ГОСТ EN 12821-2014. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение содержания холекальциферола (витамина D3) и эргокальциферола (витамина D2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.08.2014 № 963-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 16.10.2018 № 168). Документ включен в Перечень стандартов (пункты 104 и 598), содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Документ введен в действие с 01.01.2016.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 августа 2014 г. № 963-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕКАЛЬЦИФЕРОЛА (ВИТАМИНА D3) И ЭРГОКАЛЬЦИФЕРОЛА (ВИТАМИНА D2) МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Foodstuffs. Determination of cholecalciferol (vitamin D3) and ergocalciferol (vitamin D2) content by high performance liquid chromatography
Дата введения 1 января 2016 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основе аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол 25 июня 2014 г. № 45-2014)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 августа 2014 г. № 963-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 12821-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.
5 Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 12821:2009 Foodstuffs — Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography — Measurement of cholecalciferol (D3) or ergocalciferol (D2) [Продукты пищевые. Определение витамина D высокоэффективной жидкостной хроматографией. Измерение холекальциферола (витамина D3) или эргокальциферола (витамина D2)]
Перевод с английского языка (en).
Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.
Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным европейским региональным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.
Степень соответствия — идентичная (IDT)
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина D3 (холекальциферол) или D2 (эргокальциферол) в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Витамин D3 присутствует, главным образом, в продуктах питания животного происхождения, в то время как витамин D2 — в дикорастущих грибах. Как витамин D3, так и витамин D2 могут присутствовать в витаминизированных пищевых продуктах. Настоящий стандарт не применим к пробам, содержащим одновременно как витамин D3, так и витамин D2.
Кроме исходных форм — витамина D3 и витамина D2, соответствующие метаболиты — 25-гидроксивитамин D и 1,25-дигидроксивитамин D, также обладают D-витаминной активностью. Настоящий стандарт распространяется на определение витамина D2 или витамина D3 по отдельности.
Настоящий стандарт составляет основу аналитических методов, на базе которой аналитик может разработать собственную методику в соответствии со стандартной процедурой.
Метод прошел валидацию при межлабораторных испытаниях с использованием как витаминизированных, так и невитаминизированных проб, таких как маргарин, молоко, жидкое детское питание, детское питание, растительное масло для жарения, рыбий жир в диапазоне от 0,4 до 14 мкг/100 г продукта. Подробная информация о валидации приведена в приложении D.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт:
EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Метод основан на выделении витаминов D3 и D2 из пробы путем ее омыления и экстракции витаминов подходящим растворителем с последующей очисткой экстракта с помощью полупрепаративной нормально-фазовой высокоэффективной хроматографии (далее — ВЭЖХ) и количественным определением витаминов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
При определении витамина D3 в качестве внутреннего стандарта используют витамин D2. Если определению подлежит витамин D2, то в качестве внутреннего стандарта используют витамин D3.
Витамин D детектируют спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовой области и идентифицируют пики по значениям времени удерживания и дополнительно по спектру поглощения в ультрафиолетовой области, если используется диодноматричный детектор. Количественный анализ проводят с применением внутреннего стандарта по результатам измерений значений высот или площадей пиков, см. [1] - [8].
4 Реактивы
4.1 Общие положения
Если не указано иное, то при анализе используют только реактивы гарантированной чистоты и воду, по крайней мере, степени чистоты 1 по EN ISO 3696.
4.2 Метанол.
4.3 Этанол абсолютный, объемная доля \phi(C_{2}H_{5}OH) = 100% .
4.4 Этанол, \phi(C_{2}H_{5}OH) = 96% .
4.5 Сульфат натрия, безводный.
4.6 Растворы гидроксида калия для омыления — водный раствор массовой концентрации \rho(KOH) = 50\text{г}/100\text{см}^{3} или 60 г/100 см3 или водно-этанольный раствор \rho(KOH) = 28\text{г}/100\text{см}^{3} при объемном соотношении этанола и воды 9:1.
4.7 Антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, пирогаллол, сульфид натрия (Na2S) или бутилокситолуол (BHT).
4.8 Растворители и экстрагенты, например диэтиловый эфир (не содержащий перекисей), дихлорметан, петролейный эфир, н-гексан, этилацетат или подходящая их смесь.
4.9 Подвижные фазы для ВЭЖХ
4.9.1 Варианты подвижных фаз, пригодных для нормально-фазовой полупрепаративной ВЭЖХ
Примерами подходящих подвижных фаз (состав в объемных долях) для полупрепаративной ВЭЖХ являются смеси:
- н-гексана и пропанола-2 (98 + 2), (99 + 1) или (95 + 5);
- н-гексана и изоамилового спирта (99 + 1);
- н-гексана, пропанола-2 и тетрагидрофурана (98 + 1 + 1);
- изооктана и изобутанола (99 + 1);
- н-гептана и пропанола-2 (97 + 3).
4.9.2 Варианты подвижных фаз, пригодных для обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ
Примерами подходящих подвижных фаз (состав в объемных долях) для обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ являются:
- метанол;
- смеси метанола и воды (95 + 5) или (93 + 7);
- смеси ацетонитрила и метанола (80 + 20), (90 + 10) или (70 + 30);
- смесь ацетонитрила, хлороформа и метанола (93 + 4 + 3).
4.10 Образцы сравнения
4.10.1 Образец сравнения эргокальциферола (витамин D2), M(C28H44O) = 396,7 г/моль
В качестве образца сравнения витамина D2 следует использовать препарат максимально доступной степени чистоты с массовой долей основного вещества более 98%. Образец сравнения хранят в соответствии с инструкциями поставщика (при отсутствии света, обычно при температуре ниже 4 °C).
4.10.2 Образец сравнения холекальциферола (витамин D3), M(C27H44O) = 384,6 г/моль
В качестве образца сравнения витамина D3 следует использовать препарат максимально доступной степени чистоты с массовой долей основного вещества более 98%. Образец сравнения хранят в соответствии с инструкциями поставщика (при отсутствии света, обычно при температуре ниже 4 °C).
4.11 Основные растворы
4.11.1 Основной раствор витамина D2
Взвешивают около 100 мг витамина D2 с точностью до 1 мг в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в этаноле (4.4) и доводят до метки этанолом. Массовая концентрация витамина D2 в приготовленном растворе приблизительно равна 1 мг/см3. Хранят при температуре ниже 4 °C, защищая от света.
Рассчитывают массовую концентрацию основного раствора и массовую долю витамина D2 в образце сравнения, используя способ, описанный в 4.12.1.
Срок хранения приготовленного раствора — 6 мес при температуре минус 18 °C.
4.11.2 Основной раствор витамина D3
Взвешивают около 100 мг витамина D3 с точностью до 1 мг в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в этаноле (4.4) и доводят до метки этанолом. Массовая концентрация витамина D3 в приготовленном растворе приблизительно равна 1 мг/см3. Хранят при температуре ниже 4 °C, защищая от света.
Рассчитывают массовую концентрацию основного раствора и массовую долю витамина D3 в образце сравнения, используя способ, описанный в 4.12.2.
Срок хранения приготовленного раствора — 6 мес при температуре минус 18 °C.
4.12 Стандартные растворы
4.12.1 Стандартный раствор витамина D2
1 см3 основного раствора витамина D2 (4.11.1) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки этанолом (4.4). Массовая концентрация витамина D2 в приготовленном растворе приблизительно равна 10 мкг/см3. Раствор готовят в день использования.
Примечание - Допускается использование раствора с иным значением массовой концентрации для соответствия требованиям аналитической процедуры.
Измеряют оптическую плотность стандартного раствора витамина D2 в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 265 нм относительно этанола. Рассчитывают массовую концентрацию витамина D2 \rho_{D_{2}} , мкг/см3, по формуле:
\rho_{D_{2}} = \frac{A_{265} \cdot M_{D_{2}} \cdot 1000}{\epsilon \cdot b} , (1)
где A265 — оптическая плотность стандартного раствора витамина D2 при 265 нм;
M_{D_{2}} — молярная масса витамина D2 (M_{D_{2}} = 396,7\text{г}/\text{моль}) ;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения витамина D2 ( \epsilon = 18843\text{м}^{2}/\text{моль} , вычислено из значения E_{1\text{см}}^{1\%} , см. [9]);
b — длина оптического пути кварцевой кюветы, см.
4.12.2 Стандартный раствор витамина D3
1 см3 основного раствора витамина D3 (4.11.2) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки этанолом (4.4). Массовая концентрация витамина D3 в приготовленном растворе приблизительно равна 10 мкг/см3. Раствор готовят в день использования.
Примечание - Допускается использование раствора с иным значением массовой концентрации для соответствия требованиям аналитической процедуры.
Измеряют оптическую плотность стандартного раствора витамина D3 в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 265 нм относительно этанола. Рассчитывают массовую концентрацию витамина D3 \rho_{D_{3}} , мкг/см3 по формуле:
\rho_{D_{3}} = \frac{A_{265} \cdot M_{D_{3}} \cdot 1000}{\epsilon \cdot b} , (2)
где A265 — оптическая плотность стандартного раствора витамина D3 при 265 нм;
M_{D_{3}} — молярная масса витамина D3 (M_{D_{3}} = 384,6\text{г}/\text{моль}) ;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения витамина D3 ( \epsilon = 18461\text{м}^{2}/\text{моль} , вычислено из значения E_{1\text{см}}^{1\%} , см. [9]);
b — длина оптического пути кварцевой кюветы, см.
4.13 Растворы внутренних стандартов
4.13.1 Раствор внутреннего стандарта витамина D2
10 см3 стандартного раствора витамина D2 (4.12.1) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки этанолом (4.4). Массовая концентрация витамина D2 в приготовленном растворе приблизительно равна 10 мкг/см3. Раствор готовят в день использования.
4.13.2 Раствор внутреннего стандарта витамина D3
10 см3 стандартного раствора витамина D3 (4.12.2) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки этанолом (4.4). Массовая концентрация витамина D3 в приготовленном растворе приблизительно равна 10 мкг/см3. Раствор готовят в день использования.
Примечание - Если определению подлежит витамин D3, то витамин D2 используется в качестве внутреннего стандарта. Если определению подлежит витамин D2, то в качестве внутреннего стандарта используется витамин D3.
4.14 Стандартный раствор смеси витаминов D2 и D3 для полупрепаративной хроматографии
5 см3 стандартного раствора витамина D2 (4.12.1) и 5 см3 стандартного раствора витамина D3 (4.12.2) переносят пипетками в колбу ротационного испарителя и осторожно удаляют растворитель при температуре не выше 40 °C. Остаток растворяют в 100 см3 подвижной фазы для полупрепаративной ВЭЖХ (4.9.1).
Допускается использование стандартного раствора с иным значением массовой концентрации для соответствия используемой системе для ВЭЖХ (5.4 или 5.5).
4.15 Стандартный раствор смеси витаминов D2 и D3 для аналитической хроматографии
5 см3 стандартного раствора витамина D2 (4.12.1) и 5 см3 стандартного раствора витамина D3 (4.12.2) переносят пипетками в колбу ротационного испарителя и осторожно удаляют растворитель при температуре не выше 40 °C). Остаток растворяют в 100 см3 подвижной фазы для аналитической ВЭЖХ (4.9.2).
5 Аппаратура
5.1 Общие положения
При проведении испытания используют общеупотребительное лабораторное оборудование, в частности, следующее.
5.2 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности при длине волны 265 нм.
5.3 Ротационный испаритель, в комплекте с водяной баней и устройством для создания вакуума.
Примечание - Для сброса вакуума рекомендуется использовать азот.
5.4 Система для полупрепаративной ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, УФ-детектора, устройства для сбора заданной фракции элюента и самописца или интегратора.
5.5 Система для аналитической ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, УФ-детектора, самописца или интегратора, либо аналогичной системы для сбора данных.
5.6 Колонки для ВЭЖХ
5.6.1 Колонка полупрепаративная длиной от 250 до 300 мм, внутренним диаметром от 4,0 до 8,0 мм, заполненная сорбентом для нормально-фазовой хроматографии, например силикагелем или силикагелем с привитыми циано- и аминогруппами с размером частиц 5 мкм. Дополнительная информация приведена в приложении A.
5.6.2 Колонка аналитическая длиной 250 мм, диаметром от 4,0 до 4,6 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например с привитыми октадецильными (C18) группами, размером частиц 5 мкм. Дополнительная информация приведена в приложении A.
5.6.3 Альтернативные аналитические колонки
Колонки других размеров, заполненных сорбентом с иным размером частиц, могут также быть использованы в соответствии с настоящим стандартом, если установлено, что они обеспечивают удовлетворительное отделение витамина D от мешающих компонентов матрицы.
5.7 Устройство для фильтрования, пригодное для установки фильтров как большого, так и малого размера для фильтрования подвижной фазы и растворов проб, например с диаметром пор 0,45 мкм.
Примечание - Как правило, фильтрование подвижной фазы и растворов проб через мембранный фильтр перед применением или инжектированием продлевает срок службы колонок.
6 Проведение испытаний
6.1 Общие положения
Витамины D2 и D3 неустойчивы к воздействию ультрафиолетового излучения и окислителей (например, атмосферного кислорода), поэтому при работе с ними необходимо исключить ультрафиолетовое излучение путем применения посуды из темного стекла, алюминиевой фольги или материалов, поглощающих ультрафиолетовое излучение. Растворы, содержащие экстрагированный витамин, следует продувать азотом и необходимо добавлять в них антиоксиданты. Растворители следует выпаривать при пониженном давлении на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C.
6.2 Подготовка пробы для испытаний
Испытуемую пробу гомогенизируют. Грубые материалы размалывают в подходящей мельнице и тщательно перемешивают. Следует принять меры, такие как предварительное охлаждение пробы, для устранения влияния повышения температуры при этой процедуре. К анализу подготовленной для испытаний пробы приступают без промедления и защищают ее от воздействия света.
6.3 Приготовление раствора пробы
6.3.1 Омыление
Подготовленную для испытаний пробу массой от 10 до 30 г омыляют в колбе с обратным холодильником, предпочтительно в атмосфере азота, добавляя при этом необходимое количество этанола (4.4), воды, антиоксиданта (4.7), такого как аскорбиновая кислота (АК), гидрохинон, пирогаллол или BHT, и одного из растворов гидроксида калия (4.6). Можно также добавить сульфид натрия (4.7) для снижения каталитического эффекта следов металлов.
При определении витамина D3 в колбу для омыления добавляют подходящий объем раствора внутреннего стандарта витамина D2 (4.13.1). Количество добавляемого витамина D2 должно соответствовать ожидаемому содержанию витамина D3 в пробе. Если определению подлежит витамин D2, то добавляют подходящий объем раствора внутреннего стандарта витамина D3 (4.13.2).
Проводят также испытание пробы без добавления внутреннего стандарта для проверки отсутствия помех со стороны компонентов матрицы, время удерживания пиков которых близко к времени удерживания пика внутреннего стандарта.
В таблице 1 приведены примеры подходящих количеств реактивов.
Примеры количеств добавляемых реагентов
Обычно время омыления составляет от 20 до 45 мин при температуре от 70 °C до 100 °C. Омыление можно также провести при комнатной температуре в течение ночи (примерно 16 ч) при остальных аналогичных условиях.
Если по окончании омыления на поверхности охлажденной реакционной смеси присутствует жир или масло, то омыление продолжают после добавления дополнительного количества водно-этанольного раствора гидроксида калия.
Примечание — Условия, пригодные для омыления маргарина и сухого молока, приведены в приложении B.
6.3.2 Экстракция
Для предотвращения образования эмульсии при последующей экстракции раствор пробы после омыления разбавляют водой до достижения объемного соотношения этанола и воды 1:1.
Экстрагируют витамины D2 и D3 из омыленной охлажденной пробы подходящим растворителем или смесью растворителей (4.8). Процедуру экстракции проводят от двух до четырех раз, используя порции экстрагента объемом от 100 до 200 см3. Объединенные экстракты промывают водой до нейтральной реакции (как правило, пять раз объемами от 50 до 100 см3).
Примечание — В некоторых методах предусмотрена промывка экстракта до нейтральной реакции среды раствором гидроксида калия массовой доли от 3% до 5% в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, буферированном раствором ацетата натрия (pH = 7) молярной концентрации 2,6 моль/дм3 или аналогичными смесями. Условия, пригодные для омыления маргарина и сухого молока, приведены в приложении B.
6.3.3 Концентрирование экстракта
Экстракт упаривают при пониженном давлении и температуре не выше 40 °C в ротационном испарителе (5.3). Рекомендуется добавление антиоксиданта в экстракт пробы перед упариванием, например 2 см3 раствора BHT в н-гексане массовой концентрации 1 мг/см3.
Предварительно остающиеся следы воды удаляют путем осушения безводным сульфатом натрия (4.5) или азеотропной перегонкой с абсолютным этанолом (4.3).
На данной стадии анализа для устранения возможных мешающих влияний матрицы пробы допускается использовать дополнительную очистку экстракта. В этом случае должна быть проведена полная валидация аналитической процедуры.
Примечание — В приложении E дано краткое описание трех различных способов дополнительной очистки. Всегда имеет смысл объединить дополнительную очистку с использованием колоночной хроматографии (E.2) и твердофазной экстракции (E.3); она оказывается полезной для продуктов питания, например маргарина и растительного масла. Очистка с применением тонкослойной препаративной хроматографии (E.1) предпочтительнее в случае кормов и добавок, типа таблеток и капсул. Для добавок ее при необходимости можно объединить с твердофазной экстракцией (E.3).
6.3.4 Приготовление раствора пробы для полупрепаративной хроматографии
Остаток растворяют в небольшом известном объеме растворителя, совместимого с подвижной фазой для полупрепаративной ВЭЖХ. Для удаления следов воды в полученный раствор добавляют небольшое количество безводного сульфата натрия
6.4 Градуировка хроматографических систем
Градуировку полупрепаративной (5.6.1) и аналитической (5.6.2) систем и оценку пригодности условий хроматографического разделения и анализа (см. 6.5) проводят с помощью стандартных растворов витаминов D2 (4.12.1) и D3 (4.12.2).
6.5 Оценка пригодности условий хроматографического разделения и анализа
Подбор условий элюирования в полупрепаративной ВЭЖХ-системе (5.6.1) проводят путем анализа в этой системе стандартного раствора смеси витаминов D2 и D3 для полупрепаративной хроматографии (4.14), добиваясь при этом элюирования витамина D одним пиком со стабильным временем удерживания при повторных вводах. Соблюдение этого условия необходимо для обеспечения возможности точного отбора фракции элюата, содержащей витамин D, при очистке экстракта пробы.
Условия для полупрепаративной ВЭЖХ должны быть подобраны таким образом, чтобы достигалось оптимальное отделение витамина D от токоферолов и других мешающих компонентов матрицы пробы. Примеры хроматограмм см. в приложении C.
Подбор условий хроматографического разделения в аналитической ВЭЖХ-системе проводят путем анализа в этой системе стандартного раствора смеси витаминов D2 и D3 для аналитической хроматографии (4.15), добиваясь при этом 98%-ного разделения пиков витаминов D2 и D3 (т.е. коэффициент разрешения пиков должен быть более 1,0), а также отделение их пиков от всех мешающих компонентов матрицы пробы.
6.6 Анализ пробы
6.6.1 Полупрепаративная ВЭЖХ
Инжектируют аликвотную часть сконцентрированного экстракта пробы в полупрепаративную ВЭЖХ-систему (5.6.1) и собирают фракцию, содержащую витамин D. Временное окно сбора фракции должно быть предварительно установлено с использованием смешанного стандартного раствора смеси витаминов D2 и D3 для полупрепаративной хроматографии D (6.5). Окно должно быть достаточно широким для полного сбора витамина D, но в то же время достаточно узким для исключения попадания токоферолов или других мешающих соединений.
Типичная полупрепаративная хроматограмма приведена в приложении C.
6.6.2 Аналитическая ВЭЖХ
Упаривают отобранную методом полупрепаративной хроматографии фракцию досуха и остаток растворяют в растворителе, совместимом с подвижной фазой для аналитической хроматографии.
Инжектируют аликвоту полученного раствора в аналитическую ВЭЖХ-систему и идентифицируют пики витаминов D2 и D3 (6.6.3). Необходимо, чтобы было достигнуто отделение пиков витаминов D2 и D3 от пиков мешающих матричных компонентов
Типичная аналитическая хроматограмма приведена в приложении C.
6.6.3 Идентификация
Пики витаминов D2 и D3 на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению значений времени удерживания со значениями времени удерживания пиков витаминов D2 и D3 на хроматограммах стандартных растворов при одинаковых хроматографических условиях (6.5). Использование диодноматричного детектора позволяет детально рассмотреть спектр пика витамина D в ультрафиолетовой области и оценить чистоту пика. Повторная регистрация хроматограммы пробы с использованием различных длин волн детектирования может быть также использована для оценки чистоты пика и подтверждения его идентификации.
6.6.4 Число определений
Следует провести по меньшей мере два независимых определения.
6.7 Расчет градуировочного коэффициента по методу внутреннего стандарта
Рассчитывают градуировочный коэффициент (Rf) для витамина D3 при применении в качестве внутреннего стандарта витамина D2 по формуле (3), используя стандартные растворы известной концентрации (4.13):
R_{f} = \frac{A_{STD_{3}} \cdot \rho_{STD_{2}}}{A_{STD_{2}} \cdot \rho_{STD_{3}}} (3)
где A_{STD_{3}} — площадь или высота пика витамина D3 в стандартном растворе;
A_{STD_{2}} — площадь или высота пика витамина D2 в стандартном растворе;
\rho_{STD_{2}} — массовая концентрация витамина D2 в стандартном растворе, мкг/см3;
\rho_{STD_{3}} — массовая концентрация витамина D3 в стандартном растворе, мкг/см3.
7 Обработка результатов
Массовую долю витамина D3 w_{D_{3}} , мкг/100 г пробы, вычисляют по формуле:
W_{D_{3}} = \frac{A_{SD_{3}} \cdot I_{s} \cdot 100}{A_{SD_{2}} \cdot R_{f} \cdot m} , (4)
где Is — масса внутреннего стандарта витамина D2 в испытуемой порции, мкг;
m — масса пробы, отобранной для омыления, г;
Rf — градуировочный коэффициент [см. формулу (3)];
A_{SD_{3}} — площадь или высота пика витамина D3 в растворе пробы;
A_{SD_{2}} — площадь или высота пика витамина D2 в растворе пробы.
8 Прецизионность
8.1 Общие положения
Данные по прецизионности различных ВЭЖХ методов определения витамина D3 были установлены в 1994 году в ходе международных межлабораторных сравнительных испытаний, организованных в рамках Программы стандартных измерений и тестирования Европейской комиссии на образцах маргарина (сертифицированный стандартный образец CRM 122) и сухого молока (CRM 421). Испытания привели к получению статистических результатов, представленных в приложении D.
Данные по прецизионности для овсяной крупы и сухого молока были установлены при межлабораторных испытаниях в соответствии с методом, использующим расчеты на основе ИСО 5725:1986 (см. приложение D).
Данные по прецизионности для молока, жидкого детского питания, растительного масла для жарения, маргарина, детского питания и рыбьего жира были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с Руководством АОАС по процедурам совместных исследований, проведенных с целью валидации характеристик метода анализа (см. приложение D).
Результаты, полученные при этих сравнительных испытаниях, могут быть не применимы к другим диапазонам содержаний аналита и иным матрицам по сравнению с приведенными в приложении D.
8.2 Повторяемость
Абсолютная разность между двумя единичными результатами испытаний, полученными одним исполнителем на идентичном исследуемом материале на одном и том же оборудовании в течение возможно короткого промежутка времени, может превышать предел повторяемости r не чаще, чем в 5% случаев. Значения приведены ниже:
8.3 Воспроизводимость
Абсолютная разность между двумя единичными результатами, полученными в двух лабораториях на идентичном исследуемом материале, может превышать предел воспроизводимости R не чаще чем в 5% случаев. Значения приведены ниже:
9 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен содержать, по меньшей мере, следующие сведения:
a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;
b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;
c) результаты испытаний с указанием единиц измерений, в которых выражен результат испытаний;
d) дату и способ отбора проб (если он известен);
g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытаний;
h) любые применявшиеся операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытаний.
ПРИМЕРЫ ВЭЖХ-СИСТЕМ И УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Примеры полупрепаративных ВЭЖХ-систем, использованных для очистки раствора пробы участниками сертификационных исследований для витамина D (EU MAT) [8]
Примеры аналитических ВЭЖХ-систем, использованных для определения витамина D в растворах испытуемых проб участниками сертификационных исследований [8]
ПРИМЕРЫ УСЛОВИЙ ЭКСТРАКЦИИ И ОМЫЛЕНИЯ
В таблице B.1 приведены примеры условий экстракции и омыления, использованные при определении витамина D участниками сертификационных исследований EU MAT [8]. Масса проб условно представлена как масса жира (содержание жира в маргарине 82%, в сухом молоке — 27%).
| Омыление | Экстракция |
| 16 г жира + 150 см3 этанола + 1 г пирогаллола + (75 см3 воды + 30 г KOH a) + продувка азотом; 70 °C, 30 мин | PE b + DEE c (9:1) 2 x 100 см3; промывание водой 5 x 100 см3 |
| 8 г жира + 100 см3 этанола + 1 г аскорбата натрия + 0,04 г сульфида натрия + 12 г KOH + 50 см3 воды + продувка азотом; 80 °C, 30 мин | н-гексан 3 x 100 см3 и 3 x 50 см3; промывание водой 4 x 100 см3 |
| 8 г жира + 35 см3 этанола + 2 г аскорбата натрия + 10 г KOH + 50 см3 воды; 100 °C, 45 мин | н-гексан 1 x 100 см3; промывание 5% KOH 1 x 100 см3, промывание 30% этанола в 9%-ном растворе хлорида натрия 1 x 100 см3; промывание 0,9%-ным раствором хлорида натрия 1 x 100 см3 |
| 12 г жира + 30 см3 этанола + 30 см3 метанола + 0,1 г аскорбиновой кислоты + 30 см3 50% KOH + продувка азотом; 100 °C, 30 мин | DEE 2 x 100 см3; промывание водой 4 x 50 см3 |
| 6 г жира + 100 см3 этанола + 1 г аскорбиновой кислоты + 50 см3 50% KOH + продувка азотом; 20 °C, 20 ч | PE + DEE (1:1) 2 x 200 см3; промывание водой 6 x 50 см3 |
| 8 г жира + 1 г пирогаллола + 150 см3 28% KOH в смеси этанола и воды (9:1) + продувка азотом; кипячение с обратным холодильником 100 °C, 30 мин | DEE + PE (1:1) 2 x 500 см3; промывание водой 5 x 150 см3 |
| 24 г жира + 90 см3 этанола + 0,5 г аскорбата натрия + 30 см3 60% KOH + продувка азотом; 100 °C, 45 мин, обратный холодильник | DEE 1 x 150 см3, 3 x 75 см3; промывание водой 5 x 200 см3 |
| a KOH — гидроксид калия b PE — петролейный эфир c DEE — диэтиловый эфир | |
ПРИМЕРЫ ПОЛУПРЕПАРАТИВНЫХ И АНАЛИТИЧЕСКИХ ХРОМАТОГРАММ
Y — сигнал (условные единицы);
Рисунок C.1 — Типичная хроматограмма для нормально-фазовой полупрепаративной ВЭЖХ омыленного и обработанного методом жидкостно-жидкостной экстракции сухого молока (CRM 421) и стандарта витамина D (витамин D2 и D3)
Y — сигнал (условные единицы);
Рисунок C.2 — Типичная обращенно-фазовая хроматограмма фракции экстракта сухого молока (CRM 421), выделенная на стадии полупрепаративной хроматографии между 11,5 и 12,5 мин (см. рисунок C.1)
Значения, приведенные в таблице D.1 для маргарина (CRM 122) и сухого молока (CRM 421), были получены при межлабораторных испытаниях [8] в соответствии с Руководством EU MAT по сертификационным испытаниям. Испытания были организованы в Соединенном Королевстве Великобритании и Северной Ирландии (Laboratory of Government Chemist).
Значения, приведенные в таблице D.2 для молока, жидкого детского питания, растительного масла для жарения, маргарина, детского питания и рыбьего жира, были получены при межлабораторных испытаниях в соответствии с Руководством АОАС по процедурам совместных исследований, проведенных с целью валидации метода анализа [13]. Испытания были организованы Комитетом северных стран по пищевому анализу [11]. Использованный метод включал омыление, экстракцию, концентрирование, препаративную и аналитическую ВЭЖХ.
Данные по прецизионности для маргарина и сухого молока
| Проба | 1 | 2 |
| Год проведения испытаний | 1994 | 1994 |
| Число лабораторий | 11 | 11 |
| Число образцов | 5 | 5 |
| Число лабораторий после исключения выбросов | 11 | 11 |
| Число исключенных лабораторий | 0 | 0 |
| Число принятых результатов | 48 | 47 |
| Общее среднее \overline{x} , мкг/100 г | 12,30 | 14,30 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/100 г | 0,82 | 0,74 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 6,7 | 5,2 |
| Предел повторяемости r (r = 2,8 sr), мкг/100 г | 2,32 | 2,09 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/100 г | 0,94 | 0,78 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 7,6 | 5,5 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,8 sR), мкг/100 г | 2,66 | 2,21 |
| Индекс воспроизводимости Горвица R (Horrat R index) | 0,3 | 0,3 |
| 1 Маргарин, витаминизированный витамином D3 (CRM 122). 2 Сухое молоко, сублимированное из цельного молока, витаминизированного витамином D3 (CRM 421). | ||
Данные по прецизионности молока, жидкого детского питания, растительного масла для жарения, маргарина, детского питания и рыбьего жира
| Образец | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Год проведения испытаний | 1997 | 1997 | 1997 | 1997 | 1997 | 1997 |
| Число лабораторий | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| Число образцов | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| Число лабораторий после исключения выбросов | 7 | 8 | 8 | 7 | 7 | 8 |
| Число исключенных лабораторий | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| Число принятых результатов | 14 | 16 | 16 | 14 | 14 | 16 |
| Общее среднее \overline{x} , мкг/100 г | 0,418 | 1,38 | 4,61 | 8,39 | 10,1 | 11,6 |
| Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/100 г | 0,019 | 0,08 | 0,34 | 0,54 | 0,2 | 0,3 |
| Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr, % | 4,6 | 5,9 | 7,4 | 6,5 | 2,4 | 2,2 |
| Предел повторяемости r (r = 2,8 sr), мкг/100 г | 0,054 | 0,23 | 0,96 | 1,52 | 0,7 | 0,7 |
| Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мкг/100 г | 0,038 | 0,17 | 1,11 | 0,57 | 0,7 | 2,1 |
| Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDR, % | 9,1 | 12,1 | 24,1 | 6,8 | 7,1 | 17,7 |
| Предел воспроизводимости R (R = 2,8 sR), мкг/100 г | 0,106 | 0,47 | 3,11 | 1,60 | 2,0 | 5,8 |
| Полнота обнаружения, % | - | - | 102 | - | 93,9 | 92,9 |
| Индекс воспроизводимости Горвица R a (Horrat R index) | 0,4 | 0,6 | 1,1 | 0,3 | 0,3 | 0,8 |
| 1 Низколактозное ультрапастеризованное (UHT) молоко, невитаминизированное. 2 Готовое к употреблению жидкое детское питание (кашка), заявленное содержание витамина D3 (этикетка) 1,3 м кг/100 г. 3 Растительное масло для жарения с добавкой витамина D3 для сличительных испытаний. 4 Маргарин с добавкой витамина D3 для сличительных испытаний. 5 Сухое детское питание с добавкой витамина D3 для сличительных испытаний. 6 Рыбий жир с добавкой витамина D3 для сличительных испытаний. -------------------------------- a Эти значения отличаются от значений, приведенных в [[10]](#p100670), поскольку значение индекса Горвица установлено равным 22% для средних значений, меньших 120 млрд-1 согласно [[12]](#p100674). | ||||||
СТАДИЯ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ОЧИСТКИ ЭКСТРАКТА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ВИТАМИНА D С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРЕПАРАТИВНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ, КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И ТВЕРДОФАЗНОЙ ЭКСТРАКЦИИ
E.1 Стадия дополнительной очистки экстракта при определении витамина D с использованием препаративной тонкослойной хроматографии
Схематически представленная процедура для тонкослойной хроматографии (далее — ТСХ) широко использовалась для очистки экстрактов витамина D до введения препаративной ВЭЖХ. Она была валидирована для кормов, таких как корм для поросят с содержанием 50 мкг/кг витамина D.
- зона, содержащая витамин D, может быть может быть легко визуализирована ультрафиолетовым излучением. В зависимости от матрицы пробы ширина зоны, содержащей витамины D2/D3, снимаемой с пластины может быть различной по выбору аналитика. Тем самым влияние матрицы может быть минимизировано;
- при использовании многократного проявления пластин для ТСХ отделение зоны D2/D3 от зоны матричных компонентов может быть улучшено.
Недостатком этого способа является то, что он не может быть автоматизирован. Дополнительная информация дана в [11].
Аликвоту экстракта, полученного после омыления очищают с помощью препаративной ТСХ. Зону, содержащую витамины D2/D3, соскребают с пластины, переносят в небольшую колонку и экстрагируют витамины D2/D3. Объем этого экстракта уменьшают упариванием перед применением аналитической ВЭЖХ.
E.1.3.1 Пластины для ТСХ, например Silica gel 60 F 254, Merck 5715 <1>, 0,25 мм, 20 x 20 см.
<1> Silica gel 60 F 254, Merck 5715 является примером коммерчески доступных продуктов. Эта информация приведена для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанных продуктов со стороны CEN.
E.1.3.2 Бутилгидрокситолуол (BHT).
E.1.3.7 Растворитель для проявления ТСХ-пластин: смесь 88 см3 н-гексана, 2 см3 метанола, 10 см3 ацетона и 10 мг BHT.
E.1.3.8 Растворитель для элюирования выделенной зоны витаминов D2/D3: смесь 60 см3 диэтилового эфира и 40 см3 н-гексана.
E.1.3.9 Стандартный раствор витамина D3, 250 мкг/см3 в метаноле.
E.1.4.1 Камера для ТСХ для пластин размером 20 x 20 см.
E.1.4.2 Шприц вместимостью 1 см3 стеклянный или подходящее устройство для нанесения пятен для ТСХ.
E.1.4.3 Ультрафиолетовая лампа, 254 нм.
E.1.4.4 Открытая цилиндрическая стеклянная колонка, диаметром 1 см, длиной приблизительно 15 см с краном из политетрафторэтилена.
E.1.4.5 Небольшой шпатель с острыми краями.
Проявительную камеру для ТСХ заполняют растворителем (E.1.3.7) и оставляют на 2 ч для насыщения.
Упаривают досуха при пониженном давлении подходящую аликвоту экстракта, полученного после омыления, и немедленно растворяют остаток в 2 см3 н-гексана. 1 см3 этого раствора наносят на пластину для ТСХ (E.1.3.1) в виде большого числа порций таким образом, чтобы образовалась зона длиной 10 см и шириной не более 1 см. Для локализации и идентификации зоны, содержащей аналит, наносят от 5 до 10 мкл стандартного раствора витамина D3 (E.1.3.9) по обеим сторонам зоны.
Пластину проявляют два раза почти до самого верха. Для улучшения разделения может быть полезно многократное проявление пластины. Перед началом нового разделения пластину высушивают в токе азота. Визуализируют зону витаминов D2/D3 в ультрафиолетовом свете (E.1.4.3) и отмечают ее карандашом (от 0,5 до 1,5 см). Соскабливают эту зону при помощи шпателя (E.1.4.5) на лист бумаги и переносят в открытую цилиндрическую колонку (E.1.4.4), предварительно заполненную 10 см3 растворителя (E.1.3.8). Элюируют витамин D2/D3 пятью порциями по 10 см растворителя (E.1.3.8). Упаривают объединенные элюаты досуха при пониженном давлении и немедленно растворяют в 1 см3 растворителя для ВЭЖХ (раствор пробы).
E.2 Стадия дополнительной очистки с использованием колоночной хроматографии
Очистка проводится на колонке, заполненной целитом с нанесенным на него полиэтиленгликолем в качестве стационарной фазы. Недостатком этого способа является то, что он не может быть автоматизирован.
E.2.2.1 Петролейный эфир, кипящий в диапазоне от 40 °C до 60 °C, перегнанный.
E.2.2.2 Петролейный эфир, кипящий в диапазоне от 60 °C до 70 °C, перегнанный.
E.2.2.3 Диатомитовая земля, щелочная кальцинированная (CAS 68855-54-9).
E.2.2.5 Полиэтиленгликоль 600.
E.2.3.1 Ротационный испаритель, с водяной баней при 40 °C.
E.2.3.2 Взрывобезопасный высокоскоростной блендер.
E.2.3.3 Хроматографические колонки, длиной 30 см, внутреннего диаметра 2,5 см, снабженные внизу краном с вставкой из полифторэтилена и длиной 10 см, внутреннего диаметра 1,4 см, сужающаяся книзу и имеющая наверху резервуар вместимостью 100 см3.
E.2.3.4 Ультрафиолетовая лампа, 254 нм.
В блендере создают суспензию 25 г диатомитовой земли (E.2.2.3) и 200 см3 петролейного эфира (E.2.2.2). Во время перемешивания быстро добавляют 15 см3 полиэтиленгликоля (E.2.2.5) и продолжают перемешивание в течение 20 с.
Суспензия может быть создана альтернативным способом, обеспечивающим распределение полиэтиленгликоля на поверхности носителя. В хроматографическую колонку (E.2.3.3) вносят небольшую порцию петролейного эфира (E.2.2.2), помещают на дно пробку из стекловаты, из которой удален воздух, и покрывают его слоем толщиной 1 см сульфата натрия. Переносят суспензию в колонку и уплотняют содержимое колонки при помощи поршня до получения слоя высотой 15 см. При этом из колонки вытекает избыток петролейного эфира. Сверху помещают слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см.
E.2.4.2 Ввод раствора пробы, элюирование и сбор элюата
Экстракт <1> переносят из круглодонной колбы и ополаскивают колбу тремя порциями приблизительно по 3 см3 петролейного эфира (E.2.2.2), которые также переносят на колонку. Элюируют петролейным эфиром (E.2.2.2). Отбрасывают первые 30 см3 элюата. Собирают последующие 50 см3 элюата или же до того момента, пока зона ретинола не достигнет нижней границы слоя сорбента. Это можно увидеть при помощи длинноволновой ультрафиолетовой лампы (E.2.3.4). Элюат упаривают досуха в ротационном испарителе (E.2.3.1) и добавляют от 2 до 3 см3 петролейного эфира (E.2.2.1 или E.2.2.2). Затем продолжают очистку методом твердофазной экстракции (см. E.3).
<1> Данная формулировка использована для обеспечения аутентичности перевода текста стандарта EN 12821:2009 на русский язык. При применении межгосударственного стандарта используют экстракт, полученный по 6.3.3.
E.3 Стадия дополнительной очистки с использованием твердофазной экстракции
Этот раздел описывает способ очистки с использованием твердофазной экстракции на силикагеле. Недостатком этого способа является то, что он не может быть автоматизирован.
E.3.2.2 Диэтиловый эфир. Перекиси удаляют каждый день перед использованием путем перегонки над твердым гидроксидом калия.
E.3.2.3 Петролейный эфир, кипящий в диапазоне от 40 °C до 60 °C, перегнанный.
E.3.3.1 Картриджи для твердофазной экстракции, содержащие приблизительно 700 мг силикагеля.
E.3.3.2 Конические колбы вместимостью 50 см3 с нормальным шлифом 29.
Упаривают элюат (см. E.2.4.2) и растворяют остаток в 10 см3 н-гептана (E.3.2.1). Активируют картридж, пропуская через него 10 см3 н-гептана. Вводят полученный раствор в картридж и дают ему пройти через него. Промывают картридж 10 см3 6%-ного раствора диэтилового эфира (E.3.2.2) в н-гептане и элюируют 20 см3 20%-ного раствора диэтилового эфира (E.3.2.2) в н-гептане. Собирают элюат в коническую колбу (E.3.3.2), упаривают и растворяют в 1 — 2 см3 петролейного эфира (E.3.2.3). Продолжают очистку методом ТСХ или полупрепаративной ВЭЖХ.
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫХ СТАНДАРТОВ ССЫЛОЧНЫМ ЕВРОПЕЙСКИМ РЕГИОНАЛЬНЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение и наименование ссылочного европейского регионального стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование межгосударственного стандарта |
| EN ISO 3696 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний | - | <*> |
| <*> Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного европейского регионального стандарта. Перевод данного европейского регионального стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов. | ||