ГОСТ EN 12822-2020. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая. Определение содержания витамина E методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Измерение альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферолов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 30.09.2022 № 1032-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 01.03.2023. Взамен ГОСТ EN 12822-2014.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ EN 12822-2014"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-en-12822-2014" "ГОСТ EN 12822-2014. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение содержания витамина E (альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферолов) методом высокоэффективной жидкостн" n1["ГОСТ EN 12822-2020"]:::doc click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-en-12822-2020" "ГОСТ EN 12822-2020. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая. Определение содержания витамина E методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Измерение альфа-, бета-, г" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2022 г. № 1032-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА E МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ. ИЗМЕРЕНИЕ \alpha - , \beta - , \gamma - И \delta - \text{ТОКОФЕРОЛОВ}
Foodstuffs. Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography. Measurement of \alpha - , \beta - , \gamma - and \delta - tocopherols
Дата введения 1 марта 2023 года
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. № 131-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2022 г. № 1032-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 12822-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 марта 2023 г.
5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 12822:2014 «Продукты пищевые. Определение содержания витамина E методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Измерение \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} » («Foodstuffs — Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography — Measurement of \alpha - , \beta - , \gamma - and \delta - tocopherols », IDT).
Европейский стандарт разработан Техническим комитетом CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).
В стандарт внесены следующие редакционные изменения: единица измерения микролитр (мкл) заменена на кубический миллиметр (мм3); единица измерения миллилитр (мл) заменена на кубический сантиметр (см3); единица измерения литр (л) заменена на кубический дециметр (дм3).
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА
6 ВЗАМЕН ГОСТ EN 12822-2014
6 Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации не несет ответственности за патентную чистоту настоящего стандарта. Патентообладатель может заявить о своих правах и направить в национальный орган по стандартизации своего государства аргументированное предложение о внесении в настоящий стандарт поправки для указания информации о наличии в стандарте объектов патентного права и патентообладателе
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Введение
Настоящий стандарт устанавливает методику измерения массовой доли \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} в пищевых продуктах, соответственно, приводятся ссылки на литературу по расчету и выражению содержания витамина E в единицах биологической активности. Дополнительную информацию можно получить в документах [1], [2], [3] и [4]. При применении метода, установленного в настоящем стандарте, невозможно дифференцировать RRR-токоферол и все рацемические токоферолы.
Предупреждение — Применение настоящего стандарта может быть связано с проведением опасных операций, использованием вредных веществ, опасного оборудования. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина E в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение содержания витамина E осуществляется путем определения \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} . Метод прошел валидацию в двух межлабораторных испытаниях. В ходе первого межлабораторного испытания было проведено определение \alpha - \text{токоферола} в маргарине и сухом молоке в диапазоне от 9,89 до 24,09 мг/100 г. В ходе второго межлабораторного испытания было проведено определение \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} в сухом молоке и \alpha - и \beta - \text{токоферолов} в овсяной муке в диапазоне от 0,057 (\beta - \text{токоферол}) до 10,2 мг/100 г (\alpha - \text{токоферол}) .
Примечание 1 — Активность витамина E может быть рассчитана исходя из содержания токоферолов с учетом соответствующих условий, установленных в [1], [2], [3] и [4].
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных — последнее издание (включая все изменения)]:
EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (ISO 3696) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
3 Сущность метода
Определение содержания \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} осуществляют в растворе пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с фотометрическим (в ультрафиолетовой области) или, предпочтительнее, флуориметрическим детектированием. Для приготовления раствора пробы в большинстве случаев необходимо омыление материала пробы с последующей экстракцией. Определяемые соединения идентифицируют по значениям времени удерживания и количественно определяют при помощи внешнего стандарта по результатам измерений значений площадей и высот пиков. Допускается использование метода внутреннего стандарта, если соответствующие тесты по полноте обнаружения подтверждают, что поведение внутреннего стандарта и аналитов в процессе анализа тождественно, дополнительную информацию см. в [4] - [14].
4 Реактивы и материалы
Используют реактивы только требуемой аналитической чистоты и воду, соответствующую требованиям ISO 3696 (1 степень чистоты), если не предусмотрено иное.
4.1 Метанол.
4.2 Этанол абсолютный, объемная доля \phi(C_{2}H_{5}OH) = 100% .
4.3 Этанол, \phi(C_{2}H_{5}OH) = 96% .
4.4 Сульфат натрия безводный.
4.5 Раствор гидроксида калия для омыления, в подходящих концентрациях, например \rho KOH) = 50\text{г}/100\text{см}^{3} или \rho(KOH) = 60\text{г}/100\text{см}^{3} , или спиртовые растворы, например 28 г KOH в 100 см3 с объемным отношением этанола и воды 9:1.
4.6 Антиоксиданты, например аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, пирогаллол, сульфид натрия Na2S, гидрохинон или бутилгидрокситолуол (BHT).
4.7 Растворители и экстрактанты, например диэтиловый эфир (без пероксида), дихлорметан, петролейный эфир (пределы кипения от 40 °C до 60 °C), н-гексан, этилацетат или соответствующие смеси вышеперечисленных веществ.
4.8 Подвижная фаза ВЭЖХ, соответствующие смеси, выраженные в объемных долях, например 3% 1,4-диоксана или 0,5% 2-пропанола, 3% трет-бутилметилового эфира в н-гексане или н-гептане для нормально-фазовой хроматографии (НФ) или 1% — 10% воды в метаноле для обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии.
Относительно подвижных фаз для альтернативных систем для ВЭЖХ — см. приложение C.
4.9 Образцы сравнения
4.9.1 Общие положения
Фирма Calbiochem <*> реализует \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолы} , \alpha - \text{токоферол} реализуют различные поставщики. Массовая доля основного вещества в образцах сравнения токоферолов может колебаться от 90% до 100%, поэтому необходимо определить массовую концентрацию градуировочного раствора спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовой области (см. 4.10.5).
<*> Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN. Допустимо применение аналогичной продукции при подтверждении ее эквивалентной результативности.
4.9.2 \alpha - \text{токоферол} , M(C29H50O2) = 430,7 г/моль, с массовой долей не менее 95%.
\alpha - \text{токоферолацетат} , M(C31H52O3) = 472,7 г/моль можно также использовать в качестве стандартного вещества после омыления.
4.9.3 \beta - \text{токоферол} , M(C28H48O2) = 416,7 г/моль, с массовой долей не менее 90%.
4.9.4 \gamma - \text{токоферол} , M(C28H48O2) = 416,7 г/моль, с массовой долей не менее 90%.
4.9.5 \delta - \text{токоферол} , M(C27H46O2) = 402,6 г/моль, с массовой долей не менее 90%.
4.10 Основные растворы
4.10.1 Основной раствор \alpha - \text{токоферола}
Растворяют 10 мг стандартного вещества \alpha - \text{токоферола} (см. 4.9.2), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см3 подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.
4.10.2 Основной раствор \beta - \text{токоферола}
Растворяют 10 мг стандартного вещества \beta - \text{токоферола} (см. 4.9.3), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см3 подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.
4.10.3 Основной раствор \gamma - \text{токоферола}
Растворяют 10 мг стандартного вещества \gamma - \text{токоферола} (см. 4.9.4), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см3 подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.
4.10.4 Основной раствор \delta - \text{токоферола}
Растворяют 10 мг стандартного вещества \delta - \text{токоферола} (см. 4.9.5), взвешенного с точностью до 1 мг, в 100 см3 подходящего растворителя, например, н-гексана при использовании метода нормально-фазовой ВЭЖХ или метанола при использовании метода обращенно-фазовой ВЭЖХ.
4.10.5 Проверка концентрации и чистоты
Измеряют оптическую плотность основных растворов (см. 4.10.1 - 4.10.4) при соответствующей длине волны (см. таблицу 1) на спектрофотометре, пригодном для проведения измерений в ультрафиолетовой области (см. 5.1). Если в качестве растворителя используется н-гексан, то 10 см3 основного раствора помещают пипеткой в круглодонную колбу из темного стекла и отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре не выше 50 °C с использованием ротационного испарителя (см. 5.2). Остаток растворителя в колбе удаляют в токе азота, содержимое растворяют при перемешивании в 10 см3 метанола. Этот раствор используют для спектрофотометрических измерений.
Массовую концентрацию витамина E \rho , мкг/см3, соответствующего \alpha - , \beta - , \gamma - или \delta - \text{токоферолам} , вычисляют по формуле
\rho = \frac{A \cdot M \cdot 1000}{\epsilon} , (1)
где A — степень поглощения основного раствора соответствующего токоферола в метаноле;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения в метаноле на конкретной длине волны согласно таблице 1, дм3·моль-1·см-1;
M — молярная масса для соответствующего токоферола согласно таблице 1, г·моль-1
Примеры значений E_{1\text{см}}^{1\%} и рассчитанное значение \epsilon
| Соединение | Длина волны (в метаноле) | E_{1\text{см}}^{1\%} | Молярная масса, г·моль-1 | \epsilon , дм3·моль-1·см-1 | Библиография |
|---|---|---|---|---|---|
| \alpha - \text{токоферол} | 292 нм | 76 | 430,7 | 3 273,3 | [12], [13], [15] |
| \beta - \text{токоферол} | 296 нм | 89 | 416,7 | 3 708,6 | [12], [13], [15] |
| \gamma - \text{токоферол} | 298 нм | 91 | 416,7 | 3 782 | [12], [13], [15] |
| \delta - \text{токоферол} | 298 нм | 87 | 402,6 | 3 502,6 | [12], [13], [15] |
Дополнительно к значению для \alpha - \text{токоферола} , полученному при длине волны 292 нм, необходимо также измерить оптическую плотность при длине волны 255 нм (на минимуме). При данной длине волны значения не должны превышать E255/E292 = 0,18. В противном случае делают вывод о том, что произошло разложение раствора (дополнительную информацию см. в [15]).
4.11 Стандартные растворы
4.11.1 Стандартный раствор \alpha - \text{токоферола}
10 см3 основного раствора \alpha - \text{токоферола} (см. 4.10.1) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и разбавляют до метки подходящим растворителем (например, для нормально-фазовой хроматографии — н-гексаном, для обращенно-фазовой — метанолом). Массовая концентрация стандартного раствора \alpha - \text{токоферола} должна быть от 1 до 10 мкг/см3. При применении детектора в ультрафиолетовой области следует использовать более концентрированный раствор.
Стандартный раствор хранят в условиях защиты от света при температуре ниже 4 °C и проверяют в соответствии с требованиями, установленными в 4.10.5.
4.11.2 Стандартный раствор смеси \alpha - , \beta - , \gamma - , \delta - \text{токоферолов}
По 10 см3 каждого основного раствора (см. 4.10) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и разбавляют до метки подходящим растворителем (например, для нормально-фазовой хроматографии — н-гексаном, для обращенно-фазовой — метанолом). Массовая концентрация каждого токоферола в стандартном растворе должна быть от 1 до 10 мкг/см3.
Стандартный раствор хранят в условиях защиты от света при температуре ниже 4 °C и проверяют в соответствии с требованиями, установленными в 4.10.5.
5 Оборудование
При проведении испытаний используют стандартное лабораторное оборудование, в частности, следующее.
5.1 Спектрофотометр для ультрафиолетовой области, пригодный для измерений оптической плотности при заданных длинах волн, снабженный кварцевыми кюветами, например, с толщиной слоя 1 см.
5.2 Ротационный испаритель в комплекте с водяной баней и устройством для создания вакуума.
Для сброса вакуума рекомендуется использовать азот.
5.3 Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, флуориметрического детектора (длина волны возбуждения 295 нм, длина волны регистрации 330 нм) и интегратора или системы обработки данных.
Допускается использование спектрофотометрического детектора, пригодного для проведения измерений при длине волны 292 нм. В этом случае градуировочные растворы и растворы проб должны быть более концентрированными. При использовании спектрофотометрического детектора вероятность помех со стороны матрицы пробы увеличивается.
5.4 Колонки для ВЭЖХ, для проведения испытаний применяют нормально-фазовые аналитические колонки, например, внутреннего диаметра от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм, заполненные силикагелем с размером частиц 5 мкм. Допускается использование колонок других типоразмеров с другим размером частиц. При необходимости для достижения требуемой степени разделения пиков проводят корректировку условий хроматографического разделения. Критерием применимости аналитических колонок является разделение определяемых аналитов до базовой линии. Примерами подходящих сорбентов являются LiChrosorb® Si 60 <>, Spherisorb® Si <>, Hypersil® Si <> и Lichrospher® 100 DIOL <>. Могут также применяться аналитические колонки с обращенной фазой, например, C18, с размером частиц 5 мкм, внутренним диаметром от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм. Примерами подходящих обращенно-фазовых сорбентов являются Spherisorb® ODS <> и Hypersil® ODS <>. Большинство обращенно-фазовых сорбентов не разделяют \beta - и \gamma - \text{токоферолы} . Эти колонки, однако, могут использоваться для разделения \alpha - и \delta - \text{токоферолов} и получения значения суммы \beta - и \gamma - \text{токоферолов} .
<*> LiChrosorb® Si 60, Spherisorb® Si, Hypersil® Si и Lichrospher® 100 DIOL, Spherisorb® ODS и Hypersil® ODS являются примерами подходящих имеющихся в продаже продуктов. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN.
5.5 Устройство для фильтрования, пригодное для установки фильтров большого и малого размеров для фильтрования подвижной фазы и растворов проб, например, с диаметром пор 0,45 мкм.
Примечание 2 — Как правило, фильтрование подвижной фазы и растворов проб через мембранный фильтр перед вводом продлевает срок жизни колонок.
5.6 Фильтр для разделения фаз (применяется по выбору пользователя стандарта).
6 Методика
6.1 Подготовка пробы к испытаниям
Испытуемую пробу гомогенизируют. Грубые материалы размалывают в подходящей мельнице и тщательно перемешивают. Чтобы исключить длительное воздействие высоких температур, пробу охлаждают.
6.2 Приготовление раствора пробы
6.2.1 Меры предосторожности
Важно, чтобы растворы проб при хранении были защищены от света.
6.2.2 Пробы растительных масел и жиров с низким содержанием влаги, содержащие неэтерифицированные токоферолы
6.2.2.1 Растительные масла и жиры с низким содержанием влаги
Изложенный ниже способ применим только к пробам, содержащим неэтерифицированные токоферолы. В противном случае испытания проводят по 6.2.3.
Подготовленную к испытаниям пробу массой 2 г, взвешенную с точностью до 1 мг, помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Добавляют н-гексан или иной подходящий растворитель и растворяют в нем пробу. Обработка ультразвуком ускоряет процесс растворения. Доводят содержимое колбы до метки тем же растворителем. Подготовленный раствор пробы может быть использован только при анализе методом нормально-фазовой ВЭЖХ.
При необходимости раствор пробы разбавляют тем же растворителем либо готовят новый раствор с использованием подготовленной к испытаниям пробы меньшей массы.
6.2.2.2 Маргарин, сливочное масло
При испытании маргарина и сливочного масла необходимо выделить жир из пробы. Это может быть достигнуто, например, путем смешивания пробы с безводным сульфатом натрия (см. 4.4), добавления н-гексана (см. 4.7) и обработки смеси в ультразвуковой бане. Нерастворившиеся вещества отфильтровывают и не менее двух раз промывают н-гексаном. Растворитель отгоняют на ротационном испарителе при пониженном давлении, остаток растворяют в определенном объеме н-гексана и анализируют методом нормально-фазовой хроматографии.
6.2.3 Прочие продукты
6.2.3.1 Омыление
Подготовленную к испытаниям пробу массой от 2 до 10 г омыляют с обратным холодильником, предпочтительно в атмосфере азота, добавляя при этом необходимое количество этанола (см. 4.3) или метанола (см. 4.1), воды, антиокислителя (см. 4.6), такого как аскорбиновая кислота (АК), гидрохинон, пирогаллол или BHT, и одного из растворов гидроксида калия (см. 4.5). Спирты и антиокислители добавляют в пробу до добавления раствора гидроксида калия.
В таблице 2 приведены примеры подходящих количеств реактивов.
Подходящие количества реактивов
Обычно время омыления составляет от 15 до 40 мин при температуре от 80 °C до 100 °C. Если по окончании омыления на поверхности охлажденной реакционной смеси присутствует жир или масло, то добавляют дополнительное количество раствора гидроксида калия (см. 4.5) и увеличивают время омыления.
6.2.3.2 Экстракция
Во избежание образования эмульсии, раствор пробы после омыления разбавляют таким количеством воды, чтобы в полученном растворе объемное отношение спирта и воды составляло 1:1. Экстрагируют токоферолы подходящим растворителем (см. 4.7). Для обеспечения надлежащей полноты выделения \gamma - и \delta - \text{токоферолов} при использовании н-гексана в качестве экстрагента, к нему должна быть добавлена определенная доля полярного растворителя. Для количественной экстракции токоферолов также применяют такие смеси растворителей, как, например, петролейный эфир с добавлением 20% диэтилового эфира. Для выявления возможных потерь аналита контролируют полноту обнаружения токоферолов (дополнительную информацию см. в [16] и [17]).
Процедуру экстракции повторяют три-четыре раза, используя порции экстрагента объемом от 50 до 150 см3. Объединенные экстракты промывают водой до нейтральной реакции (два — четыре раза объемом от 50 до 150 см3).
Экстракция может также быть осуществлена методом жидкостно-жидкостной экстракции с использованием картриджей (например, Extrelut® <*>) при условии, что содержание токоферолов не слишком низкое (дополнительную информацию см. в [18], [22]).
<*> Extrelut® является примером подходящего имеющегося в продаже продукта. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN.
6.2.3.3 Концентрирование экстракта
Из экстракта удаляют растворитель путем дистилляции с применением ротационного испарителя (см. 5.2). Предварительно остающиеся следы воды удаляют путем осушения безводным сульфатом натрия (см. 4.4) или отгонки азеотропа с абсолютным этанолом (см. 4.2) или толуолом. Могут быть использованы другие равноценные способы удаления следов воды, такие как применение фильтра для разделения фаз, при условии, что они не оказывают негативного влияния на результаты испытаний.
6.2.3.4 Разбавление
Остаток растворяют в подвижной фазе (см. 4.8) или в другом, совместимом с подвижной фазой растворителе, причем массовая концентрация отдельных токоферолов в полученном растворе пробы должна составлять от 1 до 10 мкг/см3.
6.3 Идентификация
Пики токоферолов на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению значений времени удерживания со значениями времени удерживания пиков токоферолов на хроматограммах градуировочных растворов. В качестве альтернативы пики токоферолов на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавкой градуировочных растворов.
Примечание 3 — Установлено, что разделение и количественное определение являются удовлетворительными при следующих хроматографических условиях (см. также приложение A (рисунки A.1 и A.2)). Другие варианты условий хроматографического анализа приведены в приложении C (таблица C.1)).
6.4 Количественное определение
В ВЭЖХ-систему (см. 5.3) вводят подходящие объемы (до 100 мм3) стандартного раствора и раствора пробы. Количественное определение проводят путем соотнесения площади или высоты пика аналита на хроматограмме раствора пробы с аналогичными параметрами пика на хроматограмме стандартного раствора.
Объемы ввода раствора пробы и градуировочного раствора должны быть одинаковыми, в противном случае их учитывают при вычислении результата (см. раздел 7). Проверяют соблюдение требования проведения измерений в линейной области градуировочной характеристики.
7 Расчет
Вычисление результатов проводят при помощи градуировочного графика или путем применения соответствующей программы интегратора либо применяют следующий упрощенный способ.
Массовую долю \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} w, мг/100 г пробы, вычисляют по формуле
w = \frac{A_{S} \cdot \rho \cdot V \cdot V_{ST}}{A_{ST} \cdot m \cdot V_{S} \cdot 1000} \cdot 100 , (2)
где AS — площадь или высота пика \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} в растворе пробы;
AST — площадь или высота пика \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} в стандартном растворе;
V — общий объем раствора пробы (см. 6.2.2 и 6.2.3), см3;
\rho — массовая концентрация \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} в стандартном растворе (см. 4.11.1 и 4.11.2) с откорректированной чистотой (см. 4.10.5), мкг/см3;
VST — объем ввода стандартного раствора, мм3;
VS — объем ввода раствора пробы, мм3;
1000 — коэффициент пересчета мкг в мг;
100 — коэффициент пересчета для массовой доли на 100 г.
Результаты для \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} выражаются в мг/100 г пробы. При необходимости расчета активности витамина E руководствуются введением и документами [1] - [3].
8 Прецизионность
8.1 Общие положения
Данные по прецизионности различных вариантов определения \alpha - \text{токоферола} методом ВЭЖХ были исследованы в ходе межлабораторных сравнительных испытаний, организованных в 1994 году Европейской комиссией по нормированию, измерениям и испытаниям на международном уровне [18] на пробах маргарина (сертифицированное эталонное вещество (CRM) 122) и сухого молока CRM 421, испытания привели к получению статистических результатов, представленных в приложении B. Результаты, полученные при этих международных сравнительных испытаниях, не могут быть применимы к другим диапазонам содержаний определяемых соединений и иным матрицам по сравнению с приведенными в приложении B.
Данные по прецизионности для сухого молока и овсяной муки были установлены в соответствии с [19] в ходе межлабораторных сличительных испытаний, организованных на национальном уровне институтом им. Макса фон Петтенкофера Федерального учреждения по здравоохранению (в настоящее время — Федеральный институт защиты здоровья потребителя и ветеринарной медицины) [20]. Результаты, полученные при этих сравнительных испытаниях, не могут быть применимы к другим диапазонам содержаний определяемых соединений и иным матрицам по сравнению с приведенными в приложении B.
8.2 Повторяемость
Абсолютная разность между двумя единичными результатами испытаний, полученными одним исполнителем на идентичном исследуемом материале на одном и том же оборудовании в течение возможно короткого промежутка времени, может превышать предел повторяемости r не чаще чем в 5% случаев. Предел повторяемости зависит от содержания определяемых соединений в пробе. Значения приведены ниже:
8.3 Воспроизводимость
Абсолютная разность между двумя единичными результатами, полученными в двух лабораториях на идентичном исследуемом материале, может превышать предел воспроизводимости R не чаще чем в 5% случаев. Значения приведены ниже:
9 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен соответствовать требованиям [23] и содержать, по меньшей мере, следующие сведения:
a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;
b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;
c) дату и способ отбора проб (если он известен);
f) результаты испытаний с указанием единиц измерений, в которых выражен результат;
g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытаний;
h) любые применявшиеся операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые необязательные, которые могли повлиять на результат испытаний.
Y — флюоресценция; X — время, мин; 1 — \alpha - \text{токоферол} ; 2 — \beta - \text{токоферол} ; 3 — \gamma - \text{токоферол} ; 4 — \delta - \text{токоферол}
Рисунок A.1 — Пример высокоэффективного жидкостного хроматографического разделения \alpha - , \beta - , \gamma - , \delta - \text{токоферолов} в пробе маргарина (CRM 122)
Y — флюоресценция; X — время, мин; 1 — \alpha - \text{токоферол} ; 2 — \beta - \text{токоферол} ; 3 — \gamma - \text{токоферол}
Рисунок A.2 — Пример высокоэффективного жидкостного хроматографического разделения \alpha - , \beta - , \gamma - , \delta - \text{токоферолов} в пробе сухого молока (CRM 421)
Приведенные в таблице B.1 данные были получены в межлабораторном сравнительном испытании различных способов определения витамина E (\alpha - \text{токоферол}) , которое было организовано в рамках Программы нормирования, измерения и испытания Европейской комиссией [18]. Данные, приведенные в таблицах B.2 и B.3, получены в результате межлабораторного испытания, проведенного в соответствии с требованиями [19]. Испытание было проведено под руководством отдела пищевой химии Федеральной службы здравоохранения Института имени Макса фон Петтенкофера, Берлин, Германия [20].
Прецизионные данные для маргарина и сухого молока
| Проба | CRM 122 Маргарин | CRM 421 Сухое молоко |
|---|---|---|
| Аналит | \alpha - \text{токоферол} | \alpha - \text{токоферол} |
| Год проведения испытаний | 1994 | 1994 |
| Количество лабораторий | 9 | 10 |
| Количество проб | 1 | 1 |
| Количество лабораторий после исключения выбросов | 9 | 10 |
| Количество выбросов | 0 | 0 |
| Количество наборов данных | 9 | 10 |
| Количество признанных результатов | 45 | 50 |
| Среднее значение, \overline{x} , мг/100 г | 24,09 | 9,89 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,977 | 0,399 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 4,1 | 4,0 |
| Пределы повторяемости r (r = 2,83 x sr), мг/100 г | 2,765 | 1,130 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 1,477 | 0,693 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 6,1 | 7,0 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,83 x sR), мг/100 г | 4,180 | 1,960 |
| Значение коэффициента Хорвитца согласно [21] | 0,87 | 0,87 |
Примечание — Данные, установленные в ходе сравнительных испытаний, были получены с использованием различных вариантов метода, которые идентичны применяемым лабораториями рутинным методам, при этом были использованы ВЭЖХ-системы, приведенные в приложении C.
Прецизионные данные для сухого молока
| Аналит | \alpha - \text{токоферол} | \beta - \text{токоферол} | \gamma - \text{токоферол} | \Delta - \text{токоферол} |
|---|---|---|---|---|
| Год межлабораторного испытания | 1993 | 1993 | 1993 | 1993 |
| Количество лабораторий | 13 | 12 | 13 | 10 |
| Количество проб | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Количество лабораторий после исключения выбросов | 12 | 9 | 11 | 8 |
| Количество выбросов | 1 | 3 | 2 | 2 |
| Количество принятых результатов | 66 | 51 | 65 | 40 |
| Среднее значение \overline{x} , мг/100 г | 10,2 | 0,081 | 1,989 | 0,280 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,301 | 0,009 | 0,110 | 0,029 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 3,0 | 11,1 | 5,5 | 10,4 |
| Пределы повторяемости r (r = 2,83 x sr), мг/100 г | 0,853 | 0,025 | 0,311 | 0,082 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 1,31 | 0,016 | 0,346 | 0,047 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 12,8 | 19,8 | 17,4 | 16,8 |
| Пределы воспроизводимости R (R = 2,83 x sR), мг/100 г | 3,705 | 0,046 | 0,978 | 0,134 |
| Значение коэффициента Хорвитца согласно [21] | 1,1 | 1,2 | 1,7 | 1,2 |
Прецизионные данные для овсяной муки
| Аналит | \alpha - \text{токоферол} | \beta - \text{токоферол} |
|---|---|---|
| Год межлабораторного испытания | 1993 | 1993 |
| Количество лабораторий | 13 | 13 |
| Количество проб | 5 | 5 |
| Количество лабораторий после исключения выбросов | 12 | 11 |
| Количество выбросов | 1 | 2 |
| Количество принятых результатов | 70 | 64 |
| Среднее значение \overline{x} , мг/100 г | 0,279 | 0,057 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мг/100 г | 0,025 | 0,006 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 9,0 | 10,5 |
| Пределы повторяемости r (r = 2,83 x sr), мг/100 г | 0,071 | 0,016 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г | 0,047 | 0,011 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 16,8 | 19,3 |
| Пределы воспроизводимости R (R = 2,83 x sR), мг/100 г | 0,133 | 0,030 |
| Значение коэффициента Хорвитца согласно [21] | 1,2 | 1,1 |
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СИСТЕМЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Разделение и количественное определение считаются удовлетворительными, если при проведении хроматографического анализа соблюдены следующие условия [18].
Варианты условий хроматографического анализа
| Неподвижная фаза a | Размеры колонки, мм x мм | Подвижная фаза (объемные доли) | Поток, см3/мин | Обнаружение, нм | |
| Knauer polygosil® 60-5 | 250 x 4,6 | н-гексан + ди-изопропилэфир (80 + 20) | 1,5 | F: Ex:296 Em:320 | |
| Si 60 | 250 x 4,6 | н-гексан + 2-пропанол (98 + 2) | 1,5 | F: Ex:284 Em:330 | |
| Silicagel, 5 мкм | 100 x 8 | Изооктан + ди-изопропилэфир (с 0,15% пропанола) (97,5 + 2,5) | 2,0 | F: Ex:295 Em:330 | |
| LiChrospher® Si 100, 5 мкм | 250 x 4 | н-гексан + 2-пропанол (99,85 + 0,15) | 2,5 | F: Ex:290 Em:330 | |
| LiChrospher® Si 60, 5 мкм | 250 x 4,6 | н-гексан + 2-пропанол (99,3 + 0,7) | 1,2 | F: Ex:290 Em:330 | |
| LiChrospher® Si 60, 5 мкм | 250 x 4 | н-гексан + диоксан (97 + 3) | 1,0 | F: Ex:293 Em:326 | |
| LiChrospher® Si 60, 5 мкм | 250 x 4 | Градиент: от 1% 2-пропанола в н-гептане на 7 мин до 1,5% 2-пропанола в н-гептане | 1,0 | F: Ex:290 Em:327 | |
| Amino, 3 мкм | 100 x 4,6 | Изооктан + изобутанол (98 + 2) | 1,5 | F: Ex:290 Em:330 | |
| Nucleosil C18, 5 мкм | 250 x 4 | Метанол + вода (97 + 3) | 2,0 | UV: 292 | |
| RP-8, 10 мкм | 250 x 4,6 | Ацетонитрил + метанол + вода (50 + 45 + 5) | 2,0 | F: Ex:293 Em:326 UV: 290 | |
| a Перечисленные торговые марки продуктов являются примерами подходящих имеющихся в продаже продуктов. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика со стороны CEN. | |||||
| F: | флуоресцентное; | ||||
| UV: | ультрафиолетовое; | ||||
| Ex: | длина волны возбуждения; | ||||
| Em: | длина волны эмиссии. | ||||
Примечание - При проведении межлабораторных исследований для определения \alpha - \text{токоферола} в маргарине и сухом молоке были использованы колонки с обращенной фазой.
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНОГО ЕВРОПЕЙСКОГО СТАНДАРТА МЕЖГОСУДАРСТВЕННОМУ СТАНДАРТУ
| Обозначение ссылочного европейского стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
| EN ISO 3696 (ISO 3696) | IDT | ГОСТ ISO 3696-2013 «Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля (ISO 3696:1987)» <*> |
| Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта: - IDT — идентичный стандарт. | ||
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
БИБЛИОГРАФИЯ
| УДК 664:543.544.5:006.35 | МКС 07.100.30 | IDT |
| Ключевые слова: пищевая продукция, токоферол, витамин E, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии | ||