ГОСТ EN 14132-2013. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение охратоксина A в ячмене и жареном кофе. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 № 1916-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов государств — членов Евразийского экономического союза, а также методик исследований (испытаний) и измерений, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности зерна» (ТР ТС 015/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2024 № 134). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Документ введен в действие с 01.07.2015.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1916-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА A В ЯЧМЕНЕ И ЖАРЕНОМ КОФЕ. МЕТОД ВЭЖХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОАФФИННОЙ КОЛОНОЧНОЙ ОЧИСТКИ ЭКСТРАКТА
Foodstuffs. Determination of ochratoxin A in barley and roasted coffee. HPLC method with immunoaffinity column cleanup
Дата введения 1 июля 2015 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») при участии специалистов Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. № 44)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1916-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14132-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.
5 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 14132:2009 Foodstuffs. Determination of ochratoxin A in barley and roasted coffee. HPLC method with immunoaffinity column cleanup (Продукты пищевые. Определение охратоксина A в ячмене и жареном кофе. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта).
Перевод с английского языка (en).
Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.
Степень соответствия — идентичная (IDT)
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения охратоксина A в ячмене и жареном кофе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением очистки экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом. Метод прошел валидацию для диапазона содержания охратоксина A в ячмене от 0,1 до 4,5 мкг/кг и в жареном кофе от 0,2 до 5,5 мкг/кг.
2 Нормативные ссылки
Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая все дополнения.
EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
При испытании ячменя охратоксин A экстрагируют из пробы водно-ацетонитрильной смесью, экстракт подвергают очистке на иммуноаффинной колонке. При испытании жареного кофе охратоксин A экстрагируют из измельченной пробы смесью метанола с водным раствором двууглекислого натрия. Экстракт подвергают очистке сначала на колонке с силикагелем, модифицированным фенилсилильными группами, затем на иммуноаффинной колонке. Количественное определение охратоксина A проводят методом ВЭЖХ с применением обращенно-фазовой колонки и флуориметрическим детектированием.
4 Реактивы
4.1 Общие положения
Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную воду или воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696:1995. Используемые растворители по степени чистоты должны быть пригодны для применения в анализе с помощью ВЭЖХ. Допускается использование доступных для приобретения готовых растворов при условии, что их характеристики не отличаются от приведенных ниже.
4.2 Натрий хлористый.
4.3 Натрий фосфорнокислый двузамещенный.
4.4 Калий фосфорнокислый однозамещенный.
4.5 Калий хлористый.
4.6 Натрия гидроксид, раствор массовой концентрации \rho(NaOH) = 8,0\text{г}/\text{дм}^{3}
Растворяют 8 г гидроксида натрия в 900 см3 воды, объем полученного раствора доводят водой до 1 дм3.
4.7 Раствор фосфатно-хлоридный буферный
Растворяют 8,0 г хлористого натрия по 4.2, 1,2 г двузамещенного фосфорнокислого натрия по 4.3, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого калия по 4.4 и 0,2 г хлористого калия по 4.5 в 900 см3 воды. Значение pH полученного раствора доводят до 7,4 ед. pH путем добавления раствора гидроксида натрия по 4.13, после чего объем раствора доводят водой до 1 дм3. В качестве альтернативы допускается использовать доступный для приобретения таблетированный препарат аналогичного состава.
4.8 Натрий двууглекислый, раствор массовой концентрации \rho(NaH\text{С}O_{3}) = 30\text{г}/\text{дм}^{3}
Растворяют 30 г двууглекислого натрия в 900 см3 воды в мерной колбе вместимостью 1 дм3. Объем содержимого колбы доводят до метки водой.
4.9 Кислота уксусная ледяная массовой долей w (CH3COOH) = 98%.
4.10 Метанол.
4.11 Ацетонитрил.
4.12 Толуол.
4.13 Смесь толуола с уксусной кислотой
Смешивают 99 объемных частей толуола по 4.12 с одной объемной частью уксусной кислоты по 4.9.
4.14 Экстрагент для ячменя
Смешивают шесть объемных частей ацетонитрила по 4.11 с четырьмя объемными частями воды.
4.15 Экстрагент для кофе
Смешивают одну объемную часть метанола по 4.10 с одной объемной частью раствора двууглекислого натрия по 4.8.
4.16 Дилюент для приготовления раствора пробы для анализа с помощью ВЭЖХ
Смешивают 30 объемных частей метанола по 4.10 с 70 объемными частями воды и одной объемной частью уксусной кислоты по 4.9.
4.17 Подвижная фаза
Смешивают 102 объемные части воды с 96 объемными частями ацетонитрила по 4.11 и двумя объемными частями уксусной кислоты по 4.9. Подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр диаметром пор 0,2 мкм по 5.12. Перед использованием подвижную фазу дегазируют.
4.18 Раствор 1 для промывания колонки с фенилсилильным сорбентом
Смешивают 20 объемных частей метанола по 4.10 с 80 объемными частями раствора двууглекислого натрия по 4.8.
4.19 Раствор 2 для промывания колонки с фенилсилильным сорбентом массовой концентрации двууглекислого натрия \rho(Na_{2}\text{С}O_{3}) = 1\text{г}/100c\text{м}^{3}
Растворяют 1 г двууглекислого натрия в 90 см3 воды в мерной колбе вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят водой до метки.
4.20 Элюент для очистки экстракта на фенилсилильной колонке
Смешивают семь объемных частей метанола по 4.10 с 93 объемными частями воды.
4.21 Охратоксин A, основной раствор
Для приготовления основного раствора 1 мг кристаллического охратоксина A или при использовании ампульного препарата в пленочной форме содержимое одной ампулы растворяют в таком объеме смеси толуола с уксусной кислотой по 4.13, чтобы массовая концентрация охратоксина A в полученном растворе составила от 20 до 30 мкг/см3.
Для определения точной массовой концентрации охратоксина A в основном растворе регистрируют его оптическую плотность в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм с интервалом 5 нм в кварцевой кювете длиной оптического пути 1 см по 5.14. В качестве раствора сравнения используют смесь толуола с уксусной кислотой по 4.13. По полученному спектру определяют длину волны, соответствующую максимальной оптической плотности. Массовую концентрацию охратоксина A, \rho_{ota} , мкг/см3, рассчитывают по формуле
\rho_{ota} = \frac{A_{max}M \cdot 100}{\epsilon b} , (1)
где Amax — максимальное значение оптической плотности в данном диапазоне длин волн (\lambda_{max} = 333\text{нм}) ;
M — молярная масса охратоксина A, г/моль (M = 403,8 г/моль);
\epsilon — молярный коэффициент поглощения охратоксина A в смешанном растворителе по 4.13, м2/моль (\epsilon = 544\text{м}^{2}/\text{моль}) ;
b — длина оптического пути кюветы, см.
Основной раствор хранят при температуре около минус 18 °C, при этом срок его годности составляет не менее четырех лет.
4.22 Охратоксин A, стандартный раствор промежуточной массовой концентрации
Раствор готовят разбавлением основного раствора по 4.21 смесью толуола с уксусной кислотой по 4.13 до получения раствора массовой концентрации охратоксина A 10 мкг/см3.
Раствор хранят в холодильнике при температуре около 4 °C. Перед использованием проверяют соответствие фактической массовой концентрации охратоксина A номинальному значению.
4.23 Охратоксин A, стандартный раствор для приготовления градуировочных растворов
В стеклянный флакон помещают 200 мм3 стандартного раствора охратоксина A массовой концентрации 10 мкг/см3 по 4.22. Раствор разбавляют до объема 1 см3 путем добавления 800 мм3 смеси толуола с уксусной кислотой по 4.13, получают раствор охратоксина A массовой концентрации 2 мкг/см3. Порцию полученного раствора объемом 100 мм3 переносят микропипеткой в другой стеклянный флакон по 5.2, удаляют растворитель в токе азота, сухой остаток перерастворяют в 10 см3 дилюента по 4.16, предварительно фильтрованного через мембранный фильтр размером пор 0,2 мкм по 5.12. Массовая концентрация охратоксина A в полученном растворе составляет 20 нг/см3. Раствор готовят в день проведения испытания.
4.24 Охратоксин A, раствор для внесения в пробу при контроле полноты обнаружения
В стеклянный флакон вносят микропипеткой 100 мм3 стандартного раствора охратоксина A массовой концентрации 10 мкг/см3 по 4.22. Объем содержимого флакона доводят до 2 см3 добавлением 1,9 см3 смеси толуола с уксусной кислотой по 4.13. Массовая концентрация охратоксина A в полученном растворе составляет 500 нг/см3.
4.25 Колонка с иммуноаффинным сорбентом
Для проведения испытания пригодна колонка с иммуноаффинным сорбентом, содержащим иммобилизованные антитела, специфичные в отношении охратоксина A, имеющая сорбционную емкость по охратоксину A не менее 100 нг. Каждую партию колонок проверяют на пригодность для использования путем внесения в колонку 100 нг охратоксина A в растворителе, идентичном растворителю экстракта из пробы при его внесении в колонку по 6.1.2, при этом полнота обнаружения охратоксина A должна быть не менее 85%.
4.26 Колонка для твердофазной экстракции с силикагелем, модифицированным фенилсилильными группами
Для проведения испытания пригодна колонка, содержащая 500 мг сорбента, с резервуаром вместимостью 3 см3, толщиной слоя сорбента, достаточной для предотвращения потерь аналита из-за его прохождения сквозь колонку без связывания. Сорбционная емкость колонки по охратоксину A должна быть не меньше 100 нг. Колонка должна обеспечивать полноту обнаружения не менее 85% при внесении в нее 100 нг охратоксина A в растворителе, идентичном экстрагенту для кофе по 4.15.
5 Приборы и оборудование
При проведении испытания используют общеупотребительное лабораторное оборудование, в частности, перечисленное ниже.
5.1 Весы аналитические, пригодные для взвешивания с точностью до 0,01 мг.
5.2 Флаконы стеклянные вместимостью 10 см3
При использовании некоторых стеклянных флаконов возможны потери охратоксина A при выпаривании раствора. Для их предотвращения внутреннюю поверхность флаконов силанизируют, для чего флаконы заполняют силанизирующим реактивом и оставляют в покое на 1 мин. Затем флаконы дважды ополаскивают сначала растворителем (толуолом, ацетоном или гексаном), затем водой, после чего высушивают.
5.3 Блендер лабораторный взрывозащищенного исполнения с контейнером вместимостью 1 дм3, снабженным крышкой, обеспечивающий скорость вращения диспергирующего элемента до 20000 мин-1.
5.4 Пипетки автоматические вместимостью 200 мм3, 1 и 5 см3 в комплекте с подходящими наконечниками.
5.5 Устройство для вакуумной фильтрации многопозиционное, приспособленное для установки иммуноаффинных и фенилсилильных колонок (манифолд).
5.6 Резервуары для элюента в комплекте с приспособлениями для установки иммуноаффинных колонок.
5.7 Насос вакуумный, обеспечивающий разрежение 10 мбар производительностью не менее 18 дм3/мин.
5.8 Встряхиватель лабораторный.
5.9 Центрифуга лабораторная рефрижераторная, обеспечивающая центробежное ускорение 1300 g и рабочую температуру 4 °C.
5.10 Пробирки центрифужные вместимостью 50 см3.
5.11 Фильтры бумажные размером пор от 20 до 25 мкм или аналогичные.
5.12 Фильтры мембранные полисульфоновые шприцевые размером пор 0,2 мкм, диаметром 25 мм.
5.13 Система для ВЭЖХ в указанной ниже комплектации
5.13.1 Инжектор петлевого типа, обеспечивающий объем инжекции 100 мм3.
5.13.2 Насос для подачи подвижной фазы, работающий в изократическом режиме, обеспечивающий скорость подачи подвижной фазы 1 см3/мин.
5.13.3 Колонка для ВЭЖХ аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например с привитыми октадецильными группами (ODS), обеспечивающая отделение пика охратоксина A от сопутствующих пиков матрицы пробы. Перекрывание пика охратоксина A другими пиками не должно превышать 10% его высоты. При необходимости для достижения требуемой степени разделения пиков проводят корректировку состава подвижной фазы. Для предотвращения потери работоспособности аналитической колонки рекомендуется использовать защитную колонку.
5.13.4 Детектор флуориметрический с проточной кюветой, пригодный для проведения измерений при длинах волн возбуждения и эмиссии соответственно 333 и 460 нм.
5.13.5 Компьютерная система обработки данных.
5.14 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, в комплекте с кварцевыми кюветами.
6 Процедура проведения испытания
6.1 Определение охратоксина A в ячмене
6.1.1 Экстракция
Лабораторную пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячейки 0,5 мм. 25 г пробы для анализа, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в контейнер блендера по 5.3. В контейнер добавляют 100 см3 экстрагента по 4.14, контейнер закрывают крышкой и гомогенизируют его содержимое в течение 3 мин при скорости вращения диспергирующего элемента 20000 мин-1. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр по 5.11.
6.1.2 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом
Иммуноаффинную колонку подготавливают к использованию в соответствии с инструкциями изготовителя.
Аликвоту фильтрата, полученного по 6.1.1, объемом 4 см3 переносят с помощью пипетки в стакан, куда добавляют 44 см3 фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.7. Иммуноаффинную колонку по 4.25 устанавливают в вакуумный манифолд, к входному концу колонки присоединяют резервуар по 5.6. В резервуар вносят экстракт, разбавленный фосфатно-хлоридным буферным раствором, и пропускают его через колонку со скоростью не более 5 см3/мин. При этом не допускают попадания в колонку воздуха. Колонку промывают 10 см3 воды, после чего ее отсоединяют от манифолда и высушивают путем пропускания через нее воздуха не менее чем в двукратном объеме. Затем колонку устанавливают над стеклянным флаконом по 5.2, предназначенным для сбора элюата.
6.1.3 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа
Охратоксин A элюируют с использованием подходящего растворителя в соответствии с рекомендациями изготовителя колонки. Элюат собирают в стеклянный флакон по 5.2. По окончании элюирования растворитель удаляют в токе азота при температуре около 50 °C. Сухой остаток перерастворяют в 1,0 см3 дилюента по 4.16 (V3), раствор фильтруют через мембранный фильтр размером пор 0,2 мкм по 5.12. Полученный раствор пробы для хроматографического анализа переносят во флакон автосамплера хроматографа.
6.2 Определение охратоксина A в жареном кофе
6.2.1 Экстракция
Лабораторную пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячейки 1 мм. Пробу для анализа массой 15 г, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в коническую колбу вместимостью 500 см3, куда добавляют 150 см3 экстрагента по 4.15. Колбу закрывают пробкой, содержимое колбы встряхивают в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр по 5.11. Порцию фильтрата объемом 50 см3 помещают в центрифужную пробирку по 5.10 и центрифугируют при центробежном ускорении 1300 g в течение 15 мин при температуре 4 °C.
6.2.2 Очистка экстракта на колонке с фенилсилильным сорбентом
Колонку с фенилсилильным сорбентом по 4.26 устанавливают в вакуумный манифолд по 5.5. На стадии подготовки колонки к использованию не следует применять разрежение. При необходимости скорость протока растворителя через колонку увеличивают, создавая некоторое избыточное давление с помощью азота. Колонку кондиционируют, пропуская через нее сначала 15 см3 метанола, затем 5 см3 раствора двууглекислого натрия по 4.8, элюат отбрасывают.
Аликвоту прозрачного центрифугированного экстракта по 6.2.1 объемом 10 см3 помещают в стакан, куда добавляют 10 см3 раствора двууглекислого натрия по 4.8. Разбавленный таким образом экстракт пропускают через фенилсилильную колонку, при этом скорость протока не должна превышать 5 см3/мин. Далее через колонку пропускают сначала 10 см3 промывного раствора 1 по 4.18, затем 5 см3 промывного раствора 2 по 4.19, при этом скорость протока также не должна превышать 5 см3/мин. После этого колонку отсоединяют от манифолда и высушивают путем пропускания через нее с помощью шприца не менее 10 см3 воздуха. Затем колонку устанавливают над стеклянным флаконом подходящей вместимости и элюируют охратоксин A с помощью 10 см3 элюента по 4.20 при скорости протока, не превышающей 5 см3/мин.
6.2.3 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом
Полученный по 6.2.2 элюат разбавляют 30 см3 фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.7. Иммуноаффинную колонку по 4.25 устанавливают в вакуумный манифолд, к входному концу колонки присоединяют резервуар по 5.6. В резервуар вносят элюат, разбавленный фосфатно-хлоридным буферным раствором, и пропускают его через колонку со скоростью не более 5 см3/мин. При этом не допускается попадание в колонку воздуха. Колонку промывают 10 см3 воды, после чего ее отсоединяют от манифолда и помещают над стеклянным флаконом по 5.2, предназначенным для сбора элюата.
6.2.4 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа
Охратоксин A элюируют четырьмя порциями элюента, указанного в инструкции по применению колонки, объемом 1 см3 каждая, элюат собирают во флакон по 5.2. По окончании элюирования растворитель удаляют в токе азота при температуре около 50 °C. Сухой остаток перерастворяют в 1,0 см3 дилюента по 4.16 (V3), раствор фильтруют через мембранный фильтр размером пор 0,2 мкм по 5.12. Полученный раствор пробы для хроматографического анализа переносят во флакон автосамплера хроматографа.
7 Процедура проведения испытания пробы с добавкой охратоксина A
7.1 Испытание пробы ячменя с добавкой охратоксина A
Пробу для анализа массой 25 г, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в контейнер блендера, куда затем добавляют 200 мм3 раствора охратоксина A по 4.24. Контейнер с пробой оставляют на ночь в вытяжном шкафу для удаления растворителя. Дальнейшую процедуру проводят в соответствии с 6.1.
7.2 Испытание пробы жареного кофе с добавкой охратоксина A
Пробу кофе измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячейки 1 мм. Отбирают пробу для анализа массой 15 г, взвешенной с точностью до 0,1 г, и помещают ее в коническую колбу вместимостью 500 см3, куда затем вносят 120 мм3 раствора охратоксина A по 4.24. Контейнер с пробой оставляют на ночь в вытяжном шкафу для удаления растворителя. Дальнейшую процедуру проводят в соответствии с 6.2.
8 Анализ с помощью ВЭЖХ
8.1 Приготовление градуировочных растворов
Градуировку осуществляют в день проведения испытания перед хроматографическим анализом растворов проб или в случае изменения условий хроматографического анализа.
Готовят пять градуировочных растворов в соответствии с таблицей 1, для чего в мерные колбы вместимостью по 5 см3 пипеткой вносят различные объемы стандартного раствора по 4.23, объем содержимого в колбах доводят до метки дилюентом по 4.16, фильтрованным через мембранный фильтр.
Приготовление градуировочных растворов
| Градуировочный раствор | Объем стандартного раствора по 4.23, взятый для приготовления градуировочного раствора, мм3 | Объем дилюента по 4.16, использованный для приготовления градуировочного раствора, мм3 | Массовая концентрация охратоксина A в градуировочном растворе, нг/см3 |
|---|---|---|---|
| 1 | 125 | 4875 | 0,5 |
| 2 | 250 | 4750 | 1,0 |
| 3 | 500 | 4500 | 2,0 |
| 4 | 1250 | 3750 | 5,0 |
| 5 | 2500 | 2500 | 10,0 |
8.2 Условия хроматографического анализа
Приведенные ниже параметры обеспечивают приемлемое качество хроматографического анализа при использовании аналитической колонки по 5.13.3 длиной 250 мм, внутренним диаметром 4.6 мм и диаметром частиц сорбента 5 мкм.
Скорость подачи подвижной фазы — 1,0 см3/мин.
Параметры работы флуориметрического детектора: длина волны возбуждения 333 нм, длина волны эмиссии 460 нм.
Объем инжекции — 100 мм3 (V4).
8.3 Идентификация пика аналита
Пик охратоксина A на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению его времени удерживания с временем удерживания пика охратоксина A на хроматограммах градуировочных растворов. При возникновении сомнений в правильности идентификации пик охратоксина A на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавлением градуировочного раствора охратоксина A.
8.4 Количественное определение
Количественное определение проводят по методу внешнего стандарта. При этом либо осуществляют градуировку по одному градуировочному раствору, площадь или высота пика аналита на хроматограмме которого наиболее близки к площади или высоте пика аналита на хроматограмме раствора пробы, либо используют градуировочный график. В последнем случае проводят анализ нескольких градуировочных растворов, при этом необходимо, чтобы массовые концентраций охратоксина A в них находились в пределах линейного участка градуировочной зависимости.
Соблюдают одинаковые объемы инжекции при анализе раствора пробы и градуировочных растворов.
Если аналитический сигнал, относящийся к пику охратоксина A в растворе пробы, выходит за верхнюю границу диапазона градуировки, раствор пробы разбавляют в необходимой мере.
9 Обработка результатов
По градуировочной характеристике определяют массу охратоксина A, нг, в инжектированной аликвоте раствора пробы.
Содержание охратоксина A в пробе, wota, мкг/кг, рассчитывают по формуле
w_{ota} = m_{a} \frac{V_{3}}{V_{4}} \frac{V_{1}}{V_{2}} \frac{1000}{m_{s}} \frac{1}{1000} , (2)
где ma — масса охратоксина A в инжектированной аликвоте раствора пробы, нг;
ms — масса анализируемой пробы, г (ms = 25 г для ячменя и ms = 15 г для кофе);
V3 — объем приготовленного раствора пробы для хроматографического анализа по 6.1.3 и 6.2.3, см3 (V3 = 1,0 см3);
V1 — объем экстрагента, использованный для экстракции, см3 (V1 = 100 см3 для ячменя и V1 = 150 см3 для кофе);
V4 — объем инжекции раствора пробы для хроматографического анализа по 6.2, см3;
V2 — объем аликвоты экстракта, отобранной для очистки на иммуноаффинной колонке, см3 (V2 = 4,0 см3 для ячменя по 6.2.1 и V2 = 10 см3 для кофе по 6.2.2).
Результат испытания выражают в микрограммах на килограмм, или в нанограммах на грамм.
10 Прецизионность
10.1 Общие положения
Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности метода приведены в приложении A. Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, чем те, что указаны в приложении A.
10.2 Повторяемость
Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в одной лаборатории одним оператором с использованием одного оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости r более чем в 5% случаев.
Значения предела повторяемости для ячменя равны:
\overline{x} = 0,1\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,112\text{мкг}/\text{кг} (холостая проба);
\overline{x} = 1,3\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,896\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 3,0\text{мкг}/\text{кг}...r = 1,036\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 3,7\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,448\text{мкг}/\text{кг} (проба с добавкой охратоксина A);
\overline{x} = 4,5\text{мкг}/\text{кг}...r = 1,792\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).
Значения предела повторяемости для кофе равны:
\overline{x} = 0,2\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,112\text{мкг}/\text{кг} (холостая проба);
\overline{x} = 1,2\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,756\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 2,7\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,868\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 3,5\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,588\text{мкг}/\text{кг} (проба с добавкой охратоксина A);
\overline{x} = 5,5\text{мкг}/\text{кг}...r = 0,308\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).
10.3 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5% случаев.
Значения предела воспроизводимости для ячменя равны:
\overline{x} = 0,1\text{мкг}/\text{кг}...R = 0,280\text{мкг}/\text{кг} (холостая проба);
\overline{x} = 1,3\text{мкг}/\text{кг}...R = 1,232\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 3,0\text{мкг}/\text{кг}...R = 1,456\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 3,7\text{мкг}/\text{кг}...R = 1,204\text{мкг}/\text{кг} (проба с добавкой охратоксина A);
\overline{x} = 4,5\text{мкг}/\text{кг}...R = 1,876\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).
Значения предела воспроизводимости для кофе равны:
\overline{x} = 0,2\text{мкг}/\text{кг}...R = 0,308\text{мкг}/\text{кг} (холостая проба);
\overline{x} = 1,2\text{мкг}/\text{кг}...R = 0,896\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 2,7\text{мкг}/\text{кг}...R = 1,120\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем);
\overline{x} = 3,5\text{мкг}/\text{кг}...R = 1,288\text{мкг}/\text{кг} (проба с добавкой охратоксина A);
\overline{x} = 5,5\text{мкг}/\text{кг}...R = 2,184\text{мкг}/\text{кг} (проба, загрязненная охратоксином A естественным путем).
11 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен содержать как минимум следующие сведения:
a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;
b) ссылку на настоящий стандарт;
c) дату и время отбора пробы (если известны);
d) дату поступления пробы в лабораторию;
f) результаты испытания с указанием единиц измерения;
g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;
h) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания.
ДАННЫЕ ПО ПРЕЦИЗИОННОСТИ МЕТОДА
Приведенные в таблицах A.1 и A.2 данные получены в результате межлабораторных испытаний [2], [3], организованных в соответствии с [4].
Данные по прецизионности метода для ячменя
| Наименование показателя | Холостая проба <*> | Проба с низким уровнем содержания охратоксина A | Проба со средним уровнем содержания охратоксина A | Проба с высоким уровнем содержания охратоксина A | Проба с добавленным охратоксином A |
| Год проведения испытаний | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 |
| Количество лабораторий-участников | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 14 | 15 | 14 | 12 | 12 |
| Количество выбросов (лабораторий) | 1 | 0 | 1 | 3 | 3 |
| Число принятых результатов | 14 | 15 | 14 | 12 | 12 |
| Среднее значение \overline{x} , мкг/кг | 0,1 | 1,3 | 3,0 | 4,5 | 3,7 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/кг | 0,04 | 0,32 | 0,37 | 0,64 | 0,16 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 26 | 24 | 12 | 14 | 4 |
| Предел повторяемости r (r = 2,8sr), мкг/кг | 0,112 | 0,896 | 1,036 | 1,792 | 0,448 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/кг | 0,10 | 0,44 | 0,52 | 0,67 | 0,43 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % | 72 | 33 | 17 | 15 | 12 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,8sR), мкг/кг | 0,280 | 1,232 | 1,456 | 1,876 | 1,204 |
| Полнота обнаружения, % | - | - | - | - | 93 +/- 10 |
| <*> Результат испытания холостой пробы находится на уровне предела обнаружения. | |||||
Данные по прецизионности методики для жареного кофе
| Наименование показателя | Холостая проба <*> | Проба с низким уровнем содержания охратоксина A | Проба со средним уровнем содержания охратоксина A | Проба с высоким уровнем содержания охратоксина A | Проба с добавленным охратоксином A |
| Год проведения испытаний | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 | 1998 — 1999 |
| Количество лабораторий-участников | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов | 14 | 15 | 14 | 12 | 13 |
| Количество выбросов (лабораторий) | 1 | 0 | 1 | 3 | 2 |
| Число принятых результатов | 14 | 15 | 14 | 12 | 13 |
| Среднее значение \overline{x} , мкг/кг | 0,2 | 1,2 | 2,7 | 5,5 | 3,5 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/кг | 0,04 | 0,27 | 0,31 | 0,11 | 0,21 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 28 | 22 | 11 | 2 | 6 |
| Предел повторяемости r (r = 2,8 sr), мкг/кг | 0,112 | 0,756 | 0,868 | 0,308 | 0,588 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/кг | 0,11 | 0,32 | 0,40 | 0,78 | 0,46 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % | 71 | 26 | 15 | 14 | 13 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,8 sR), мкг/кг | 0,308 | 0,896 | 1,120 | 2,184 | 1,288 |
| Полнота обнаружения, % | - | - | - | - | 88 +/- 15 |
| <*> Результат испытания холостой пробы находится на уровне предела обнаружения. | |||||
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫХ СТАНДАРТОВ ССЫЛОЧНЫМ ЕВРОПЕЙСКИМ РЕГИОНАЛЬНЫМ СТАНДАРТАМ