ГОСТ EN 15851-2013. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 в продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта и флуориметрическим детектированием
(введен в действие Приказом Росстандарта от 17.10.2013 № 1170-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов государств — членов Евразийского экономического союза, а также методик исследований (испытаний) и измерений, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности зерна» (ТР ТС 015/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2024 № 134). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ введен в действие с 01.07.2014.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2013 г. № 1170-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА B1 В ПРОДУКТАХ НА ЗЕРНОВОЙ ОСНОВЕ ДЛЯ ПИТАНИЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ И ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА
МЕТОД ВЭЖХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОАФФИННОЙ КОЛОНОЧНОЙ ОЧИСТКИ ЭКСТРАКТА И ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
Foodstuffs. Determination of aflatoxin B1 in cereal based foods for infants and young children. HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection
67.060
Дата введения 1 июля 2014 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») при участии специалистов Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 28 августа 2013 г. № 58-П)
4 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 15851:2010 «Foodstuffs. Determination of aflatoxin B1 in cereal based foods for infants and young children. HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection» (Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 в продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта и флуориметрическим детектированием).
Перевод с немецкого языка (de).
Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.
Степень соответствия — идентичная (IDT)
5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2013 г. № 1170-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 15851-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения афлатоксина B1 в продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением очистки экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом и флуориметрическим детектированием. Метод прошел валидацию путем межлабораторных испытаний проб, загрязненных афлатоксином B1 естественным и искусственным образом в диапазоне содержания от 0,07 до 0,18 мкг/кг. Подробная информация о валидации метода приведена в разделе 9 и в приложении B.
2 Нормативные ссылки
Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая все дополнения.
EN ISO 3696:1995 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
Анализируемую пробу экстрагируют смесью метанола и воды. Экстракт фильтруют, разбавляют фосфатно-хлоридным буферным раствором и пропускают через колонку с иммуноаффинным сорбентом, содержащим антитела, специфичные к афлатоксину B1, при этом происходит очистка экстракта и концентрирование афлатоксина B1. Афлатоксин B1 элюируют с колонки метанолом и определяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с применением послеколоночной дериватизации методом бромирования и детектированием по флуоресценции.
Послеколоночную дериватизацию осуществляют с использованием брома, полученного электрохимическим путем или с помощью бромида-пербромида пиридиния.
4 Реактивы
4.1 Общие положения
Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696:1995. Используемые растворители по степени чистоты должны быть пригодны для применения в анализе с помощью ВЭЖХ. Допускается использование готовых растворов, доступных для приобретения, при условии, что их характеристики не отличаются от приведенных ниже.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Утилизацию отработанных растворителей проводят в соответствии с требованиями законодательства по охране окружающей среды. Способы обезвреживания отработанных реактивов приведены в материалах Международного агентства по исследованию рака (IARC) [1].
4.2 Гелий газообразный очищенный сжатый.
4.3 Азот.
4.4 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный безводный (Na2HPO4) или гидратированный (Na2HPO4·12H2O).
4.5 Калий бромистый.
4.6 Калий хлористый.
4.7 Калий фосфорнокислый однозамещенный.
4.8 Натрий хлористый.
4.9 Натрия гидроксид.
4.10 Кислота соляная, водный раствор массовой долей w (HCl) = 37%.
4.11 Кислота соляная, раствор молярной концентрации c (HCl) = 0,1 моль/дм3
Раствор готовят разбавлением 8,28 см3 раствора соляной кислоты по 4.10 водой до 1 дм3.
4.12 Натрия гидроксид, раствор молярной концентрации c (NaOH) = 0,1 моль/дм3
Растворяют 4 г гидроксида натрия по 4.9 в 1 дм3 воды.
4.13 Раствор фосфатно-хлоридный буферный молярной концентрации натрия хлористого c (NaCl) = 120 ммоль/дм3, хлористого калия c (KCl) = 2,7 ммоль/дм3, суммы натрия фосфорнокислого и калия фосфорнокислого c (Na2HPO4 + KH2PO4) = 10 ммоль/дм3, pH = 7,4
Растворяют 8,0 г натрия хлористого по 4.8, 1,2 г безводного двухзамещенного фосфорнокислого натрия [или 2,9 г гидратированного двухзамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4·12H2O)] по 4.4, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого калия по 4.7 и 0,2 г хлористого калия по 4.6 в 900 см3 воды.
Значение pH приготовленного раствора доводят до 7,4 ед. pH путем добавления раствора соляной кислоты по 4.11, либо раствора гидроксида натрия по 4.12, после чего объем раствора доводят водой до 1 дм3. В качестве альтернативы допускается использовать доступный для приобретения таблетированный препарат или готовый раствор с аналогичными характеристиками.
4.14 Пиридиния бромид-пербромид (CAS 39416-48-3).
4.15 Ацетонитрил.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Ацетонитрил является токсичным веществом, поэтому все операции по приготовлению растворов, содержащих ацетонитрил, следует проводить в вытяжном шкафу с использованием взрывобезопасного перемешивающего устройства. Фильтрование растворов, содержащих ацетонитрил, следует проводить также в вытяжном шкафу.
4.16 Метанол для ВЭЖХ.
4.17 Метанол технический.
4.18 Толуол.
4.19 Экстрагент
Смешивают 8 объемных частей метанола по 4.17 с двумя объемными частями воды.
4.20 Кислота азотная, раствор молярной концентрации c (HNO3) = 4 моль/дм3.
4.21 Подвижная фаза A для использования при послеколоночной дериватизации бромидом-пербромидом пиридиния
Смешивают шесть объемных частей воды с двумя объемными частями ацетонитрила по 4.15 и тремя объемными частями метанола по 4.16. Перед использованием подвижную фазу дегазируют, например, с помощью гелия по 4.2.
4.22 Подвижная фаза B для использования при послеколоночной дериватизации бромом, полученным электрохимическим путем
Смешивают шесть объемных частей воды с двумя объемными частями ацетонитрила по 4.15 и тремя объемными частями метанола по 4.16. Добавляют из расчета на 1 дм3 подвижной фазы по 120 мг бромистого калия по 4.5 и по 350 мм3 азотной кислоты по 4.20. Перед использованием подвижную фазу дегазируют, например, с помощью гелия по 4.2.
4.23 Реактив для послеколоночной дериватизации
Растворяют 50 мг бромида-пербромида пиридиния по 4.14 в 1 дм3 воды. Реактив используют в сочетании с подвижной фазой A по 4.21. Срок годности раствора — четыре дня при хранении в темном месте при комнатной температуре.
4.24 Смесь толуола и ацетонитрила
Смешивают девять объемных частей толуола по 4.18 с одной объемной частью ацетонитрила по 4.15.
4.25 Колонка с иммуноаффинным сорбентом
Для проведения испытания пригодна колонка с иммуноаффинным сорбентом с иммобилизованными антителами, специфичными в отношении афлатоксина B1, имеющая сорбционную емкость по отношению к афлатоксину B1 не менее 100 нг и обеспечивающая полноту обнаружения не менее 80% при внесении в нее 5 нг афлатоксина B1 в растворе, состоящем из 10 объемных частей метанола и 90 объемных частей воды.
4.26 Афлатоксин B1 кристаллический или в виде ампульного препарата в пленочной форме, либо в виде раствора, доступного для приобретения.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Афлатоксины подвержены фотохимическому разложению. Лабораторное помещение, в котором проводятся испытания, должно быть в достаточной мере защищено от доступа дневного света. Это достигается путем аппликации на окна пленки, поглощающей ультрафиолетовый свет, в сочетании с обеспечением отсутствия доступа прямого солнечного света, либо путем применения занавесей или жалюзи при искусственном освещении, при этом в качестве источников света допустимо использовать люминесцентные лампы.
Растворы афлатоксинов следует всеми возможными мерами защищать от доступа света путем хранения в темном месте в сосудах из темного стекла или обернутых алюминиевой фольгой.
4.27 Афлатоксин B1, основной раствор массовой концентрации c = 10 мкг/см3
Готовят основной раствор афлатоксина B1 массовой концентрации около 10 мкг/см3 в смеси толуола с ацетонитрилом по 4.24.
Для определения точной массовой концентрации афлатоксина B1 в основном растворе регистрируют его оптическую плотность в диапазоне длин волн от 330 до 370 нм в кварцевой кювете длиной оптического пути 1 см с использованием спектрофотометра по 5.14. В качестве раствора сравнения используют смесь толуола с ацетонитрилом по 4.24. По полученному спектру определяют длину волны, соответствующую максимальной оптической плотности. Массовую концентрацию афлатоксина B1, \rho_{afl} , мкг/см3, рассчитывают по формуле
\rho_{afl} = \frac{A_{max}M100}{\epsilon b} , (1)
где Amax — максимальное значение оптической плотности в данном диапазоне длин волн (между 330 и 370 нм);
M — молярная масса афлатоксина B1, г/моль (M = 312 г/моль);
\epsilon — молярный коэффициент поглощения афлатоксина B1 в смеси толуола с ацетонитрилом по 4.24, м2/моль (\epsilon = 1930\text{м}^{2}/\text{моль}) [2];
b — длина оптического пути кюветы, см.
Основной раствор хранят при температуре около минус 18 °C. Перед использованием раствор выдерживают до достижения комнатной температуры. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет как правило 12 мес. При хранении основного раствора более 12 мес перед его использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации афлатоксина B1 ранее установленному значению.
4.28 Афлатоксин B1, стандартный раствор массовой концентрации \rho = 5,00\text{нг}/\text{см}^{3}
Пипеткой отбирают порцию основного раствора по 4.27, содержащую точно 1,00 мкг афлатоксина B1, и помещают ее в мерную колбу вместимостью 200 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки смесью толуола с ацетонитрилом по 4.24. Массовая концентрация афлатоксина B1 в полученном стандартном растворе составляет 5,00 нг/см3.
Раствор хранят при температуре не выше минус 4 °C в колбе, плотно обернутой алюминиевой фольгой. Перед использованием алюминиевую фольгу удаляют после достижения раствором комнатной температуры с целью предотвращения попадания конденсата внутрь колбы. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет не менее четырех недель.
4.29 Афлатоксин B1, раствор массовой концентрации \rho = 2\text{мкс}/\text{см}^{3} для внесения в пробу при контроле полноты обнаружения
Пипеткой отбирают порцию основного раствора по 4.27, содержащую точно 20 мкг афлатоксина B1, и помещают ее в мерную колбу вместимостью 10 см3. Растворитель (смесь толуола с ацетонитрилом) удаляют досуха в токе азота при комнатной температуре, после чего объем содержимого в колбе доводят до метки метанолом по 4.16, содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксина B1 в полученном растворе составляет 2 мкг/см3.
Раствор хранят при температуре не выше минус 4 °C в колбе, плотно обернутой алюминиевой фольгой. Перед использованием алюминиевую фольгу удаляют после достижения раствором комнатной температуры с целью предотвращения попадания конденсата внутрь колбы. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет не менее 3 мес.
5 Аппаратура
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Всю стеклянную лабораторную посуду, контактирующую при проведении испытания с водными растворами афлатоксинов, перед использованием ополаскивают раствором кислоты. Данная процедура является составной частью программы работы многих машин для мойки лабораторной посуды. В качестве альтернативы стеклянную посуду, контактирующую с водными растворами афлатоксинов, помещают на длительный срок (например, на 15 ч на ночь) в раствор серной кислоты концентрации 2 моль/дм3, после чего тщательно (не менее трех раз) ополаскивают водой для полного удаления кислоты. Полноту удаления кислоты контролируют с помощью индикаторной бумаги.
Необходимость данной процедуры обусловлена потерями афлатоксинов при контакте их растворов со стеклянной посудой, не обработанной кислотой. Обработка кислотой необходима в отношении круглодонных колб, мерных колб и цилиндров, стеклянных колб и сосудов для градуировочных растворов и раствора пробы для хроматографического анализа, в особенности, для флаконов к автосамплеру, а также для пастеровских пипеток, используемых при отборе градуировочных растворов и экстрактов.
При проведении испытания используют общеупотребительные лабораторные приборы и оборудование, в частности, перечисленные ниже.
5.1 Весы аналитические, пригодные для взвешивания с точностью до 0,0001 г.
5.2 Весы лабораторные, пригодные для взвешивания с точностью до 0,01 г.
5.3 Встряхиватель лабораторный вертикального или горизонтального типа с возможностью регулировки скорости встряхивания.
5.4 Фильтры складчатые диаметром, например, 24 см.
5.5 Колбы конические с винтовой крышкой или стеклянной пробкой вместимостью 500 см3.
5.6 Фильтры из стеклянного микроволокна, задерживающие частицы размером не менее 1,6 мкм, или аналогичные.
5.7 Резервуары вместимостью 75 см3 с адаптером типа люер-лок в комплекте с приспособлениями для подсоединения иммуноаффинных колонок.
5.8 Насос ручной объемом цилиндра 20 см3, снабженный адаптером типа люер-лок или резиновой втулкой для соединения с иммуноаффинной колонкой.
5.9 Колбы мерные вместимостью 5, 10, 20, 150 и 200 см3 точностью не ниже 0,5%.
5.10 Фильтры мембранные шприцевые размером диаметра пор 0,45 мкм
Перед использованием следует убедиться в отсутствии потерь афлатоксина B1 при фильтрации путем установления полноты его обнаружения.
Примечание - Некоторые фильтрующие материалы могут задерживать афлатоксин B1.
5.11 Пипетки вместимостью 2 и 10 см3.
5.12 Микрошприцы или микропипетки градуированные вместимостью от 25 до 500 мм3.
5.13 Система для ВЭЖХ в указанной ниже комплектации:
5.13.1 Инжектор, обеспечивающий объем ввода 1000 мм3 (рекомендуется полное заполнение петли).
Объем инжекции может быть меньше указанного при условии обеспечения предела обнаружения афлатоксина B1 не более 0,05 мкг/кг (при отношении уровня аналитического сигнала к уровню шума, равном 3) и предела количественного определения не более 0,1 мкг/кг. Предел количественного определения устанавливают путем многократных анализов стандартного раствора афлатоксина B1 массовой концентрации, соответствующей содержанию афлатоксина B1 в пробе 0,1 мкг/кг. При этом относительное стандартное отклонение аналитического сигнала не должно превышать 10%. Полученные результаты документируют.
5.13.2 Насос для подачи подвижной фазы, обеспечивающий скорость подачи подвижной фазы 1 см3/мин.
5.13.3 Детектор флуориметрический, снабженный оптическим фильтром для выделения длины волны возбуждения 360 нм и отсекающим оптическим фильтром для выделения диапазона длин волн эмиссии выше 420 нм, или аналогичный детектор, например, снабженный монохроматорами.
5.13.4 Самописец, интегратор или компьютерная система обработки данных.
5.13.5 Колонка для ВЭЖХ аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например, с привитыми октадецильными группами (C18 или ODS-2), снабженная соответствующей обращенно-фазовой защитной колонкой.
Для проведения испытания пригодна колонка, обеспечивающая отделение пика афлатоксина B1 от сопутствующих пиков матрицы пробы. Перекрывание пика афлатоксина B1 другими пиками не должно превышать 10% его высоты. При необходимости для достижения требуемой степени разделения пиков проводят корректировку состава подвижной фазы.
5.13.6 Система для послеколоночной дериватизации с использованием бромида-пербромида пиридиния (применяется только с подвижной фазой A по 4.21), состоящая из насоса, обеспечивающего отсутствие пульсаций скорости потока, соединительного элемента для трех капилляров, имеющего нулевой мертвый объем, и реактора в виде капилляра из политетрафторэтилена длиной 45 см и внутренним диаметром 0,5 мм.
5.13.7 Система для послеколоночной дериватизации с использованием брома, полученного электрохимическим путем (применяется только с подвижной фазой B по 4.22), например, ячейка KOBRA® <1>.
<1> Ячейка KOBRA — торговое наименование подходящего изделия, доступного для приобретения. Эта информация дана для удобства применения настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данного изделия. Допускается использовать другие изделия с аналогичными техническими характеристиками.
5.13.8 Дегазатор подвижной фазы (применяется по выбору пользователя).
5.14 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, в комплекте с кварцевыми кюветами.
6 Процедура проведения испытания
6.1 Экстракция
Перед отбором пробы для анализа лабораторную пробу тщательно перемешивают.
50 г пробы для анализа, измеренной с точностью до 0,1 г, помещают коническую колбу вместимостью 500 см3. В колбу добавляют 5 г хлористого натрия по 4.8 и 250 см3 экстрагента по 4.19. Содержимое колбы встряхивают сначала вручную в течение 15 — 30 с, затем с использованием встряхивателя по 5.3 в течение 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через складчатый фильтр по 5.4. Пипеткой по 5.11 отбирают аликвоту фильтрата объемом 10 см3 и переносят ее в мерную колбу вместимостью 100 см3 по 5.9. Объем содержимого в колбе доводят до метки фосфатно-хлоридным буферным раствором по 4.13. Содержимое колбы снова фильтруют через фильтр из стеклянного микроволокна по 5.6. Аликвоту фильтрата объемом от 50 до 100 см3 переносят в резервуар по 5.7, присоединенный к предварительно кондиционированной иммуноаффинной колонке по 4.25. Дальнейшую очистку экстракта на иммуноаффинной колонке проводят в соответствии с 6.2.
6.2 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом
Очистку экстракта проводят с применением разрежения либо избыточного давления, либо жидкость протекает через колонку под действием собственной силы тяжести. При этом скорость протока не должна превышать предельно допустимой величины для данной колонки. Соблюдение данного требования требует особого внимания при применении разрежения.
Иммуноаффинную колонку по 4.25 подготавливают к использованию в соответствии с инструкцией изготовителя. Если в этой инструкции предписано избегать попадания воздуха в колонку, на соблюдение этого требования обращают особое внимание. Перед кондиционированием колонку выдерживают до достижения ею комнатной температуры.
Аликвоту фильтрованного экстракта пропускают через колонку со скоростью около 3 см3/мин (примерно одна капля в секунду), но не более 5 см3/мин. Далее колонку промывают фосфатно-хлоридным буферным раствором по 4.13 объемом около 15 см3 порциями по 5 см3 при скорости протока не более 5 см3/мин. По окончании промывания колонку высушивают, для чего на выходе из нее создают небольшое разрежение в течение 5 — 10 с или пропускают через нее воздух с помощью шприца в течение 10 с.
6.3 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа
Афлатоксин B1 элюируют с колонки, для чего через нее пропускают 0,50 см3 метанола по 4.16 под действием силы тяжести. Элюат собирают в мерную колбу по 5.9 вместимостью 5 см3. Колонку оставляют в покое на 1 мин, после чего через нее пропускают вторую порцию метанола по 4.16 объемом 0,75 см3. Элюирование заканчивают продуванием колонки воздухом с целью сбора максимально возможного количества элюата. Объем содержимого колбы с элюатом доводят до метки водой, содержимое колбы тщательно перемешивают. Если полученный раствор прозрачен, его непосредственно используют для хроматографического анализа. Если раствор непрозрачен, перед хроматографическим анализом его фильтруют через мембранный шприцевой фильтр по 5.10.
Примечание - Для иммуноаффинных колонок различных изготовителей операции пропускания экстракта через колонку, промывки колонки и элюирования несколько различаются, поэтому при их проведении следует руководствоваться прилагаемой к колонке инструкцией по ее использованию.
6.4 Процедура проведения испытания пробы с добавкой афлатоксина B1
Для контроля полноты обнаружения афлатоксина B1 проводят испытание пробы с добавкой метанольного раствора афлатоксина B1 по 4.29. Содержание афлатоксина B1 в пробе должно находиться в пределах диапазона градуировки, желательно, в середине этого диапазона. В пробу пипеткой по 5.11 добавляют не более 2 см3 раствора афлатоксина B1, после чего пробу выдерживают в темноте в течение 0,5 — 2 ч для удаления растворителя.
7 Анализ с помощью ВЭЖХ
7.1 Условия хроматографического анализа
Хроматографический анализ афлатоксина B1 проводят при комнатной температуре с использованием обращенно-фазовой колонки по 5.13.5 и подвижной фазы подходящего состава по 4.21 или 4.22 в изократическом режиме при объеме инжекции 1000 мм3. Для обеспечения максимальной прецизионности рекомендуется полностью заполнять петлю инжектора анализируемым раствором (см. 5.13.1). При использовании колонки внутренним диаметром 4,6 мм рекомендуется устанавливать скорость подачи подвижной фазы 1 см3/мин. Допускается использовать колонки других размеров при условии обеспечения требуемого предела количественного определения, что должно быть подтверждено экспериментально. В этом случае подбирают оптимальную скорость подачи подвижной фазы применительно к размерам колонки.
Время удерживания пика афлатоксина B1 составляет около 11 мин. Необходимым условием является достижение отделения пика афлатоксина B1 от пиков других компонентов матрицы пробы на уровне базовой линии. Для достижения максимальной эффективности и степени разделения пиков состав подвижной фазы корректируют добавлением воды, метанола по 4.16 или ацетонитрила по 4.15. Типичная хроматограмма приведена в приложении A.
7.2 Условия послеколоночной дериватизации
При дериватизации бромидом-пербромидом пиридиния используют систему для послеколоночной дериватизации. Дериватизацию проводят при скорости подачи подвижной фазы 1,0 см3/мин и скорости подачи дериватизирующего реактива 0,30 см3/мин (значение этого параметра корректируют в зависимости от скорости протока подвижной фазы).
При дериватизации бромом, полученным электрохимическим путем (например, с использованием ячейки KOBRA® ) электрохимическую ячейку устанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя и проводят дериватизацию при скорости протока подвижной фазы 1,0 см3/мин и силе тока электролиза 100 мА.
7.3 Приготовление градуировочных растворов
В мерные колбы вместимостью 10 см3 пипеткой вносят стандартный раствор афлатоксина B1 по 4.28 в объемах, указанных в таблице 1. Растворитель удаляют досуха в токе азота при комнатной температуре. Далее в колбы вносят по 3,5 см3 метанола по 4.16 для перерастворения афлатоксина B1. Объем содержимого в колбах доводят до метки водой, содержимое колб тщательно перемешивают. При соблюдении указанных параметров диапазон массовых концентраций афлатоксина B1 в градуировочных растворах соответствует диапазону его содержания в пробе от 0,05 мкг/кг до 0,35 мкг/кг.
Примечание - При смешивании метанола с водой имеет место уменьшение объема смеси по отношению к суммарному объему компонентов.
Приготовление градуировочных растворов
| Градуировочный раствор | Объем стандартного раствора афлатоксина B1 по 4.28 массовой концентрации 5,00 нг/см3, взятый для приготовления градуировочного раствора, мм3 | Массовая концентрация афлатоксина B1 в градуировочном растворе, нг/см3 |
|---|---|---|
| 1 | 20 | 0,01 |
| 2 | 40 | 0,02 |
| 3 | 60 | 0,03 |
| 4 | 80 | 0,04 |
| 5 | 100 | 0,05 |
| 6 | 120 | 0,06 |
| 7 | 140 | 0,07 |
Для приготовления градуировочных растворов используют пипетки либо другие доступные градуированные стеклянные средства измерения объема.
7.4 Построение градуировочного графика
Градуировку осуществляют в день проведения испытания перед хроматографическим анализом растворов проб, для чего проводят хроматографический анализ градуировочных растворов, приготовленных в соответствии с таблицей 1, при объеме инжекции 1000 мм3. При построении градуировочного графика в системе координат откладывают значения массовой концентрации афлатоксина B1 против соответствующих значений площади пика. Полученный график проверяют на соответствие требованиям линейности.
Если содержание афлатоксина B1 в пробе превышает верхнюю границу диапазона градуировки, проводят новую градуировку, соответствующим образом изменив ее диапазон. В качестве альтернативы анализируемый раствор пробы разбавляют до получения в нем массовой концентрации афлатоксина B1 в пределах диапазона градуировки.
7.5 Определение афлатоксина B1 в растворе пробы
Проводят хроматографический анализ растворов проб по 6.3 при тех же условиях что были использованы при анализе градуировочных растворов.
7.6 Подтверждение правильности идентификации пика афлатоксина B1
Для подтверждения правильности идентификации пика афлатоксина B1 выходной конец колонки отсоединяют от системы послеколоночной дериватизации, подсоединяют его непосредственно к флуориметрическому детектору. При отключенной системе послеколоночной дериватизации аналитический сигнал, относящийся к пику афлатоксина B1, существенно меньше (в десять раз или более). При использовании электрохимической ячейки данный способ не следует реализовывать, отключив ток электролиза и оставив ячейку подсоединенной к хроматографу, поскольку мембрана ячейки может содержать остаточный бром.
Альтернативным способом идентификации пика афлатоксина B1 является хроматографический анализ с применением масс-спектрометрического или тандемного масс-спектрометрического детекторов.
8 Обработка результатов
По градуировочному графику определяют массовую концентрацию афлатоксина B1, нг/см3, в растворе пробы для анализа.
Содержание афлатоксина B1 в пробе, wafla, мкг/кг, рассчитывают по формуле
w_{afla} = \frac{\rho_{afla}V_{1}V_{3}}{V_{2}m_{s}} , (2)
где \rho_{afla} — массовая концентрация афлатоксина B1 в растворе пробы для хроматографического анализа, определенная по градуировочному графику, нг/см3;
V1 — объем экстрагента, использованный для экстракции, см3 (V1 = 250 см3);
V2 — объем аликвоты неразбавленного экстракта, отобранной для очистки на иммуноаффинной колонке, см3 [V2 = (5 — 10) см3];
V3 — объем приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа, см3 (V3 = 5 см3);
ms — масса анализируемой пробы, г (ms = 50 г).
9 Прецизионность
9.1 Общие положения
Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности метода приведены в таблице B.1 (приложение B). Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, чем те, что указаны в приложении B.
9.2 Повторяемость
Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в одной лаборатории одним оператором с использованием одного оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.
Значения предела повторяемости для продуктов для питания грудных детей и детей раннего возраста равны:
\overline{x} = 0,10\text{мкг}/\text{кг} , r = 0,011 мкг/кг (проба с искусственным внесением афлатоксина B1);
\overline{x} = 0,18\text{мкг}/\text{кг} , r = 0,067 мкг/кг (проба с искусственным внесением афлатоксина B1);
\overline{x} = 0,07\text{мкг}/\text{кг} , r = 0,028 мкг/кг;
\overline{x} = 0,09\text{мкг}/\text{кг} , r = 0,020 мкг/кг;
\overline{x} = 0,17\text{мкг}/\text{кг} , r = 0,059 мкг/кг.
9.3 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.
Значения предела воспроизводимости для продуктов для питания грудных детей и детей раннего возраста равны:
\overline{x} = 0,10\text{мкг}/\text{кг} , R = 0,034 мкг/кг (проба с искусственным внесением афлатоксина B1);
\overline{x} = 0,18\text{мкг}/\text{кг} , R = 0,118 мкг/кг (проба с искусственным внесением афлатоксина B1);
\overline{x} = 0,07\text{мкг}/\text{кг} , R = 0,048 мкг/кг;
\overline{x} = 0,09\text{мкг}/\text{кг} , R = 0,022 мкг/кг;
\overline{x} = 0,17\text{мкг}/\text{кг} , R = 0,109 мкг/кг.
10 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен содержать как минимум следующие сведения:
a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;
b) ссылку на настоящий стандарт;
c) дату и время отбора пробы (если известны);
d) дату поступления пробы в лабораторию;
f) результаты испытания с указанием единиц измерения;
g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;
h) все операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания.
Рисунок A.1 — Пример типичной хроматограммы при определении афлатоксина B1 в продукте для питания детей раннего возраста с применением очистки экстракта на иммуноаффинной колонке. Содержание афлатоксина B1 — 0,1 мкг/кг
Условия хроматографического анализа:
Колонка: Supelcosil®LC - 18 <1> длиной 25 см, размером внутреннего диаметра 4,6 мм.
<1> Supelcosil® — торговое наименование подходящего изделия, доступного для приобретения. Эта информация дана для удобства применения настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данного изделия. Допускается использовать другие изделия, обеспечивающие аналогичную эффективность хроматографического разделения.
Скорость протока подвижной фазы — 1 см3/мин.
Состав подвижной фазы — подвижная фаза B по 4.22.
Температура колонки — комнатная.
Способ послеколоночной дериватизации — дериватизация бромом, полученным электрохимическим путем.
Условия детектирования — измерение флуоресценции при длине волны возбуждения 365 нм, длине волны эмиссии 435 нм и ширине оптической щели 18 нм.
ДАННЫЕ ПО ПРЕЦИЗИОННОСТИ МЕТОДА
Приведенные в таблице B.1 данные получены в результате межлабораторных испытаний, организованных в рамках Программы по стандартизации, измерениям и испытаниям Европейского сообщества [3] в соответствии с ISO 5725-2 [4], ISO 5725-4 [5] и ISO 5725-6 [6]. Для этих испытаний использованы пробы продуктов для питания грудных детей и детей раннего возраста, загрязненные афлатоксином B1 как естественным, так и искусственным образом. Предел количественного определения афлатоксина B1 составлял 0,05 мкг/кг применительно к модели использованного детектора.
Данные по прецизионности метода для продуктов для детского питания
| 1 | 2 | ||||
| 3 <*> | 4 <*> | 5 <*> | Год проведения испытаний | 1999 | |
| 1999 | 1999 | 1999 | 1999 | Количество лабораторий-участников | 14 |
| 14 | 14 | 14 | 14 | Количество параллельных проб | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 11 |
| 14 | 14 | 11 | 13 | Количество выбросов (лабораторий) | 3 |
| 0 | 0 | 3 | 1 | Число принятых результатов | 11 |
| 14 | 14 | 11 | 13 | Среднее значение \overline{x} , мкг/кг | 0,10 |
| 0,18 | 0,07 | 0,09 | 0,17 | Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/кг | 0,004 |
| 0,024 | 0,010 | 0,007 | 0,021 | Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 3,5 |
| 13 | 14 | 8 | 12 | Предел повторяемости r (r = 2,8sr), мкг/кг | 0,011 |
| 0,067 | 0,028 | 0,020 | 0,059 | Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/кг | 0,012 |
| 0,042 | 0,017 | 0,008 | 0,039 | Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 12 |
| 23 | 23 | 9 | 23 | Предел воспроизводимости R (R = 2,8sR), мкг/кг | 0,034 |
| 0,118 | 0,048 | 0,022 | 0,109 | Полнота обнаружения, % a | 101 |
| 92 | - | - | - | Значение индекса Горвица, рассчитанное по [[7]](#p100375) | 0,19 |
| 0,39 | 0,34 | 0,14 | 0,39 | Значение индекса Горвица, рассчитанное по [[8]](#p100377) | 0,55 |
| 1,05 | 1,01 | 0,41 | 1,05 | <*> Проба, загрязненная афлатоксином B1 естественным образом. | |