ГОСТ EN 14526-2022. Межгосударственный стандарт. Продукция рыбная пищевая. Определение содержания токсинов группы сакситоксина в моллюсках. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением предколоночной дериватизации методом пероксидного или периодатного окисления

(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.11.2025 № 1561-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ EN 14526-2015"]:::doc
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-en-14526-2015" "ГОСТ EN 14526-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение сакситоксина и DC-сакситоксина в мидиях. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с применени"
  n1["ГОСТ EN 14526-2022"]:::notEnt
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-en-14526-2022" "ГОСТ EN 14526-2022. Межгосударственный стандарт. Продукция рыбная пищевая. Определение содержания токсинов группы сакситоксина в моллюсках. Метод высокоэффективной жидкостной... (в"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 ноября 2025 г. № 1561-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ РЫБНАЯ ПИЩЕВАЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТОКСИНОВ ГРУППЫ САКСИТОКСИНА В МОЛЛЮСКАХ. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПРЕДКОЛОНОЧНОЙ ДЕРИВАТИЗАЦИИ МЕТОДОМ ПЕРОКСИДНОГО ИЛИ ПЕРИОДАТНОГО ОКИСЛЕНИЯ

Fish food products. Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish. High performance liquid chromatography method using precolumn derivatization with peroxide or periodate oxidation

(EN 14526:2017, Foodstuffs — Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish — HPLC method using pre-column derivatization with peroxide or periodate oxidation, IDT)

ГОСТ EN 14526-2022

МКС 67.120.30

Дата введения 30 ноября 2026 года с правом досрочного применения

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 Разработан научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык немецкоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 29 апреля 2022 г. № 150-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 ноября 2025 г. № 1561-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14526-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 30 ноября 2026 г. с правом досрочного применения

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14526:2017 «Продукция пищевая. Определение содержания токсинов группы сакситоксина в моллюсках. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением предколоночной дериватизации методом пероксидного или периодатного окисления» («Lebensmittel — Bestimmung von Toxinen der Saxitoxingruppe in Schalentieren — HPLC-Verfahren mit Vorsaulenderivatisierung und Peroxid — oder Periodatoxidation», IDT).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного европейского стандарта для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

Европейский стандарт разработан Техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВЗАМЕН ГОСТ EN 14526-2015

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»

Предупреждение — Применение настоящего стандарта может быть связано с проведением опасных операций, использованием вредных веществ, опасного оборудования. В задачи настоящего стандарта не входит решение всех вопросов безопасности, связанных с его применением. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод [1] количественного определения сакситоксина (STX), декарбамоил-сакситоксина (dcSTX), неосакситоксина (NEO), декарбамоил-неосакситоксина (dcNEO), гониаутоксина 1 и 4 (GTX1,4; сумма изомеров), гониаутоксина 2 и 3 (GTX2,3; сумма изомеров), гониаутоксина 5 (GTX5, также обозначаемый как B1), гониаутоксина 6 (GTX6, также обозначаемый как B2), декарбамоил-гониаутоксина 2 и 3 (dcGTX2,3; сумма изомеров), N-сульфокарбамоил-гониаутоксина 1 и 2 (C1,2; сумма изомеров) и (в зависимости от наличия сертифицированных эталонных материалов (CRM)) N-сульфокарбамоил-гониаутоксина 3 и 4 (C3,4; сумма изомеров) в непереработанных мидиях, устрицах, морских гребешках и венеридах. Практика применения метода в лаборатории показала, что данный метод применим к другим непереработанным моллюскам [2], [3], а также готовым к употреблению моллюскам. Описанный метод был валидирован в межлабораторном испытании [4], [5], а также верифицирован в ходе проверки рабочих характеристик метода при оценке общей токсичности образцов в Референтной лаборатории Европейского союза (EURL) [6]. Токсины, наличие которых не исследовали в первом межлабораторном испытании [4], [5], такие как dcGTX2,3 и dcNEO, были валидированы в двух последующих межлабораторных испытаниях [7], [8]. Минимальные валидированные значения [4], [5], [8] указаны в мкг токсина (свободное основание)/кг ткани моллюсков, а также в мкмоль/кг ткани моллюсков и приведены в таблице 1.

Таблица 1

Минимальные валидированные значения

Количественное определение GTX6 (B2) не было предусмотрено в первом межлабораторном испытании, однако несколько лабораторий обнаружили данный токсин непосредственно после очистки методом твердофазной экстракции на ионообменнике (SPE-COOH). Данные лаборатории обнаружили в некоторых образцах концентрацию 30 мкг/кг или выше. По этой причине представленный метод, в зависимости от наличия стандартного вещества, применим для непосредственного количественного определения GTX6 (B2). В настоящее время возможно определить GTX6 преобразованием в NEO после гидролиза фракции 2, полученной после SPE-COOH-очистки, как указано в 6.4. Косвенное количественное определение GTX6 было валидировано в двух дополнительных межлабораторных испытаниях [7], [8].

Сумма изомеров C3,4 была количественно определена в первом межлабораторном испытании. Представленный метод, в зависимости от наличия стандартного вещества, применим для непосредственного количественного определения C3,4. При отсутствии стандартного вещества C3,4 может быть количественно определено косвенно, преобразованием в GTX1,4 после гидролиза фракции 1, полученной после SPE-COOH-очистки, таким же образом, как при помощи гидролиза можно определить GTX6 по 6.4 [10].

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированной ссылки применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированной — последнее издание (включая все изменения).

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3 Сущность метода

Предупреждение — PSP-токсины являются нейротоксинами, которые могут поступать в организм оральным путем или посредством ингаляции. Поэтому при проведении испытания следует использовать меры защиты.

Токсины, входящие в паралитический яд моллюсков (PSP-токсины), экстрагируют из гомогенизированной пробы путем нагревания с уксусной кислотой. После центрифугирования надосадочную жидкость очищают методом твердофазной экстракции (SPE) на картридже с сорбентом (C18). Анализ проводят после пероксидного или периодатного окисления, используя метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектированием (FLD). Большинство токсинов (STX, C1,2, GTX5 (B1), dcSTX, GTX2,3 и dcGTX2,3) можно определить количественно после SPE-C18-очистки. <1>

<1> Данный метод основан на процедуре, описанной Лоуренсом и др. [4], а также опубликован как Официальный метод AOAC 2005.06 [1].

При окислении PSP-токсинов образуются различные продукты окисления, которые определяют методом ВЭЖХ с использованием обращенно-фазовой колонки и флуориметрического детектирования. В таблице 2 приведены продукты окисления PSP-токсинов, образующиеся при пероксидном или периодатном окислении. Дополнительно на рисунке 1 представлены соответствующие хроматограммы.

Таблица 2

Продукты окисления, образующиеся после пероксидного или периодатного окисления

Токсин	Продукты окисления и последовательность элюирования при окислении		Интенсивность аналитического сигнала при окислении		Продукт окисления при таком же времени удерживания, как и при окислении
	пероксидом	периодатом	пероксидом	периодатом	пероксидом	периодатом
STX	Один	Один	++	+	NEO a {3} b)	NEO {3}; GTX6 (B2) {3}
dcSTX	Первый {1}	Первый {1}	++	-		dcNEO {1}
	Второй {2}	Второй {2}	+	+	NEO a {2}	NEO {2}; GTX6 (B2) {2}; dcNEO {2}
NEO	Нет	Первый {1}		+		GTX6 (B2) {1}
	Второй {2}	Второй {2}	-	++	dcSTX {2}	GTX6 (B2) {2}; dcSTX {2}, dcNEO {2}
	Третий {3}	Третий {3}	-	+	STX	STX; GTX6 (B2) {3}
C1,2	Один	Один	++	+
C3,4	Нет	Первый {1}		+		GTX1,4 {1}
	Нет	Второй {2}		++		GTX1,4 {2}; dcGTX2,3 {2}
	Нет	Третий {3}		+		GTX1,4 {3}; GTX2,3
GTX1,4	Нет	Первый {1}		+		C3,4 {1}
	Нет	Второй {2}		++		C3,4 {2}; dcGTX2,3 {2}
	Третий {3}	Третий {3}	-	++	GTX2,3	C3,4 {3}; GTX2,3
GTX2,3	Один	Один	++	++	GTX1,4 a {3}	C3,4 {3}; GTX1,4 {3}
GTX5, (B1)	Один	Один	++	-
GTX6, (B2)	Нет	Первый {1}		+		NEO {1}
	Нет	Второй {2}		++		NEO {2}; dcSTX {2}; dcNEO {2}
	Нет	Третий {3}		-		NEO {3}; STX
dcGTX2,3	Первый {1}	Первый {1}	++	+
	Второй {2}	Второй {2}	+	++		C3,4 {2}; GTX1,4 {2}
dcNEO	Первый {1}	Первый {1}	-	++		dcSTX {1}
	Второй {2}	Второй {2}	-	+	dcSTX {2}	dcSTX {2}; NEO {2}; GTX6 (B2) {2}
Интенсивность: не видима; - очень низкая; + низкая; ++ высокая.
a Высокая концентрация указанного токсина может повлиять на количественное определение, имитируя высокое содержание. b Цифры в фигурных скобках относятся к последовательности элюирования.

a) негидроксилированные токсины: пероксид	b) негидроксилированные токсины: периодат
с) N-гидроксилированные токсины: пероксид	d) N-гидроксилированные токсины: периодат
Y — сигнал обнаружения V; X — время, мин

Рисунок 1 — Продукты окисления после дериватизации пероксидом и периодатом (пики для количественного определения обозначены стрелками)

Гониаутоксины GTX2 и GTX3, а также GTX1 и GTX4, декарбамоил-гониаутоксины dcGTX2 и dcGTX3, N-сульфокарбамоил-гониаутоксины C1 и C2, а также C3 и C4 являются структурными изомерами и в результате пероксидного или периодатного окисления приводят к аналогичным продуктам окисления. Долю структурных изомеров определяют, как сумму обоих токсинов.

При пероксидном и периодатном окислении STX образуется один и тот же продукт окисления. Такой же принцип действует и в отношении GTX2,3, GTX5 (B1) и C1,2. С другой стороны, при пероксидном и периодатном окислении dcSTX и dcGTX2,3 образуются два разных продукта окисления, см. таблицу 2. Токсин dcNEO образует два продукта окисления только при периодатном окислении. Каждый из токсинов, NEO, GTX6 (B2), GTX1,4 и C3,4, образует три пика после периодатного окисления, но только второй пик используется для количественного определения (пероксидное окисление не может использоваться для количественного определения).

Одновременное появление в пробе различных PSP-токсинов может повлиять на результат анализа, так как некоторые PSP-токсины могут (частично) приводить к одним и тем же продуктам окисления (см. таблицу 2). Поэтому следует проявлять внимательность при интерпретации хроматограмм после SPE-C18-очистки.

Для количественного определения N-гидроксилированных токсинов необходимо разделить пробу на фракции путем SPE-COOH-очистки (см. таблицу 3), так как продукты окисления определенных PSP-токсинов (NEO и GTX6 (B2), GTX1,4 и C3,4) идентичны. На данном этапе PSP-токсины путем элюирования с использованием подвижных фаз различной ионной силы разделяют на три четкие группы, обозначаемые как C-токсин-группа, GTX-токсин-группа и сакситоксиновая группа. C-токсины мгновенно элюируются водой, GTX-токсины (как GTX1 — GTX6, так и dcGTX2 и dcGTX3) элюируются раствором хлорида натрия молярной концентрацией 0,05 моль/дм3, в то время как сакситоксиновая группа (STX, NEO, dcNEO и dcSTX) элюируется раствором хлорида натрия молярной концентрацией 0,3 моль/дм3. Данные фракции можно анализировать с использованием ВЭЖХ, после пероксидного или периодатного окисления.

Таблица 3

Последовательность элюирования токсина после SPE-COOH-очистки

4 Реактивы

Для проведения анализа, если не указано иное, используют только реактивы со степенью чистоты «чистые для анализа» (ч.д.а.) и растворы, пригодные для ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

Применяемая вода должна быть получена дистилляцией в стеклянном дистилляторе или деионизацией и должна соответствовать первой степени чистоты по EN ISO 3696.

Если не установлено иное, стабильность растворов должна быть проверена лабораторией.

4.1 Метанол, пригодный для ВЭЖХ.

4.2 Ацетонитрил, пригодный для ВЭЖХ.

4.3 Раствор формиата аммония молярной концентрацией c = 0,3 моль/дм3.

Для приготовления раствора 1,892 г формиата аммония (кристаллический порошок) растворяют в 100 см3 воды.

4.4 Ледяная уксусная кислота

4.4.1 Раствор уксусной кислоты 1 массовой долей \rho \approx 1\% .

1 см3 ледяной уксусной кислоты (см. 4.4) разбавляют водой до объема 100 см3.

4.4.2 Раствор уксусной кислоты 2 молярной концентрацией c ~= 0,1 моль/дм3.

572 мм3 ледяной уксусной кислоты (см. 4.4) разбавляют водой до объема 100 см3.

4.4.3 Раствор уксусной кислоты 3 молярной концентрацией c ~= 0,1 ммоль/дм3.

100 мм3 раствора ледяной уксусной кислоты (см. 4.4.2) разбавляют водой до объема 100 см3.

4.5 Ацетат аммония

4.5.1 Раствор ацетата аммония 1 молярной концентрацией c = 0,1 моль/дм3.

0,77 г ацетата аммония (см. 4.5) растворяют в 100 см3 воды.

4.5.2 Раствор ацетата аммония 2 молярной концентрацией c = 0,01 моль/дм3.

10 см3 раствора ацетата аммония (см. 4.5.1) разбавляют водой до объема 100 см3.

4.6 Хлорид натрия

4.6.1 Раствор хлорида натрия 1 молярной концентрацией c = 0,05 моль/дм3.

0,29 г хлорида натрия (см. 4.6) растворяют в 100 см3 воды.

4.6.2 Раствор хлорида натрия 2 молярной концентрацией c = 0,3 моль/дм3.

1,75 г хлорида натрия (см. 4.6) растворяют в 100 см3 воды.

4.7 Кислота соляная молярной концентрацией c = 1 моль/дм3.

4.8 Раствор гидрофосфата натрия молярной концентрацией c = 0,3 моль/дм3.

4,26 г гидрофосфата натрия или 8,04 г гидрофосфата натрия 7-водного растворяют в 100 см3 воды.

4.9 Гидроксид натрия

4.9.1 Раствор гидроксида натрия 1 молярной концентрацией c = 1 моль/дм3.

4 г гидроксида натрия (см. 4.9) растворяют в 100 см3 воды.

4.9.2 Раствор гидроксида натрия 2 молярной концентрацией c = 0,2 моль/дм3.

10 см3 раствора гидроксида натрия 1 (см. 4.9.1) разбавляют водой до объема 50 см3.

4.10 Раствор перекиси водорода массовой долей w ~= 10%.

3 см3 раствора перекиси водорода массовой долей w = 30% смешивают с 6 см3 воды. Раствор ежедневно готовят свежий. Растворы хранят в темном месте при температуре около 4 °C.

4.11 Кислота периодная

4.11.1 Раствор кислоты периодной 1 молярной концентрацией c = 0,1 моль/дм3.

0,227 9 г периодной кислоты (см. 4.11) растворяют в 10 см3 воды.

4.11.2 Раствор кислоты периодной 2 молярной концентрацией c = 0,034 моль/дм3.

3,4 см3 раствора кислоты периодной 1 (см. 4.11.1) разбавляют 6,6 см3 воды. Раствор хранят в холодильнике в темноте при температуре около 4 °C. Раствор ежедневно готовят свежий.

4.12 Реактив для периодатного окисления

Для приготовления реактива смешивают объемную долю раствора кислоты периодной 2 (см. 4.11.2) с объемной долей раствора гидрофосфата натрия (см. 4.8) и объемной долей раствора формиата аммония (см. 4.3). Путем добавления по каплям раствора гидроксида натрия 2 (см. 4.9.2) доводят значение pH до 8,2, используя потенциометр для определения pH. Раствор готовят в день проведения анализа.

4.13 Стандартные образцы PSP-токсина

4.13.1 Основные растворы PSP-токсина

Для удобства стандартные вещества могут комбинироваться в три смеси путем соответствующего разбавления стандартных растворов водой. Доводят pH растворов до значения около 4, используя 0,1 моль/дм3 раствора уксусной кислоты 2 (см. 4.4.2). Для анализа на C1,2 pH растворов доводят до значения около 5, поскольку при других значениях наблюдалось разложение. В таблице 4 приведены соответствующие концентрации каждого PSP-токсина в трех основных смесях. Растворы хранят в темном месте при температуре около 4 °C и регулярно проверяют концентрацию после 2 нед хранения или хранят в темном месте при температуре около минус 18 °C или ниже и регулярно проверяют концентрацию после 6 мес хранения.

Таблица 4

Примеры соответствующих концентраций для каждого PSP-токсина в трех основных смесях

Примечание — Ампулы, содержащие раздельно стандартные вещества STX, NEO, GTX1,4, GTX2,3, C1,2, GTX5, dcGTX2,3, dcNEO, dcSTX в соляной кислоте или в водном растворе уксусной кислоты с диапазоном концентрации от 100 до 2 000 мкг/см3, доступны для приобретения в торговой сети <1>.

<1> Соответствующие градуировочные растворы доступны в Национальном исследовательском совете Канады, Галифакс, Канада. Дополнительную информацию о подходящих градуировочных растворах можно получить, например, на домашней странице Референтной лаборатории Европейского союза по морским биотоксинам по адресу http://aesan.msssi.gob.es/en/CRLMB/web/home.shtml и http://www.aesan.msssi.gob.es/en/CRLMB/web/estandares_materiales_referencia/materiales_referencia.shtml. Данная информация приведена исключительно для информационных целей и не является рекламой CEN указанной продукции. Допускается использовать аналогичную продукцию при условии обеспечения идентичных результатов.

Некоторые стандартные вещества могут быть контаминированы другими PSP-токсинами, поэтому следует учитывать загрязняющие примеси в целях градуировки (с помощью количественного определения загрязняющих примесей, составления различных градуировочных кривых или путем их включения в погрешности измерения).

4.13.2 Градуировочные растворы PSP-токсина

Для определения PSP-токсинов градуировка проводится с применением как минимум пяти точек, например, с применением не разбавленного основного раствора PSP-токсина и растворов, полученных при 2,5-кратном, 5-кратном, 7,5-кратном и 10-кратном разбавлении основного раствора PSP-токсина (см. 4.13.1) раствором уксусной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 (см. 4.4.3). Градуировочные растворы PSP-токсина также можно готовить, разбавляя смеси основных растворов водой (если значение pH находится в кислом диапазоне). Растворы хранят в темном месте при температуре ниже минус 18 °C и регулярно проверяют концентрацию после 6 мес хранения.

Примечание 1 — Важно хранить разбавленные стандартные растворы во флаконах для ВЭЖХ из полимерных материалов или в деактивированных стеклянных флаконах. Данную деактивацию можно проводить, например, путем погружения стеклянных флаконов на ночь в гидроксид натрия с последующим промыванием водой, метанолом и высушиванием.

Для межлабораторного испытания, указанного в разделе A.1 [4], [5], применяли три градуировочные точки. Однако для повышения надежности метода рекомендуется использовать как минимум пять градуировочных точек.

Примечание 2 — Градуировочный раствор может быть тоже приготовлен на этапе окисления (6.5.2 и 6.5.3). Для этого различные аликвоты основного раствора PSP-токсина доводятся до конечного объема 100 мм3 раствором уксусной кислоты 3 молярной концентрацией 0,1 ммоль/дм3 (см. 4.4.3).

4.13.3 Раствор PSP-токсинов для проверки степени обнаружения

Готовят растворы PSP-токсинов соответствующей концентрации (например, в 0,6%-ном растворе уксусной кислоты) для проверки степени обнаружения токсинов на картриджах твердофазной экстракции (SPE-картриджи).

4.14 Модификатор матрицы для периодатного окисления

Используют холостой экстракт устриц (не содержащий PSP-токсины), приготовленный как описано в 6.1 и 6.2. Данный неочищенный экстракт устойчив при хранении в замороженном состоянии при температуре ниже минус 20 °C и может использоваться в течение 2 мес. Для применения в качестве модификатора матрицы холостой экстракт устриц очищают по 6.3.1 и доводят значение pH до 6,5, используя раствор гидроксида натрия 1 (см. 4.9.1). Раствор можно хранить в холодильнике 2 — 3 сут для осаждения экстрагированного совместно материала. Декантируют надосадочную жидкость или фильтруют ее, используя фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (см. 5.18) <*>. Полученный модификатор матрицы хранят в холодильнике. Перед применением для обеспечения отсутствия токсинов модификатор матрицы проверяют на наличие PSP-токсинов с помощью периодатного и пероксидного окисления. Модификатор матрицы следует готовить каждые две недели (например, путем очистки неочищенного экстракта).

<*> Исправлена ошибка, допущенная в EN 14526:2017.

4.15 Подвижные фазы для ВЭЖХ

4.15.1 Подвижная фаза A: формиат аммония молярной концентрацией c = 0,1 моль/дм3.

6,31 г формиата аммония растворяют в 1 дм3 воды и, добавляя примерно 6 см3 раствора уксусной кислоты 2 (см. 4.4.2), доводят значение pH до 6,0. Раствор фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.18) под вакуумом.

4.15.2 Подвижная фаза B: формиат аммония молярной концентрацией c = 0,1 моль/дм3 в 5%-ном ацетонитриле.

6,31 г формиата аммония растворяют в 950 см3 воды и смешивают с 50 см3 ацетонитрила (см. 4.2). Путем добавления 6 см3 раствора уксусной кислоты 2 (см. 4.4.2) доводят значение pH до 6,0. Раствор фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.18) под вакуумом.

5 Оборудование и материалы

Используют стандартное лабораторное оборудование, в том числе перечисленное ниже.

5.1 Измельчитель проб лабораторный.

5.2 Весы лабораторные с точностью взвешивания 0,01 г.

5.3 Весы лабораторные с точностью взвешивания 0,1 мг.

5.4 Пробирки центрифужные из полимерного материала (полипропилен) вместимостью 50 см3, снабженные обжимными пробками.

5.5 Центрифуга, обеспечивающая фактор разделения 3 600g <1>.

<1> g = 9,81 м·с-2.

5.6 Пипетки Пастера, пипетки автоматические с одноразовыми наконечниками из полимерного материала.

5.7 Вихревая мешалка.

5.8 Водяная баня и/или плита.

5.9 Пробирки конические градуированные (вместимостью 2, 5, 10, 15 см3).

5.10 SPE-C18-картриджи, например, с объемом картриджа 3 см3 и массой сорбента 500 мг.

Каждую новую партию SPE-C18-картриджей (например, Supelcoclean LC18) необходимо протестировать с помощью стандартных растворов (см. 4.13.3), чтобы убедиться, что достигается степень обнаружения не менее 80%. Необходимость осуществления такого тестирования основана на сведениях, полученных в ходе разработки метода, свидетельствующих о том, что могут иметь место отклонения. Для GTX6 и C3,4 проведение указанного тестирования невозможно, так как их стандартные вещества в настоящее время не доступны на рынке.

Если практика применения метода в лаборатории показала, что производительность SPE-C18-картриджей стабильна в пределах партии, то может быть выполнена следующая процедура: каждая новая партия SPE-C18-картриджей должна быть протестирована с использованием растворов пробы с точно известными концентрациями, чтобы гарантировать, что минимальная степень обнаружения всего процесса соответствует минимальным валидированным значениям.

5.11 Картриджи для твердофазной экстракции на ионообменнике (SPE-COOH), например, с объемом картриджа 3 см3 и массой сорбента 500 мг.

Каждую новую партию SPE-COOH-картриджей (например, Bakerbond Carboxylic Acidsilane или, опционально, слабый катионообменник Strata-X от Phenomenex) необходимо протестировать с помощью стандартных растворов (см. 4.13.3), чтобы убедиться, что достигается степень обнаружения не менее 80% и получен правильный профиль элюирования в соответствии с 6.3.2. Необходимость осуществления такого тестирования основана на сведениях, полученных в ходе разработки метода, согласно которым установлено, что могут иметь место отклонения. Для GTX6 и C3,4 проведение указанного тестирования невозможно, так как их стандартные вещества в настоящее время недоступны на рынке.

Если практика применения метода в лаборатории показала, что производительность SPE-COOH-картриджей стабильна в пределах партии, то может быть выполнена следующая процедура. Каждая новая партия SPE-COOH-картриджей должна быть протестирована с использованием растворов пробы с точно известными концентрациями, чтобы гарантировать, что минимальная степень обнаружения всего процесса соответствует минимальным валидированным значениями.

5.12 Манифолд или автоматическое устройство для твердофазной экстракции (для SPE-очистки)

5.13 Нагревательный блок (или аналогичное оборудование) для этапа гидролиза

5.14 Реакционные пробирки, например, стеклянные пробирки с навинчивающейся крышкой или флаконы для ВЭЖХ вместимостью 1,5 см3.

5.15 Бумага индикаторная для определения значения pH 6,5 +/- 0,3.

5.16 Прибор для измерения pH

5.17 Роторный испаритель, опционально для проб с низкими концентрациями.

5.18 Фильтры мембранные для водных растворов с диаметром пор 0,45 мкм, например, регенерированная целлюлоза.

5.19 Флаконы для ВЭЖХ, например, из темного стекла.

5.20 Установка ВЭЖХ с нижеприведенным оборудованием

5.20.1 Инжектор, преимущественно охлаждаемый, пригодный для ввода до 100 мм3.

5.20.2 Насос, пригодный для работы в режиме градиентного элюирования.

5.20.3 Колоночный термостат, пригодный для нагревания до (40 +/- 2) °C.

5.20.4 Колонка аналитическая, например, RP C18, размер частиц 5 мкм, 150 мм (длина) x 4,6 мм (диаметр).

Измерение может проводиться с применением различных аналитических колонок (различных размеров, изготовителей). Однако продукты окисления PSP-токсинов должны быть разделены до базовой линии.

5.20.5 Флуориметрический детектор, длина волны возбуждения \lambda = 340\text{нм} , длина волны эмиссии \lambda = 395\text{нм} , способный обнаруживать обработанный пероксидом (см. 6.5.3) 400 пг STX-стандартного вещества в виде свободного основания на колонке с соотношением «сигнал-шум» не менее 10:1.

6 Методика проведения испытания

6.1 Подготовка пробы

Поверхность моллюсков тщательно очищают водопроводной водой. Моллюски открывают путем разделения мышц-аддукторов. Внутреннюю часть промывают водопроводной водой для удаления песка и посторонних частиц. Удаляют мякоть из раковин путем разделения мышцы-аддуктора и ткани от эластичного лигамента. После удаления раковины мякоть моллюска помещают на 5 мин в сито для стекания избыточной влаги. Мякоть моллюсков гомогенизируют в измельчителе (см. 5.1). Следует использовать от 100 до 150 г объединенной гомогенизированной мякоти. В случае если непосредственно после подготовки пробы не предполагается проводить испытание, то гомогенизированную мякоть моллюска замораживают.

6.2 Экстракция

Гомогенизированную пробу размораживают в холодильнике или при комнатной температуре либо используют непосредственно после измельчения (см. 6.1).

Пробу нельзя нагревать.

Экстракты и растворы хранят в холодильнике, если не используют.

Из гомогенизированной мякоти моллюсков отбирают пробу для испытания в количестве (5 +/- 0,1) г в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 (см. 5.4), добавляют 3 см3 1%-ного раствора уксусной кислоты 1 (см. 4.4.1) и перемешивают, используя вихревую мешалку. Пробирку закрывают неплотно во избежание возникновения давления при нагревании и помещают в кипящую водяную баню (100 °C) таким образом, чтобы содержимое пробирки находилось ниже уровня воды. Содержимое пробирки нагревают в течение 5 мин.

Необходимо убедиться, что водяная баня достигла температуры кипения, прежде чем поместить в нее пробы и начать отсчет времени нагревания. Чтобы не прерывать кипение водяной бани дольше 30 с, в нее сразу не следует помещать слишком много проб.

Пробы извлекают из водяной бани и снова перемешивают, используя вихревую мешалку. Далее пробы охлаждают в течение 5 мин в холодильнике или в стакане с холодной водой и центрифугируют в течение 10 мин при 3 600g. Надосадочную жидкость декантируют в градуированную коническую пробирку вместимостью 15 см3 (см. 5.9).

В центрифужную пробирку, содержащую однократно экстрагированную пробу (твердый остаток), добавляют 3 см3 1%-ного раствора уксусной кислоты 1 (см. 4.4.1) <*> тщательно перемешивают, используя вихревую мешалку, и центрифугируют в течение 10 мин при 3 600g. Надосадочную жидкость декантируют в градуированную коническую пробирку вместимостью 15 см3 (см. 5.9), которая содержит собранный раньше неочищенный экстракт, и доводят водой до 10 см3.

<*> Исправлена ошибка, допущенная в EN 14526:2017.

Процедуру можно завершить на этом этапе, и если экстракт не будет использоваться сразу, то его следует хранить в холодильнике.

6.3 Очистка пробы

6.3.1 SPE-C18-очистка

Картридж кондиционируют в соответствии с рекомендациями изготовителя, например, SPE-C18-картридж (см. 5.10) объемом 3 см3 кондиционируют, пропуская через него последовательно 6 см3 метанола и 6 см3 воды. Растворы, прошедшие через картридж, отбрасывают. Под картридж помещают градуированную коническую пробирку вместимостью 5 см3 (см. 5.9). Через картридж пропускают 1 см3 (соответствует 0,5 г мякоти моллюсков) неочищенного экстракта (см. 6.2). Для всего элюирования скорость потока устанавливают от 2 до 3 см3/мин. Элюат собирают в градуированную коническую пробирку. Картридж промывают 2 см3 воды и промывочную жидкость соединяют с элюатом, чтобы получить очищенный экстракт.

В течение испытания картридж не должен быть сухим.

Раствором гидроксида натрия 1 молярной концентрацией 1 моль/дм3 (см. 4.9.1) доводят значение pH очищенного экстракта до 6,5, используя для контроля значения pH индикаторную бумагу (см. 5.15) или прибор для измерения pH (см. 5.16), и затем водой доводят объем точно до значения 4 см3.

В целях скрининга очистку пробы можно завершить на этом этапе. Экстракты, полученные после SPE-C18-очистки, обычно остаются стабильными в морозильной камере в течение более одного года, однако данный факт требует подтверждения.

Аликвоты очищенного экстракта можно использовать для периодатного или пероксидного окисления, описанного в 6.5.2 и 6.5.3.

Дополнительно аликвоту очищенного экстракта, не подвергающегося окислению, испытывают в качестве контрольной пробы при проведении пероксидного окисления, чтобы убедиться, что пики на хроматограмме окисленной пробы вызваны PSP-токсинами, а не естественными флуоресцентными соединениями. В данном случае аликвоту очищенного экстракта, полученного после SPE-C18-очистки, необходимо смешать с модификатором матрицы для периодатного окисления и водой (вместо реактива для периодатного окисления), а далее испытать. Полученная хроматограмма позволит идентифицировать пики, возникающие из-за обладающих естественной флуоресценцией соэкстрактов проб. При данных условиях не рассматриваются пики PSP-токсинов.

Если в очищенном экстракте обнаруживают N-гидроксилированные PSP-токсины, то выполняют нижеописанную процедуру SPE-COOH-очистки.

Примечание — При проверке целых морских гребешков (Aequipecten opercularis) и королевских морских гребешков (Pecten maximus), контаминированных токсинами NEO и GTX1,4, применение 1,5 см3 неочищенного экстракта для SPE-018-очистки повышает степень обнаружения GTX1,4 и NEO [3].

6.3.2 SPE-COOH-очистка (фракционирование)

Процедуру проводят только с теми экстрактами, которые после SPE-C18-очистки содержат N-гидроксилированные PSP-токсины (например, NEO, dcNEO, C3,4, GTX6 (B2) и GTX1,4).

Картридж кондиционируют в соответствии с рекомендациями изготовителя, например SPE-COOH-картридж (для твердофазной экстракции на ионообменнике) (см. 5.11) объемом 3 см3 кондиционируют, пропуская через него 10 см3 раствора ацетата аммония 2 молярной концентрацией 0,01 моль/дм3 (см. 4.5.2) <*>. Растворы, прошедшие через картридж, отбрасывают.

<*> Исправлена ошибка, допущенная в EN 14526:2017.

Для всего элюирования скорость потока устанавливают от 2 до 3 см3/мин.

Фракция 1: Через картридж пропускают аликвоту экстракта моллюсков, полученного после SPE-C18-очистки (см. 6.3.1), объемом 2 см3 (соответствует 0,25 г мякоти моллюсков). Элюат собирают в градуированную коническую пробирку вместимостью 10 см3 и обозначают как фракция 1. Затем через картридж пропускают 4 см3 воды и собирают в ту же градуированную коническую пробирку. Конечный объем содержимого градуированной конической пробирки доводят до 6 см3. Данная фракция содержит группу C-токсина. Далее проводят окисление в соответствии с 6.5.2 и/или 6.5.3. При наличии токсина C3,4 проводят соответствующее преобразование по 6.4.

Фракция 2: Через тот же картридж пропускают 4 см3 раствора 1 NaCl молярной концентрацией 0,05 моль/дм3 (см. 4.6.1). Элюат собирают в градуированную коническую пробирку вместимостью 5 см3 и обозначают как фракция 2. Конечный объем содержимого градуированной конической пробирки доводят до 4 см3. Данная фракция содержит токсины GTX1,4, GTX2,3, GTX5 (B1), GTX6 (B2) и dcGTX2,3. Далее проводят окисление в соответствии с 6.5.2 и/или 6.5.3. При наличии токсина GTX6 (B2) проводят соответствующее преобразование по 6.4.

Фракция 3: Через тот же картридж пропускают 5 см3 раствора 2 NaCl молярной концентрацией 0,3 моль/дм3 (см. 4.6.2). Элюат собирают в градуированную коническую пробирку вместимостью 5 см3 и обозначают как фракция 3. Конечный объем содержимого градуированной конической пробирки доводят до 5 см3. Данная фракция содержит токсины STX, NEO, dcNEO и dcSTX. Далее проводят окисление в соответствии с 6.5.2 и/или 6.5.3.

В течение испытания картридж не должен быть сухим.

Если возникают проблемы с чувствительностью детектора, то любую фракцию можно сконцентрировать. Для этого рекомендуется собрать нужную фракцию, полученную после SPE-COOH-очистки, в круглодонную колбу вместимостью 50 см3 вместо градуированной конической пробирки и упарить до 1 см3, используя, например, роторный испаритель или другие подходящие испарители с водяной баней, установленной на 45 °C. Далее необходимо перенести концентрированный раствор в градуированную коническую пробирку вместимостью 5 см3 с помощью пипетки Пастера. Круглодонную колбу вместимостью 50 см3 трижды ополаскивают от 0,2 до 0,3 см3 воды, при этом промывочную жидкость переносят в градуированную коническую пробирку таким образом, чтобы конечный объем фракции, прошедшей SPE-COOH-очистку, точно составлял 2 см3. Анализируют фракции 1, 2 и 3 с помощью ВЭЖХ после проведения периодатного и пероксидного окислений в соответствии с 6.5.2 и/или 6.5.3.

Примечание — Для улучшения чувствительности метода в ходе лабораторной валидации [2], [11] была разработана альтернативная процедура SPE-очистки со слабым катионным обменом (см. 6.3.3).

На этом этапе очистку проб можно остановить. Сразу после этого проводят окисление и измерение методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором или очищенную после SPE-COOH-очистки фракцию хранят в холодильнике не дольше недели или в морозильной камере не более года.

6.3.3 Альтернативная SPE-очистка со слабым катионным обменом [2], [11]

Чтобы повысить чувствительность и уменьшить переход в соседних фракциях с низким содержанием PSP-токсина, может применяться следующая модифицированная очистка после SPE-C18-очистки, однако следует отметить, что эта процедура была валидирована только внутрилабораторно.

Процедура фракционирования такая же, как описано в 6.3.2. Отличается от [1] только в части концентрации растворов хлорида натрия и объема для элюирования (см. таблицу 5).

Таблица 5

Сравнение условий фракционирования [2], [11]

6.4 Преобразование GTX6 (B2) в NEO и/или C3,4 в GTX1,4

6.4.1 Общие положения

В настоящее время стандартное вещество GTX6 (B2) недоступно. Следовательно, для количественного определения GTX6 (B2) данный токсин должен быть преобразован в NEO гидролизом [7], [8]. Содержание GTX6 (B2) может быть косвенно определено путем гидролиза фракции 2, полученной после SPE-COOH-очистки и не содержащей NEO.

В настоящее время стандартное вещество C3,4 коммерчески недоступно. Данный токсин, присутствующий во фракции 1, полученной после SPE-COOH-очистки, может быть косвенно определен путем преобразования в GTX1,4 после гидролиза [10].

6.4.2 Гидролиз фракции 1 или 2, полученной после SPE-COOH-очистки

Во флакон для ВЭЖХ или в пробирку с навинчивающейся крышкой помещают 300 мм3 фракции 2, полученной после SPE-COOH-очистки (см. 6.3.2), и добавляют 75 мм3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3. Флакон (пробирку) плотно закрывают и взвешивают. Смесь нагревают в течение 20 мин при температуре 90 °C в водяной бане или нагревательном блоке. Смесь охлаждают до комнатной температуры и снова взвешивают, чтобы определить возможное изменение в массе флакона (пробирки) со смесью в результате возможного испарения при нагревании (если масса флакона (пробирки) со смесью изменилась, добавляют воду до достижения первоначальной массы). В несколько приемов добавляют по 15 мм3 раствора гидроксида натрия 1 молярной концентрацией 1 моль/дм3 (см. 4.9.1), каждый раз перемешивая до тех пор, пока общий объем добавленного раствора не достигнет 75 мм3. Данные действия необходимы для нейтрализации кислоты, при этом следует избегать чрезмерного подщелачивания гидролизованной фракции 2. Доводят pH до нейтрального.

В процессе периодатного окисления (сочетание гидролизованной фракции 2, модификатора матрицы и реактива для периодатного окисления) pH смеси должен достигнуть значения 8,2. Однако если pH окисленной гидролизованной фракции не достигает значения 8,2, тогда гидролизованная фракция 2 должна быть скорректирована путем добавления немного большего количества раствора гидроксида натрия. Дополнительное добавленное количество раствора гидроксида натрия должно быть зафиксировано и учтено при осуществлении расчетов [12].

Пробу анализируют с помощью метода ВЭЖХ после периодатного окисления в соответствии с 6.5.2.

Указанную процедуру также можно применить к фракции 1, полученной после SPE-COOH-очистки.

Примечание - В зависимости от минимального измеряемого объема используемого pH-метра возможно увеличить объем всех реактивов в равном соотношении (т.е. 900 мм3 фракции 2, полученной после SPE-COOH-очистки (фильтрованная), + 225 мм3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3 и после реакции 225 мм3 раствора гидроксида натрия 1 молярной концентрацией 1 моль/дм3).

6.5 Процесс окисления

6.5.1 Общие положения

При проведении реакции окисления важно, чтобы время реакции оставалось одинаковым для всех смесей образцов и стандартов, так как отклонения могут повлиять на эффективность окисления и изменить выход продуктов окисления, что в свою очередь влияет на воспроизводимость результатов. Необходима контрольная проба, подтверждающая отсутствие естественных флуоресцирующих соединений, как указано в шестом абзаце 6.3.1.

При проверке целых морских гребешков (Aequipecten opercularis) и королевских морских гребешков (Pecten maximus), контаминированных токсинами NEO и GTX1,4, данный подход может снизить чувствительность. Для повышения чувствительности может быть использована модификация стадии периодатного окисления, как описано в примечании к 6.5.2.

6.5.2 Периодатное окисление

Для всех используемых в реакциях окисления реактивов и растворов применяют автоматические пипетки с одноразовыми наконечниками из полимерного материала.

До проведения периодатного окисления необходимо довести значение pH до 6,5 [12].

Во флакон для ВЭЖХ вместимостью 1,5 см3 вносят 100 мм3 раствора модификатора матрицы и добавляют 100 мм3 стандартного раствора или экстракта пробы после SPE-C18-очистки (см. 6.3.1) или фракцию после SPE-COOH-очистки (см. 6.3.2). Затем добавляют 500 мм3 реактива для периодатного окисления (см. 4.12) <*> и тщательно перемешивают на вихревой мешалке. Раствору дают возможность прореагировать в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мм3 ледяной уксусной кислоты (см. 4.4) и раствор перемешивают. Смесь оставляют на 10 мин при комнатной температуре, прежде чем вводить от 50 до 100 мм3 в систему ВЭЖХ.

Для негидролизованных токсинов раствор стабилен не менее одного дня. Однако у NEO, GTX6 (B2) и GTX1,4 происходит медленное разложение продуктов окисления. Несмотря на это разложение, количество токсинов можно определить, если стандартные и анализируемые растворы хранятся и анализируются в одних и тех же условиях [5].

Примечание — При проверке целых морских гребешков (Aequipecten opercularis) и королевских морских гребешков (Pecten maximus), контаминированных токсинами NEO и GTX1,4, было установлено, что применение для окисления градуировочных стандартов модификатора матрицы из экстракта королевских морских гребешков вместо модификатора матрицы из экстракта устриц (см. 4.14) приводит к хорошей степени обнаружения. Модифицированный реактив для периодатного окисления, содержащий в 5 раз больше периодной кислоты, чем обычно, показал хорошую чувствительность. Периодат, используемый для окисления всех стандартных растворов и проб, был приготовлен с использованием раствора периодной кислоты 2 молярной концентрацией 0,034 <*> моль/дм3 (см. 4.11.2), раствор формиата аммония молярной концентрацией 0,3 моль/дм3 (см. 4.3) и раствор гидрофосфата натрия молярной концентрацией 0,3 моль/дм3 (см. 4.8) в соотношении 5:1:1, при этом перед использованием значение pH было доведено до 8,2. Также повышалась чувствительность при использовании больших объемов вводимой пробы (100 мм3) [3].

<*> Исправлена ошибка, допущенная в EN 14526:2017.

6.5.3 Пероксидное окисление

Во флакон для ВЭЖХ вместимостью 1,5 см3 вносят 250 мм3 раствора гидроксида натрия 1 молярной концентрацией 1 моль/дм3 (см. 4.9.1), добавляют 25 мм3 водного раствора H2O2 массовой долей 10% (см. 4.10) и перемешивают. Затем добавляют 100 мм3 стандартного раствора или экстракта пробы после SPE-C18-очистки (см. 6.3.1) или SPE-COOH-очистки (см. 6.3.2). Раствор перемешивают. Раствору дают возможность прореагировать в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 20 мм3 ледяной уксусной кислоты (см. 4.4) и раствор снова перемешивают. В систему ВЭЖХ вводят от 25 до 50 мм3 данного раствора. Раствор стабилен при комнатной температуре не менее 8 ч [5].

Примечание - Ввод в систему ВЭЖХ более 50 мм3 раствора может вызвать размывание (уширение) пика.

7 Проведение измерений методом ВЭЖХ

Пользователь проверяет стабильность системы (% отклонения площадей пика и % отклонения времени удерживания) на основании своих условий ВЭЖХ. Вводят продукты окисления PSP-токсинов, хроматографически разделяют их для индивидуальной идентификации и количественного определения токсинов.

Следует учитывать, что dcGTX2,3 и dcSTX образуют каждый по два пика, так как при пероксидном окислении они образуют два различных продукта, которые следует хроматографически разделить с разрешением более 1,5. Флуориметрический детектор должен обнаружить обработанные пероксидом (см. 6.5.3) 400 пг STX-стандартного вещества в виде свободного основания на колонке с соотношением «сигнал-шум» не менее 10:1.

Следующие условия ВЭЖХ привели к удовлетворительным результатам:

    Колонка:                    C18 обращенная фаза, 5 мкм, 150 x 4,6 мм
    Температура:                40 °C
    Скорость потока:            2 см3/мин
    Объем  введенной пробы:     От 25 до 50 мм3 (при пероксидном окислении)
                                или от  50  до  100 мм3

(при периодатном окислении)

Флуориметрический детектор: длина волны возбуждения: 340 нм

длина волны эмиссии: 395 нм

Соответствующий ВЭЖХ-градиент со скоростью потока 2 см3/мин приведен в таблице 6.

Таблица 6

Рекомендуемый градиент подвижной фазы при скорости потока 2 см3/мин

Примечание 1 — Измерение можно проводить с использованием различных разделительных колонок (размер, производитель).

Значение pH элюентов A и B нестабильно во времени. Поэтому перед каждой аналитической серией необходимо готовить свежие элюенты A и B [12].

Следующая схема ввода проб доказала свою эффективность. Перед вводом серии проб вводят серию градуировочных растворов. В процессе анализа проб градуировочные растворы и/или раствор с определенной концентрацией вводят через регулярные промежутки времени для проверки стабильности системы (например, каждый четвертый ввод — это раствор с определенной концентрацией). После завершения серии проб производится повторный ввод серии градуировочных растворов.

Примечание 2 — В процессе применения автоматического дозатора при комнатной температуре некоторые продукты окисления токсинов нестабильны, поэтому чувствительность этих токсинов (например, dcNEO и NEO) может уменьшаться в течение одной последовательности. Влияние данного явления может быть снижено при использовании охлаждаемого автоматического дозатора (например, при 6 °C) [12].

Окисленные периодатом и пероксидом экстракты после SPE-C18-очистки (см. 6.3.1) или фракции после SPE-COOH-очистки исследуют. Экстракты после SPE-C18-очистки без окисления следует анализировать также, как и после периодатного или пероксидного окисления, чтобы убедиться, что пики PSP-токсинов, обнаруженные в хроматограммах, действительно связаны с PSP-токсинами, а не с обладающими естественной флуоресценцией соэкстрактами проб (см. 6.3.1). Экстракты с содержанием PSP-токсинов, превышающим высший градуировочный стандарт, следует разбавлять водой. Коэффициенты разбавления регистрируют.

Для того чтобы иметь возможность эффективно использовать этот метод в рутинных анализах, где требуется анализ большого количества образцов, рекомендуется процедура, представленная на рисунке 2.

Рисунок 2 — Блок-схема процесса [4]

Экстракты анализируют после SPE-C18-очистки и периодатного окисления. Если пики не соответствуют ни одному из стандартных веществ PSP, анализируемая проба считается отрицательной и дальнейший анализ не требуется.

Если присутствует какой-либо из негидроксилированных токсинов (STX, dcSTX, GTX2,3, dcGTX2,3, GTX5 (B1) или C1,2) и отсутствуют N-гидроксилированные токсины (NEO, dcNEO, GTX1,4, GTX6 (B2) и C3,4), то негидроксилированные токсины могут быть количественно определены путем прямого сравнения с известными стандартными растворами, полученными путем периодатного окисления. Однако реакция пероксидного окисления намного более чувствительна для GTX5 (B1), C1,2 и dcSTX и предпочтительна, если требуется оптимальная чувствительность.

Если присутствуют как N-гидроксилированные, так и негидроксилированные токсины, тогда негидроксилированные токсины количественно определяют после пероксидного окисления другой аликвоты экстракта после SPE-C18-очистки. Полученные пики сравниваются с пиками одинаково окисленных стандартных растворов. Использование данного способа обусловлено тем, что при периодатном окислении некоторые из N-гидроксилированных токсинов реагируют с теми же продуктами, что и их негидроксилированные аналоги. Кроме того, для некоторых токсинов (особенно GTX5 (B1), C1,2 и dcSTX) пероксидное окисление дает лучшую чувствительность.

Для количественного определения любых N-гидроксилированных токсинов дополнительную аликвоту экстракта после SPE-C18-очистки необходимо фракционировать (см. 6.3.2) и окислить периодатом. На этом этапе происходит отделение C3,4 от GTX1,4 и GTX6 (B2) от NEO, что позволяет количественно определять все токсины путем прямого сравнения со стандартными веществами, для которых проводится такая же процедура периодатного окисления [5].

8 Установление градуировочной характеристики

Градуировочный график составляют в начале анализа, а также при каждом изменении условий хроматографического анализа. Площадь пика строится в соотношении со значениями массовых концентраций введенных градуировочных растворов PSP-токсинов. Коэффициент детерминации для всех токсинов должен составлять не менее 0,98. Концентрацию PSP-токсинов определяют непосредственно с помощью градуировочного графика (см. 10.2.2) или путем прямого сравнения с аналитическими стандартами, имеющими концентрации, аналогичные концентрациям, ожидаемым в пробе [5] (см. 10.2.3).

9 Идентификация аналита

PSP-токсины идентифицируют путем сравнения времени удерживания, а также количества продуктов окисления в пробе со стандартными веществами.

10 Вычисление

10.1 Общие положения

Каждый токсин количественно определяется в тканях моллюсков с помощью градуировочного графика (см. 10.2.2). В качестве альтернативы можно сравнить площади пиков растворов испытуемых проб с площадями пиков стандартных растворов с аналогичными массовыми концентрациями, как ожидается в пробе (см. 10.2.3). Для удобства можно использовать три стандартные смеси для количественного определения токсинов, как описано в таблице 4. Результаты рассчитывают в соответствии с 10.2, за исключением случаев, перечисленных в таблице 7.

Таблица 7

Расчет, применяемый для различных комбинаций токсинов

После расчета концентраций токсина их следует указывать как эквивалент STX-2HCl, применяя формулу, указанную в 10.9.

При пероксидном и периодатном окислении STX образуется один и тот же продукт окисления. Такой же принцип действует и в отношении GTX2,3, GTX5 (B1) и C1,2. С другой стороны, при пероксидном и периодатном окислении dcSTX и dcGTX2,3 образуются два разных продукта окисления, см. также раздел 3 и таблицу 2.

Токсин dcNEO образует два продукта окисления только при периодатном окислении. Каждый из токсинов (NEO, GTX6 (B2), GTX1,4 и C3,4) образует три пика после периодатного окисления, но только второй пик используется для количественного определения (пероксидное окисление не может использоваться для количественного определения) (таблица 2). Поскольку некоторые PSP-токсины (NEO и GTX6 (B2), GTX1,4 и C3,4) образуют одни и те же продукты окисления, то их количественное определение может проводиться только после разделения с помощью SPE-COOH-очистки (см. 6.3.2 или 6.3.3). Если dcSTX присутствует в высокой концентрации, то это влияет на количественное определение NEO после периодатного окисления. Токсин NEO может быть определен по соотношениям пиков после периодатного и пероксидного окисления (см. 10.3). При отсутствии стандартных веществ GTX6 может быть определен количественно после преобразования в NEO гидролизом (см. 6.4.2), (см. 10.4). Токсин C3,4 может быть определен количественно после преобразования в GTX1,4 гидролизом (см. 6.4.2) (см. 10.5). Токсины dcNEO и dcSTX имеют два общих пика при периодатном окислении, метод количественного определения описан в 10.6.

Примечание 1 — Важно отметить, что некоторые токсины не могут быть полностью разделены на одну из трех фракций после SPE-COOH-очистки и иногда небольшие количества могут встречаться в соседней фракции.

Примечание 2 — Рекомендуется указывать градуировочные стандарты в мкмоль/см3, так как это может снизить риск погрешностей вычислений после анализа и упростить расчеты.

10.2 Расчет содержания токсинов

10.2.1 Общие положения

Существует два метода расчета для количественного определения концентрации токсинов.

10.2.2 Метод расчета с использованием стандартного градуировочного графика

Концентрацию количества вещества c, мкмоль/кг, или массовую концентрацию w, мкг (свободное основание)/кг токсина, рассчитывают, используя градуировочный график и формулу (1):

c\text{или }w = \frac{A_{x} - b}{a} \frac{V_{x} \cdot F_{d} \cdot 1000}{m} , (1)

где Ax — площадь пика токсина в анализируемом экстракте или в анализируемой фракции;

a — наклон градуировочного графика токсина;

b — точка пересечения градуировочного графика;

Vx — суммарный объем анализируемого экстракта, см3;

Fd — коэффициент разбавления (для тех экстрактов или фракций, где содержание PSP-токсинов превышает содержание наиболее концентрированной стандартной смеси, разводят водой);

m — масса пробы для испытания, прошедшей процедуру очистки, как правило, 0,5 г для SPE-C18-очистки и 0,25 г для SPE-COOH-очистки, г;

1000 — коэффициент пересчета мкмоль/г в мкмоль/кг или мкг/г в мкг/кг.

Из-за множества заряженных функциональных групп токсины могут присутствовать в разных формах. Поэтому важно указать точную форму соли (молекулярную массу), если результаты выражены в мкг/кг.

10.2.3 Альтернативный метод расчета с использованием градуировки по одной точке [4], [5]

Концентрацию каждого токсина в пробе рассчитывают путем сравнения соответствующей площади пика с площадью пика стандартного вещества, используемого при измерениях. Стандартные растворы следует вводить незадолго до или после ввода растворов неизвестной пробы, кроме того, концентрация растворов должна быть схожей.

Концентрацию количества вещества c, мкмоль/кг, или массовую концентрацию w, мкг (свободное основание)/кг токсина, рассчитывают, используя градуировочный график и формулу (2), см. также [4], [5].

c\text{или }w = \frac{A_{x} \cdot C_{s}V_{x} \cdot F_{d} \cdot 1000}{A_{s} \cdot m} , (2)

где Ax — площадь пика токсина в анализируемом экстракте или в анализируемой фракции;

As — площадь пика стандартного раствора, схожего с анализируемым экстрактом (время и концентрация);

Cs — концентрация стандартного вещества или массовая концентрация стандартного раствора, мкмоль/см3 или мкг/см3;

Vx — суммарный объем анализируемого экстракта или анализируемой фракции, см3;

Fd — коэффициент разбавления (для тех экстрактов или фракций, где содержание PSP-токсинов превышает содержание наиболее концентрированной стандартной смеси, разбавляют водой);

m — масса пробы для испытания, прошедшей процедуру очистки, как правило, 0,5 г для SPE-C18-очистки и 0,25 г для SPE-COOH-очистки, г;

1000 — коэффициент пересчета мкмоль/г в мкмоль/кг или мкг/г в мкг/кг.

10.3 Расчет NEO при наличии dcSTX [4], [5]

10.3.1 Общие положения

В связи с тем, что один из продуктов окисления NEO и dcSTX идентичен, необходима стратегия количественного определения NEO в присутствии dcSTX. Второй продукт окисления NEO имеет такое же время удерживания, что и второй продукт окисления dcSTX. Площадь пика NEO в пробе, содержащей NEO и dcSTX, можно рассчитать двумя способами. На рисунке 3 приведены хроматограммы стандартного раствора dcSTX и неизвестной пробы, содержащей смесь NEO и dcSTX, после периодатного и пероксидного окисления.

a) периодатное окисление	b) пероксидное окисление

Рисунок 3 — Хроматограмма, поясняющая расчет NEO при наличии dcSTX (представленные соотношения пиков являются только примерами)

Методы 1 и 2 неприменимы для расчета содержания NEO при наличии dcSTX и dcNEO. Единственный способ количественного определения — это применение третьего пика NEO, образовавшегося после периодатного окисления, когда STX отсутствует. Если STX также присутствует, то содержание STX рассчитывают после пероксидного окисления. Долей NEO в пике, образовавшемся после пероксидного окисления, следует пренебречь. Полученное содержание STX преобразуют в соответствующую площадь периодатного окисления и вычитают из площади третьего пика периодатного окисления NEO. Оставшаяся площадь соответствует содержанию NEO, см. 10.8.

10.3.2 Метод 1

Если концентрация dcSTX в пробе, содержащей смесь NEO и dcSTX, достаточно высока для получения хорошо интегрированного первого пика (пик D, рисунок 3) при периодатном окислении, тогда соответствующую площадь пика NEO (XNEO) рассчитывают по соотношению площадей двух пиков dcSTX, образовавшихся при периодатном окислении стандарта.

Для стандартного раствора dcSTX, анализируемого после периодатного окисления, отношение площадей двух пиков рассчитывают по формуле (3) :

\frac{A}{B} = \frac{X_{dcSTX}}{D} \Rightarrow X_{dcSTX} = \frac{D \cdot A}{B} , (3)

где A — площадь второго (большего) пика dcSTX при периодатном окислении;

B — площадь первого (меньшего) пика dcSTX при периодатном окислении;

D — площадь первого (меньшего) пика dcSTX в неизвестной пробе при периодатном окислении;

XdcSTX — площадь пика dcSTX в пике C.

Национальная сноска: формулы немецкой редакции исправлены по сравнению с английской версией (скобки и написание индексов).

Площадь пика для NEO рассчитывают по формуле (4):

X_{NEO} = C - X_{dcSTX} = C - \frac{D \cdot A}{B} , (4)

где C — площадь второго (большего) пика dcSTX + NEO в неизвестной пробе при периодатном окислении.

Для расчета массы NEO и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.3.3 Метод 2

Если концентрация dcSTX в пробе, содержащей NEO и dcSTX, недостаточно высока для получения хорошо интегрированного первого пика (пик D, рисунок 3) при периодатном окислении, тогда соответствующую площадь пика NEO (XNEO) рассчитывают по соотношению площади пика dcSTX, образовавшегося при периодатном окислении (пик A) и площади пика dcSTX, образовавшегося при пероксидном окислении (пик E) стандартного раствора.

Для стандартного раствора dcSTX, анализируемого после периодатного и пероксидного окисления, отношение площадей двух пиков рассчитывают по формуле (5):

\frac{E}{A} = \frac{F}{X_{dcSTX}} \Rightarrow X_{dcSTX} = \frac{F \cdot A}{E} , (5)

где E — площадь первого (большего) пика dcSTX при пероксидном окислении;

F — площадь первого (большего) пика dcSTX в неизвестной пробе при пероксидном окислении;

XdcSTX — площадь пика dcSTX в пике C.

Площадь пика NEO рассчитывают по формуле (6):

X_{NEO} = C - X_{(dcSTX)} = C - \frac{F \cdot A}{E} . (6)

Для расчета массы NEO и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

Примечание - Результаты двух методов различаются. Метод 2 может быть более точным, так как применяемые в расчетах площади пиков (пики E и F) намного больше, чем используемые в методе 1 пики B и D.

10.4 Расчет GTX6 (B2)

Если обнаружен GTX6 (B2), то при количественном определении применяется периодатное окисление гидролизованной фракции 2. Гидролиз преобразует GTX6 (B2) в NEO. При количественном определении используют градуировку, мкмоль/кг, второго элюируемого пика NEO. Молярность токсина GTX6 (B2) равна молярности NEO-токсина, присутствующего во фракции 2 после гидролиза.

10.5 Расчет C3,4

Если обнаружен C3,4, то при количественном определении применяется периодатное окисление гидролизованной фракции 1. Гидролиз преобразует C3,4 в GTX1,4. При количественном определении используют градуировку, мкмоль/кг, второго элюируемого пика GTX1,4. Молярность C3,4-токсина равна молярности GTX1,4-токсина, присутствующего во фракции 1 после гидролиза.

10.6 Расчет dcNEO при наличии dcSTX

10.6.1 Общие положения

В связи с тем, что оба продукта периодатного окисления dcNEO и dcSTX (пик G и H на рисунке 4) идентичны, необходима стратегия для количественного определения dcNEO при наличии dcSTX. Существует два метода (метод 3 и метод 4) количественного определения концентрации токсинов.

a) периодатное окисление	b) пероксидное окисление

Рисунок 4 — Хроматограмма, поясняющая расчет dcNEO при наличии dcSTX

10.6.2 Метод 3

Если концентрация dcSTX в пробе, содержащей смесь dcNEO и dcSTX, достаточно высока для получения хорошо интегрированного первого пика (пик G, рисунок 4) при периодатном окислении и доля dcNEO в пероксидном окислении несущественна, тогда соответствующую площадь пика dcNEO (X(dcNEO)) рассчитывают по соотношению площадей двух пиков dcSTX, образовавшихся при периодатном и пероксидном окислении стандартного раствора (пик B и E) и неизвестной пробы (пик I) по формуле (7):

\frac{E}{B} = \frac{I}{X_{dcSTX - Period}} \Rightarrow X_{dcSTX - Period} = \frac{I \cdot B}{E} , (7)

где B — площадь первого (меньшего) пика dcSTX при периодатном окислении;

E — площадь первого (большего) пика dcSTX при пероксидном окислении;

I — площадь первого (большего) пика dcSTX в неизвестной пробе при пероксидном окислении;

XdcSTX-Period — площадь пика dcSTX в пике G.

Площадь пика dcNEO в пике G рассчитывают по формуле (8):

X_{dcNEO} = G - X_{dcSTX - Period} = G - \frac{I \cdot B}{E} , (8)

где G — площадь первого (большего) пика dcSTX + dcNEO в неизвестной пробе при периодатном окислении.

Для расчета массы dcNEO и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.6.3 Метод 4

Чувствительность метода с использованием пероксидного окисления для определения dcNEO очень низкая, поэтому содержанием dcNEO при расчете dcSTX после пероксидного окисления можно пренебречь. Долю dcSTX на площади пика G рассчитывают по формуле градуировочного графика (10) или (11):

\rho_{dcSTX - H_{2}O_{2}} = \frac{I - b_{dcSTX - H_{2}O_{2}}}{\alpha_{dcSTX - H_{2}O_{2}}} = \rho_{dcSTX - Period}, (9)

X_{dcSTX - Period} = \rho_{dcSTX - H_{2}O_{2}} \cdot \alpha_{dcSTX - Period} + b_{dcSTX - Period}, (10)

X_{dcSTX - Period} = (\frac{(I - b_{dcSTX - H_{2}O_{2}}) \cdot \alpha_{dcSTX - Period}}{\alpha_{dcSTX - H_{2}O_{2}}}) + b_{dcSTX - Period}, (11)

где \rho_{dcSTX - H_{2}O_{2}} — массовая концентрация dcSTX в пике I;

I — площадь пика I;

\rho_{dcSTX - Period} — массовая концентрация dcSTX в пике G;

X_{dcSTX - Period} — площадь пика dcSTX в пике G;

\alpha_{dcSTX - H_{2}O_{2}} — наклон градуировочного графика dcSTX, окисленного пероксидом;

\alpha_{dcSTX - Period} — наклон градуировочного графика dcSTX, окисленного периодатом;

b_{dcSTX - H_{2}O_{2}} — точка пересечения градуировочного графика dcSTX, окисленного пероксидом;

bdcSTX-Period — точка пересечения градуировочного графика dcSTX, окисленного периодатом.

Площадь пика dcNEO в пике G рассчитывают по формуле (12):

X_{dcNEO} = G - X_{dcSTX - Period} = G - (\frac{(I - b_{dcSTX - H_{2}O_{2}}) \cdot \alpha_{dcSTX - Period}}{\alpha_{dcSTX - H_{2}O_{2}}}) + b_{dcSTX - Period}. (12)

Для расчета массы dcNEO и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.7 Расчет GTX1,4 при наличии GTX2,3 и dcGTX2,3

10.7.1 Общие положения

В связи с тем, что некоторые продукты окисления GTX1,4 и GTX2,3, а также GTX1,4 и dcGTX2,3 идентичны, необходима стратегия количественного определения GTX1,4 при наличии GTX2,3 и dcGTX2,3, хотя возникновение данной ситуации маловероятно. Второй продукт окисления GTX1,4 (пик M, рисунок 5) имеет такое же время удерживания, что и второй продукт окисления dcGTX2,3. Третий продукт окисления GTX1,4 (пик O) имеет такое же время удерживания, что и продукт окисления GTX2,3.

a) периодатное окисление	b) пероксидное окисление

Рисунок 5 — Хроматограмма, поясняющая расчет GTX1,4 при наличии GTX2,3 и dcGTX2,3

Если присутствует только GTX2,3, то содержание GTX1,4 можно рассчитать, используя площадь второго пика окисления GTX1,4.

Если присутствует только dcGTX2,3, то содержание GTX1,4 можно рассчитать, используя площадь третьего пика окисления GTX1,4.

Долю GTX1,4 в пробе, содержащей GTX1,4, dcG_TX2,3 и G_TX2,3, можно рассчитать, используя методы 5 и 6.

10.7.₂ Метод 5

Если концентрация dcGTX2,3 в пробе, содержащей смесь GTX1,4 и dcGTX2,3, достаточно высока для получения хорошо интегрированного первого пика (пик L, рисунок 5) при периодатном окислении, тогда соответствующую площадь пика GTX1,4 (X(GTX1,4)) рассчитывают по соотношению площадей двух пиков dcGTX2,3, образовавшихся при периодатном окислении стандарта, по формуле (13):

\frac{K}{J} = \frac{X_{dcGTX_{2,3}}}{L} \Rightarrow X_{dcGTX_{2,3}} = \frac{K \cdot L}{J} , (13)

где J — площадь первого (меньшего) пика dcGTX2,3 при периодатном окислении;

K — площадь второго (большего) пика dcGTX2,3 при периодатном окислении;

L — площадь первого (меньшего) пика dcGTX2,3 в неизвестной пробе при периодатном окислении;

XdcGTX2,3 — площадь пика dcGTX2,3 в пике M.

Площадь пика для GTX1,4 рассчитывают по формуле (14):

X_{GTX_{1,4}} = M - X_{dcGTX_{2,3}} = M - \frac{L \cdot K}{J} , (14)

где M — площадь второго (большего) пика dcGTX2,3 и GTX1,4 в неизвестной пробе при периодатном окислении.

Для расчета массы GTX1,4 и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.₇.3 Метод 6

Чувствительность метода с использованием пероксидного окисления для определения GTX1,4 очень низкая, поэтому содержанием GTX1,4 при расчете GTX2,3 после пероксидного окисления можно пренебречь. Долю GTX2,3 на площади пика O рассчитывают по формулам градуировочного графика (16) или (17):

\rho_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}} = \frac{P - b_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}}}{\alpha_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}}} = \rho_{GTX_{2,3} - Period}, (15)

X_{GTX_{2,3} - Period} = \rho_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}} \cdot \alpha_{GTX_{2,3} - Period} + b_{GTX_{2,3} - Period}, (16)

X_{GTX_{2,3} - Period} = (\frac{(P - b_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}}) \cdot \alpha_{GTX_{2,3} - Period}}{\alpha_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}}}) + b_{GTX_{2,3} - Period}, (17)

где \rho_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}} — массовая концентрация GTX2,3 в пике P;

\rho_{GTX_{2,3} - Period} — массовая концентрация GTX2,3 в пике O;

P — площадь пика P;

X_{GTX_{2,3} - Period} — площадь пика GTX2,3 в пике O;

\alpha_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}} — наклон градуировочного графика GTX2,3, окисленного пероксидом;

\alpha_{GTX_{2,3} - Period} — наклон градуировочного графика GTX2,3, окисленного периодатом;

b_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}} — точка пересечения градуировочного графика GTX2,3, окисленного пероксидом;

b_{GTX_{2,3} - Period} — точка пересечения градуировочного графика GTX2,3, окисленного периодатом.

Площадь пика GTX1,4 в пике O рассчитывают по формуле (18):

X_{GTX_{1,4}} = O - X_{GTX_{2,3} - Period} = O - (\frac{(P - b_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}}) \cdot \alpha_{GTX_{2,3} - Period}}{\alpha_{GTX_{2,3} - H_{2}O_{2}}}) + b_{GTX_{2,3} - Period}, (18)

где O — площадь второго (большего) пика GTX2,3 и GTX1,4 в неизвестной пробе при периодатном окислении.

Для расчета массы GTX1,4 и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.₈ Расчет NEO при наличии dcSTX, dcNEO и STX (опционально)

10.8.1 Общие положения

В связи с тем, что некоторые продукты окисления NEO, dcNEO, STX и dcSTX идентичны, может потребоваться стратегия количественного определения NEO при наличии dcNEO, dcSTX и STX, хотя возникновение данной ситуации маловероятно. Второй продукт окисления NEO имеет такое же время удерживания, как и второй продукт окисления dcSTX и dcNEO (пик S, рисунок 6). Третий продукт окисления NEO имеет такое же время удерживания, как и продукт окисления STX (пик T). Площадь пика NEO в пробе, содержащей NEO, dcNEO, dcSTX и STX, можно рассчитать, используя нижеуказанные два метода (методы 7, 8). На рисунке 6 показаны хроматограммы после периодатного и пероксидного окисления стандартного раствора STX и неизвестной пробы, содержащей смесь NEO и dcNEO, dcSTX и STX.

a) периодатное окисление	b) пероксидное окисление

Рисунок 6 — Хроматограмма, поясняющая расчет NEO при наличии dcSTX, dcNEO и STX

10.8.2 Метод 7

Если проба содержит NEO и dcSTX, dcNEO и STX (пик T: NEO и STX вместе, пик S: NEO, dcNEO и dcSTX вместе, рисунок 6), долей NEO в пике U в пероксидном окислении можно пренебречь, тогда соответствующую NEO площадь пика (X(NEO)) рассчитывают из соотношения площадей пиков STX, которые получают в стандартном растворе путем периодатного (пик Q) и пероксидного окисления (пик R).

Для стандартного раствора STX, анализируемого после периодатного и пероксидного окисления, соотношение площадей двух пиков рассчитывают по формуле (19):

\frac{R}{Q} = \frac{U}{X_{STX}} \Rightarrow X_{STX} = \frac{U \cdot Q}{R} , (19)

где Q — площадь пика STX при периодатном окислении;

R — площадь пика STX при пероксидном окислении;

U — площадь пика STX в неизвестной пробе при пероксидном окислении;

XSTX — площадь пика STX в пике T.

Площадь пика NEO рассчитывают по формуле (20):

X_{NEO} = T - X_{STX} = T - \frac{U \cdot Q}{R} , (20)

где T — площадь третьего (большего) пика STX и NEO в неизвестной пробе при периодатном окислении.

Для расчета массы NEO и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.8.3 Метод 8

Чувствительность метода с использованием пероксидного окисления для определения NEO очень низкая, поэтому содержанием NEO при расчете STX после пероксидного окисления можно пренебречь. Долю STX на площади пика T рассчитывают по формулам (21), (22) или (23):

\rho_{STX - H_{2}O_{2}} = \frac{U - b_{STX - H_{2}O_{2}}}{\alpha_{STX - H_{2}O_{2}}} = \rho_{STX - Period}, (21)

X_{STX - Period} = \rho_{STX - H_{2}O_{2}} \cdot \alpha_{STX - Period} + b_{STX - Period}, (22)

X_{STX - Period} = (\frac{(U - b_{STX - H_{2}O_{2}}) \cdot \alpha_{GTX_{2,3} - Period}}{\alpha_{STX - H_{2}O_{2}}}) + b_{STX - Period}, (23)

где \rho_{STX - H_{2}O_{2}} — массовая концентрация STX в пике U;

\rho_{STX - Period} — массовая концентрация STX в пике T;

U — площадь пика U;

XSTX-Period — площадь пика STX в пике T;

\alpha_{STX - H_{2}O_{2}} — наклон градуировочного графика STX, окисленного пероксидом;

\alpha_{STX - Period} — наклон градуировочного графика STX, окисленного периодатом STX;

b_{STX - H_{2}O_{2}} — точка пересечения градуировочного графика STX, окисленного пероксидом;

bSTX-Period — точка пересечения градуировочного графика STX, окисленного периодатом.

Площадь пика NEO в пике T рассчитывают по формуле (24):

X_{NEO} = T - X_{STX - Period} = T - (\frac{(U - b_{STX - Period}) \cdot \alpha_{STX - Period}}{\alpha_{STX - Period}}) + b_{STX - Period}. (24)

Для расчета массы NEO и/или концентрации вещества используют формулу (1) и/или (2).

10.9 Преобразование в эквиваленты STX-2HCl

Для контроля допустимых предельных значений PSP-токсинов в тканях моллюсков необходимо рассчитать суммарную токсичность в эквивалентах STX-2HCl. Поэтому каждая массовая доля PSP-токсинов должна быть преобразована в концентрацию вещества, мкмоль/кг, по формуле (25), если это уже не было сделано в 10.2:

C_{i} = \frac{w}{M} , (25)

где w — массовая доля токсина, мкг/кг (рассчитанная в 10.2);

M — молекулярная масса токсина, мкг/моль.

Общую токсичность в тканях рассчитывают по формуле (26):

\text{мкг эквивалента }STX - 2HCl/\text{кг} = (\sum_{i = 1}^{n} C_{i} \cdot T_{i})372,2, (26)

где Ci — концентрация вещества токсина каждого обнаруженного токсина, мкмоль/кг;

Ti — показатель эквивалентной токсичности PSP-токсинов в соответствии с таблицей 8, см. [13], [14];

372,2 — молекулярная масса STX-2HCl, г/моль.

Для тех токсинов, которые определяются вместе, так как они элюируются совместно (dcGTX2 и dcGTX3; GTX1 и GTX4; GTX2 и GTX3; C1 и C2; C3 и C4), следует выбирать максимальный показатель токсичности обоих изомеров для расчета доли токсичности для каждого токсина.

Примечание — Европейская рабочая группа по определению PSP-токсинов под руководством Референтной лаборатории Европейского союза по морским биотоксинам (EURLMB), используя метод AOAC 2005.06, одобрила на 3-м заседании в 2009 г. применение показателей эквивалентной токсичности (TEF), указанных в таблице 8, согласно заключению EFSA.

Таблица 8

Показатель эквивалентной токсичности (TEF) PSP-токсинов

Другие показатели эквивалентной токсичности, не указанные в таблице 8, могут применяться при условии их международного признания, а также если их использование было одобрено Комиссией ЕС, EURLMB и ее национальными эталонными лабораториями (сеть NRL).

11 Прецизионность

В приложении A приведены результаты межлабораторных испытаний и проверки эффективности метода.

Значения, полученные в результате этих межлабораторных испытаний, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от тех, которые указаны в приложении A.

12 Протокол испытания

Протокол испытания должен соответствовать требованиям EN ISO/IEC 17025 и содержать следующие данные:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы (вид пробы (например, из продукции готовой к употреблению, переработанной или непереработанной), ее происхождение и наименование);

b) ссылку на настоящий стандарт;

c) дату и время отбора проб (если известно);

d) дату получения пробы;

e) дату проведения испытания;

f) результаты и единицы измерения, в которых выражены результаты;

g) любые особенности, которые наблюдались в ходе проведения испытания;

h) любые операции, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве дополнительных, которые могли повлиять на результаты.

Приложение A (справочное)

ДАННЫЕ ПО ПРЕЦИЗИОННОСТИ МЕТОДОВ

A.1 Межлабораторные испытания, организованные Министерством здравоохранения Канады (2001 г.)

Следующие данные были получены в ходе межлабораторного испытания, организованного Министерством здравоохранения Канады, отделом исследований пищевых продуктов, Оттава, Канада, в соответствии с официальной программой валидации методов AOAC [15] в 2001 г. Для данного межлабораторного испытания использовались три точки градуировки (см. 4.13.2). Неконтаминированные и естественным образом загрязненные образцы мидий были смешаны и гомогенизированы для получения различных смесей PSP-токсинов и уровней их концентрации. Также были смешаны образцы моллюсков, устриц и морских гребешков. Всего 21 образец был разослан 21 участнику, однако 3 лаборатории отказались от участия после получения тестовых материалов. Результаты были получены 18 лабораториями, представляющими 14 различных стран. Данные двух лабораторий не были включены в отчет, поскольку представленная информация была недостаточной для верификации результатов. Данные (не скорректированные в отношении степени обнаружения) оставшихся 16 лабораторий были статистически оценены и обобщены в таблицах A.5 - A.19. В таблицах A.20 и A.21 приведены результаты, полученные на параллельных холостых пробах для всех тестируемых токсинов. Все результаты со значениями индекса Горвица ниже 2 были приняты [4] и [5].

В ходе межлабораторного испытания тест на выявление резко отклоняющихся значений по Диксону применялся к каждой отдельной тестируемой выборке, имевшей достаточное количество измерительных точек для определения статистических данных межлабораторного сличения по тестируемой выборке. Значения индекса Горвица (допустимые значения < 2) указывают на то, что вариабельность результатов для большинства токсинов при различных концентрациях находится в пределах допустимого диапазона.

Исследуемый материал представлял собой ткани моллюсков из Испании, Новой Зеландии, а также восточного и западного побережий Канады и содержал различные образцы PSP-токсинов для тестирования метода с географически различными тканями моллюсков и смесями PSP-токсинов, см. таблицу A.1.

Таблица A.1

Характеристики проб

GTX6 (B2) не был включен в исследование для количественного определения, поскольку количество доступного стандартного вещества было недостаточным. Однако после SPE-COOH-очистки большинство лабораторий успешно обнаружили GTX6 (B2) в определенных пробах в концентрации около 30 мкг/кг или выше и сообщили об этом результате. Это указывает на то, что, после того как стандартное вещество станет доступно, этот метод должен применяться для количественного определения данного токсина.

Следующие данные выборки действуют для всех таблиц данных по прецизионности методов.

A.2 Проверка эффективности для общей токсичности, организованная Референтной лабораторией Сообщества по морским биотоксинам (CRLMB) <1> в 2006 г.

<1> Нынешнее название — Референтная лаборатория Европейского союза по морским биотоксинам (EURLMB), Испанское агентство по потреблению, безопасности пищевых продуктов и питанию, Виго, Испания.

Следующие данные были получены в ходе проверки эффективности [6], организованной в 2006 г. Референтной лабораторией Сообщества по морским биотоксинам (CRLMB), на (непереработанных и замороженных) образцах в соответствии с Программой валидации официальных методов AOAC [15]. Данное исследование было проведено для оценки пригодности к применению метода ВЭЖХ с флуориметрическим детектором по Лоуренсу с целью официального контроля PSP-токсинов в европейских лабораториях. Эффективность участвующих лабораторий ЕС при применении данного метода сравнили с эффективностью, определенной в межлабораторном испытании, организованном Лоуренсом [5]. Метод Лоуренса [1] определяет процедуру расчета концентрации для каждого PSP-токсина (мкг свободного основания токсина/кг ткани моллюсков), однако он не указывает, как следует представлять результаты в качестве общей токсичности. При проверке эффективности результаты указаны в мкг эквивалентов STX-2HCl/100 г ткани моллюсков. В настоящем стандарте значения были переведены в мкг эквивалентов STX-2HCl/100 г ткани моллюсков. Для расчетов использовали специфические токсичности PSP-токсинов (Ошима, 1995, [13], как также указано в работе «Дополнительная информация для сертифицированных эталонных материалов PSP-токсинов»).

Пробы мидий, морских гребешков, венерид и Acanthocardia tuberculata (бородавчатый моллюск-сердцевик) (см. таблицу A.2), естественно загрязненных, были гомогенизированы. Образцы, содержащие C1,2 (стандартное вещество на данный момент недоступно), dcSTX, GTX2,3, GTX5, STX и dcGTX2,3, могут быть количественно определены после SPE-C18-очистки. Экстракты также содержали GTX1,4, C3,4 (стандартное вещество отсутствовало), NEO и GTX6 (стандартное вещество отсутствовало).

Таблица A.2

Характеристики проб для проверки эффективности

Всего шесть проб были распределены среди 21 участника, однако три лаборатории несвоевременно прислали свои результаты. Результаты поступили от 18 лабораторий. У лабораторий, перепутавших один PSP-токсин с другим (т.е. GTX6 с NEO), результаты были признаны недействительными и исключены из статистической оценки. Идентификация лабораторий с резко отклоняющимися значениями была проведена для проб CRL/06/P/01 и CRL/06/P/05 (параллельные холостые пробы) с применением критериев Кохрана и Граббса. Для остальных проб применяли тест Диксона (\alpha = 0,05) .

Данные по прецизионности методов представлены в таблицах A.22, A.23.

A.3 Определение PSP-токсинов в моллюсках, включая GTX6 после гидролиза, организованное Референтной лабораторией Сообщества по морским биотоксинам (CRLMB) в 2007 г.

Межлабораторное испытание [7] было организовано Референтной лабораторией Сообщества по морским биотоксинам (CRLMB), Испанским агентством по потреблению, безопасности пищевых продуктов и питанию (AESAN) и проведено на непереработанных образцах. Основными новшествами по сравнению с предыдущим исследованием были доступность стандартного вещества C1,2-токсина и определение GTX6 (B2) при помощи кислотного гидролиза. В небольшом масштабе следовало определить, применима ли технология гидролиза для косвенного определения GTX6 (B2). Поэтому два образца (замороженные и гомогенизированные мидии, см. таблицу A.3) были проанализированы семью лабораториями ЕС. Использовался метод ВЭЖХ по Лоуренсу, и дополнительно необходимо было провести кислотный гидролиз очищенной фракции 2, полученной после SPE-COOH-очистки, для косвенного определения токсина GTX6 (B2) (см. 6.4).

Таблица A.3

Характеристики образцов

Была проведена оценка GTX6 (B2), GTX5 (B1), dcGTX2,3, C1,2, dcSTX и общей токсичности. Для расчетов общей токсичности использовали специфические токсичности PSP-токсинов (Ошима, 1995 г., [13], как также указано в работе «Дополнительная информация для сертифицированных эталонных материалов PSP-токсинов»). Все лабораторные данные были включены в статистическую оценку. Идентификация лабораторий с резко отклоняющимися значениями была проведена с использованием теста Диксона (\alpha = 0,05) , и они были исключены из рассчитанного среднего значения участников. Полученные данные представлены в таблицах A.24 - A.27, таблицах A.29, A.30.

A.4 Расширение валидации, включая dcGTX2,3 и dcNEO, предоставленное Референтной лабораторией Сообщества по морским биотоксинам (CRLMB) в 2008 г.

Межлабораторное испытание для определения PSP-токсинов в непереработанных и замороженных моллюсках [8] было проведено Референтной лабораторией Сообщества по морским биотоксинам (CRLMB), Испанским агентством по потреблению, безопасности пищевых продуктов и питанию (AESAN). Таким образом, существующий официальный метод AOAC 2005.06 следует расширить на dcGTX2,3 и dcNEO. Кроме того, была включена технология кислотного гидролиза для преобразования GTX6 (B2) в NEO, что оказалось полезным для количественного определения GTX6 [7].

Различные венериды и мидии, естественно и искусственно загрязненные, были гомогенизированы и использовались в качестве материала для исследования в ходе межлабораторного испытания (см. таблицу A.4). Всего 11 образцов были разосланы 11 участникам. Данные 10 различных лабораторий были подвергнуты статистической оценке с целью идентификации лабораторий с резко отклоняющимися значениями, которые были исключены из дальнейших расчетов. Идентификация лабораторий с резко отклоняющимися значениями была проведена для проб (параллельные холостые пробы) с использованием критериев Кохрана и Граббса. Для остальных проб вместо этого применяли тест Диксона (\alpha = 0,05) .

Таблица A.4

Характеристики проб

В ходе межлабораторного испытания валидирован метод определения dcGTX2,3, подвергнуты оценке методы определения GTX6 (B2), GTX5 (B1), dcGTX2,3, C1,2, dcSTX, dcNEO и общей токсичности. Для расчетов общей токсичности должны были применять специфические токсичности PSP-токсинов [13]. Полученные данные представлены в таблицах A.24 - A.31.

Сложный расчет для количественного определения dcNEO и GTX6 (B2) может быть причиной низкой эффективности некоторых лабораторий в данном межлабораторном испытании.

Таблица A.5

Данные по прецизионности методов для STX после SPE-C18-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.6

Данные по прецизионности методов для STX после SPE-COOH-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.7

Данные по прецизионности методов для NEO после SPE-C18-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.8

Данные по прецизионности методов для NEO после SPE-COOH-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.9

Данные по прецизионности методов для dcSTX после SPE-C18-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.10

Данные по прецизионности методов для dcSTX после SPE-COOH-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.11

Данные по прецизионности методов для GTX1.4 (в сумме) после SPE-C 18-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания A.1

Таблица A.12

Данные по прецизионности методов для GTX1,4 (в сумме) после SPE-COOH-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.13

Данные по прецизионности методов для GTX2,3 (в сумме) после SPE-C18-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.14

Данные по прецизионности методов для GTX2,3 (в сумме) после SPE-COOH-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1

Таблица A.15

Данные по прецизионности методов для GTX5 (В1) (в сумме) после SPE-C18-очистки, полученные в ходе межлабораторного испытания по разделу A.1