливают от 15 до 20 см3 расплавленной агаризованной питательной среды (см. 5.4.2), выдержанной на водяной бане при температуре, не превышающей 48 °C. Параллельно готовят и заливают чашку для контрольного посева, используя тот же разбавитель и ту же суспензию микроорганизмов, но без пробы.
После инкубации в течение 3 — 5 сут при температуре (25 +/- 2,5) °C или в альтернативных условиях (см. примечания к 4.2 и 4.3) подсчитывают колонии на чашках и сравнивают результаты, полученные при испытании, с результатами на контрольном посеве. Разбавитель и метод подсчета считают удовлетворяющими требованиям при разведении 1:10 (когда используется 1 мл исходной суспензии), если количество микроорганизмов, подсчитанных в тесте на пригодность, составляет не менее 50% от количества микроорганизмов на контрольном посеве.
12.3.3 Тест на пригодность метода поверхностного посева
Смешивают 9 см3 исходной суспензии в нейтрализующем разбавителе (или в другом разбавителе, см. 5.2) с 1 см3 суспензии микроорганизмов с концентрацией от 10 000 до 30 000 КОЕ/см3 (или менее, если распределяется 0,5 или 1 см3 суспензии). Распределяют не менее 0,1 см3 суспензии по поверхности застывшей агазированной среды (см. 5.4.2) предпочтительно в двух повторностях. Параллельно готовят и заливают чашку для контрольного посева, используя тот же разбавитель и ту же суспензию микроорганизмов, но без пробы.
После инкубации в течение 3 — 5 сут при температуре (25 +/- 2,5) °C или в альтернативных условиях (см. примечания к 4.2 и 4.3) подсчитывают колонии на чашках и сравнивают результаты, полученные при испытании, с результатами на контрольном посеве. Разбавитель и метод подсчета считают удовлетворяющими требованиям при разведении 1:10 (когда используется 1 см3 исходной суспензии), если количество микроорганизмов, подсчитанных в тесте на пригодность, составляет не менее 50% (0,3 log) от количества микроорганизмов в контрольном посеве.
12.3.4 Тест на пригодность метода мембранной фильтрации
Смешивают соответствующее количество исходной суспензии или разведения пробы, использованное в испытании (см. 9.3.2.3), с соответствующим количеством стандартной суспензии микроорганизмов, количество клеток в которой соответствует приблизительно 100 КОЕ.
Фильтруют сразу же весь объем и промывают мембранный фильтр, используя необходимый объем воды (см. 5.1), разбавителя (см. 5.2.3) или нейтрализующего разбавителя (см. 5.2.2). Переносят мембранный фильтр на поверхность соответствующей агаризованной питательной среды.
Параллельно готовят контрольный посев при условиях, описанных выше, но без добавления продукции. Фильтруют и промывают контрольный мембранный фильтр при тех же условиях.
После инкубации в течение 3 — 5 сут при температуре (25 +/- 2,5) °C или в альтернативных условиях (см. примечания к 4.2 и 4.3) производят подсчет колоний на мембранных фильтрах и сравнивают с результатами на контрольном мембранном фильтре. Метод мембранной фильтрации и разбавитель считают удовлетворяющими требованиям, если количество микроорганизмов, подсчитанных в тесте на пригодность, составляет не менее 50% (0,3 log) от количества микроорганизмов на контрольном посеве.
Протокол испытания должен содержать:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации продукции;
d) все подробности приготовления исходной суспензии;
e) описание метода с указанием использованных нейтрализующих веществ и питательных сред;
f) сведения о пригодности метода, даже если испытание проводилось отдельно;
g) любые детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробностями, которые могут повлиять на полученные результаты.
ДРУГИЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ РАЗБАВИТЕЛИ
Любой нейтрализующий разбавитель может использоваться для приготовления исходной суспензии, если он будет проверен и будет подтверждена его пригодность. Нижеприведенные нейтрализующие разбавители являются примерами соответствующих составов. Общая информация по нейтрализации приведена в приложении D.
A.2 Жидкий бульон Eugon LT 100
Данная среда содержит компоненты, которые нейтрализуют ингибирующие вещества, присутствующие в пробе (лецитин и полисорбат 80), а также диспергирующий агент (октоксинол 9).
Растворяют последовательно в горячей воде: полисорбат 80, октоксинол 9 и яичный лецитин до их полного растворения. Растворяют другие компоненты, перемешивая при нагревании. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,0 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.
A.3 Лецитин-полисорбатный разбавитель (LP)
| - полипептон | 1,0 г; |
|---|---|
| - яичный лецитин | 0,7 г; |
| - полисорбат-80 | 20,0 г; |
| - вода | 980 см3. |
Смешивают и растворяют компоненты при нагревании. Охлаждают до температуры 25 °C перед розливом раствора в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,2 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.
Любой разбавитель может использоваться для приготовления исходной суспензии, если он будет проверен и будет подтверждена его пригодность. Приведенные ниже разбавители являются примерами соответствующих составов.
B.2 Буферный пептоновый раствор (pH 7)
| - мясной пептон | 1,0 г; |
|---|---|
| - натрия хлорид | 4,3 г; |
| - однозамещенный фосфорнокислый калий | 3,6 г; |
| - двузамещенный фосфорнокислый натрий двуводный | 7,2 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
Растворяют компоненты в горячей воде. Перемешивают и охлаждают до температуры 25 °C перед розливом раствора в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,1 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.
B.3 Фосфатный буферный раствор (pH 7,2)
| - однозамещенный фосфорнокислый калий | 34 г; |
|---|---|
| - вода | 500 см3. |
Растворяют компоненты в воде в мерной колбе вместимостью 1 000 см3. Доводят значение pH до 7,2 +/- 0,1 путем добавления приблизительно 175 см3 раствора гидроксида натрия (4,3 г/100 см3).
Затем доводят водой конечный объем раствора до 1 000 см3. Конечная концентрация раствора должна составлять 0,05 моль/дм3. Полученный раствор используют как маточный. Хранят в холодильнике.
Перед использованием разводят маточный раствор водой в соотношении 1 : 800 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Любая питательная среда может использоваться, если она проверена и будет подтверждена ее пригодность. Приведенные ниже питательные среды являются примерами соответствующих составов.
C.2.1 Питательная среда на основе картофельного агара с декстрозой с добавлением антибиотиков
| - картофельный экстракт | 4,0 г; |
|---|---|
| - глюкоза | 20,0 г; |
| - агар | 15,0 г; |
| - хлорамфеникол | 0,05 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
Перемешивают все компоненты и разливают питательную среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 5,6 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.
В качестве альтернативы применяемый хлорамфеникол может быть заменен 0,10 г бензилпенициллина калия и 0,10 г тетрациклина на кубический дециметр питательной среды, которые добавляются в виде стерильного раствора непосредственно перед применением.
C.2.2 Глюкозопептонная (GP) агаризованная среда с антибиотиками
| - глюкоза | 20,0 г; |
|---|---|
| - дрожжевой экстракт | 2,0 г; |
| - магния сульфат | 0,5 г; |
| - пептон | 5,0 г; |
| - однозамещенный фосфорнокислый калий | 1,0 г; |
| - агар | 15,0 г; |
| - хлорамфеникол | 0,05 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
Перемешивают все компоненты и разливают питательную среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH должен быть равен 5,7 +/- 0,1 при измерении при комнатной температуре.
В качестве альтернативы применяемый хлорамфеникол может быть заменен 0,10 г бензилпенициллина калия и 0,10 г тетрациклина на кубический дециметр питательной среды, которые добавляются в виде стерильного раствора непосредственно перед применением.
| - солодовый экстракт | 30,0 г; |
|---|---|
| - соевый пептон, папаиновый гидролизат соевой муки | 3,0 г; |
| - агар | 15,0 г; |
| - хлорамфеникол | 0,05 г; |
| - вода | 1 000 см3. |
Растворяют компоненты (включая хлорамфеникол) или сухую готовую среду в воде при нагревании. Разливают питательную среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 115 °C в течение 10 мин. После стерилизации pH раствора должен быть равен 5,6 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.
НЕЙТРАЛИЗАТОРЫ АНТИГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ КОНСЕРВАНТОВ И ПРОМЫВНЫЕ ЖИДКОСТИ
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНЫХ И ЕВРОПЕЙСКИХ СТАНДАРТОВ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение ссылочного международного, европейского стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
| ISO 21148 | IDT | ГОСТ ISO 21148-2020 «Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Общие требования к микробиологическому контролю (ISO 21148:2017)» |
| EN 12353 | IDT | ГОСТ EN 12353-2016 «Средства химические дезинфицирующие и антисептические. Консервация тест-микроорганизмов, используемых для определения бактерицидной (включая микроорганизмы Legionella), микобактерицидной, спорицидной, фунгицидной и вируцидной (включая бактериофаги) активности (EN 12353:2013)» |
| Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандартов: - IDT — идентичные стандарты. | ||