ГОСТ 34960-2023. Межгосударственный стандарт. Качество воды. Обнаружение и подсчет кишечных энтерококков. Миниатюризированный метод (наиболее вероятное число) для поверхностных и сточных вод
(введен в действие Приказом Росстандарта от 26.11.2025 № 1516-ст)
Примечание
Документ вводится в действие с 30.11.2026 с правом досрочного применения.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 ноября 2025 г. № 1516-ст
КАЧЕСТВО ВОДЫ. ОБНАРУЖЕНИЕ И ПОДСЧЕТ КИШЕЧНЫХ ЭНТЕРОКОККОВ
МИНИАТЮРИЗИРОВАННЫЙ МЕТОД (НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОЕ ЧИСЛО) ДЛЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ И СТОЧНЫХ ВОД
Water quality. Detection and enumeration of intestinal enterococci. Miniaturized method (most probable number) for surface and waste water
Дата введения 30 ноября 2026 года с правом досрочного применения
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Республиканским государственным предприятием на праве хозяйственного ведения «Казахстанский институт стандартизации и метрологии»
2 ВНЕСЕН Комитетом технического регулирования и метрологии Министерства торговли и интеграции Республики Казахстан
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 31 мая 2023 г. № 162-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 ноября 2025 г. № 1516-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34960-2023 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 30 ноября 2026 г. с правом досрочного применения
5 Настоящий стандарт разработан на основе применения национального стандарта Республики Казахстан СТ РК 1884-1-2009 «Обнаружение и подсчет кишечных энтерококков. Часть 1. Миниатюризированный метод (наиболее вероятное число) путем инокуляции в жидкой среде»
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает миниатюризированный метод обнаружения и подсчета кишечных энтерококков в сточных и поверхностных водах посредством инокуляции в жидкой среде. Данный метод применим ко всем типам поверхностных и сточных вод, особенно богатых взвешенными веществами.
Настоящий стандарт распространяется на воду с высоким содержанием взвешенных веществ и не применяется для исследования питьевой воды.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 13646 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия
ГОСТ 20289 Реактивы. Диметилформамид. Технические условия
ГОСТ 24104 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ ИСО 5725-1 <1> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».
ГОСТ ИСО 5725-2 <2> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
ГОСТ ISO/IEC 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Сущность метода заключается в обнаружении энтерококков с помощью УФ-камеры после инкубационного периода в титрационном микропланшете, содержащем обезвоженную питательную среду.
4 Аппаратура, материалы и реактивы
4.1 Автоклав электрический (стерилизатор паровой) с рабочим давлением пара не более 0,22 МПа.
4.2 Термостат электрический для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором (44 +/- 0,5) °C.
4.3 Сушильный шкаф с ламинарным потоком воздуха.
4.4 УФ-камера (лампа с длиной волны 366 нм).
4.5 pH-метр в режиме измерения активности от (-1) до (+19,99) единиц pH.
4.6 Пробирки цилиндрические диаметром 16 мм и высотой 160 мм или диаметром 20 мм и высотой 200 мм по ГОСТ 25336.
4.7 Дозаторы восьмиканальные с пределом допускаемой относительной погрешности +/- 3%.
4.8 Стерильные наконечники для дозаторов.
4.9 Аппарат для фильтрации с мембранными фильтрами с размером пор 0,2 мкм.
4.10 Стерильные титрационные микропланшеты.
4.11 Стерильные липкие ленты.
4.12 Чашки бактериологические (Петри).
4.13 Магнитная мешалка.
4.14 Электрическая плита.
4.15 Весы лабораторные специального назначения по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой погрешности взвешивания +/- 0,01 г.
4.16 Таймер лабораторный с точностью хода +/- 1 с.
4.17 Термометр по ГОСТ 13646.
4.18 Дистиллированная вода по ГОСТ 6709.
4.19 Бромофенол.
4.20 Этанол по ГОСТ 5962.
4.21 Триптоза.
4.22 Гидрокарбонат натрия.
4.23 Галактоза.
4.24 Полиоксиэтиленсорбитан (Tween 80).
4.25 Гидрокарбонат натрия.
4.26 Налидиксовая кислота.
4.27 N,N-диметилформамид по ГОСТ 20289.
4.28 Ацетат таллия.
4.29 4-метилзонтичный-p-D-глюкозид.
4.30 Гидроксида натрия по ГОСТ 4328, ч.д.а., раствор концентрацией 0,1 моль/дм3.
4.31 Соляная кислота по ГОСТ 3118, ч.д.а., раствор концентрацией 0,1 моль/дм3.
5 Отбор и хранение проб
Отбор, хранение и подготовка проб осуществляются в соответствии с [1], [2].
6 Питательная среда и растворители
6.1 Приготовление физиологического раствора для разбавления
В 1000 см дистиллированной воды растворяют 22,5 г натрия хлорида и приливают 10,0 см3 раствора бромфенолового голубого. Раствор стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 3) °C в течение 20 мин. Раствор бромфенолового голубого готовят добавлением 0,04 г в 100 см3 50%-этанола.
6.2 Дистиллированная вода для разбавления
Дистиллированную воду стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 3) °C в течение 20 мин.
6.3 Питательная среда готовится перед использованием.
6.3.1 Подготовка растворов
6.3.1.1 Раствор А
В 900 см3 дистиллированной воды (30 +/- 3) °C помещают 40 г триптозы, 10 г гидрокарбоната натрия, 2 г галактозы и 1,5 см3 полиоксиэтиленсорбитан моноолеата (Tween 80).
Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки, кипятят на электрической плите до полного растворения веществ и охлаждают до (20 +/- 1) °C.
6.3.1.2 Раствор Б
В 50 см3 дистиллированной воды температурой от 60 °C до 70 °C помещают 4 г гидрокарбоната натрия и 0,25 г налидиксовой кислоты.
Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки и охлаждают до (20 +/- 1) °C.
6.3.1.3 Раствор В
В 50 см3 дистиллированной воды с температурой от 60 °C до 70 °C помещают 2 г ацетата таллия и 0,1 г 4-метилзонтичного-p-D-глюкозида.
Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки и охлаждают до (20 +/- 1) °C.
6.3.1.4 Раствор Г
В 2 см3 N,N-диметилформамида помещают 0,15 г 4-метилзонтичного-p-D-глюкозида.
6.3.2 Подготовленные растворы А, Б, В, Г смешивают и регулируют pH (7,5 +/- 0,2) раствором гидроксида натрия или соляной кислотой. Полученный объем питательной среды стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм и распределяют в 96-луночный титровальный микропланшет по 100 мкл в каждую лунку. Микропланшет помещают в сушильный шкаф до полного обезвоживания.
7 Проведение испытания
7.1 Количество разбавлений с целью инокуляции изменяется согласно предполагаемому уровню загрязнения воды. Примеры разбавлений приведены в таблице 1.
Разбавление воды согласно предполагаемому уровню загрязнения
7.2 Расчет разбавлений
7.2.1 Разбавление для воды соленостью менее 30 мг/дм3
Массовая доля поваренной соли определяется рефрактометром или эквивалентным методом.
Подготавливают количество стерильных пробирок согласно количеству предполагаемых разбавлений.
Подготавливают исходное разведение 1:1 (9 см3 исследуемой пробы и 9 см3 физиологического раствора). Интенсивно перемешивают. Используя новую стерильную пипетку, переносят 1 см3 раствора первой пробирки во вторую, содержащую 9 см3 исследуемой пробы (разбавление 1:20). Из второго разведения готовят последующие. Разведение продолжают, пока не будут подготовлены все разбавления. Для приготовления каждого разведения используют новую стерильную пипетку.
7.2.2 Разбавление для воды с соленостью 30 мг/дм3 и более
Подготавливают количество стерильных пробирок согласно количеству предполагаемых разбавлений.
Подготавливают исходное разведение 1:1 (9 см3 исследуемой пробы и 9 см3 физиологического раствора). Интенсивно перемешивают. Используя новую стерильную пипетку, переносят 1 см3 раствора первой пробирки во вторую, содержащую 9 см3 физиологического раствор (разбавление 1:20). Из второго разведения, готовят следующие. Разведение продолжают, пока не будут подготовлены все разбавления. Для приготовления каждого разведения используют новую стерильную пипетку.
7.3 Инокуляция и инкубация титрационных микропланшетов
7.3.1 Инокуляция
Содержимое первой пробирки переносят в стерильную чашку Петри. Используя многоканальную пипетку, вносят по 200 мкл во все лунки титрационного микропланшета, соответствующие первому разбавлению.
7.3.2 Инкубация
После инокуляции титрационного микропланшета его покрывают одноразовой стерильной клейкой лентой. Титрационный микропланшет помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 +/- 0,5) °C от 36 до 7 ч.
8 Расчет и выражение результатов
8.1 Считывание результатов
Подсчет микроорганизмов проводят в соответствии с требованиями [3].
Каждый титрационный микропланшет с липкой лентой помещают в УФ-камеру. Все лунки, в которых наблюдается голубое флуоресцирование, рассматривают как положительные.
8.2 Выражение результатов
Необходимо обращать внимание на число положительных лунок.
1 Вода из плавательного бассейна
В разбавлении 1:1: из 64 положительные 32 лунки.
В разбавлении 1:10: из 32 положительные 5 лунок.
32:5 — наиболее вероятное число (НВЧ).
2 Вода поверхностная в разбавлении 1:1: из 24 положительные 24 лунки.
В разбавлении 1:10: из 24 положительные 18 лунок.
В разбавлении 1:100: из 24 положительные 5 лунок.
В разбавлении 1:1000: из 24 положительные 1 лунка.
В разбавлении 1:1: из 16 положительные 16 лунок.
В разбавлении 1:10: из 16 положительные 16 лунок.
В разбавлении 1:100: из 16 положительные 12 лунок.
В разбавлении 1:1000: из 16 положительные 5 лунок.
В разбавлении 1:10000: из 16 положительные 0 лунок.
В разбавлении 1:100000: из 16 положительные 0 лунок.
Если разбавлений было 3 и более, то наиболее вероятное число состоит из трех цифр, заканчивающихся на 0. Полученный результат регистрируют в соответствии с [3].
8.3 Расчет НВЧ и его доверительного интервала проводят с помощью программного обеспечения. Примеры приведены в приложениях А и Б.
Проводят статистический анализ плотности микроорганизмов, соответствующих распределению Пуассона в инокуляционных объемах. Программное обеспечение позволяет выполнить расчеты НВЧ кишечных энтерококков на 1 см3 воды для каждого разбавления с доверительным интервалом 95%.
1 Рассчитывают наиболее вероятное число, наиболее низкий предел (ННП), наиболее высокий предел (НВП). Если НВЧ составляет 32:5, программное обеспечение выдает 7,56 энтерококков на 1,0 см3. (ННП = 5,42-НВП, ННП = 10,54 энтерококков на 1,0 см3 исследуемой воды).
2 Если НВЧ составляет 18:5:1, программное обеспечение выдает 159,08 энтерококков на 1,0 см3 (ННП = 101,99 НВП, ННП = 248,11 энтерококков на 1,0 см3 исследуемой воды).
3 Если НВЧ составляет 12:5:0, программное обеспечение выдает 1724,61 энтерококков на 1,0 см3 (ННП = 1003,98-НВП, ННП = 2962,50 энтерококков на 1,0 см3 исследуемой воды).
Если положительные лунки отсутствуют, то результат выражают в следующей форме: <n/100 см3,
где n — наиболее вероятное число для одной положительной лунки.
8.4 Контроль точности измерений
8.4.1 Расчет значений повторяемости и воспроизводимости проводится в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 и ГОСТ ИСО 5725-2. Внутрилабораторные испытания воды для плавательных бассейнов показали следующие результаты: 100 лабораторий исследовали три пробы воды (одна проба морской воды и две пробы пресной воды). При уровне в 100 кишечных энтерококков на 100 см3 воды R = 5,2, r = 3,6. При уровне 400 кишечных энтерококков на 100 см3 воды: R = 3,7, r = 2,1. Во время испытаний при участии девяти лабораторий исследовались четыре естественно загрязненные пробы воды. В речной воде, содержащей от 2,2·103 до 1,5·104 кишечных энтерококков на 100 см3 воды, R = 2,7, r = 1,5. В сточной воде, содержащей от 1,9·104 до 5,1·106 кишечных энтерококков на 100 см3 воды, R = 3,9, r = 2,6.
8.4.2 Внутренний контроль точности измерений проводят в соответствии с требованиями [4].
9 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен быть оформлен в соответствии с требованием ГОСТ ISO/IEC 17025.
ПРИМЕР ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА НВЧ
ПРИМЕР ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ ВЫЧИСЛЕНИЯ НВЧ
БИБЛИОГРАФИЯ
| [1] | ISO 5667-1, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes and sampling techniques (Качество воды. Отбор проб. Часть 1. Руководство по составлению программ отбора проб) |
|---|---|
| [2] | ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Preservation and handling of water samples (Качество воды. Отбор проб. Часть 3. Руководство по хранению и обращению с пробами воды) |
| [3] | ISO 8199, Water quality — General requirements and guidance for microbiological examinations by culture (Качество воды. Общие требования для подсчета микроорганизмов выращенных методом посева на питательной среде) |
| [4] | МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» |
| УДК 628.16:006.35:006.354 | МКС 13.060 |
| Ключевые слова: вода, качество, анализ химический, определение содержания, хлориды, анализ объемный | |