ГОСТ EN 15850-2013. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение зеараленона в продуктах для детского питания на кукурузной основе, ячменной, кукурузной и пшеничной муке, поленте и продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта и флуориметрическим детектированием
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 № 1710-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов государств — членов Евразийского экономического союза, а также методик исследований (испытаний) и измерений, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности зерна» (ТР ТС 015/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2024 № 134). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ введен в действие с 01.07.2015.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1710-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗЕАРАЛЕНОНА В ПРОДУКТАХ ДЛЯ ДЕТСКОГО ПИТАНИЯ НА КУКУРУЗНОЙ ОСНОВЕ, ЯЧМЕННОЙ, КУКУРУЗНОЙ И ПШЕНИЧНОЙ МУКЕ, ПОЛЕНТЕ И ПРОДУКТАХ НА ЗЕРНОВОЙ ОСНОВЕ ДЛЯ ПИТАНИЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ И ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА
МЕТОД ВЭЖХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОАФФИННОЙ КОЛОНОЧНОЙ ОЧИСТКИ ЭКСТРАКТА И ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
Foodstuffs. Determination of zearalenone in maize based baby food, barley flour, maize flour, polenta, wheat flour and cereal based foods for infants and young children. HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection
67.230
Дата введения 1 июля 2015 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») при участии специалистов Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 28 августа 2013 г. № 58-П)
4 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 15850:2010 Foodstuffs. Determination of zearalenone in maize based baby food, barley flour, maize flour, polenta, wheat flour and cereal based foods for infants and young children. HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection (Продукты пищевые. Определение зеараленона в продуктах для детского питания на кукурузной основе, ячменной, кукурузной и пшеничной муке, поленте и продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта и флуориметрическим детектированием).
Перевод с английского языка (en).
Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.
Степень соответствия — идентичная (IDT)
5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1710-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 15850-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.
7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Октябрь 2016 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения зеараленона в продуктах для детского питания на основе кукурузы, ячменной, кукурузной и пшеничной муке, поленте и продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением очистки экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом и флуориметрическим детектированием. Метод прошел валидацию путем двух межлабораторных испытаний. В одном случае объектом испытаний были пробы продуктов для детского питания на основе кукурузы, ячменная, кукурузная, пшеничная мука и полента с содержания зеараленона от 10 до 335 мкг/кг. Во втором случае объектом испытаний были пробы продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста с содержанием зеараленона от 9 до 44 мкг/кг.
Подробная информация о результатах валидации метода содержится в разделе 9 и приложении B.
2 Нормативные ссылки
Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая все дополнения.
EN ISO 3696:1995 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
Зеараленон экстрагируют из пробы водно-ацетонитрильной смесью или метанолом, в зависимости от вида пробы. Экстракт разбавляют фосфатно-хлоридным буферным раствором и пропускают через иммуноаффинную колонку, заполненную сорбентом, содержащим антитела, специфичные к зеараленону, при этом происходит очистка экстракта и концентрирование зеараленона. Зеараленон элюируют с колонки ацетонитрилом или метанолом, после чего количественно определяют с помощью ВЭЖХ с применением обращенно-фазовой аналитической колонки и флуориметрическим детектированием.
4 Реактивы
4.1 Общие положения
Для проведения испытания при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696:1995. Используемые растворители по степени чистоты должны быть пригодны для применения в анализе с помощью ВЭЖХ, если не оговорены другие условия. Допускается использование доступных для приобретения готовых растворов при условии, что их характеристики не отличаются от приведенных ниже.
4.2 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный безводный (Na2HPO4) или гидратированный (Na2HPO4·12H2O).
4.3 Калий хлористый.
4.4 Калий фосфорнокислый однозамещенный.
4.5 Натрий хлористый.
4.6 Натрия гидроксид.
4.7 Кислота соляная, водный раствор массовой долей w (HCl) = 37%.
4.8 Кислота соляная, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3
Раствор готовят разбавлением 8,28 см3 раствора соляной кислоты по 4.7 водой до 1 дм3.
4.9 Натрия гидроксид, раствор молярной концентрации c (NaOH) = 0,1 моль/дм3
Растворяют 4 г гидроксида натрия по 4.6 в 1 дм3 воды.
4.10 Раствор фосфатно-хлоридный буферный молярной концентрации хлористого натрия c (NaCl) = 120 ммоль/дм3, хлористого калия c (KCl) = 2,7 ммоль/дм3, суммы фосфатов натрия и калия c (Na2HPO4 + KH2PO4) = 10 ммоль/дм3, pH = 7,4
Растворяют 8,0 г хлористого натрия по 4.5, 1,2 г безводного двухзамещенного фосфорнокислого натрия [или 2,9 г гидратированного двухзамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4·12H2O)] по 4.2, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого калия по 4.4 и 0,2 г хлористого калия по 4.3 в 900 см3 воды.
Значение pH приготовленного раствора доводят до 7,4 путем добавления раствора соляной кислоты по 4.8 либо раствора гидроксида натрия по 4.9, после чего объем раствора доводят водой до 1 дм3.
В качестве альтернативы для приготовления раствора допускается использовать доступный для приобретения препарат с аналогичными характеристиками.
4.11 Ацетонитрил.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Ацетонитрил является токсичным веществом, поэтому все операции по приготовлению растворов, содержащих ацетонитрил, следует проводить в вытяжном шкафу с использованием взрывобезопасного перемешивающего устройства. Фильтрование растворов, содержащих ацетонитрил, следует проводить также в вытяжном шкафу.
4.12 Метанол для ВЭЖХ.
4.13 Метанол технический.
4.14 Экстрагент A
Смешивают 75 объемных частей ацетонитрила по 4.11 с 25 объемными частями воды.
4.15 Дилюент A для приготовления раствора пробы для анализа с помощью ВЭЖХ
Смешивают четыре объемных части ацетонитрила по 4.11 с шестью объемными частями воды.
4.16 Подвижная фаза A для ВЭЖХ
Подвижную фазу готовят смешиванием 53 объемных частей ацетонитрила по 4.11 с 47 объемными частями воды. Перед использованием подвижную фазу фильтруют и дегазируют.
4.17 Экстрагент B
Смешивают 75 объемных частей метанола по 4.13 с 25 объемными частями воды.
4.18 Растворитель для промывания иммуноаффинной колонки
Смешивают 15 объемных частей метанола по 4.12 с 85 объемными частями фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10.
4.19 Дилюент B для приготовления раствора пробы для анализа с помощью ВЭЖХ
Смешивают пять объемных частей метанола по 4.12 с пятью объемными частями воды.
4.20 Подвижная фаза B для ВЭЖХ
Смешивают 75 объемных частей метанола по 4.12 с 25 объемными частями воды. Перед использованием подвижную фазу фильтруют и дегазируют.
4.21 Колонка с иммуноаффинным сорбентом
Для проведения испытания пригодна колонка с иммуноаффинным сорбентом с иммобилизованными антителами, специфичными в отношении зеараленона, имеющая сорбционную емкость по зеараленону не менее 1500 нг и обеспечивающая полноту обнаружения не менее 80% при внесении в нее 75 нг зеараленона в 10 см3 раствора, состоящего из 15 объемных частей метанола и 85 объемных частей фосфатно-хлоридного буферного раствора.
4.22 Зеараленон кристаллический или в виде ампульного препарата в пленочной форме массовой долей основного вещества не менее 98%, или в виде готового раствора.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Зеараленон является эстрогенным веществом, поэтому с ним надлежит обращаться с особой осторожностью. Все работы, связанные с подготовкой пробы и приготовлением стандартных растворов должны проводиться в вытяжном шкафу с использованием защитной одежды, перчаток и защитных очков.
4.23 Зеараленон, основной раствор массовой концентрации 200 мкг/см3
Готовят раствор зеараленона массовой концентрации около 1,25 мг/см3 путем растворения 5 мг зеараленона по 4.22 в 4,0 см3 ацетонитрила по 4.11. Порцию полученного раствора объемом 800 мм3 разбавляют ацетонитрилом по 4.11 до объема 5 см3, получают основной раствор зеараленона массовой концентрации около 200 мкг/см3.
Раствор хранят при температуре от минус 18 °C до минус 20 °C. Перед использованием раствор выдерживают до достижения комнатной температуры. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет 12 мес. При хранении основного раствора более 6 мес перед его использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации зеараленона ранее установленному значению.
4.24 Зеараленон, основной раствор промежуточной концентрации (стандартный раствор для внесения в пробу при контроле полноты обнаружения) массовой концентрации 10 мкг/см3
Раствор зеараленона массовой концентрации около 10 мкг/см3 готовят путем смешивания 250 мм3 основного раствора зеараленона по 4.23 с 4,75 см3 ацетонитрила по 4.11.
Для определения точной массовой концентрации зеараленона в полученном растворе регистрируют его оптическую плотность в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм в кварцевой кювете длиной оптического пути 1 см с использованием спектрофотометра по 5.25. В качестве раствора сравнения используют ацетонитрил по 4.11. По полученному спектру определяют длину волны, соответствующую максимальной оптической плотности, приблизительно равную 274 нм. Массовую концентрацию зеараленона в растворе, \rho_{zon} , мкг/см3, рассчитывают по формуле
\rho_{zon} = \frac{A_{max}M \cdot 100}{\epsilon b} , (1)
где Amax — максимальное значение оптической плотности в данном диапазоне длин волн (в данном случае при 274 нм);
M — молярная масса зеараленона, г/моль (M = 318,4 г/моль);
\epsilon — молярный коэффициент поглощения зеараленона в ацетонитриле, м2/моль, ( \epsilon = 1262\text{м}^{2}/\text{моль} по [1]);
b — длина оптического пути кюветы, см.
Раствор хранят в морозильной камере при температуре от минус 18 °C до минус 20 °C. Перед использованием раствор выдерживают до достижения комнатной температуры. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет 12 мес. При хранении основного раствора более 6 мес перед его использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации зеараленона ранее установленному значению.
4.25 Зеараленон, стандартный раствор A массовой концентрации 2,0 мкг/см3 (используется при испытании продуктов для детского питания на кукурузной основе, ячменной, кукурузной, пшеничной муки и поленты)
Аликвоту основного раствора зеараленона промежуточной концентрации по 4.24, эквивалентную 10 мкг зеараленона, переносят во флакон по 5.9 или в мерную колбу по 5.10 вместимостью 5 см3 и разбавляют ацетонитрилом до объема 5 см3.
Раствор хранят в морозильной камере при температуре от минус 18 °C до минус 20 °C. Перед использованием раствор выдерживают до достижения комнатной температуры. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет 12 мес. При хранении основного раствора более 6 мес перед его использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации зеараленона ранее установленному значению.
4.26 Зеараленон, стандартный раствор B массовой концентрации 0,4 мкг/см3 (используется при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста)
Аликвоту основного раствора зеараленона промежуточной концентрации по 4.24, эквивалентную 2 мкг зеараленона, переносят во флакон по 5.9 или в мерную колбу по 5.10 вместимостью 5 см3 и разбавляют ацетонитрилом до объема 5 см3.
Раствор хранят в морозильной камере при температуре от минус 18 °C до минус 20 °C. Перед использованием раствор выдерживают до достижения комнатной температуры. При указанных условиях хранения срок годности раствора составляет 12 мес. При хранении основного раствора более 6 мес перед его использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации зеараленона ранее установленному значению.
5 Приборы и оборудование
5.1 Общие положения
При проведении испытания используют общеупотребительные лабораторную посуду и оборудование, в частности, перечисленные ниже.
5.2 Блендер высокоскоростной или гомогенизатор.
5.3 Весы аналитические, пригодные для взвешивания с точностью до 0,0001 г.
5.4 Весы лабораторные, пригодные для взвешивания с точностью до 0,1 г.
5.5 Встряхиватель лабораторный вертикального или горизонтального типа с возможностью регулировки скорости встряхивания.
5.6 Устройство перемешивающее лабораторное (миксер) типа Вортекс или аналогичный.
5.7 Мельница лабораторная с комплектом решеток.
5.8 Миксер барабанного типа лабораторный.
5.9 Флаконы стеклянные различного объема.
5.10 Колбы мерные вместимостью 3, 5 и 10 см3.
5.11 Стакан вместимостью 250 см3.
5.12 Колбы конические с винтовой крышкой или стеклянной пробкой вместимостью 100, 250 и 500 см3.
5.13 Фильтры бумажные например, для качественного анализа, быстрофильтрующие, прочные, диаметром 24 см, размером пор 30 мкм, или аналогичные.
5.14 Фильтры из стеклянного микроволокна, задерживающие частицы размером от 1,6 мкм, или аналогичные.
5.15 Пипетки вместимостью от 25 до 250 мм3, 1,5 и 10 см3.
5.16 Микропипетки выдувные или микрошприцы газонепроницаемые вместимостью 100, 500 и 1000 мм3.
5.17 Устройство для вакуумной фильтрации многопозиционное, приспособленное для установки иммуноаффинных колонок (манифолд) или автоматизированная система для вакуумной фильтрации.
5.18 Резервуары для элюента вместимостью от 50 до 75 см3 в комплекте с приспособлениями для подсоединения иммуноаффинных колонок.
5.19 Шприцы пластиковые вместимостью 5 см3.
5.20 Насос вакуумный, пригодный для создания разрежения 1 кПа производительностью не менее 18 дм3/мин.
5.21 Устройство для вакуумной фильтрации растворителей в комплекте с фильтрами из стеклянного микроволокна диаметром 47 мм.
5.22 Фильтры мембранные нейлоновые шприцевые диаметром пор 0,45 мкм
Перед использованием следует убедиться в отсутствии потерь зеараленона при фильтрации, экспериментально проверив полноту его обнаружения.
Примечание - Некоторые фильтрующие материалы могут задерживать зеараленон.
5.23 Баня ультразвуковая лабораторная.
5.24 Система для ВЭЖХ в указанной ниже комплектации:
5.24.1 Инжектор, обеспечивающий объем ввода от 100 до 300 мм3.
5.24.2 Насос для подачи подвижной фазы, обеспечивающий скорость подачи подвижной фазы от 0,5 до 1,5 см3/мин при отсутствии пульсаций.
5.24.3 Колонка для ВЭЖХ аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом
Для проведения испытания пригодна колонка, обеспечивающая отделение пика зеараленона от сопутствующих пиков других компонентов матрицы пробы. Перекрывание пика зеараленона другими пиками не должно превышать 10% его высоты.
В отношении указанных ниже колонок установлена пригодность для проведения испытания при использовании подвижной фазы A по 4.16.
Колонка длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом Phenomenex Prodigy^{®} <*> ODS-3 размером частиц 5 мкм и размером пор 25 нм и колонка длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом Spherisorb^{®} <*> ODS-2 Excel размером частиц 5 мкм и размером пор 25 нм.
Указанная ниже колонка найдена пригодной при использовании подвижной фазы B по 4.20.
Колонка длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом Supelkosil^{®} <*> (C18) с блокированными остаточными силанольными группами размером частиц 5 мкм и размером пор 18 нм.
<*> Phenomenex Prodigy® , Spherisorb^{®} и Supelkosil^{®} — примеры подходящих изделий, доступных для приобретения. Эта информация дана для удобства применения настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой указанных изделий. Допускается использование других сорбентов с аналогичными свойствами, удовлетворяющими указанным требованиям.
5.24.4 Колонка защитная внутренним диаметром 4 мм, заполненная тем же сорбентом, что и аналитическая колонка, или аналогичным, диаметром частиц 5 мкм.
5.24.5 Детектор флуориметрический с проточной кюветой, пригодный для проведения измерений при длинах волн возбуждения и эмиссии соответственно 274 или 275 нм и 446 или 450 нм.
5.24.6 Самописец, интегратор или компьютерная система обработки данных.
5.24.7 Дегазатор (применяется по выбору пользователя) для дегазации подвижной фазы.
5.25 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, в комплекте с кварцевыми кюветами.
6 Процедура проведения испытания
6.1 Экстракция
6.1.1 Экстракция при испытании ячменной, кукурузной и пшеничной муки, поленты и продуктов для детского питания на кукурузной основе
Измельченную пробу для анализа массой 25 г, измеренной с точностью до 0,1 г, помещают в стакан по 5.11. В стакан добавляют 100 см3 экстрагента A по 4.14. Содержимое стакана гомогенизируют с использованием гомогенизатора по 5.2 в течение 3 мин при высокой скорости перемешивания, после чего экстракт фильтруют через складчатый фильтр по 5.13.
Отбирают пипеткой по 5.15 аликвоту фильтрата объемом 12 см3 и помещают ее в коническую колбу по 5.12. В колбу добавляют 88 см3 фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10, содержимое колбы тщательно перемешивают. Если при этом раствор в колбе становится мутным, его количественно фильтруют через фильтр из стеклянного микроволокна по 5.14.
6.1.2 Экстракция при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста
20 г пробы для анализа, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в коническую колбу с винтовой крышкой по 5.12. В колбу добавляют 150 см3 экстрагента B по 4.17, содержимое колбы перемешивают вручную в течение нескольких секунд до получения гомогенной суспензии, после чего встряхивают в течение 1 ч с помощью встряхивателя по 5.5, либо помещают на 15 мин в ультразвуковую баню по 5.23, а затем встряхивают в течение 15 мин с помощью встряхивателя по 5.5.
Экстракт фильтруют через складчатый фильтр по 5.13 в коническую колбу по 5.12 вместимостью 100 см3. Аликвоту фильтрата объемом 30 см3 переносят в мерный цилиндр вместимостью 150 см3 с пробкой. Объем содержимого в цилиндре доводят до 150 см3 фосфатно-хлоридным буферным раствором по 4.10. Содержимое цилиндра перемешивают и фильтруют через фильтр из стеклянного микроволокна по 5.14 с помощью вакуумного насоса по 5.21 при неглубоком разрежении. Первые 20 см3 фильтрата отбрасывают, для дальнейшего анализа отбирают порцию последующего фильтрата объемом около 70 см3.
Примечание - При фильтрации экстракта не следует применять глубокое разрежение, поскольку при этом возможно получение мутного фильтрата.
После фильтрации экстракт немедленно подвергают очистке на иммуноаффинной колонке по 6.2.
6.2 Очистка экстракта на иммуноаффинной колонке
Перед кондиционированием колонку выдерживают до достижения ею комнатной температуры. Иммуноаффинную колонку по 4.21 подсоединяют к вакуумному манифолду по 5.17, к верхнему концу колонки присоединяют резервуар для элюента по 5.18.
Колонку кондиционируют путем пропускания через нее 20 см3 фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10 со скоростью от 3 до 5 см3/мин. Затем в резервуар для элюента вносят 50 см3 разбавленного и фильтрованного экстракта по 6.1.1 или 6.1.2. Экстракту дают полностью протечь через колонку под действием силы тяжести при постоянной скорости протока до тех пор, пока его уровень не достигнет верхнего фильтра колонки. При прохождении экстракта через колонку скорость протока не должна превышать одну-две капли в секунду.
После прохождения экстракта через колонку ее промывают 20 см3 воды, или, при испытании продуктов для детского питания, сначала 5 см3 растворителя для промывания по 4.18, затем 15 см3 воды со скоростью протока одна-две капли в секунду. По окончании промывания из колонки удаляют воду путем пропускания через нее около 3 см3 воздуха или азота. Элюат, полученный на стадии промывания колонки, отбрасывают.
1 Допускается использовать параметры предварительного кондиционирования и промывания колонки, оговоренные в инструкции по ее применению.
2 При проведении очистки экстракта следует обращать внимание, чтобы сорбционная емкость колонки не была превышена.
6.3 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа
6.3.1 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа при испытании ячменной, кукурузной и пшеничной муки, поленты и продуктов для детского питания на кукурузной основе
Под иммуноаффинную колонку помещают флакон по 5.9 для сбора элюата. В резервуар для элюента по 5.18 пипеткой вносят 1,5 см3 ацетонитрила по 4.11 и дают ему заполнить колонку. Колонку выдерживают в таком состоянии в течение 1 мин, после чего открывают выход растворителя и элюируют зеараленон со скоростью одна-две капли в секунду. По окончании элюирования для полного выведения из колонки растворителя и сбора всего элюата через колонку пропускают не менее 5 см3 воздуха.
Элюат выпаривают досуха в токе азота. Остаток после выпаривания растворяют в 1 см3 дилюента A по 4.15 и тщательно перемешивают с использованием миксера типа Вортекс. Полученный раствор пробы для хроматографического анализа переносят в стеклянный сосуд по 5.9.
В качестве альтернативы раствор пробы для хроматографического анализа готовят разбавлением элюата водой до определенного объема, например 3 см3.
6.3.2 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста
Под колонку помещают мерную колбу по 5.10 вместимостью 3,0 см3 для сбора элюата. Через колонку пропускают 0,75 см3 метанола по 4.12, собирая элюат. Как только весь метанол войдет в колонку, перекрывают выход элюата и выдерживают колонку в контакте с метанолом в течение 1 мин. Затем через колонку пропускают новую порцию метанола объемом 0,75 см3, собирая элюат. Для полноты сбора элюата остаток растворителя в колонке аккуратно вытесняют воздухом.
Объем содержимого в мерной колбе с элюатом доводят до метки водой, содержимое колбы перемешивают. В случае образования при разбавлении элюата мутного раствора его фильтруют через мембранный фильтр по 5.22 с помощью пластикового шприца по 5.19.
1 При смешивании метанола с водой имеет место уменьшение объема смеси по отношению к сумме объемов каждого ее компонента. Поэтому при необходимости после разбавления элюата водой и перемешивания объем содержимого в мерной колбе повторно доводят до метки водой.
2 Операции очистки экстракта на иммуноаффинной колонке и элюирования зеараленона по 6.3.1 и 6.3.2 допускается проводить с использованием соответствующей автоматизированной системы при соблюдении тех же объемных параметров и скорости протока.
6.4 Приготовление пробы с добавкой зеараленона
Для контроля полноты обнаружения готовят пробу с добавлением стандартного раствора зеараленона по 4.24. Содержание зеараленона в пробе должно находиться в пределах диапазона градуировки, желательно, на середине этого диапазона. После внесения в пробу раствора зеараленона ее выдерживают в покое в течение не менее 30 мин для удаления растворителя.
7 Анализ с помощью ВЭЖХ
7.1 Условия хроматографического анализа
Приведенные ниже параметры обеспечивают удовлетворительное качество хроматографического анализа при использовании колонки по 5.24.3 и подвижных фаз по 4.16 или 4.20 (см. хроматограммы на рисунке A.1 и рисунке A.2, приложение A):
- скорость подачи подвижной фазы от 0,7 до 1,0 см3/мин;
- длина волны возбуждения флуориметрического детектора от 274 до 275 нм;
- длина волны эмиссии флуориметрического детектора от 440 до 450 нм;
- объем инжекции: от 100 до 300 мм3.
7.2 Приготовление градуировочных растворов
Готовят пять градуировочных растворов, для чего в мерные колбы вместимостью 10 см3 пипеткой по 5.15 или микрошприцем по 5.16 вносят стандартные растворы зеараленона в объемах, указанных в таблице 1 и 2, в зависимости от вида пробы. Объем содержимого в каждой колбе доводят до метки подходящим дилюентом (дилюент A по 4.15 для приготовления растворов по таблице 1 и дилюент B по 4.19 для приготовления растворов по таблице 2).
Приготовление градуировочных растворов при испытании ячменной, кукурузной и пшеничной муки, поленты и продуктов для детского питания на кукурузной основе
| Градуировочный раствор | Объем стандартного раствора A по 4.25, взятый для приготовления градуировочного раствора, мм3 | Массовая концентрация зеараленона в градуировочном растворе, нг/см3 |
|---|---|---|
| 1 | 25 | 5 |
| 2 | 175 | 35 |
| 3 | 375 | 75 |
| 4 | 550 | 110 |
| 5 | 750 | 150 |
Приготовление градуировочных растворов при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста
| Градуировочный раствор | Объем стандартного раствора B по 4.26, взятый для приготовления градуировочного раствора, мм3 | Массовая концентрация зеараленона в градуировочном растворе, нг/см3 |
|---|---|---|
| 1 | 50 | 2 |
| 2 | 200 | 8 |
| 3 | 350 | 14 |
| 4 | 500 | 20 |
| 5 | 650 | 26 |
При приготовлении градуировочных растворов допускается использовать как пипетки, так и другие подходящие стеклянные градуированные средства измерения объема.
7.3 Построение градуировочного графика
Градуировку осуществляют ежедневно перед проведением испытаний, для чего проводят хроматографический анализ градуировочных растворов, приготовленных в соответствии с таблицей 1 или 2. При построении градуировочного графика в системе координат откладывают значения массовой концентрации зеараленона, нг/см3, против соответствующих величин аналитического сигнала в виде площади или высоты пика зеараленона. Полученный график проверяют на соответствие требованиям линейности с помощью регрессионного анализа (r2 >= 0,998).
7.4 Определение зеараленона в растворе пробы
Проводят хроматографический анализ растворов проб, приготовленных по 6.3.1 или 6.3.2, при тех же условиях, что были использованы при анализе градуировочных растворов.
7.5 Идентификация пиков
Пик зеараленона на хроматограмме раствора анализируемой пробы идентифицируют по совпадению его времени удерживания с временем удерживания пика зеараленона на хроматограммах градуировочных растворов. Необходимо, чтобы массовая концентрация зеараленона в анализируемом растворе пробы находилась в границах диапазона градуировки. Если массовая концентрация зеараленона в растворе пробы превышает верхнюю границу диапазона градуировки, раствор пробы разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ и проводят его повторный хроматографический анализ. Разбавление раствора пробы учитывают во всех последующих расчетах.
8 Обработка результатов
По градуировочному графику определяют массовую концентрацию зеараленона в растворе пробы для анализа по 6.3.1 или 6.3.2, нг/см3.
Содержание зеараленона в пробе, wzon, мкг/кг, рассчитывают по формуле
w_{zon} = \frac{\rho_{a}V_{1}V_{2}}{V_{3}m_{s}} , (2)
где \rho_{a} — массовая концентрация зеараленона в растворе пробы для хроматографического анализа, определенная по градуировочному графику, нг/см3;
V1 — объем экстрагента, использованный для экстракции, см3 (V1 = 100 см3 по 6.1.1 или V1 = 150 см3 по 6.1.2);
V2 — объем приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа, см3 (V2 = 1,0 см3 или V2 = 3,0 см3);
V3 — объем аликвоты экстракта, взятой для очистки на иммуноаффинной колонке, см3 (V3 = 6 см3 по 6.1.1 или V3 = 10 см3 по 6.1.2);
ms — масса пробы для анализа, г (ms = 25 г по 6.1.1 или ms = 20 г по 6.1.2).
При соблюдении всех параметров, указанных в методике, содержание зеараленона рассчитывают по следующим упрощенным формулам.
При экстракции по 6.1.1 и объеме приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа 1 см3:
При экстракции по 6.1.1 и объеме приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа 3 см3:
При экстракции по 6.1.2 и объеме приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа 3 см3:
9 Прецизионность
9.1 Общие положения
Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности метода для продуктов для детского питания на кукурузной основе, ячменной, кукурузной, пшеничной муки и поленты приведены в таблице B.1, приложение B. Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности метода для продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста приведены в таблице B.2, приложение B. Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, чем те, что указаны в приложении B.
9.2 Повторяемость
Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в одной лаборатории одним оператором с использованием одного оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.
При проведении экстракции по 6.1.1 предел повторяемости равен следующим значениям:
\overline{x} = 10,9\text{мкг}/\text{кг} , r = 11,0 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 143\text{мкг}/\text{кг} , r = 27,5 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 87,2\text{мкг}/\text{кг} , r = 34,8 мкг/кг (проба, загрязненная зеараленоном естественным путем);
\overline{x} = 335\text{мкг}/\text{кг} , r = 82,9 мкг/кг (проба, загрязненная зеараленоном естественным путем);
\overline{x} = 66,5\text{мкг}/\text{кг} , r = 16,6 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 227\text{мкг}/\text{кг} , r = 52,9 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона).
Для продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста при проведении экстракции по 6.1.2 предел повторяемости равен следующим значениям:
\overline{x} = 9,1\text{мкг}/\text{кг} , r = 1,5 мкг/кг (проба, загрязненная естественным путем);
\overline{x} = 17,1\text{мкг}/\text{кг} , r = 2,5 мкг/кг (проба, загрязненная естественным путем);
\overline{x} = 44,0\text{мкг}/\text{кг} , r = 3,4 мкг/кг (проба, загрязненная естественным путем);
\overline{x} = 18,4\text{мкг}/\text{кг} , r = 4,5 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 26,6\text{мкг}/\text{кг} , r = 4,2 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона).
9.3 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.
При проведении экстракции по 6.1.1 предел воспроизводимости равен следующим значениям:
\overline{x} = 10,9\text{мкг}/\text{кг} , R = 11,7 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 143\text{мкг}/\text{кг} , R = 71,8 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 87,2\text{мкг}/\text{кг} , R = 50,4 мкг/кг (проба, загрязненная зеараленоном естественным путем);
\overline{x} = 335\text{мкг}/\text{кг} , R = 343,7 мкг/кг (проба, загрязненная зеараленоном естественным путем);
\overline{x} = 66,5\text{мкг}/\text{кг} , R = 30,6 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 227\text{мкг}/\text{кг} , R = 107,9 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона).
Для продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста при проведении экстракции по 6.1.2 предел воспроизводимости равен следующим значениям:
\overline{x} = 9,1\text{мкг}/\text{кг} , R = 3,3 мкг/кг (проба, загрязненная естественным путем);
\overline{x} = 17,1\text{мкг}/\text{кг} , R = 6,2 мкг/кг (проба, загрязненная естественным путем);
\overline{x} = 44,0\text{мкг}/\text{кг} , R = 12,5 мкг/кг (проба, загрязненная естественным путем);
\overline{x} = 18,4\text{мкг}/\text{кг} , R = 6,6 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона);
\overline{x} = 26,6\text{мкг}/\text{кг} , R = 6,1 мкг/кг (проба с искусственным внесением зеараленона).
10 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен содержать, как минимум, следующие сведения:
a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;
b) ссылку на настоящий стандарт;
c) дату и способ отбора пробы (если известны);
d) дату поступления пробы в лабораторию;
f) результаты испытания с указанием единиц измерения;
g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;
h) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания.
Рисунок A.1 — Хроматограмма пробы пшеницы, загрязненной зеараленоном естественным путем. Содержание зеараленона 190 мкг/кг. Условия хроматографического анализа — по 7.1
Рисунок A.2 — Хроматограмма пробы пшеницы, загрязненной зеараленоном естественным путем. Содержание зеараленона 36 мкг/кг. Условия хроматографического анализа — по 7.1
ДАННЫЕ ПО ПРЕЦИЗИОННОСТИ МЕТОДА
Приведенные в таблице B.1 данные получены в результате межлабораторных испытаний [2], [3], проведенных в соответствии с руководством АОАС по проведению межлабораторных испытаний для определения характеристик эффективности методов анализа [4].
Данные по прецизионности методики при проведении экстракции по 6.1.1
| Наименование показателя | Продукт для детского питания на кукурузной основе (проба с искусственным внесением зеараленона) | Мука ячменная (проба с искусственным внесением зеараленона) | Мука кукурузная (проба, загрязненная зеараленоном естественным путем) | Полента (проба с искусственным внесением зеараленона) | Мука пшеничная (проба с искусственным внесением зеараленона) | Мука кукурузная (проба, загрязненная зеараленоном естественным путем) |
| Год проведения испытаний | 2002 | 2002 | 2002 | 2002 | 2002 | 2002 |
| Количество лабораторий-участников | 29 | 29 | 29 | 29 | 29 | 28 |
| Число исключенных результатов | 28 | 28 | 29 | 29 | 29 | 27 |
| Количество выбросов (лабораторий) | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Число принятых результатов | 23 | 25 | 27 | 27 | 27 | 27 |
| Среднее значение \overline{x} , мкг/кг | 10,9 | 143 | 87,2 | 66,5 | 227 | 335 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/кг | 3,9 | 9,8 | 12,4 | 5,9 | 18,9 | 29,6 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 35,8 | 6,9 | 14,2 | 8,9 | 8,3 | 8,8 |
| Предел повторяемости r (r = 2,8 sr), мкг/кг | 11,0 | 27,5 | 34,8 | 16,6 | 52,9 | 82,9 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/кг | 4,2 | 25,6 | 18,0 | 10,9 | 38,6 | 123 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % | 38,2 | 17,9 | 20,6 | 16,4 | 17 | 36,6 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,8 sR), мкг/кг | 11,7 | 71,8 | 50,4 | 30,6 | 108 | 344 |
| Полнота обнаружения, % <*> | 100 | 92 | 91 | 91 | 95 | 98 |
| Значение индекса Горвица, рассчитанное из прогнозируемого стандартного отклонения по уравнению Томпсона [[5]](#p100543), [[6]](#p100545). | 1,7 | 0,8 | 0,9 | 0,7 | 0,9 | 1,9 |
| <*> Значения полноты обнаружения получены независимо каждой лабораторией по результатам испытаний единичной пробы каждого вида матрицы с внесением зеараленона на уровне 100 мкг/кг. | ||||||
Данные по прецизионности методики при проведении экстракции по 6.1.2
| Наименование показателя | Продукты на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста | |||||
| с искусственным внесением зеараленона | загрязненные зеараленоном естественным путем | |||||
| Год проведения испытаний | 2005 | 2005 | 2005 | 2005 | 2005 | 2005 |
| Количество лабораторий-участников | 17 | 17 | 19 | 19 | 19 | 19 |
| Число исключенных результатов | 17 | 17 | 19 | 17 | 18 | 17 |
| Количество выбросов (лабораторий) | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | 2 |
| Число принятых результатов | 17 | 17 | 19 | 17 | 18 | 17 |
| Среднее значение \overline{x} , мкг/кг | 18,4 | 26,6 | менее 2 | 9,1 | 17,1 | 44 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/кг | 1,6 | 1,5 | - | 0,5 | 0,8 | 1,2 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 8,7 | 5,7 | - | 5,9 | 5,3 | 2,8 |
| Предел повторяемости r (r = 2,8 sr), мкг/кг | 4,5 | 4,2 | - | 1,5 | 2,5 | 3,4 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/кг | 2,4 | 2,2 | - | 1,2 | 2,2 | 4,5 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % | 12,9 | 8,2 | - | 13,0 | 13,0 | 10,1 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,8 sR), мкг/кг | 6,7 | 6,1 | - | 3,3 | 6,2 | 12,5 |
| Полнота обнаружения, % <*> | 92 | 91 | - | - | - | - |
| Значение индекса Горвица, рассчитанное из прогнозируемого стандартного отклонения по уравнению Томпсона [[5]](#p100543), [[6]](#p100545) | 0,4 | 0,3 | - | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| <*> Значения полноты обнаружения получены независимо каждой лабораторией по результатам испытаний двух идентичных слепых проб каждого вида матрицы с внесением зеараленона на уровне 20 мкг/кг и 30 мкг/кг. | ||||||