ГОСТ EN 14176-2022. Межгосударственный стандарт. Продукция рыбная пищевая. Определение домоевой кислоты в непереработанных двустворчатых моллюсках, рыбе и готовых к употреблению мидиях методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектирования
(введен в действие Приказом Росстандарта от 24.11.2025 № 1467-ст)
Примечание
Документ вводится в действие с 30.11.2026 с правом досрочного применения. Взамен ГОСТ EN 14176-2015.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ EN 14176-2015"]:::doc click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-en-14176-2015" "ГОСТ EN 14176-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение домоевой кислоты в мидиях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (введен в действие Прика" n1["ГОСТ EN 14176-2022"]:::notEnt click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-en-14176-2022" "ГОСТ EN 14176-2022. Межгосударственный стандарт. Продукция рыбная пищевая. Определение домоевой кислоты в непереработанных двустворчатых моллюсках, рыбе и готовых к употреблению ми" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2025 г. № 1467-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОМОЕВОЙ КИСЛОТЫ В НЕПЕРЕРАБОТАННЫХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКАХ, РЫБЕ И ГОТОВЫХ К УПОТРЕБЛЕНИЮ МИДИЯХ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ
Fish food products. Determination of domoic acid in unprocessed bivalve molluscs, fish and cooked mussels by reversed-phase high-performance liquid chromatography using ultraviolet detection
(EN 14176:2017, Foodstuffs — Determination of domoic acid in raw shellfish, raw finfish and cooked mussels by RP-HPLC using UV detection, IDT)
Дата введения 30 ноября 2026 года с правом досрочного применения
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык немецкоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 29 апреля 2022 г. № 150-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2025 г. № 1467-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14176-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 30 ноября 2026 г. с правом досрочного применения
5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14176:2017 «Продукты пищевые. Определение домоевой кислоты в сырых моллюсках, сырой рыбе и вареных мидиях методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием УФ-детектирования» («Lebensmittel — Bestimmung von Domoinsäure in rohen Schalentieren, rohen Fischen und gekochten Miesmuscheln mit RP-HPLC und UV-Detektion», IDT).
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного европейского стандарта для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.
Европейский стандарт разработан Техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА
6 ВЗАМЕН ГОСТ EN 14176-2015
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Введение
Вызывающий отравление амнестический яд моллюсков (ASP), или домоевая кислота (DA), принадлежит к группе аминокислот, известных как каиноиды, которые классифицируются как нейровозбудители или экзотоксины, так как они оказывают влияние на механизмы нейропередачи головного мозга. Моллюски могут накапливать данный яд, питаясь различными токсичными видами водорослей Pseudonitzschia. Употребление человеком пищевой рыбной продукции, содержащей домоевую кислоту, может привести к отравлению, симптомами которого являются: спазмы в животе, рвота, дезориентация и потеря памяти (амнезия), при этом отравления в некоторых случаях могут иметь серьезные последствия для здоровья.
Высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием (ВЭЖХ-УФ) стала первым химико-аналитическим методом, используемым для определения домоевой кислоты, и до сих пор является наиболее широко используемым методом для мониторинга моллюсков. Обнаружение домоевой кислоты осуществимо за счет ее поглощения при длине волны 242 нм [1].
Настоящий стандарт основан на двух сопоставимых методах проведения испытаний. Один метод количественного определения домоевой кислоты и ее изомеров, например эпидомоевой кислоты (epi-DA), в непереработанных морепродуктах (метод A) описан в [2]. Другой метод количественного определения домоевой кислоты и ее изомеров, например, эпидомоевой кислоты, в готовых к употреблению мидиях (метод B) описан в [3].
Метод A включает одноступенчатую экстракцию с использованием 50%-ного водного раствора метанола, селективную очистку (по желанию) и концентрирование методом твердофазной экстракции (SPE) с использованием сильного анионообменника. С учетом результатов процедуры валидации необязательный этап очистки метода A, описанный в [2], в настоящем стандарте не описан. Аналиты определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях изократического элюирования и детектирования в ультрафиолетовой области спектра.
Метод B включает одноступенчатую экстракцию с использованием 50%-ного водного раствора метанола и по желанию нагревание, позволяющее лучше декантировать надосадочную жидкость. Однако следует обратить внимание, что нагревание может вызвать распад домоевой и эпидомоевой кислот. Домоевую и эпидомоевую кислоты определяют при помощи ВЭЖХ с бинарным градиентом, а также с детектированием ультрафиолетового поглощения.
Оба метода могут быть использованы для количественного определения домоевой кислоты.
Предупреждение — Применение настоящего стандарта может быть связано с использованием опасных материалов и оборудования, проведением опасных операций. В задачи настоящего стандарта не входит решение всех вопросов безопасности, связанных с его применением. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает методы количественного определения домоевой кислоты в непереработанных двустворчатых моллюсках и рыбе, а также в готовых к употреблению мидиях. В зависимости от чувствительности УФ-детектора предел обнаружения составляет от 10 до 80 нг/см3 (от 0,05 до 0,4 мг/кг). Метод A был валидирован для определения домоевой кислоты в различных непереработанных матрицах, таких как мидии, венериды, морские гребешки и анчоусы, искусственно загрязненных и/или загрязненных естественно в диапазоне от 2,7 до 85,1 мг/кг. Метод B был валидирован для определения домоевой кислоты в диапазоне от 5 до 12,9 мг/кг в готовых к употреблению голубых мидиях.
Дополнительная информация о валидации методов приведена в разделе 8 и приложении A.
Практика применения метода в лаборатории показала, что настоящий стандарт может быть применен к другим видам моллюсков, однако до настоящего времени не проведена полная валидация в соответствии с ISO 5725.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированной ссылки применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированной — последнее издание (включая все изменения)].
EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
Домоевую и эпидомоевую кислоты экстрагируют из пробы смесью метанола и воды. Экстракт фильтруют через мембранный фильтр и испытания проводят с помощью установки ВЭЖХ с изократическим (метод A) или градиентным (метод B) элюированием и детектированием в ультрафиолетовой области спектра. Содержание домоевой кислоты рассчитывают по градуировочному графику методом внешнего стандарта.
Предупреждение — Амнестические яды моллюсков являются сильными нейротоксинами, которые могут поступать в организм пероральным или ингаляционным путем. Поэтому необходимо принять соответствующие защитные меры.
4 Реактивы
Для проведения анализа, если не указано иное, используют воду только первой степени чистоты по EN ISO 3696.
Если не указано иное, все химические вещества должны быть чистыми для анализа (ч.д.а.).
Допускается использовать аналогичные стандартные материалы (сертифицированные, при возможности) или вещества при условии их однозначной идентификации и точно установленной массовой доле основного вещества.
Лаборатория должна определить стабильность растворов при отсутствии соответствующей информации.
4.1 Метанол, пригодный для ВЭЖХ.
4.2 Ацетонитрил, пригодный для ВЭЖХ.
4.3 Растворитель для экстракции, метанол/вода в соотношении 50:50 по объему.
4.4 Ацетонитрил/вода в соотношении 10:90 по объему (метод A).
4.5 Трифторуксусная кислота (TFA) для спектрофотометрии с содержанием основного вещества >= 99% (метод A).
4.6 Муравьиная кислота с содержанием основного вещества >= 98% (метод B).
4.7 Элюенты
4.7.1 Элюент 1 (для изократического элюирования)
10%-ный водный ацетонитрил по объему (см. 4.4) с 0,1%-ной трифторуксусной кислотой по объему (см. 4.5). Для однонасосного варианта системы ВЭЖХ смешивают 100 см3 ацетонитрила и около 400 см3 воды, добавляют 1,0 см3 трифторуксусной кислоты и разбавляют водой до 1 дм3.
4.7.2 Элюент 2 (для градиентного элюирования)
100 см3 ацетонитрила (см. 4.2) смешивают с 900 см3 воды и доводят pH до 2,5 с помощью муравьиной кислоты (см. 4.6).
4.7.3 Элюент 3 (градиентного элюирования)
300 см3 ацетонитрила (см. 4.2) смешивают с 700 см3 воды и доводят pH до 2,5 с помощью муравьиной кислоты (см. 4.6).
4.8 Стандартные вещества
4.8.1 Домоевая кислота, сертифицированный градуировочный раствор <1>
Герметичные ампулы следует хранить в темноте в холодильнике (при температуре около 4 °C). Раствор не должен замерзать. Перед открытием каждую ампулу следует выдержать при комнатной температуре. После вскрытия ампулы с помощью мерного оборудования отбирают точные аликвотные части и как можно быстрее переносят их во флакон для ВЭЖХ из темного стекла для разбавления и/или анализа. Закрытые флаконы для ВЭЖХ следует хранить в темноте в холодильнике (при температуре около 4 °C) не более 3 мес.
Примечание — Эпидомоевая кислота присутствует в низких концентрациях в сертифицированном градуировочном растворе домоевой кислоты, разработанном Институтом морских биологических наук Национального исследовательского совета Канады, Галифакс, Новая Шотландия — Канада <1>.
<1> Информацию о подходящих градуировочных растворах можно найти, например, по ссылкам:
http://aesan.msssi.gob.es/en/CRLMB/web/home.shtml и
http://aesan.msssi.gob.es/en/CRLMB/web/estandares_materiales_referencia/materiales_referencia.shtml.
Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции, упомянутой на веб-страницах или доступной в Канаде. Допускается использовать аналогичную продукцию при условии обеспечения идентичных результатов.
4.8.2 Домоевая кислота, кристаллический порошок с содержанием основного вещества > 95%.
4.9 Стандартные растворы
4.9.1 Общие положения
Используют имеющиеся в продаже сертифицированные градуировочные растворы (см. 4.8.1) или готовят градуировочные растворы путем растворения кристаллического порошка домоевой кислоты (см. 4.8.2) с последующим его разбавлением. Было установлено, что оба способа приготовления градуировочных растворов приводят к успешным данным валидации.
4.9.2 Основной раствор
Кристаллический порошок домоевой кислоты (см. 4.8.2) взвешивают (см. 5.1) в мерной колбе и растворяют в метаноле до конечной концентрации 500 мкг/см3. Закрытые колбы следует хранить в темноте в холодильнике (при температуре около 4 °C).
4.9.3 Стандартный раствор
Основной раствор (см. 4.9.2) разбавляют метанолом до конечной концентрации 50 мкг/см3. Проверяют массовую концентрацию этого раствора путем сравнения с сертифицированными градуировочными растворами (см. 4.8.1).
4.9.4 Градуировочные растворы
Градуировочные растворы с соответствующими массовыми концентрациями домоевой и эпидомоевой кислот готовят путем разбавления стандартного (см. 4.9.3) или сертифицированного градуировочного раствора (см. 4.8.1).
Для валидации метода A с изократическим элюированием были приготовлены градуировочные растворы в диапазоне от 0,2 до 25 мкг/см3 путем разбавления сертифицированного градуировочного раствора (см. 4.8.1) ацетонитрилом/водой в соотношении 10:90 по объему (см. 4.4).
Для валидации метода B с градиентным элюированием были приготовлены градуировочные растворы в диапазоне от 0,5 до 10 мкг/см3 путем разбавления стандартного раствора (см. 4.9.3) раствором метанол/вода (см. 4.3).
Растворы, если их не используют, следует хранить в темном и охлажденном месте (около 4 °C). Растворы нельзя хранить более 3 мес и замораживать. Перед использованием растворы выдерживают при комнатной температуре.
4.10 Эталонный материал <1>
<1> Подходящие эталонные материалы имеются, например, в Институте морских биологических наук Национального исследовательского совета Канады, Галифакс, Новая Шотландия — Канада. Эпидомоевая кислота содержится в таком сертифицированном эталонном материале в малых количествах. Данная информация приведена исключительно для информационных целей и не является рекламой CEN указанной продукции. Допускается использовать аналогичную продукцию при условии обеспечения идентичных результатов.
Эталонный материал мяса мидий следует хранить в соответствии с инструкциями производителя. Каждую бутылку перед открытием следует прогреть до комнатной температуры, а содержимое тщательно перемешать при помощи вихревой мешалки в течение не менее 2 мин. После вскрытия бутылки следует немедленно использовать все содержимое. Эталонный материал может быть использован для проверки точности указанного аналитического метода. Эталонный материал следует экстрагировать методом, описанным в 6.2.1 или 6.2.2.
5 Оборудование
Используют стандартное лабораторное оборудование, в том числе перечисленное ниже.
5.1 Весы лабораторные с точностью взвешивания 0,1 мг.
5.2 Весы лабораторные с точностью взвешивания 0,01 г.
5.3 Гомогенизатор (например, измельчитель или блендер).
5.4 Механическая мешалка с диапазоном скорости от 8 000 до 45 000 об/мин (например, диспергатор Ultra-Turrax).
5.5 Центрифуга, пригодная для эффективного разделения жидкой и твердой фаз, например обеспечивающая фактор разделения 3 000g <2> (желательно с охлаждением до 4 °C).
5.6 Центрифужные пробирки вместимостью от 30 до 50 см3, с завинчивающимися крышками.
5.7 Мембранные фильтры, совместимые с метанолом, с размером пор 0,2 или 0,45 мкм, например из ацетата целлюлозы без поверхностно-активных веществ с предфильтром из стекловолокна.
5.8 Регулируемые автоматические пипетки, подходящие для диапазона от 20 до 1 000 мм3.
5.9 Электрический нагреватель (метод B).
5.10 Флаконы для ВЭЖХ.
5.11 Флаконы из темного стекла вместимостью 2 см3 или меньше, например с обжимными крышками (для хранения градуировочных растворов домоевой кислоты).
5.12 Установка ВЭЖХ, в которую входят:
5.12.1 Система ввода.
Примечание - Охлаждение инжектора может предотвратить распад домоевой кислоты, особенно при высокой комнатной температуре.
5.12.2 Насос, пригодный для изократического элюирования (метод A) или градиентного элюирования (метод B).
5.12.3 Колоночный термостат, поддерживающий температуру (40 +/- 2) °C (метод A) или (35 +/- 2) °C (метод B).
5.12.4 Разделительная колонка, обращенно-фазовая колонка C18, например, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм (для метода A) или 4,0 мм (для метода B), заполненная частицами размером 5 мкм.
Примечание - Допускается использовать колонки для жидкостной хроматографии других размеров, если отрегулирован расход подвижной фазы и/или объем ввода. Рекомендуется использовать предколонку. Соответствующие результаты также могут быть достигнуты при следующих условиях: колонка C18 длиной 250 мм и внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная сопоставимой стационарной фазой с объемом вводимой пробы 5 мм3 и скоростью потока от 0,2 до 0,3 см3/мин.
5.12.5 УФ-детектор, по возможности диодно-матричный, настроенный на 242 нм, обеспечивающий отношение сигнал/шум (S/N) 10:1 при введении 0,2 мкг/см3 раствора домоевой кислоты с соблюдением условий согласно 6.3.
6 Методика проведения испытания
6.1 Подготовка проб
6.1.1 Непереработанные двустворчатые моллюски в раковинах
Моллюски снаружи тщательно промывают водопроводной водой. Моллюски открывают, отрезав приводящую мышцу. Внутреннюю часть моллюсков промывают водопроводной водой для удаления песка и посторонних частиц. Удаляют мясо моллюсков из раковин. Нельзя применять для открытия раковин тепло или анестетики. Мясо моллюсков помещают в сито на 5 мин, чтобы дать воде стечь. Полученное мясо моллюсков объединяют и в количестве не менее 100 — 150 г гомогенизируют (см. 5.3) [4]. Навески отбирают сразу после гомогенизации или после повторного перемешивания. При подготовке проб гребешка согласно [5] следует использовать не менее 10 экземпляров моллюска.
6.1.2 Непереработанные двустворчатые моллюски без раковин (целые или отдельные части, пригодные для употребления в пищу)
При необходимости мясо моллюсков промывают водопроводной водой и дают воде стечь. Полученное мясо моллюсков объединяют и в количестве не менее 100 — 150 г гомогенизируют (см. 5.3). Навески отбирают сразу после гомогенизации или повторного перемешивания. При подготовке проб гребешка согласно [5] следует использовать не менее 10 экземпляров моллюска или отдельные части, пригодные для употребления в пищу (мышцу, мышцу и гонаду).
6.1.3 Непереработанная рыба
Рыбу промывают, удаляют чешую и разделывают. В случае мелких рыб в целом виде длиной 15 см и менее используют от 5 до 10 рыб. В случае рыб среднего размера удаляют и выбрасывают головы, чешую, хвостовые и другие плавники, внутренности и кости. Рыба должна быть разделана таким образом, чтобы мясо и кожа рыбы сохранили целостность от головы до хвостовой части и от спины до брюшка с обеих сторон [4]. Подготовленную рыбу объединяют и в количестве не менее 100 — 150 г гомогенизируют (см. 5.3). Навески отбирают сразу после гомогенизации или повторного перемешивания.
6.1.4 Готовые к употреблению мидии <1>
<1> Практика применения метода в лаборатории показала, что другие готовые к употреблению двустворчатые моллюски, например гребешки, также могут быть подготовлены в соответствии с 6.1.4, однако данная возможность не была подтверждена в ходе межлабораторного испытания. Для исследования гребешков следует брать не менее 10 особей [5].
Мясо мидий, готовое к употреблению, объединяют и в количестве не менее 100 — 150 г гомогенизируют (см. 5.3). Навески отбирают сразу после гомогенизации или повторного перемешивания. Если в лабораторию мидии поступают в непереработанном виде, но для испытаний желательно использовать метод B, тогда мидии следует сначала термически обработать, а затем открыть и удалить раковины.
6.2 Процедура экстракции
Примечание - Перед экстракцией необходимо убедиться, не изменились ли условия ее проведения в лаборатории.
6.2.1 Метод A
Взвешивают точную навеску (4,0 +/- 0,1) г гомогенизированного продукта в центрифужной пробирке (см. 5.6) или чаше блендера из нержавеющей стали. Добавляют 16 см3 смеси метанол/вода (см. 4.3) и тщательно перемешивают пробу в блендере или центрифужной пробирке (3 мин при 10 000 об/мин) при помощи мешалки (см. 5.4). После извлечения содержимого из блендера или центрифужной пробирки тщательно их промывают, чтобы предотвратить загрязнение следующей пробы.
Если для гомогенизации был использован блендер, полученную смесь переносят в центрифужную пробирку.
6.2.2 Метод B
Взвешивают (5,0 +/- 0,1) г гомогенизированного продукта в центрифужной пробирке (см. 5.6). Добавляют 15 см3 смеси метанол/вода (см. 4.3) и перемешивают около 2 мин при помощи мешалки (см. 5.4).
В результате нагревания экстракта можно улучшить декантирование надосадочной жидкости. В этом случае пробирку закрывают и нагревают смесь при температуре от 60 °C до 70 °C в течение 15 мин [3]. Пробу оставляют остывать до комнатной температуры. Следует обратить внимание, что нагревание экстракта может привести к незначительному распаду домоевой кислоты.
6.2.3 Центрифугирование, разбавление и хранение
Экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 3 000g или выше. Часть надосадочной жидкости фильтруют через сухой фильтр, подходящий для экстрактов, содержащих метанол, с размером пор 0,45 или 0,2 мкм. Полученные пробы экстрактов необходимо сразу анализировать. Если анализ не проводится сразу, то экстракт можно хранить в холодильнике при температуре около 4 °C в плотно закрытых завинчивающимися крышками контейнерах для хранения.
Экстракция холостой пробы: проводят процедуру экстракции (см. 6.2.1 или 6.2.2), заменяя содержимое пробы водой (хроматограммы не должны показывать никаких пиков элюирования вблизи домоевой кислоты или вызывать чрезмерный подъем базовой линии).
Для скрининга проб с установленным или предположительно высоким уровнем загрязнения домоевой кислотой экстракт можно разбавлять смесью метанол/вода (см. 4.3).
6.3 Определение методом ВЭЖХ
6.3.1 Общие положения
При валидации метода с соблюдением условий, установленных в 6.3.2, пробы, экстрагированные согласно 6.2.1, определяют методом ВЭЖХ в изократическом режиме, а пробы, экстрагированные согласно 6.2.2, — методом ВЭЖХ в режиме градиентного элюирования. Однако практика применения метода в лаборатории показала, что условия ВЭЖХ, указанные для методов A и B, могут быть использованы для обоих видов экстрагирования. Типичная хроматограмма представлена в приложении B.
6.3.2 Условия ВЭЖХ
Содержание домоевой кислоты в пробе определяют после хроматографического разделения на обращенно-фазовой колонке в изократическом режиме с элюентом 1 (см. 4.7.1) либо в режиме градиентного элюирования с элюентом 2 (см. 4.7.2) и элюентом 3 (см. 4.7.3).
Определение методом ВЭЖХ при следующих условиях показывает удовлетворительные результаты:
Примечание - Указанные условия были применены при межлабораторных испытаниях с использованием метода A в изократическом режиме. Выделенные курсивом условия были применены при межлабораторных испытаниях с использованием метода B в режиме градиентного элюирования.
При использовании другого варианта разделительной колонки может потребоваться уточнение хроматографических условий. Подходящие условия градиента описаны в таблице 1.
Программа градиентного элюирования
| Время, мин | Элюент 2, % | Элюент 3, % |
| 0,00 | 90 | 10 |
| 30,00 | 90 | 10 |
| 30,10 | 60 | 40 |
| 40,00 | 60 | 40 |
| 40,10 | 90 | 10 |
| 50,00 | Конец | |
6.4 Градуировочный график
Градуировочный график минимум с четырьмя точками строят каждый день при проведении анализа и/или при изменении хроматографических условий. Строят график зависимости площади пика от концентрации введенных градуировочных растворов домоевой и эпидомоевой кислот. Необходимо убедиться, что коэффициент корреляции градуировочной кривой показывает линейную регрессию (метод A: r >= 0,99 и тест на отклонение значений градуировочных точек (расчет процентного соотношения между каждой точкой калибровки площади пика Yi и соответствующей точкой калибровки массы Xi относительно средних значений всех соотношений) Yi/Xi [%] находится в диапазоне (100 +/- 10)%).
6.5 Введение пробы
Пробы вводят в двух повторностях, если повторяемость вводимых проб не является достаточной. Коэффициент вариации (CV) для двух последовательных вводов не должен превышать 5%. Для проверки стабильности системы периодически вводят градуировочные растворы и/или растворы с фиксированными концентрациями эталонного материала (см. 4.10).
7 Обработка результатов
7.1 Идентификация
Идентификацию домоевой и эпидомоевой кислот проводят путем сравнения времени удерживания пробы со временем удерживания стандартных веществ.
Было установлено, что чистая домоевая кислота в растворе постепенно изомеризуется, особенно в диастереомере C5'-эпидомоевой кислоты, поэтому длительное хранение стандартов неизбежно приведет к образованию смеси. Поскольку эпидомоевая кислота имеет УФ-спектр, идентичный спектру домоевой кислоты, относительные молярные коэффициенты отклика в жидкостной хроматографии с УФ-детектированием идентичны и относительные соотношения могут быть пересчитаны в любое время. При определенных условиях жидкостной хроматографии домоевая и эпидомоевая кислоты не могут быть разделены. Это не является проблемой и упрощает анализ. Сумму двух площадей домоевой и эпидомоевой кислот следует использовать для калибровки измерительных приборов и количественного определения домоевой кислоты в пробах [3].
7.2 Количественное определение
Количественное определение домоевой и эпидомоевой кислот в пробе проводят методом внешнего стандарта путем интегрирования площади пика относительно градуировочного графика стандартов домоевой кислоты (см. 4.10). Массовую долю домоевой и эпидомоевой кислот в пробе w, мг/кг, рассчитывают по формуле
w = \frac{\text{площадь пика} - b}{a} \cdot \frac{D}{m} \cdot V_{t}, (1)
где a — наклон линии градуировочного графика;
b — отрезок у оси координат градуировочного графика;
D — коэффициент разбавления (если экстракт был разбавлен);
m — масса пробы в граммах, как правило, 4 г (метод A) или 5 г (метод B);
Vt — общий объем гомогенного продукта и растворителя для экстракции, см3.
8 Прецизионность
Метод A с использованием изократического режима был подтвержден в межлабораторных испытаниях с участием 13 лабораторий. Подробные результаты межлабораторных испытаний в отношении точности метода приведены в таблице A.1 (приложение A).
Метод B с использованием режима градиентного элюирования был подтвержден в межлабораторных испытаниях с участием 11 лабораторий. Подробные результаты межлабораторных испытаний точности метода приведены в таблице A.2 (приложение A).
В таблице A.3 (приложение A) приведены результаты испытаний по оценке прецизионности методов из программ проверки квалификации.
Значения, полученные при межлабораторных испытаниях, могут быть неприменимы к другим диапазонам концентраций и матрицам, отличным от приведенных в приложении A.
9 Протокол испытания
Протокол испытания должен содержать:
- всю информацию, необходимую для идентификации пробы (тип пробы, происхождение пробы, название);
- ссылку на настоящий стандарт;
- дату и метод отбора проб (если известно);
- дату получения пробы;
- дату проведения испытания;
- результаты измерения и единицы, в которых они были выражены;
- все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;
- любые детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также все особенности, которые могли повлиять на результаты испытания.
ДАННЫЕ ПО ПРЕЦИЗИОННОСТИ МЕТОДОВ
A.1 Данные по прецизионности метода A с использованием изократического элюирования
Результаты, приведенные в таблице A.1, были получены в ходе исследования «Валидационное исследование ЕС по определению домоевой кислоты посредством метода ВЭЖХ-УФ», организованного Референтной лабораторией ЕС по морским биотоксинам (EURLMB) в соответствии с [6], с использованием различных матриц и уровней загрязнения на холостых пробах для параллельных определений.
Данные по прецизионности метода A с использованием изократического элюирования
| Проба | Венериды, искусственно загрязненные | Венериды, ез a | Мидии, искусственно загрязненные | Гонады морского гребешка, ез a | Морской гребешок целый, ез a | Анчоусы, ез a |
| Год проведения испытания | 2003 | 2003 | 2003 | 2003 | 2003 | 2003 |
| Количество лабораторий | 12 | 12 | 12 | 13 | 13 | 12 |
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбракованных | 12 | 12 | 11 | 13 | 13 | 11 |
| Количество выбракованных (лабораторий) | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Количество принятых результатов | 12 | 12 | 11 | 13 | 13 | 11 |
| Среднее значение \overline{x} , мг/кг | 3,38 | 17,7 | 11,6 | 2,72 | 9,63 | 85,1 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/кг | 0,28 | 0,40 | 0,37 | 0,12 | 0,18 | 1,1 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 8,3 | 2,3 | 3,2 | 4,4 | 1,9 | 1,3 |
| Предел повторяемости r [r = 2,8·sr], мг/кг | 0,78 | 1,12 | 1,04 | 0,34 | 0,50 | 3,08 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/кг | 0,51 | 1,6 | 2,0 | 0,62 | 1,2 | 6,6 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 15 | 9,0 | 17 | 23 | 12 | 7,8 |
| Предел воспроизводимости R [R = 2,8·sR], мг/кг | 1,43 | 4,48 | 5,60 | 1,74 | 3,36 | 18,5 |
| Значение индекса Горвица (HorRat) | 1,1 | 0,87 | 1,6 | 1,7 | 1,0 | 0,94 |
| Степень обнаружения, % | 79 | 84 | ||||
| a ез — естественное загрязнение. | ||||||
A.2 Данные по прецизионности метода B с использованием градиентного элюирования
Данные, приведенные в таблице A.2, были получены в межлабораторных испытаниях [7] в соответствии с руководящими принципами Закона Германии о пищевых продуктах и кормах (§ 64-LFGB), которые были проведены немецкой рабочей группой (§ 64-LFGB) «Токсины моллюсков» с использованием двух матриц искусственно загрязненных мидий и одной матрицы незагрязненных мидий. Холостая проба была идентифицирована всеми участниками. В данном исследовании был применен описанный метод. Нагревали экстракт и применяли режим градиентного элюирования ВЭЖХ. Каждый участник проводил испытания пяти проб, и если результаты теста Граббса были неудовлетворительными, то анализировали еще три дополнительные пробы.
Данные по прецизионности метода B с использованием градиентного элюирования
| Проба | Мясо мидии A | Мясо мидии B |
| Год проведения испытания | 2001 | 2001 |
| Количество лабораторий | 11 | 11 |
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбракованных | 10 | 10 |
| Количество выбракованных (лабораторий) | 1 | 1 |
| Количество принятых результатов | 10 | 10 |
| Среднее значение \overline{x} , мг/кг | 12,9 | 5,0 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/кг | 0,5 | 0,2 |
| Предел повторяемости r [r = 2,8·sr], мг/кг | 1,4 | 0,5 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/кг | 1,4 | 0,6 |
| Предел воспроизводимости R [R = 2,8·sR], мг/кг | 3,9 | 1,7 |
| Значение индекса Горвица (HorRat) | 1,0 | 0,96 |
| Степень обнаружения, % | 85 — 92 a | 81 — 90 a |
| Степень обнаружения, %; уровень высеваемости, определенный участниками | 86 | 83 |
| a Полученные в исследованиях однородности и стабильности перед основной частью межлабораторного исследования. | ||
A.3 Данные по прецизионности методов из программ проверки квалификации EURLMB
В таблице A.3 приведены данные из программ проверки квалификации при проведении испытаний по определению домоевой кислоты, организованных Референтной лабораторией ЕС по морским биотоксинам в период с 2011 по 2013 год. В таблице A.3 приведены только значения, полученные от лабораторий, которые использовали методы ВЭЖХ-УФ.
Данные по прецизионности методов из программ проверки квалификации EURLMB при использовании метода ВЭЖХ-УФ
| Проба | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Матрица | Морские гребешки, ез a | Мидии, ез a | Морские гребешки, ез a | Венериды, ез a | Мидии, ез a | Морские гребешки без гепатопанкреаса, ез a |
| Год проведения испытания | 2011 | 2011 | 2012 | 2012 | 2013 | 2013 |
| Количество переданных данных | 24 | 24 | 26 | 26 | 25 | 25 |
| Присвоенное значение b, мг/кг | 15,8 | 4,7 | 35,7 | 22,4 | 30,5 | 8,8 |
| Неопределенность присвоенного значения, мг/кг | 0,2 | 0,1 | 0,6 | 0,6 | 0,5 | 0,3 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/кг | 1,2 | 0,6 | 3,3 | 2,3 | 2,6 | 1,1 |
| Предел повторяемости r [r = 2,8·sr], мг/кг | 3,4 | 1,7 | 9,2 | 6,4 | 7,3 | 3,1 |
| Значение индекса Горвица (HorRat) | 0,7 | 0,9 | 1,0 | 1,0 | 0,9 | 1,1 |
| a ез — естественное загрязнение. b Вычислено с помощью робастных методов статистического анализа: алгоритм A (ISO 13528:2015). | ||||||
Хроматография с использованием ВЭЖХ Dionex с PDA100, Nucleosil C18 (250 x 4,6 мм, 5 мкм) в изократическом режиме элюирования.
Y — относительная интенсивность, %; t — время, мин; 1 — L-триптофан; 2 — домоевая кислота; 3 — эпидомоевая кислота; 4 — изодомоевая кислота D; 5 — изодомоевая кислота E
Рисунок B.1 — Типовая хроматограмма эталонного материала MUS1b
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНОГО ЕВРОПЕЙСКОГО СТАНДАРТА МЕЖГОСУДАРСТВЕННОМУ СТАНДАРТУ
| Обозначение ссылочного европейского стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
| EN ISO 3696 | - | <*>, <1> |
| <*> Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его принятия рекомендуется использовать перевод на русский язык данного европейского стандарта. | ||
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».