ГОСТ EN 14663-2014. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая. Определение витамина B6 (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.06.2016 № 733-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 16.10.2018 № 168). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Текст данного документа приведен с учетом поправок, опубликованных в «ИУС», № 6, 2019 и № 7, 2019. Документ введен в действие с 01.06.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июня 2016 г. № 733-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА B6 (ВКЛЮЧАЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЕ ФОРМЫ) МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Foodstuffs. Determination of vitamin B6 (including its glycosylated forms) by high performance liquid chromatography method
Дата введения 1 июня 2017 года
Предисловие
Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. № 45)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июня 2016 г. № 733-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14663-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2017 г.
5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14663:2005 «Продукты пищевые. Определение витамина B6 (включая гликозилированные формы) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии» [(«Foodstuffs — Determination of vitamin B6 (including its glycosylated forms) by HPLC», IDT].
Европейский стандарт разработан Техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).
При применении настоящего стандарта рекомендуется вместо ссылочного европейского стандарта использовать межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина B6 в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Витамин B6 определяется как сумма пиридоксина, пиридоксаля, пиридоксамина, включая их фосфорилированные производные, а также \beta - \text{гликозилированные} формы, в пересчете на пиридоксин.
Настоящий метод был успешно проверен на манной крупе с молоком (детское питание), картофельном пюре, овощах с ветчиной (типичная пищевая продукция) и мультивитаминном напитке в диапазоне концентраций от 0,034 мг/100 г до 1,210 мг/100 г.
2 Нормативные ссылки
Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный стандарт. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).
EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
Производные витамина B6 (пиридоксаль, пиридоксамин и пиридоксин) извлекают из пищевой продукции путем кислотного гидролиза, затем подвергают ферментативному воздействию: дефосфорилируют, используя кислую фосфатазу, и дегликозилируют, используя \beta - \text{глюкозидазу} .
Полученные производные витамина B6 разделяют и количественно определяют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием ([1], [2]).
4 Реактивы
4.1 Общие положения
В ходе анализа используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.
4.2 Фосфат калия двузамещенный, массовая доля w (K2HPO4·3H2O) >= 99,9%.
4.3 Ацетат натрия безводный, w (CH3COONa) >= 99,0%.
4.4 Трихлоруксусная кислота (ТХУ), w (Cl3CCOOOH) >= 99,0%.
4.5 Раствор ацетата натрия молярной концентрацией c (CH3COONa) = 2,5 моль/дм3
205 г ацетата натрия (см. 4.3) растворяют в 1 дм3 воды.
4.6 Реагент послеколоночный (дополнительно), K2HPO4 раствор с концентрацией c (K2HPO4) = 0,15 моль/дм3.
Растворяют 34,2 г фосфата калия двузамещенного (см. 4.2) в воде, доводят до 1000 см3, перемешивают и дегазируют.
4.7 Соляная кислота, c(HCl) = 1 моль/дм3.
4.8 Соляная кислота, c(HCl) = 0,1 моль/дм3.
4.9 Соляная кислота, c(HCl) = 0,2 моль/дм3.
4.10 Серная кислота, c(H2SO4) = 1 моль/дм3.
4.11 Эфир петролейный, диапазон кипения от 40 °C до 60 °C.
4.12 Фосфатаза кислая из картофеля. Ферментативная активность составляет около 5,3 U/мг <1>.
<1> U — данная единица измерения (международная или стандартная единица) определяется количеством фермента, который катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата в минуту при стандартных условиях.
Необходимо, чтобы используемый фермент с положительным результатом проходил проверку ферментативной активности согласно 4.13.2 (более подробная информация приведена в [2], [7]).
4.13 Раствор кислой фосфатазы
4.13.1 Общие положения
Растворяют 60 мг кислой фосфатазы (см. 4.12) в 10 см3 воды в конической колбе, перемешивая в течение 2 мин.
Раствор готовят в день проведения анализа.
4.13.2 Проверка ферментативной активности кислой фосфатазы
Взвешивают 10 г свинины, 5 г картофельного пюре или 5 г муки из цельного зерна в конической колбе и экстрагируют кислотой, как описано в 6.2.1. Добавляют к 12,5 см3 раствора экстрагированной пробы 1 см3 раствора кислой фосфатазы (см. 4.13.1) и опционально 1 см3 раствора \beta - \text{глюкозидазы} (см. 4.15) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °C при постоянном перемешивании. Повторяют эту операцию с двойным количеством раствора кислой фосфатазы.
Определяют массовую концентрацию витаминов в соответствии с 6.6. Ферментативная активность используемого фермента считается достаточной, если значения массовой концентрации соединений витамина B6 в обоих растворах пробы эквивалентны. На хроматограмме должен отсутствовать пик фосфата пиридоксамина.
Примечание - Для межлабораторного испытания использовали кислую фосфатазу производства Sigma Nr P 3752 <2>.
<2> Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.
4.14 \beta - \text{глюкозидаза} из миндаля с ферментативной активностью приблизительно 3,2 U/мг
Необходимо, чтобы используемый фермент с положительным результатом проходил проверку ферментативной активности согласно 4.15.2 (более подробная информация приведена в [2], [7]).
4.15 Раствор \beta - \text{глюкозидазы}
4.15.1 Общие положения
Растворяют 100 мг \beta - \text{глюкозидазы} (см. 4.14) в 10 см3 воды в конической колбе, перемешивая в течение 2 мин.
Раствор готовят в день проведения анализа.
4.15.2 Проверка ферментативной активности \beta - \text{глюкозидазы}
Взвешивают 10 г свинины, 5 г картофельного пюре или 5 г муки из цельного зерна в конической колбе и экстрагируют кислотой, как описано в 6.2.1. Добавляют к 12,5 см3 раствора экстрагированной пробы 1 см3 раствора кислой фосфатазы (см. 4.13.1) и 1 см3 раствора \beta - \text{глюкозидазы} (см. 4.15.1) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °C при постоянном перемешивании. Данную операцию повторяют с двойным количеством раствора \beta - \text{глюкозидазы} .
Определяют массовую концентрацию витаминов в соответствии с 6.6. Ферментативная активность используемого фермента считается достаточной, если значения массовой концентрации соединений витамина B6 в обоих растворах пробы эквивалентны. На хроматограмме должен отсутствовать пик фосфата пиридоксамина.
Примечание - Для межлабораторного испытания использовали кислую фосфатазу Sigma Nr G-0395 <2>.
<2> Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.
4.16 Подвижная фаза для ВЭЖХ (серная кислота, c(H2SO4) = 0,015 моль/дм3, содержащая 0,005 моль/дм3 трихлоруксусной кислоты)
(817 +/- 5) мг трихлоруксусной кислоты (см. 4.4) растворяют в 15 см3 серной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3 (см. 4.10), переливают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки водой, перемешивают и дегазируют.
4.17 Силиконовое масло для удаления пены.
4.18 Образцы сравнения
4.18.1 Общие положения
Пиридоксамин (PM), пиридоксаль (PL) и пиридоксин (PN) могут быть получены у различных поставщиков. Чистота образцов сравнения может варьироваться, поэтому необходимо определить их концентрацию и чистоту (см. 4.19.4 и 4.20.7).
4.18.2 Пиридоксамина (PM) дигидрохлорид, w (C8H12N2O2·2HCl) >= 98%.
4.18.3 Пиридоксаля (PL) гидрохлорид, w (C8H9NO3·HCl) >= 98%.
4.18.4 Пиридоксина (PN) гидрохлорид, w (C8H11NO3·HCl) >= 98%.
4.19 Исходные растворы
4.19.1 Исходный раствор пиридоксамина (PM), массовой концентрацией \rho(PM) приблизительно 500 мкг/см3
71,7 мг пиридоксамина дигидрохлорида (см. 4.18.2) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.
Срок хранения раствора — 1 неделя при температуре 4 °C или 2 мес при температуре минус 18 °C.
4.19.2 Исходный раствор пиридоксаля (PL) массовой концентрацией \rho(PL) приблизительно 500 мкг/см3
60,9 мг пиридоксаля гидрохлорида (см. 4.18.3) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.
Срок хранения раствора — 1 неделя при температуре 4 °C или 2 мес при температуре минус 18 °C.
4.19.3 Исходный раствор пиридоксина (PN), массовой концентрацией \rho(PN) приблизительно 500 мкг/см3
60,8 мг пиридоксина гидрохлорида (см. 4.18.4) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.
Срок хранения раствора — 1 неделя при температуре 4 °C или 2 мес при температуре минус 18 °C.
4.19.4 Определение концентраций растворов
Отбирают пипеткой 1 см3 исходного раствора пиридоксамина (см. 4.19.1), пиридоксаля (см. 4.19.2) и пиридоксина (см. 4.19.3) соответственно в мерные колбы вместимостью 50 см3 и содержимое колб доводят до метки 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8). Измеряют оптическую плотность растворов в кювете из кварцевого стекла с толщиной поглощающего слоя 1 см при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения относительно 0,1 моль/дм3 HCl (см. таблицу 1).
Примеры молярных коэффициентов поглощения соединений витамина B6
| Соединение | Растворитель | \lambda_{max} | \epsilon_{i} , ммоль-1см-1 | Mi, г/моль | F |
| PM·2HCl a | 0,1 моль/дм3 HCl, pH ~ 1 | 292 | 8,2 | 241,1 | 0,698 |
| PL·HCl b | 0,1 моль/дм3 HCl, pH ~ 1 | 288 | 9,0 | 203,6 | 0,821 |
| PN·HCl c | 0,1 моль/дм3 HCl, pH ~ 1 | 291 | 8,6 | 205,6 | 0,823 |
| a PM·2HCl — Пиридоксамина дигидрохлорид (4.18.2). b PL·HCl — Пиридоксаля гидрохлорид (4.18.3). c PN·HCl — Пиридоксина гидрохлорид (4.18.4). | |||||
Массовую концентрацию пиридоксамина, пиридоксаля и пиридоксина в исходных растворах \rho_{i} , мкг/см3, вычисляют, используя молярный коэффициент поглощения, по формуле
\rho_{i} = \frac{A \cdot M_{i}}{\epsilon_{i}} \cdot V \cdot F , (1)
где A — значение оптической плотности растворов пиридоксамина, пиридоксаля и пиридоксина при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения \lambda_{max} (см. таблицу 1);
Mi — молярная масса образцов сравнения PM, PL или PN соответственно согласно таблице 1, г/моль;
V — коэффициент разбавления, см3 (в данном случае V = 50 см3);
F — коэффициент для вычисления доли свободных форм соединений витамина B6;
\epsilon_{i} — молярный коэффициент поглощения PM, PL или PN при соответствующем pH согласно таблице 1, ммоль-1см-1.
Данные значения массовой концентрации используют для вычисления точных концентраций веществ, приведенных в пунктах 4.19.1 - 4.19.3 и 4.20.1 - 4.20.6.
4.20 Стандартные растворы
4.20.1 Стандартный раствор пиридоксамина (PM) I, массовой концентрацией \rho(PM) приблизительно 10 мкг/см3
Разбавляют 2 см3 исходного раствора пиридоксамина (см. 4.19.1) 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) и доводят до 100 см3. Полученный раствор хранению не подлежит.
4.20.2 Стандартный раствор пиридоксаля (PL) I, \rho(PL) приблизительно 10 мкг/см3
Разбавляют 2 см3 исходного раствора пиридоксаля (см. 4.19.2) 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) и доводят до 100 см3. Полученный раствор хранению не подлежит.
4.20.3 Стандартный раствор пиридоксина (PN) I, \rho(PL) приблизительно 10 мкг/см3
Разбавляют 2 см3 исходного раствора пиридоксаля (см. 4.19.3) 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) и доводят до 100 см3. Полученный раствор хранению не подлежит.
4.20.4 Стандартный раствор пиридоксамина (PM) II, \rho(PM) приблизительно 1 мкг/см3
Разбавляют 10 см3 исходного раствора пиридоксамина (см. 4.20.1) 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) и доводят до 100 см3. Полученный раствор хранению не подлежит.
4.20.5 Стандартный раствор пиридоксаля (PL) II, \rho(PL) приблизительно 1 мкг/см3
Разбавляют 10 см3 стандартного раствора пиридоксаля (см. 4.20.2) 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) до 100 см3. Полученный раствор хранению не подлежит.
4.20.6 Стандартный раствор пиридоксина (PN) II, \rho(PL) приблизительно 1 мкг/см3
Разбавляют 10 см3 стандартного раствора пиридоксина (см. 4.20.3) 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) и доводят до 100 см3. Полученный раствор хранению не подлежит.
4.20.7 Проверка хроматографической чистоты методом ВЭЖХ
Чистота образцов сравнения может быть проверена методом ВЭЖХ, как описано ниже: вводят соответствующие объемы PM, PL и PN стандартных растворов I (см. 4.20.1, 4.20.2, 4.20.3) в систему ВЭЖХ и анализируют, как установлено в 6.4.
Степень чистоты образцов сравнения Ri, %, вычисляют по формуле
R_{i} = \frac{x_{i} \cdot 100}{x_{i} + B} , (2)
где xi — площадь пика образца сравнения i;
B — сумма площадей пиков загрязняющих веществ (без пика растворителя).
Хроматографическая чистота образцов сравнения должна быть не менее 98%, в ином случае используют новые образцы сравнения или готовят новые стандартные растворы.
4.21 Смешанный градуировочный раствор (например \rho(PM,PL,PN) = 0,1\text{мкг}/\text{см}^{3}\text{до}10\text{мкг }/\text{см}^{3} )
Отбирают пипеткой подходящие объемы исходных растворов PM, PL и PN (см. 4.19.1 - 4.19.3) или стандартных растворов (см. 4.20.1 - 4.20.6) в мерную колбу вместимостью 20 см3 и при необходимости доводят 0,1 моль/дм3 HCl (см. 4.8) до объема 6,5 см3. Доводят pH до значения 4,8 ед. pH, используя раствор ацетата натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм3 (см. 4.5), а затем доводят pH до значения 3,0 ед. pH, используя серную кислоту (см. 4.10), объем содержимого в колбе доводят водой до метки и перемешивают (градуировочные растворы). Рекомендуется использовать не менее трех градуировочных точек. При необходимости допускается разбавление смешанных градуировочных растворов подвижной фазой до ввода в хроматограф.
5 Оборудование
5.1 Общие положения
Используют общепринятое лабораторное оборудование, стеклянную посуду, вспомогательное оборудование и следующие средства измерений.
5.2 УФ-спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности при определенных длинах волн.
5.3 Нагревательные приборы
Используют лабораторный автоклав и печь или водяную баню, оборудованные мешалками и позволяющие устанавливать температуру на уровне 37 °C.
5.4 Система для ВЭЖХ
Система для ВЭЖХ состоит из насоса, устройства для ввода проб, флуоресцентного детектора, обеспечивающего длину волны возбуждения 290 нм и длину волны регистрации 390 нм, интегратора или устройства для обработки данных, устройства для постколоночной дериватизации.
5.5 Колонки для ВЭЖХ
Используют обращенно-фазовую колонку со следующими характеристиками:
LunaTM RP C18, 5 мкм <1>, размер частицы 5 мкм, диаметр 4,0 мм, длина 250 мм <2>. Другие примеры подходящих колонок для ВЭЖХ приведены в приложении B.
<1> LunaTM — это пример продукта, доступного на рынке, поставляемого фирмой Phenomenex. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.
<2> Допускается использовать размеры частиц или колонок, которые отличаются от установленных в настоящем стандарте. Параметры разделения должны адаптироваться к таким материалам, чтобы гарантировать эквивалентные результаты. Критерий эффективности функционирования подходящих аналитических колонок является базовым разрешением рассматриваемых веществ, определяемых при анализе.
5.6 Устройства фильтровальные
Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм перед использованием или вводом проб увеличит срок службы колонок.
6 Методика проведения испытания
6.1 Подготовка анализируемой пробы
Отбирают и гомогенизируют анализируемую пробу. Измельчают материал в соответствующем смесителе-мельнице и снова перемешивают. Чтобы не подвергать пробу воздействию высокой температуры в течение длительного периода времени, необходимо предварительно ее охладить. После гомогенизации пробу сразу анализируют.
6.2 Подготовка раствора анализируемой пробы
6.2.1 Экстракция
6.2.1.1 Общие положения
Из проб с высоким содержанием жира (более 25%) следует удалить жир, например, путем обработки петролейным эфиром перед кислотным гидролизом.
Для обработки пенящихся материалов рекомендуется использование нескольких капель силиконового масла (см. 4.17).
Значение pH экстрагированного раствора должно быть приблизительно 1 ед. pH. В ином случае рекомендуется уменьшить массу пробы или использовать соляную кислоту с более высокой концентрацией [(например, 0,2 моль/дм3 (см. 4.9) или 1 моль/дм3 (см. 4.7)].
6.2.1.2 Экстракция из сухих продуктов (содержание воды менее 20%; например, в крупах, сухом молоке, сушеных овощах)
Взвешивают от 1 до 10 г гомогенизированной анализируемой пробы (см. 6.1) с точностью до миллиграмма в конической колбе вместимостью 150 см3, добавляют 50 см3 0,1 моль/дм3 соляной кислоты (см. 4.8), перемешивают и проверяют, чтобы значение pH составляло приблизительно 1 ед. pH.
Нагревают в автоклаве (см. 5.3) в течение 30 мин при температуре 120 °C, затем охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят водой до 100 см3 (с возможным силиконовым слоем выше метки) и перемешивают.
Фильтруют или центрифугируют при 3000 об/мин аликвотную часть (приблизительно 50 см3) пробы, обработанной кислотой, и отбирают верхний слой в герметичные стеклянные емкости (данный раствор является экстрактом пробы).
6.2.1.3 Экстракция из продуктов с высоким содержанием влаги (более 20%) и жидких продуктов (например, в мясе, овощах, соках)
Взвешивают от 2 до 40 г гомогенизированной пробы (см. 6.1) с точностью до миллиграмма в конической колбе вместимостью 150 см3, добавляют 10 см3 1 моль/дм3 соляной кислоты (см. 4.7), доводят водой до приблизительно 50 см3, перемешивают и проверяют, чтобы значение pH составляло приблизительно 1 ед. pH.
Нагревают в автоклаве (см. 5.3) в течение 30 мин при температуре 120 °C, затем охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и объем содержимого в колбе доводят водой до 100 см3 (с возможным силиконовым слоем выше метки) и перемешивают.
Фильтруют или центрифугируют при 3000 об/мин аликвотную часть (приблизительно 50 см3) пробы, обработанной кислотой, и отбирают верхний слой в герметичные стеклянные емкости (данный раствор является экстрактом пробы).
Примечание — Во время автоклавирования может произойти взаимное превращение различных форм витамина, например, путем трансаминирования. Это часто наблюдается в приготовленном мясе или в пробах с высоким содержанием свободных аминогрупп (см. [2], [7]).
6.2.2 Ферментативная обработка и этапы подготовки проб трансформации
Для проб пищевой продукции животного происхождения (свинина, молоко, рыба и т.д.), которые не содержат \beta - \text{глюкозилированного} связанного пиридоксина, ферментативная обработка \beta - \text{глюкозидазой} не является необходимой. Лабораторные эксперименты показывают, что результаты определения общего содержания витамина B6 в пищевой продукции, полученные с применением и без применения \beta - \text{глюкозидазы} для ферментативной обработки, были приблизительно одинаковыми (см. [2], [7]).
Отбирают пипеткой 12,5 см3 экстракта пробы по 6.2.1.2, 6.2.1.3 в коническую колбу вместимостью 20 см3 и доводят pH до значения (4,8 +/- 0,1) ед. pH, используя раствор ацетата натрия (см. 4.5). Добавляют 1 см3 раствора кислой фосфатазы (см. 4.13) и 1 см3 раствора \beta - \text{глюкозидазы} (см. 4.15) и перемешивают. Накрывают коническую колбу и инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °C, постоянно перемешивая.
После охлаждения до комнатной температуры доводят pH до значения приблизительно 3 ед. pH, используя серную кислоту (см. 4.10), переливают отрегулированный раствор количественно в мерную колбу вместимостью 20 см3 и объем содержимого в колбе доводят до метки водой. Встряхивают и фильтруют через сухой складчатый бумажный фильтр, удаляют первые 5 см3 фильтрата.
Подготовленный раствор пробы хранят до 3 сут в холодильнике при температуре около 4 °C.
Перед хроматографическим анализом фильтруют аликвоту (приблизительно 2 см3) через мембранный фильтр (см. 5.6) и разбавляют подвижной фазой, если необходимо.
6.3 Подготовка «холостой» пробы
Отбирают пипеткой 12,5 см3 раствора соляной кислоты (см. 4.8) в коническую колбу вместимостью 20 см3 и доводят pH до значения (4,8 +/- 0,1) ед. pH, используя раствор ацетата натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм3 (см. 4.5). Добавляют 1 см3 раствора кислой фосфатазы (см. 4.13) и 1 см3 раствора \beta - \text{глюкозидазы} (см. 4.15) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °C при постоянном перемешивании.
После охлаждения до комнатной температуры доводят pH до значения приблизительно 3 ед. pH, используя серную кислоту (см. 4.10), переливают количественно в мерную колбу вместимостью 20 см3, объем содержимого в колбе доводят водой до метки, встряхивают и фильтруют через сухой складчатый бумажный фильтр, удаляя первые 5 см3 фильтрата.
Перед хроматографическим анализом фильтруют аликвоту (приблизительно 2 см3) через мембранный фильтр (см. 5.6) и разбавляют подвижной фазой, если необходимо.
6.4 Условия хроматографического анализа
Эффективность системы ВЭЖХ должна обеспечивать разделение пиков PM, PL и PN друг от друга, а также от пиков всех других веществ пробы до базовой линии.
Установлено, что разделение и количественное определение является удовлетворительным при следующих условиях:
| Колонка ВЭЖХ — в соответствии с 5.5; Подвижная фаза — в соответствии с 4.16; Расход жидкости — 1,5 см3/мин; Вводимый объем — от 1 до 50 мм3; | |
| Детектор — флуоресцентный: | длина волны возбуждения (Ex) — 290 нм; длина волны эмиссии (Em) — 390 нм. |
6.5 Идентификация
Вводят одинаковые подходящие объемы раствора анализируемой пробы (см. 6.2.2), «холостой» пробы (см. 6.3) и смешанных градуировочных растворов (см. 4.21) в систему ВЭЖХ в условиях по 6.4.
Идентифицируют пики PM, PL и PN путем сравнения времени удерживания пиков на хроматограммах раствора анализируемой пробы и стандартного раствора. Идентификацию пика допускается также проводить с помощью сдвига значения pH в сторону увеличения, например при установлении pH = 6,6 ед. pH при использовании устройства постколоночной дериватизации (см. 5.4) при скорости потока послеколоночного реагента 0,1 см3/мин (см. 4.6). Обнаружение осуществляется при возбуждении при 330 нм и регистрации при 390 нм (см. [2], [4], [5]).
Примечание — Увеличение значения pH путем использования послеколоночного реагента (см. 4.6) приводит к сдвигу длины волны возбуждения до 330 нм. Кроме того, избирательность матриц улучшается в связи с уменьшением матрицы пиков ([2], [4], [5]).
6.6 Определение
Вводят одинаковые подходящие объемы стандартного раствора, а также раствора анализируемой пробы в систему ВЭЖХ согласно условиям по 6.4. Для определения содержания методом внешней градуировки определяют среднее значение площади пиков или высоты пиков и сравнивают результаты с соответствующими значениями образца сравнения.
7 Вычисление результата
7.1 Вычисление проводят с использованием градуировочной зависимости либо соответствующих программ интегратора, либо в соответствии с нижеприведенными формулами (3) - (6).
Массовую долю пиридоксамина (PM), пиридоксаля (PL) или пиридоксина (PN), w, мг/100 г пробы вычисляют по формуле
w = \frac{y_{i}}{m} \cdot \frac{F \cdot 100}{1000} , (3)
где yi — содержание PM, PL и PN, определенное по площади пика или высоте пика с использованием линейной регрессии или градуировочной зависимости, мкг/20 см3 раствора анализируемой пробы (см. 6.2.2);
F — коэффициент разбавления из формулы (6).
Значение yi вычисляют по формуле
где bi, ai — коэффициенты регрессии для PM, PL или PN, вычисленные методом линейной регрессии на основе концентрации и площади пика в градуировочных растворах;
xi — откорректированная площадь пика раствора анализируемой пробы PM, PL или PN.
Значение xi вычисляют по формуле
где Pi — площади пика PM, PL или PN для раствора анализируемой пробы;
Bi — площади пика PM, PL или PN для «холостой» пробы.
Коэффициент разбавления F вычисляют по формуле
где V — общий объем раствора кислой вытяжки пробы (см. 6.2.1.2), (см. 6.2.1.3), см3;
V1 — общий объем раствора кислой вытяжки пробы, подвергнутый ферментативной обработке (см. 6.2.2), см3.
7.2 Массовую долю витамина B6 в пересчете на пиридоксин w, мг/100 г пробы вычисляют по формуле
w = 1,006wPM + 1,012wPL + wPN, (7)
где 1,006 — коэффициент для пересчета PM на PN;
wPM — содержание пиридоксамина, мг/100 г пробы;
1,012 — коэффициент для пересчета PL на PN;
wPL — содержание пиридоксаля, мг/100 г пробы;
wPN — содержание пиридоксина, мг/100 г пробы.
7.3 Массовую долю витамина B6 в пересчете на пиридоксин выражают в миллиграммах на 100 г пробы.
Примечание - Если необходимо представить результат в пересчете на гидрохлорид пиридоксина, используют коэффициент пересчета 1,216. Сведения о проведении пересчета должны быть четко указаны в протоколе испытания.
8 Прецизионность
8.1 Общие положения
Данные по прецизионности для определения витамина B6 были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с [8], проведенных бывшим BgVV (Bundesinstitut f\dot{u}\dot{r} gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterin\dot{a}\dot{r}medizin (Немецкий федеральный институт по защите прав потребителей и ветеринарной медицине).
Подробная информация о совместном испытании точности метода приведена в приложении A. Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к диапазонам концентраций и пробам, не приведенным в приложении A.
Применимость и надежность настоящего метода были подтверждены в ходе испытаний различной пищевой продукции, например мяса, рыбы, молока, овощей, фруктов и злаков (см. [2], [3]). Полученные результаты были в достаточной степени воспроизводимы, и только иногда наблюдались относительно небольшие мешающие влияния матричных пиков проб, которые могут быть легко устранены. Для градуировочных растворов наблюдается сильно выраженная корреляция и линейная регрессия между площадью пика и концентрацией PM, PL и PN соответственно. Относительные стандартные отклонения от общего содержания витамина B6 в последовательности, включающей от трех до пяти определений в различных продуктах, варьируются от 2% до 6%.
Полнота извлечения PM, PL и PN варьируется от 85% до 105% (см. [2], [3]). Определение общего содержания витамина B6 настоящим методом дает в результате значительно более высокие значения в пищевой продукции растительного происхождения (содержащих гликозилированный пиридоксин), чем другие методы, в которых не используется обработка \beta - \text{глюкозидазой} (см. [2], [3], [7]).
8.2 Повторяемость
Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытания, которые были получены при использовании одного и того же метода на идентичном испытательном материале одним и тем же оператором на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.
Значения для порошковой манной крупы с молоком:
Значения для порошкового картофельного пюре:
Значения для овощей с ветчиной (детское питание):
Значения для мультивитаминного напитка:
8.3 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными на идентичном объекте испытаний двумя лабораториями, должно превышать предел воспроизводимости R не более чем в 5% случаев.
Значения для порошковой манной крупы с молоком:
Значения для порошкового картофельного пюре:
Значения для овощей с ветчиной (детское питание):
Значения для мультивитаминного напитка:
9 Протокол испытания
Протокол испытания должен содержать по меньшей мере следующие сведения:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;
c) дату и метод отбора пробы (если они известны);
d) дату поступления пробы в лабораторию;
f) результаты и единицы, в которых выражены результаты испытания;
g) информацию о других специфичных особенностях, которые наблюдались в ходе проведения испытания;
h) информацию о других особенностях, не установленных в настоящем методе или рассматриваемых как дополнительные, которые могут повлиять на результаты испытания.
Имеющиеся данные были получены с использованием методов ВЭЖХ, установленных в приложении C. Данные результатов испытаний для определения витамина B6 были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с [8], проведенных бывшим BgVV [Bundesinstitut f\dot{u}\dot{r} gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterin\dot{a}\dot{r}medizin (Немецкий федеральный институт по защите прав потребителей и ветеринарной медицине)].
Данные результатов испытаний для порошковой манной крупы с молоком
| Проба | Порошковая манная крупа с молоком | |||
| Вещество, определяемое при анализе | Пиридоксамин | Пиридоксаль | Пиридоксин | Витамин B6 a |
| Год совместного исследования | 2000 | |||
| Количество лабораторий | 11 | |||
| Количество проб | 5 | |||
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 10 | |||
| Количество оставшихся результатов | 53 | |||
| Среднее значение \overline{x} , мг/100 г | 0,065 | 0,080 | 0,523 | 0,667 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,003 | 0,008 | 0,024 | 0,030 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 4,6 | 10,0 | 4,6 | 4,5 |
| Значение повторяемости r (2,8·sr), мг/100 г | 0,008 | 0,022 | 0,067 | 0,084 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 0,013 | 0,025 | 0,053 | 0,068 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 20,5 | 31,3 | 10,1 | 10,2 |
| Значение воспроизводимости R (2,8·sR), мг/100 г | 0,035 | 0,071 | 0,151 | 0,193 |
| Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % | 97,2 | 94,7 | 93,9 | - |
| Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % | 9 | 8,2 | 9,7 | - |
| Количество результатов, использованных для расчета | 23 | 20 | 23 | - |
| a См. формулу (7). | ||||
Данные результатов испытаний для порошкового картофельного пюре
| Проба | Порошковое картофельное пюре | |||
| Вещество, определяемое при анализе | Пиридоксамин | Пиридоксаль | Пиридоксин | Витамин B6 a |
| Год совместного исследования | 2000 | |||
| Количество лабораторий | 10 | |||
| Количество проб | 5 (9) | |||
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 9 | |||
| Количество оставшихся результатов | 49 | |||
| Среднее значение \overline{x} , мг/100 г | 0,163 | 0,032 | 1,008 | 1,204 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,006 | 0,004 | 0,028 | 0,032 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 3,7 | 12,3 | 2,8 | 2,7 |
| Значение повторяемости r (2,8·sr), мг/100 г | 0,016 | 0,012 | 0,080 | 0,089 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 0,031 | 0,008 | 0,111 | 0,131 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 19,0 | 25,0 | 11,0 | 10,9 |
| Значение воспроизводимости R (2,8·sR), мг/100 г | 0,089 | 0,022 | 0,314 | 0,369 |
| Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % | 97,7 | 85,2 | 90,8 | - |
| Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % | 9,4 | 7,4 | 9,9 | - |
| Количество результатов, использованных для расчета | 19 | 20 | 20 | - |
| a См. формулу (7). | ||||
Данные результатов испытаний для овощей с ветчиной (детское питание)
| Проба | Овощи с ветчиной (детское питание) | |||
| Вещество, определяемое при анализе | Пиридоксамин | Пиридоксаль | Пиридоксин | Витамин B6 a |
| Год совместного исследования | 2000 | |||
| Количество лабораторий | 9 | |||
| Количество проб | 5 (2) | |||
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 8 | |||
| Количество оставшихся результатов | 37 | |||
| Среднее значение \overline{x} , мг/100 г | 0,043 | 0,009 | 0,047 | 0,107 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,002 | 0,001 | 0,003 | 0,004 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 4,4 | 15,4 | 7,2 | 3,6 |
| Значение повторяемости r (2,8·sr), мг/100 г | 0,005 | 0,004 | 0,010 | 0,011 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 0,005 | 0,005 | 0,007 | 0,014 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 11,0 | 50,5 | 15,7 | 12,8 |
| Значение воспроизводимости R (2,8·sR), мг/100 г | 0,013 | 0,013 | 0,021 | 0,039 |
| Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % | 95,1 | 90,6 | 88,9 | - |
| Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % | 4,5 | 12,0 | 10,2 | - |
| Количество результатов, использованных для расчета | 18 | 16 | 19 | - |
| a См. формулу (7). | ||||
Данные результатов испытаний для мультивитаминного напитка
| Проба | Мультивитаминный напиток | |||
| Вещество, определяемое при анализе | Пиридоксамин | Пиридоксаль | Пиридоксин | Витамин B6 a |
| Год совместного исследования | 2000 | |||
| Количество лабораторий | 11 | |||
| Количество проб | 5 | |||
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 10 | |||
| Количество оставшихся результатов | 53 | |||
| Среднее значение \overline{x} , мг/100 г | 0,004 | 0,004 | 0,373 | 0,380 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,001 | 0,001 | 0,020 | 0,020 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 25,0 | 25,0 | 5,4 | 5,3 |
| Значение повторяемости r (2,8·sr), мг/100 г | 0,003 | 0,003 | 0,056 | 0,056 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 0,002 | 0,002 | 0,030 | 0,034 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 38,6 | 49 | 8,0 | 8,8 |
| Значение воспроизводимости R (2,8·sR), мг/100 г | 0,005 | 0,005 | 0,086 | 0,095 |
| Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % | 98,1 | 94,5 | 98,2 | - |
| Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % | 11,4 | 6,2 | 8,4 | - |
| Количество результатов, использованных для расчета | 23 | 23 | 23 | - |
| a См. формулу (7). | ||||
ПРИМЕРЫ ПОДХОДЯЩИХ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ВЭЖХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ ВИТАМИНА B6
Примеры подходящих условий ВЭЖХ для определения соединений витамина B6
| Лаборатория | Разделительная колонка | Размеры, мм x мм | Температура, °C | Подвижная фаза | Расход, см3/мин | Обнаружение, нм | Время удерживания, мин | |||
| Ex | Em | PM b | PL c | PN d | ||||||
| 1a | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 1,5 | 290 | 390 | ~3 | ~7 | ~11,4 |
| 1b | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 1,5 | 330 | 390 | ~2,4 | ~6,9 | ~11,2 |
| и послеколоночный реагент: K2HPO4 (c = 0,15 моль/дм3) | 0,5 | |||||||||
| 2 | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 1,5 | 290 | 390 | ~3 | ~7,9 | ~13,0 |
| 3 | AQUA C18, 5 мкм a | 250 x 4,6 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 2,0 | 290 | 390 | ~2,2 | ~4,7 | ~6,4 |
| Предколонка: RP C18, 5 мкм | 4,0 x 3,0 | 1,5 | ~2,7 | ~5,4 | ~6,9 | |||||
| 4 | LiChrospher 60 RP C8 | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,03 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,05 моль/дм3) | 3,0 | 290 | 390 | ~2,5 | ~4,8 | ~6,1 |
| Выборка B, 5 мкм | от 0 до 14 мин B: Метанол, от 14 до 21 мин | |||||||||
| 5 | Nucleosil 120 C18, 5 мкм Предколонка: RP C18 | 250 x 4,0 | ~ 20 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 2,0 | 290 | 390 | ~2,0 | ~4,9 | ~7,0 |
| 6 | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 2,0 | 290 | 390 | ~2,5 | ~6,3 | ~9,2 |
| 7 | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 2,0 | 290 | 390 | ~2,8 | ~6,5 | ~11,8 |
| 8 | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 2,0 | 290 | 390 | ~2,8 | ~6,9 | ~11,4 |
| 9 | Spherisorb 80 ODS-2, 5 мкм | 250 x 4,6 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) | 2,0 | 290 | 390 | ~5,5 | ~10,4 | ~16,1 |
| 10 | LUNA RP C18, 5 мкм | 250 x 4,0 | 30 | H2SO4 (c = 0,015 моль/дм3), содержание ТХУ (c = 0,005 моль/дм3) и послеколоночный реагент: K2HPO4 (c = 0,15 моль/дм3) | 1,0 | 330 | 390 | ~6,9 | ~17,9 | ~28,4 |
| 0,5 | ||||||||||
| a Phenomenex, 125 A. b PM — пиридоксамин. c PL — пиридоксаль. d PN — пиридоксин. | ||||||||||
ПРИМЕРЫ МОЛЯРНЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ПОГЛОЩЕНИЯ
Примеры молярных коэффициентов поглощения E соединений витамина B6 (см. [3], [4])
LU — интенсивность флуоресценции
Рисунок D.1 — Хроматограммы образцов сравнения и пробы картофельного пюре
Условия хроматографического анализа:
колонка ВЭЖХ — в соответствии с 5.5;
подвижная фаза — в соответствии с 4.16;
детектор — флуоресцентный: длина волны возбуждения — 290 нм;
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ ЕВРОПЕЙСКИХ СТАНДАРТОВ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение ссылочного европейского стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование межгосударственного стандарта |
| EN ISO 3696 | IDT | ГОСТ ISO 3696-2013 <1> «Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля» |
| Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта: - IDT — идентичный стандарт. | ||
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
Библиография
| [1] | Bognar, A.: Bestimmung von Vitamin B6 in Lebensmitteln mit Hilfe der Hochdruckflüssig — Chromatographie (HPLC) Z Lebensm Unters Forsch A, 1985, 181: 200 — 205 (Определение содержания витамина B6 в продуктах питания с использованием ВЭЖХ) | |
| [2] | Bognár , A., Ollilainen, V.: Influence of Extraction on the Determination of Vitamin B6 in Food by HPLC Z Lebensm Unters Forsch A, 1997, 204: 327 — 335 (Влияние экстракции на определение витамина B6 в пищевых продуктах методом ВЭЖХ) | |
| [3] | Metzler, D.E., and Snell, E.E.: Spectra and lonisation Constants of the Vitamin B6 - Group and Related 3-Hydroxypyridine Derivates Journal of the American Chemical Society. 1955, 77: 2431 — 2437 (Константы спектра и ионизации группы витамина B6 - группа и связанные производные 3-гидроксипиридина) | |
| [4] | Bitsch, R., Möller , J., J Chromatogr 1989, 463: 207 — 211 (Журнал хроматографии) | |
| [5] | Ollilainen, V.: HPLC Analysis of Vitamin B6 in Agricultural and Food Science in Finland Department of Applied Chemistry and Microbiology University of Helsinki 1999. Vol. 8: No. 6: 515 — 619 (Анализ ВЭЖХ витамина B6 в науках о сельском хозяйстве и продуктах питания в Финляндии) | |
| [6] | Bergaentzle, M., Arella, F., Bourguignon, J.B., Hasselmann, C.: Determination of vitamin B6 in foods by HPLC A collaborative study. Food Chemistry, 1995, 52: 81 — 86 (Определение витамина B6 в пищевых продуктах методом ВЭЖХ) | |
| [7] | Ndaw, S., Bergaentzle, M., Aoude-Werner, D., Hasselmann, C.: Extraction procedures for the liquid chromatographic determination of thiamin Riboflavin and vitamin B6 in foodstuffs Food Chemistry 2000, 71, 129 — 138 (Процедуры экстракции для определения тиамина, рибофлавина и витамина B6 в пищевых продуктах методом жидкостной хроматографии) | |
| [8] | ISO 5725:1986 <1> | Precision of test methods — Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений) |
<1> ISO 5725:1986 отменен и заменен на ISO 5725-1:1994, ISO 5725-2:1994, ISO 5725-3:1994, ISO 5725-4:1994, ISO 5725-5:1998, ISO 5725-6:1994.