ГОСТ 34877.2-2022. Межгосударственный стандарт. Путь неблагоприятного исхода для сенсибилизации кожи, вызванной ковалентным связыванием с белками. Часть 2. Применение при классификации и разработке интегрированных подходов к комплексной оценке и испытаниям химической продукции. Серия по испытаниям и оценке № 168
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "ГОСТ 34877.2-2022. Межгосударственный стандарт. Путь неблагоприятного исхода для сенсибилизации кожи, вызванной ковалентным связыванием с белками. Часть 2. Применение при классификации и разработке интегрированных подходов к комплексной оценке и испытаниям химической продукции. Серия по испытаниям и оценке N 168". ГОСТ 34877.2-2022. https://bukva.ai/docs/standart-gost-34877-2-2022
(введен в действие Приказом Росстандарта от 24.11.2025 № 1477-ст)
Примечание
Документ вводится в действие с 01.11.2026 с правом досрочного применения. Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, в результате применения которых на добровольной основе обеспечивается соблюдение требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» (ТР ТС 009/2011) (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22.12.2020 № 177).
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2025 г. № 1477-ст
ПУТЬ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА ДЛЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ КОЖИ, ВЫЗВАННОЙ КОВАЛЕНТНЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С БЕЛКАМИ
ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ КЛАССИФИКАЦИИ И РАЗРАБОТКЕ ИНТЕГРИРОВАННЫХ ПОДХОДОВ К КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКЕ И ИСПЫТАНИЯМ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ. СЕРИЯ ПО ИСПЫТАНИЯМ И ОЦЕНКЕ № 168
An adverse outcome path for skin sensitization caused by covalent proteins binding. Part 2. Application in the classification and development of integrated approaches to the integrated assessment and testing of chemical products. Series on testing and assessment № 168
(ENV/JM/MONO(2012)10/PART2:2012, The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins — Part 2: Use of the AOP to Develop Chemical Categories and Integrated Assessment and Testing Approaches — Series on Testing and Assessment № 168, MOD)
13.020.01
Дата введения 1 ноября 2026 года с правом досрочного применения
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 31 августа 2022 г. № 153-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2025 г. № 1477-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34877.2-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2026 г. с правом досрочного применения
5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу ENV/JM/MONO(2012)10/PART2:2012 «Путь неблагоприятного исхода для сенсибилизации кожи, вызванный ковалентным связыванием с белками. Часть 2. Применение AOP при разработке категорий химических веществ и интегрированных подходов к комплексной оценке и испытаниям. Серия по испытаниям и оценке № 168» («The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins — Part 2: Use of the AOP to Develop Chemical Categories and Integrated Assessment and Testing Approaches — Series on Testing and Assessment № 168», MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.
В тексте стандарта библиографические ссылки приведены не в порядке возрастания из-за особенностей построения примененного международного документа.
Международный документ разработан международной Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР).
Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа приведено в дополнительном приложении ДА
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты».
Введение
В декабре 2010 г. ОЭСР было организовано проведение научно-практического семинара на тему «Использование механистической информации при формировании классов опасности химической продукции». Целью семинара было определение исходного набора научных данных, которые могли бы способствовать дальнейшей разработке и применению концепции путей неблагоприятного исхода (AOP). Одна из его задач заключалась в обсуждении предложений, касающихся возможности упорядочения информации о механизме или способе токсического воздействия в виде описания ключевых событий и процессов, представляющих собой элементы пути неблагоприятного исхода, для содействия классификации химической продукции (см. [36]). AOP в рамках данного семинара рассматривался как структурированное представление, последовательно описывающее документированные, аргументированные и экспериментально проверенные процессы, в ходе которых химическая продукция вызывает определенные молекулярные нарушения и соответствующие им биологические эффекты, и определяющее, каким образом эти молекулярные нарушения приводят к дальнейшим последствиям, наблюдаемым на уровне субклеток, клеток, ткани, органа, на уровне животного, а также (при необходимости) на уровне популяции в целом (см. [36]).
На семинаре были представлены материалы по нескольким прикладным исследованиям, послужившие основой для дискуссии. С учетом преимуществ и недостатков данных исследований был предложен для соблюдения ряд обоснованных принципов, рекомендуемых для разработки AOP с целью классификации химической продукции (см. [36]). Согласно данным принципам AOP должен базироваться на известном одиночном исходном молекулярном событии и должен быть связан с подтвержденным опасным последствием (группой последствий), которое наблюдается in vivo. Важно, чтобы любая модель, используемая для разработки AOP, включала в себя обобщенную информацию об экспериментальных данных, подтверждающих его обоснованность, а также сведения, касающиеся: 1) уровня качественной интерпретации AOP; 2) согласованности экспериментальных данных; 3) степени достоверности AOP и 4) уровня количественной интерпретации AOP (см. [36]).
Кроме того, была достигнута договоренность о том, что оценка уровня качественной интерпретации AOP должна включать документированные сведения о: 1) исходном молекулярном событии и локализации воздействия; 2) ключевых реакциях клеток; 3) ткани/органе(ах), выступающих в качестве мишени, и ключевых реакциях этих ткани или органа; 4) ключевых реакциях на уровне всего организма, рассматриваемых как с физиологической, так и с анатомической точки зрения, а также 5) (при необходимости) ключевых реакциях на уровне популяции (см. [36]).
Было также отмечено, что при оценке свидетельств, подтверждающих обоснованность AOP, следует учитывать критерии, предусмотренные методической схемой IPCS (International Programme on Chemical Safety) (см. [14]).
В степени достоверности, обеспечиваемой AOP, можно удостовериться, исходя из ответов на следующие вопросы:
1. Насколько подробно охарактеризован AOP?
2. Насколько убедительно представлена причинно-следственная связь исходного события и последующих ключевых событий с конечным неблагоприятным исходом?
3. Какие факторы накладывают ограничения на возможность получения свидетельств, подтверждающих актуальность AOP?
4. Является ли рассматриваемый AOP характерным для конкретных видов тканей, жизненных стадий/возрастных классов?
5. Предполагается ли, что исходное событие и последующие ключевые события будут однотипными для различных таксонов?
Оценка уровня количественной интерпретации должна включать в себя документированные сведения о: 1) исходном молекулярном событии; 2) последующих ключевых событиях; 3) соотношении «воздействие — эффект», необходимом для преобразования токсического проявления(ий) in vitro, впоследствии in vivo (см. [36]).
Наконец, было выработано согласованное мнение о том, что определение параметров соответствующего химического пространства критически важно для классификации химической продукции и обеспечивается путем получения ответов на следующие вопросы:
1. Воздействие какой химической продукции может приводить или не приводить к исходному молекулярному событию, предусматриваемому AOP?
2. Какие химические характеристики повышают/снижают вероятность отнесения последствий воздействия химической продукции к определенному AOP?
3. Имеют ли место схожие ключевые события для ряда химической продукции, обуславливающие общий AOP?
4. Имеются ли у химической продукции различия, которые могли бы служить основанием для отнесения ее к подклассам опасности?
Участники семинара договорились о подготовке ряда рекомендаций, касающихся совершенствования использования концепции AOP (см. [36]). Данные рекомендации предусматривали привлечение специалистов в области токсикологии, а также других научных сотрудников к участию в дискуссиях, касающихся AOP, с целью интенсификации межотраслевого взаимодействия при разработке AOP для хорошо изученных нежелательных проявлений, таких как сенсибилизация кожи.
Если сформулировать вкратце, то AOP представляет собой последовательность фактов и событий от химической структуры продукции, включая исходное молекулярное событие, до исследуемых последствий in vivo. AOP является способом представления имеющихся знаний о взаимосвязи(ях) между исходным молекулярным событием и неблагоприятным исходом на уровне отдельного организма или целой популяции. Несмотря на то что изначально AOP могут представляться как линейные процессы, на практике количество деталей и линейный характер варианта развития исходного молекулярного события до неблагоприятного исхода могут существенно различаться, в особенности при наблюдении за показателями здоровья человека, в случае, когда нежелательные последствия являются результатом воздействия на ряд органов (например, сенсибилизация кожи), наступления ряда событий (например, токсичность повторной дозы), которые накапливаются с течением времени (например, нейротоксичность), либо присущи определенной жизненной стадии организма (например, эмбриофетальная токсичность).
AOP предусматривает, что химические взаимодействия происходят на молекулярном уровне, а не на уровне всего живого организма. Таким образом, неблагоприятные последствия, наблюдаемые in vivo, являются результатом множества биологических реакций в сочетании с химической структурой токсического вещества. Важной задачей при разработке AOP является исключение смешения информации от разнообразных механизмов воздействия (например, различные исходные молекулярные события, способные приводить к одному и тому же нежелательному исходу in vivo, при разных AOP). Если исходное молекулярное событие тесно связано с реакцией, наблюдаемой in vivo, специалист может легко определить класс опасности химической продукции или общепринятую количественную зависимость «структура — активность» (quantitative structure-activity relationship — QSAR) между показателем in vivo и химической структурой (например, острая токсичность у рыб). В рамках предлагаемого ОЭСР программного инструментария QSAR Toolbox (далее — программный инструментарий), (www.oecd.org/env/hazard/gsar) эта цель достигается путем профилирования (т.е. формирования классов опасности химической продукции) с использованием механистических модулей-профилировщиков и последующего заполнения недостающих данных путем применения метода аналогий или анализа тенденций изменений (т.е. посредством упрощенного QSAR-анализа), исходя из результатов наблюдений in vivo, содержащихся в базах данных. В то же время подобного рода прямые взаимосвязи достаточно редко встречаются, если речь идет о показателях здоровья человека. Более того, в отсутствие понятного описания вероятного прогрессирования неблагоприятных последствий на тех или иных уровнях биологической системы представляется затруднительным достоверное формирование классов опасности химической продукции на основе сходства 2-мерных химических структур и подклассов опасности — на основе близости их токсических свойств, двух критически важных аспектов для данного инструментария. Применение AOP способствует решению указанных проблем, поскольку оно обеспечивает возможность отнесения различной химической продукции к определенным классам, с одновременным учетом как восходящих химических, так и нисходящих биологических процессов. Внедрение понятия AOP смещает акценты в работе по классификации химической продукции с простого изучения их собственной химической активности в сторону комплексного изучения химической активности и ключевых событий, отмечаемых на различных уровнях биологической системы. В этом смысле AOP представляют собой надежную механистическую платформу для логических рассуждений, чтобы способствовать применению метода аналогий и классификации химической продукции, исключая непосредственные исследования на острую токсичность, могут быть полезны для целей дальнейшего совершенствования применяемого программного инструментария за счет включения в базу данных имеющих отношение токсикологических профилей с соответствующими изученными AOP.
Термин «сенсибилизация кожи» используется для обозначения регламентируемых опасных факторов, известных как аллергический контактный дерматит у человека или контактная гиперчувствительность у грызунов, важных с медицинской точки зрения показателей, принимаемых в расчет при оценке опасностей и рисков, сопряженных с использованием химической продукции. Сенсибилизация кожи — это хорошо изученное неблагоприятное последствие химического воздействия, аспекты которого явились предметом для сотен научных публикаций, издававшихся в течение последнего десятилетия (из последнего см. [10], [9], [6]). Поскольку нековалентные взаимодействия с металлами и окислительно-восстановительный цикл увязывают с сенсибилизацией кожи, основное внимание при проведении исследований все же уделяется химической продукции, способной образовывать ковалентные связи с тиолом и/или первичными аминогруппами, присутствующими в белках кожи. В зависимости от исследуемой химической продукции варианты одного и того же AOP могут различаться в зависимости от предпочитаемых целевых заместителей и преобладающих химических реакций, однако основные нисходящие биологические ответные реакции для них одинаковы.
Сенсибилизация кожи — это иммунологический процесс, при описании которого выделяют две фазы, а именно: индукцию сенсибилизации и последующее развитие иммунной реакции (см. [26]). Первая фаза включает в себя ряд событий, описываемых в данном AOP. Несмотря на наличие консенсуса в отношении общей структуры этих событий, понимания лежащих в основе особенностей большинства ключевых событий достигнуть пока не удалось. В то же время в противоположность принципам и концепциям, предусмотренным методической схемой IPCS MOA (Mode of Action) (см. [14]), глубокое понимание природы всех событий не является обязательным при использовании AOP для классификации химической продукции. В силу множества биологических составляющих (т.е. органов и различных типов клеток) оценка сенсибилизации кожи, как правило, осуществлялась в прошлом и продолжает осуществляться до настоящего времени на основе данных испытаний in vivo, хотя на стадии разработки или предварительной валидации уже находится ряд альтернативных методов (см. [3], [6]).
Хотя некоторые из процессов, рассматриваемых в настоящем стандарте, также играют существенную роль в формировании иммунного ответа по отношению к металлам или аллергенам биологического происхождения, приведенный AOP концентрируется на органической химической продукции, в частности такой, которая способна вступать в реакцию с тиолом (т.е. цистеином) и первичными аминами (т.е. лизином). С учетом указанного ведущая роль Toll-подобного рецептора 4 в сенсибилизации по отношению к никелю (см. [39]) должна быть подробно рассмотрена в рамках отдельного AOP, в котором следует также обосновывать, почему наиболее часто применяемый в настоящее время для оценки кожной сенсибилизации у мышей in vivo метод изучения реакции регионарных лимфатических узлов (Local Lymph Node Assay — LLNA) не обеспечивает достоверную классификацию воздействия никеля.
В фазе индукции, или накопления, химическая продукция, или аллерген, проникает сквозь наружный слой эпидермиса кожи. В течение данного пассажа химическая продукция потенциально может подвергаться процессам биологической трансформации, что в свою очередь может повышать или понижать ее аллергенный потенциал. Исходная химическая продукция или метаболит формируют стабильные конъюгаты с белками-носителями, локализующимися в толще кожи. С образовавшимися стабильными конъюгатами, или гаптен-белковыми комплексами, взаимодействуют затем эпидермальные дендритные клетки (так называемые клетки Лангерганса) и дермальные дендритные клетки, которые, последовательно созревая, мигрируют из эпидермиса в регионарные лимфатические узлы. Гаптен-белковые комплексы также могут реагировать с кератиноцитами, вызывая у них активный ответ, после чего те в свою очередь взаимодействуют с дендритными клетками. В лимфатических узлах дендритные клетки предъявляют молекулы главного комплекса гистосовместимости, содержащие части гаптен-белкового комплекса, нативным T-лимфоцитам (T-клеткам). Это приводит к дифференциации и пролиферации специфичных к аллергену T-клеток памяти, некоторые из которых начинают циркулировать по всему телу (см. рисунок 1).
Фаза развития, или фаза провокации, наступает при последующем контакте с тем же самым аллергеном. В этом случае снова образуются гаптен-белковые конъюгаты, которые захватываются эпидермальными дендритными клетками и другими антигенпрезентирующими клетками. Аллергенспецифичные активированные T-клетки, циркулирующие в организме, реагируют выделением специфичных цитокинов, что приводит к высвобождению воспалительных цитокинов и мобилизации цитотоксических T-клеток, а также иных воспалительных клеток из потока крови. Эти клетки мигрируют в эпидермис кожи, вызывая местную воспалительную реакцию, характерным признаком которой служит появление красных высыпаний, пузырьков, крапивницы, сопровождаемое ощущениями зуда и жжения кожи (см. рисунок 2).
Рисунок 1 — Фаза индукции сенсибилизации кожи
Согласно установившейся практике к ошибке при распознавании продукции, дающей положительный и отрицательный ответ при проведении опытов на интактных животных, как регулирующие органы, так и другие стороны, заинтересованные в получении результатов эксперимента, за исключением отдельных случаев, относятся с пониманием. Но если раньше достаточными для классификации химической продукции по ее способности оказывать сенсибилизирующее воздействие считались данные визуального осмотра подопытных морских свинок, то с началом применения метода LLNA для мышей (см. [10], [27]), в сочетании с использованием показателя EC3 (эффективной концентрации исследуемого вещества, необходимой для получения индекса стимуляции, равного 3) (см. [11]), особое внимание уделяется вопросам отнесения химической продукции к группам, различающимся по степени такого воздействия (например, очень сильная, сильная, умеренная, слабая и не обладающая аллергенным действием).
В настоящее время метод LLNA зачастую используют для промежуточной оценки новых предлагаемых подходов. Наряду с тем, что метод LLNA может быть полезен для целей валидации других методов, сведения о точности данного метода являются неполными (см. [12]), что вызывает интерес в практике оценки сенсибилизации кожи по совокупности имеющихся свидетельств (см. [8]). В любом случае активные попытки замены методов испытаний in vivo одним альтернативным методом или сочетанием таких методов (см. [6]) продолжаются. В противоположность методам in vivo, предусматривающим проведение испытаний в интактных динамических системах, альтернативные подходы, включающие in chemico или in vitro, являются относительно статическими и сосредотачиваются на описании или количественной оценке отдельных химических, биохимических и/или клеточных событий для последующего использования в рамках опирающегося на AOP интегрированного подхода к испытаниям и/или оценке.
Рисунок 2 — Фаза развития сенсибилизации кожи
Обобщенные результаты первых работ в области изучения молекулярных основ сенсибилизации кожи были приведены в [30]. В дальнейшем круг знаний о механизме ее развития продолжил расширяться. В более поздних обзорных материалах на данную тему (см. [22], [46], [3], [9], [6]) последовательно упоминаются одни и те же факты и события, соответствующие ключевым этапам, которые предшествуют появлению сенсибилизации. Таковыми предлагается считать биодоступность кожи и ее метаболизм, формирование гаптенов (например, способность химической продукции вступать в реакцию с белками кожи), воспаление эпидермиса, инициируемое сигнальной системой кератиноцитов и/или дендритных клеток, активацию, созревание и миграцию дендритных клеток, а также пролиферацию T-лимфоцитов (T-клеток).
1 Область применения
Настоящий стандарт содержит краткое изложение этапов предполагаемого AOP в отношении сенсибилизации кожи, вызванной ковалентным связыванием химической продукции с белками, включает положения, касающиеся возможности использования концепции AOP для классификации химической продукции и разработки соответствующих интегрированных подходов к ее испытаниям и оценке.
2 Общее представление структуры AOP
Доступный объем информации о структуре AOP применительно к сенсибилизации кожи как следствию ковалентного связывания химической продукции с белками стремительно вырос за последнее десятилетие, что позволяет описать его основные этапы следующим образом.
Этап 1. Вещество-мишень должно обладать биодоступностью (т.е. оно должно быть способно проникать через роговой слой эпидермиса).
Этап 2. Вещество-мишень должно относиться непосредственно к активным электрофильным веществам, превращаться метаболическим путем из химически неактивной субстанции (проэлектрофила) в активный метаболит либо в результате абиотического процесса, чаще всего окисления, превращаться из химически неактивной субстанции (проэлектрофила) в активное производное.
Этап 3. Местом воздействия на молекулярном уровне являются нуклеофильные участки-мишени (например, цистеиновые и лизиновые остатки) белков эпидермиса.
Этап 4. Исходное молекулярное событие представляет собой необратимое нарушение ковалентной структуры белков кожи (т.е. формирование гаптен-белкового комплекса или полного антигена). В условиях in vivo ответом на него является выработка специфичных T-клеток памяти.
Этап 5. Биохимические пути негативного воздействия конкретных электрофильных веществ на молекулярные мишени изучены не достаточно хорошо, но чаще всего они предусматривают пути, связанные с формированием воспалительного процесса, включая явления митоген-активируемого протеинкиназного сигнального каскада и реакции на окислительный стресс, прежде всего в кератиноцитах и дендритных клетках.
Этап 6. Последствия воздействия на уровне клеток/ткани также изучены не полностью, но известно, что они включают в себя определенные эпидермальные реакции, а именно: 1) иммунное распознавание химических аллергенов кератиноцитами, специализированными эпидермальными дендритными клетками (клетками Лангерганса) и дермальными дендритными клетками; 2) ответ в виде экспрессии специфических поверхностных клеточных маркеров, таких как молекулы адгезии, хемокины и цитокины, включая IL - 1\beta или IL-12p70, что, как правило, свидетельствует о созревании дендритных клеток.
Этап 7. К реакциям на уровне органов относятся:
a) миграция дендритных клеток в лимфатические узлы, где они предъявляют молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) нативным T-лимфоцитам (T-клеткам), с
b) последующей дифференциацией T-клеток и пролиферацией аллергенспецифичных T-клеток памяти.
Этап 8. В роли органа-мишени (органов-мишеней) выступают кожа и регионарные лимфатические узлы, в роли клеточных популяций-мишеней — популяции клеток иммунитета, в первую очередь эффекторных T-клеток.
Этап 9. Ключевой физиологической реакцией на данном этапе является появление сенсибилизации.
Этап 10. Ключевая реакция организма выражается в формировании воспаления после провоцирующего воздействия химического вещества в фазе развития. Подобный ответ объясняется стимулированием специфичных T-клеток памяти, выработанных в фазе индукции.
Этап 11. Системными последствиями воздействия химического вещества у млекопитающих следует считать аллергический контактный дерматит у человека и контактную гиперчувствительность у грызунов соответственно.
Обобщенная информация, лежащая в основе качественной интерпретации AOP, приведена в таблице 1, в которой перечислены известные ключевые события, приведены ссылки на документы с подтверждающими экспериментальными данными по каждому такому событию, а также дана оценка уровня достоверности имеющихся научных свидетельств для этого события.
2.1 Схема промежуточных событий, связанных с AOP
Схема, иллюстрирующая пути и промежуточные этапы развития сенсибилизации кожи, представлена на рисунке 3. Объяснение пути взято из [36].
Рисунок 3 — Структурная схема путей сенсибилизации кожи
2.2 Перечень ключевых событий в составе AOP
Краткое описание качественной интерпретации AOP приведено в таблице 1, в которой указаны ключевые события, документальная база с подтверждающими экспериментальными данными по каждому такому событию, а также дана субъективная оценка преимущества научного обоснования для этого события.
Перечень ключевых событий в составе AOP
3 Формирование класса химической продукции, способной вызывать сенсибилизацию кожи
Как на национальном, так и на международном уровне проводятся работы по оценке опасностей или рисков, сопряженных с использованием химических веществ, в частности промышленных органических соединений для здоровья человека и состояния окружающей среды. Согласно всеобщему мнению, первым этапом процесса оценки является установление достоверной информации для каждого оцениваемого показателя. Если же, как это нередко случается, соответствующая информация оказывается неполной, для завершения процесса оценки требуются дополнительные данные. По ряду причин, включая временные и материальные ресурсы, благополучие животных, проведение испытаний, и в особенности испытаний in vivo, не во всех случаях может рассматриваться как оптимальный способ получения недостающей информации. Один из применяемых подходов к заполнению пробелов в данных в процессе оценки заключается в том, чтобы рассматривать близкородственную химическую продукцию как группу или класс химической продукции, а не как индивидуальную химическую продукцию (см. [55]).
В широком контексте класс химической продукции может рассматриваться как совокупность химической продукции, у которой физико-химические характеристики, токсикологические свойства с точки зрения воздействия на здоровье человека и/или состояние окружающей среды и/или характеристики трансформации в окружающей среде подобны либо подчиняются одним и тем же закономерностям. Как следствие, класс химической продукции может быть представлен в виде матрицы, состоящей из химической продукции, относящейся к данному классу, и соответствующей ей номенклатуры химических характеристик и токсикологических показателей.
Критически важным этапом формирования классов химической продукции, способной вызывать сенсибилизацию кожи либо оказывать иное токсическое воздействие, является умение правильно определять «подобную» химическую продукцию (см. [49]). В идеальном случае подобие продукции должно основываться на общности механизма или способа ее воздействия; в основе такого механизма или способа могут лежать характерные химические реакции либо токсикологические свойства (см. [55]). Ключевым моментом при применении классов химической продукции для целей прогнозирования остается необходимость проверки предположения, действительно ли рассматриваемая химическая продукция может быть отнесена к соответствующей области применения или к соответствующему пространству прогнозирования (т.е. не выходят ли характеристики химической продукции за пределы, установленные для данного класса).
Предлагаемый AOP для сенсибилизации кожи, обусловленной ковалентным связыванием с белками, представляет собой прозрачную, основанную на закономерностях функционирования химических и биологических механизмов схему, описывающую этапы развития сенсибилизации, начиная с исходного молекулярного события и заканчивая последствиями, наблюдаемыми in vivo, и представляет основу для разработки или уточнения классов химической продукции (см. [55]). В то время как модель in vivo обеспечивает получение интегрированных выходных данных, система, реализуемая в условиях in vitro, представляет информацию лишь об отдельных событиях на определенном участке общего пути. С учетом данного обстоятельства для оценки показателей явлений, а именно сенсибилизации кожи, требуется проведение многократных испытаний in vitro по аналогии с концепцией методов определения токсичности в XXI веке (см. [61]), результаты которых затем должны тем или иным образом подвергаться обобщению (см. [62], [12]). Интуитивно понятно, что чем больше количество ключевых событий, для которых экспериментальным путем подтверждено соответствие признакам определенного класса химической продукции, тем весомее совокупность имеющихся свидетельств и доверительность прогнозируемых по методу аналогий последствий in vivo для химической продукции, относящейся к данному классу, испытания которой в условиях in vivo не проводились. Аналогично совокупность имеющихся свидетельств тем весомее и доверительность прогнозирования тем выше, чем большее количество химической продукции подвергнуто испытаниям на наличие ключевого события, характерного для соответствующего класса химической продукции.
Поскольку образование гаптен-белковых комплексов является исходным молекулярным событием при сенсибилизации кожи по причине связывания химической продукции с белками, информация о химической структуре вещества-мишени, отражающая его способность к образованию подобных аддуктов, может быть особенно полезна при классификации продукции по механистическому принципу. Кожные сенсибилизаторы, исходя из своей природы, обладают электрофильными свойствами и способны реагировать с нуклеофильными аминокислотными остатками. Поэтому возможность распознавания таких свойств на основе сведений о молекулярной структуре является первоочередным условием при проведении классификации.
Традиционно в органической химии (см. [64]) реакции между электрофильными и нуклеофильными химическими веществами принято делить на соответствующие механистические области: ацилирование, ароматическое нуклеофильное замещение SNAr, бимолекулярное нуклеофильное замещение SN2, реакцию Михаэля, образование оснований Шиффа и мономолекулярное нуклеофильное замещение SN1 (см. [63], [19]). Исходя из значимости химической реакционной способности были предприняты попытки разделить результаты испытаний по методу LLNA по указанным механистическим областям (см. [65]). Тем не менее даже после разделения результатов испытаний по методу LLNA установлено, что сенсибилизация in vivo может наблюдаться после протекания некоторых, но не всех реакций, относящихся к конкретной механистической области. Так, например, даже в рамках одного и того же механизма протекания реакции (реакции Михаэля) исследуемые химические соединения не позволяют установить общие закономерности в части их сенсибилизирующей способности in vivo (см. [56]). В связи с этим возникло предложение о разделении классов химической продукции на отдельные подклассы, основанные на еще более тесном сходстве показателей химической продукции (см. [67]).
Большой объем информации, описывающей химические основы электрофильных реакций, был задокументирован в [19] и преобразован в набор признаков структур так называемой системы упрощенного представления молекул в строке ввода (Simplified Molecular Information Line Entry Structures — SMILES) (cm. [68]) с использованием компьютерного программного инструментария ОЭСР QSAR Toolbox версии 2.2 (www.oecd.org/env/hazard/qsar).
Поскольку формирование гаптен-белковых комплексов является исходным молекулярным событием при развитии сенсибилизации кожи, обусловленной химическим связыванием с белками, информация об интенсивности образования соответствующих аддуктов (получаемая экспериментально или путем расчетов) также представляет чрезвычайный интерес для целей отнесения химической продукции к соответствующему классу по механистическому признаку. В настоящее время существует ряд баз данных, содержащих сведения о результатах измерений реакционной способности веществ in chemico. Так, метод прямого анализа реакционной способности пептидов, описанный в [66], позволяет определять в процентах образование связей с использованием цистеина и лизина в качестве модельных нуклеофилов. Одна из самых крупных имеющихся баз представляет значения RC50, характеризующие связывание с GSH (см. [69]). Это частный пример базы количественных данных по реакционной способности без малого 250 наименований химической продукции, структурные характеристики которой согласно SMILES отвечают критериям реакции присоединения Михаэля, охватывающей диапазон, равный почти 4 порядкам величины и доступной при работе с версией 2.2 инструментария ОЭСР QSAR Toolbox. Другая подобная база данных, которая включает в себя данные о более чем 150 наименованиях химической продукции, отвечающей критериям двухмерной структуры, необходимой для реакций замещения в соответствии с механизмом SN2, в первую очередь для реакции SN2 галоген — sp3C (см. [72]), и охватывает диапазон, превышающий 3 порядка величины, аналогично представлена в Toolbox. Не так давно в Toolbox была предусмотрена возможность работы с базой данных реакционной способности веществ, описывающей их реакции с GSH в соответствии с механизмом SNAr.
Используя указанные данные, химическая продукция в пределах отдельных указанных выше механических областей может в дальнейшем быть выделена в соответствующие подобласти и механистические кластеры. Данные механические кластеры могут быть сформированы на основе общего реакционноспособного центра (т.е. места нуклеофильной атаки, активируемого широким перечнем заместителей). Так, в частности, алканы (C=C), выступающие как акцепторы Михаэля вследствие воздействия поляризующих групп, образуют механический кластер, при этом другой аналогичный кластер представляют алкины (C#C), которые поляризуются теми же заместителями. Важно иметь в виду, что любой механистический кластер может, в свою очередь, состоять из нескольких механистических групп. Эти механистические группы объединяют в себе близкородственную химическую продукцию. Например, бензохиноны и хинон-метиды принадлежат к одному механистическому кластеру, но к разным механистическим классам. Возможность определения кластеров и классов химической продукции на основе реакции присоединения Михаэля в виде системы построения профиля, описывающего их характеристики с точки зрения способности связываться с белками, также предусмотрена в версии 2.2 программного инструментария ОЭСР QSAR Toolbox (www.oecd.org/env/hazard/qsar).
Перспективы дальнейших работ по классификации химической продукции с использованием сигнатур их биологической активности зависят от появления в общем доступе баз данных in vitro, обладающих достаточной глубиной и широтой охвата необходимой информации. В частности, получение экспериментальных данных об экспрессии генов Keap1/Nrf2/ARE/EpRE (например, результатов испытаний по методу KeratinoSens) и данных об активации дендритных клеток (например, результатов применения средств экспериментальной проточной цитофлуориметрии для экспрессии CD86 и CD54 в клетках THP-1 (h-CLAT) или экспрессии CD86 в клетках миелоидного лейкоза U937 при сенсибилизации кожи (MUSST)), могло бы позволить уточнять классификацию либо способствовать большей весомости имеющихся свидетельств и доверительности присваемого класса опасности. Можно сформировать концепцию оценки сенсибилизации кожи посредством классификации химической продукции, в которой область применимости классификации продукции для целей заполнения пробелов в имеющихся данных обусловлена частичным совпадением классов химической продукции, базирующихся на различных химических и токсикологических признаках, в основе каждого из которых лежат показатели, отражающие конкретные ключевые события в структуре AOP (см. рисунок 4).
Рисунок 4 — Последовательное построение профилей для формирования отдельного класса химической продукции, удовлетворяющей одновременно различным химическим и токсикологическим критериям
4 Интегрированные подходы к испытаниям и оценке (IANA) для кожных сенсибилизаторов
IATA — это концепция токсикологических исследований и оценки опасностей и рисков, предусматривающая комплексный учет различных данных химического и токсикологического характера в процессе принятия решений. Ее применение позволяет сократить количество химической продукции, подлежащей исследованиям для целей законодательного регулирования. IATA, как правило, является поэтапной и может представлять собой как многоуровневую, так и одноуровневую систему оценки. Отправной точкой в ее реализации служит базирующаяся на результатах анализа опасностей гипотеза о вероятном токсическом воздействии вещества мишени или класса химической продукции. Имеющиеся данные объединяются с данными компьютерного моделирования и биологических испытаний (выполняемых, например, с применением методов in vitro и омических методов) для выявления потребностей в дальнейшей информации, специфической для вещества-мишени или класса химической продукции. Концепция IATA ставит перед специалистами вопрос о том, каким образом должны обосновываться результаты конкретных исследований in silico, in chemico и/или in vitro либо иные данные, которые используются в рамках IATA. Введение понятия AOP обеспечивает их необходимыми средствами для получения такого обоснования.
Одними из первых попытку объединения данных о ключевых событиях AOP для сенсибилизации кожи, обусловленной ковалентным связыванием с белками, предприняли в [70]. Используя сведения о химической продукции 116 наименований, для которой уже были известны результаты исследований по методу LLNA, были изучены возможные схемы оценки экспериментальных данных на основе таких параметров, как: 1) разделение «1-октанол — вода»; 2) способность к реакциям с тиолом (т.е. деплеция (обеднение) цистеина); 3) прогнозные показатели согласно модели тканевого метаболизма (Tissue Metabolism Simulator) и 4) индукция передачи сигналов ARE in vitro, связанная с репортерным геном люциферазы. Данные исследований по методу LLNA были распределены согласно пяти различным уровням сенсибилизирующего воздействия (очень сильное, сильное, умеренное, слабое и отсутствие аллергенного действия). Аналогичному ранжированию, с использованием шкалы от 0 до 4, подверглись результаты исследований с применением альтернативных методов. Итоговая модель, оптимизированная в соответствии с оценкой конкурирующих параметров, продемонстрировала точность классификации на уровне приблизительно 88%, чувствительность — 86% и специфичность — 94% в сравнении с результатами, полученными при применении метода LLNA. Наиболее существенный вклад в формирование указанной интегрированной модели внесли сведения о деплеции (обеднении) цистеина и активации путей ARE (явлениях, соответствующих двум различным ключевым событиям в структуре пути неблагоприятного исхода) (см. [70]).
Немного позднее еще одна попытка комплексного анализа данных о ключевых событиях в структуре AOP для сенсибилизации кожи, обусловленной ковалентным связыванием с белками, была предпринята согласно [32]. Для определения возможного положительного или отрицательного биологического ответа на сенсибилизирующее воздействие были использованы данные о химической активности веществ и профилировании экспрессии генов в линии клеток человеческой кожи HaCaT; затем на основе этих данных вещества разделялись по сенсибилизирующей способности на очень сильные/сильные (ES), умеренные (M), слабые (W) аллергены и не обладающие аллергенным действием (N), а также осуществлялась оценка соответствующих значений, которые могли бы быть получены по методу LLNA. Если сформулировать вкратце, химическая реакционная способность определялась путем измерения % деплеции (обеднения) глутатиона (GSH) в условиях in chemico. Три разновидности клеточных сигнальных путей (Keap1/Nrf 2/ARE/EpRE, ARNT/AhR/XRE и Nrf1/MTF/MRE), о которых известно, что они активируются сенсибилизирующими агентами, отслеживались путем измерения относительной распространенности одиннадцати генов, экспрессия каждого из которых контролируется при помощи какого-либо из этих путей. К генам, контролируемым Nrf2/ARE/EpRE, относятся: 1) NQO1, 2) AKR1C2, 3) тиоредоксин (TXN), 4) интерлейкин 8 (IL8), 5) альдегид-дегидрогеназа 3A (ALDH3A), 6) гемооксигеназа 1 (HMOX1), 7) ген мышечно-апоневротической фибросаркомы (MafF) и 8) GCLC. Ген, контролируемый XRE, — это 9) CYP1A1. К генам, контролируемым MRE, относятся: 10) металлотионеин 1 (MT1), 11) металлотионеин 2 (MT2). Экспрессия генов оценивалась по шкале 4+, 3+, 2+, + и «без изменений». Прогнозируемый коэффициент токсичности (Predicted Toxicity Index — PTI) представляет собой определяемую алгоритмическим путем оценку по шкале от 8 до 0. Поскольку информация о структуре применяемого алгоритма является закрытой, обратные расчеты позволяют предположить, что выставляемое количество баллов приблизительно на 2/3 зависит от реакционной способности химического вещества и на 1/3 от уровня экспрессии генов.
В процессе разработки описываемой модели были использованы данные о 39 исследованных веществах, тогда как сведения о 58 других соединениях послужили основой для ее последующей валидации. Соединения, которые были отнесены к категориям ES и M, были признаны аллергенными, а к категориям W и N — неаллергенными соответственно. Точность классификации в сравнении с результатами, полученными по методу LLNA, составила приблизительно 84%, чувствительность — 81%, специфичность — 92%.
Наблюдение за деплецией (обеднением) глутатиона само по себе не обеспечивало достаточной точности, необходимой для распределения веществ по категориям в зависимости от их сенсибилизирующей способности. Использование данных о химической реакционной способности веществ в сочетании со сведениями о профиле экспрессии соответствующих генов (т.е. одновременное отслеживание двух ключевых событий в структуре AOP) позволило значительно повысить уровень достоверности прогнозов сенсибилизирующего воздействия.
Исследования [71] показали, что хотя экспериментальные данные in vitro на основе таких методов, как: 1) прямой анализ реакционной способности в отношении пептидов (Direct Peptide Reactivity Assay — DPRA), 2) KeratinoSens, 3) h-CLAT b 4) MUSST, представляют возможность по отдельности прогнозировать сенсибилизацию как при непосредственном воздействии на человека, так и при проведении исследований по методу LLNA, их совместное использование в значительной степени повышает достоверность прогнозирования, в особенности в отношении никеля. При наличии согласованности данных, полученных из четырех указанных источников, обеспечивается, таким образом, весомость имеющихся свидетельств и большая степень доверительности прогнозирования.
ОЭСР пока еще не разработаны соответствующие IATA для сенсибилизации кожи.
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ 1-ХЛОР-2,4-ДИНИТРОБЕНЗОЛА (ДНХБ) К ВЕЩЕСТВАМ, СПОСОБНЫМ ВЫЗЫВАТЬ СЕНСИБИЛИЗАЦИЮ КОЖИ, С ПРИМЕНЕНИЕМ КОНЦЕПЦИИ ПУТИ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА (AOP)
Доступный объем информации AOP применительно к сенсибилизации кожи как следствию ковалентного связывания химических веществ с белками стремительно вырос за последнее десятилетие, что позволяет описать основные этапы данного AOP следующим образом:
Этап 1. Вещество-мишень должно обладать биодоступностью (т.е. оно должно быть способно проникать через роговой слой кожи эпидермиса).
Этап 2. Вещество-мишень должно относиться непосредственно к активным электрофильным веществам, превращаться метаболическим путем из химически неактивной субстанции (проэлектрофила) в активный метаболит либо в результате абиотического процесса, чаще всего окисления, превращаться из химически неактивной субстанции (проэлектрофила) в активное производное.
Этап 3. Местом воздействия на молекулярном уровне являются нуклеофильные участки-мишени (например, цистеиновые и лизиновые остатки) белков эпидермиса.
Этап 4. Исходное молекулярное событие представляет собой необратимое нарушение ковалентной структуры белков кожи (т.е. формирование гаптен-белкового комплекса или полного антигена). В условиях in vivo ответом на него является выработка специфичных T-клеток памяти.
Этап 5. Биохимические пути негативного воздействия конкретных электрофильных веществ на молекулярные мишени изучены не достаточно хорошо, но чаще они включают пути, связанные с формированием воспалительного процесса, в том числе явления митоген-активируемого белкового сигнального каскада и реакции на окислительный стресс, прежде всего в кератиноцитах и дендритных клетках.
Этап 6. Последствия воздействия на уровне клеток/ткани также изучены не полностью, но известно, что они включают в себя определенные эпидермальные реакции, а именно: 1) иммунное распознавание химических аллергенов кератиноцитами, специализированными эпидермальными дендритными клетками (т.е. клетками Лангерганса) и 2) дермальными дендритными клетками. Ответ в виде экспрессии специфических поверхностных клеточных маркеров, таких как молекулы адгезии, хемокины и цитокины, включая IL1\beta или IL-12p70, как правило, считается свидетельством созревания дендритных клеток.
Этап 7. К реакциям на уровне органов относятся:
a) миграция дендритных клеток в лимфатические узлы, где они предъявляют молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) нативным T-лимфоцитам (T-клеткам), с
b) последующей дифференциацией T-клеток и пролиферацией аллергенспецифичных T-клеток памяти.
Этап 8. В роли органа-мишени (органов-мишеней) выступают кожа и регионарные лимфатические узлы; в роли клеточных популяций-мишеней — популяции клеток иммунитета, в первую очередь T-клеток.
Этап 9. Ключевым физиологическим ответом на данном этапе является появление сенсибилизации.
Этап 10. Ключевая реакция организма выражается в формировании воспаления после провоцирующего воздействия химического вещества в фазе развития. Подобный ответ объясняется стимулированием специфичных T-клеток памяти, ранее выработанных в фазе индукции.
Этап 11. Системными последствиями воздействия химического вещества у млекопитающих следует считать аллергический контактный дерматит у человека и контактную гиперчувствительность у грызунов соответственно.
К конкретным доказательствам сенсибилизирующей способности ДНХБ на перечисленных этапах AOP относятся:
Этап 1. С учетом значения коэффициента распределения «октанол — вода» logKow = 2,40, небольших размеров молекул и умеренной летучести ДНХБ приведенная в литературных источниках информация не дает оснований полагать, что проникновение через кожу или биодоступность могут являться смягчающим фактором при развитии сенсибилизации под действием данного вещества.
Этап 2. Хотя ДНХБ усиливает экспрессию цитохромов P450 (см. [32]), экспериментально полученные доказательства того, что метаболизм может являться смягчающим фактором при развитии сенсибилизации под действием ДХНБ, отсутствуют.
ДНХБ представляет собой типичный электрофил, поддающийся ароматическому нуклеофильному замещению (SnAr) и относящийся к области применимости механизма SnAr (см. [19]). В соответствии с [40] данные, полученные для ДНХБ, свидетельствуют о его высокой реакционной способности при применении различных методов in chemico (см. таблицу A.1).
Этапы 3 и 4. Согласно [23] установлено, что ДНХБ преимущественно (в пять раз чаще) связывается с клеточными, а не сывороточными белками и что такие реакции не являются специфическими на белок. Клеточные белки считаются тиолонасыщенными, а сывороточные — тиолоненасыщенными белками. В соответствии с [32] 75% ДНХБ связывается с глутатионом после его 24-часовой деплеции (обеднения) (т.е. потери свободных тиолов).
Сводная информация об определении реакционной способности ДНХБ in chemico
ДНХБ способен реагировать с множеством нуклеофилов. Относительные показатели его реакционной способности по сравнению с другими химическими веществами, ранее исследованными в соответствии с тем же протоколом, однозначно свидетельствуют о его высоком реакционном потенциале
| Идентиф. N | Нуклеофил | Параметр, единица измерений | Значение | Время, с; pH; растворитель | Время реакции, соотношение нуклеофил:электрофил | Библиографический источник | Метод |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 26 | Глутатион (GSH) | t1/2 (GSH) мин |
200 | 22; 7; ЭДТА-буферный раствор |
Макс. 16 ч; 50:1 |
[73] | ВЭЖХ-УФ (210 — 300 нм) |
| 596 | Cor1C-420 (AcNKKCDLF) |
RC50 (Cor1) мМ |
0,07 | 37; 7,5; фосфатный буферный раствор (ФБР) 0,1 М |
150 мин; 1:10 |
[70] | УФ (неизрасходованный цистеин после реакции с монобромобиманом; 385 нм возб., 480 эмисс.) |
| 735 | Глутатион | krel (GSH): CDNB 1 = CDNB | 1,00E+00 | 25; 7.5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[74] | УФ (GSH-конъюгат), k отн. для 1-хлор-2,4-динитро-бензола |
| 855 | 4-нитробензил-пиридин (NBP) | k1 (NBP) мин-1 |
-2,71 | 80; 2-бутанон |
60 мин; 30:1 |
[75] | УФ (~560 нм) |
| 961 | Пиперидин | k (пиперидин) М-1 мин-1 |
1,15E+00 0,06 |
25 | - | [76] | - |
| 962 | Пиперидин | k (пиперидин) М-1 мин-1 |
9,20E-01 -0,04 |
25; этанол | - | [76] | - |
| 1043 | Натрия метилат | k (Метилат) М-1 мин-1 |
1,51E+00 0,18 |
25; метанол |
- | [76] | - |
| 1044 | Натрия метилат | k (Метилат) М-1 мин-1 |
1,11E-01 -0,95 |
0; метанол |
- | [76] | - |
| 1171 | Глутатион | k (GSH) М-1 мин-1 |
0,72-0,14 | 22; 7; ЭДТА-буферный раствор |
Макс. 16 ч; 50:1 |
[73] | - |
| 1172 | Глутатион | k (GSH) М-1 мин-1 |
0,42-0,38 | 25; 6,5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[74] | - |
| 1173 | Глутатион | k (GSH) М-1 мин-1 |
3,8 0,58 | 25; 7,5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[74] | УФ (GSH-конъюгат) |
| 1174 | Глутатион | k (GSH) М-1 мин-1 |
0,58 | 25; 7,5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[74] | Уст. по pH 6.5: k2(уст. pH 7,5) = 10·k2(эксп. pH 6,5); УФ |
| 1408 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
4,95E+00 0,69 |
25; этанол |
- | [76] | - |
| 1409 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
3,90E-01 -0,41 |
0; этанол |
- | [76] | - |
| 1410 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
1,05 0,02 | 10; этанол |
- | [76] | - |
| 1411 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
1,63 0,21 | 15; этанол |
- | [76] | - |
| 1412 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
2,90 0,46 | 20; этанол |
- | [76] | - |
| 1413 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
2,98 0,47 | 25; этанол |
- | [76] | - |
| 1414 | Натрия этилат | k (Этилат) М-1 мин-1 |
3,26 0,51 | 15; этанол |
- | [77] | - |
| 1597 | Анилин | k (Анилин) М-1 мин-1 |
1,79E-02 -1,75 |
50; этанол |
- | [76] | - |
| 1598 | Анилин | k (Анилин) М-1 мин-1 |
9,75E-03 -2,01 |
35; этанол |
- | [76] | - |
| 1599 | Анилин | k (Анилин) М-1 мин-1 |
2,13E-02 -1,67 |
35; этанол |
- | [76] | - |
| 1600 | Анилин | k (Анилин) М-1 мин-1 |
1,93E-03 -2,71 |
50; этанол |
- | [76] | - |
| 1723 | Анилин | DPE (Анилин) % деплеции (обеднение) |
> 90 | 100; этанол |
2 ч | [77] | Метод: паровая баня; > 90 = высвобождение более 90% галогена |
| 2155 | Глутатион | DP (GSH): Gerberic % деплеции (обеднение) |
43,6 | 25; 7,4; ФБС |
15 мин 1:100 |
[78] | 0,2 GSH: 20 мМ Эл; ОФ-ВЭЖХ (производная GSH/GSSH с ДНФБ; [47]) |
| 2240 | Цисцеин-пептид (Cys-P.) (AcRFAACAA) | DP (Cys-P): Natsh % деплеции (обеднение) |
100 | 30; ФБС 20 мМ |
24 ч; 1:100 |
[79] | ВЭЖХ-ДМД 214 нм |
| 2684 | Cor1C-420 (AcNKKCDLF) | DP (Cor1) % деплеции (обеднение) | > 98 | 37; 7,5; ФБС 0,1 М |
31 ч; 1:10 |
[70] | - |
| 2766 | Аргинин-пептид (Arg-P.) (AcFAARAA) | DP (Arg-P): Aleksic % деплеции (обеднение) |
-1,73 | 37; 10; Карбонатный буфер 50 мМ |
24 ч 1:100 |
[80] | ЖХ-МС/МС (электроспрей); с AcFAGAGA в качестве внутреннего стандарта |
| 2948 | Цистеин | Аддукт (Cys) (да/нет) | Да | Водный раствор NaOH | 10 мин; 1:1 |
[81] | Комнатная температура; титрование спиртовым раствором йода |
Как отмечают [15] и [41], взаимодействие ДНХБ с дендритными клетками (ДК) происходит из-за деплеции (обеднения) глутатиона.
Этап 5. Предполагается, что в созревании ДК должны быть задействованы клеточные сигнальные пути, такие как MAPKs и NF-kappaB (кВ). Пути JNK и p38 MAPK подтверждают первичную активность при проявлении различного рода внешних стрессовых факторов, включая окислительный стресс и высвобождение воспалительных цитокинов. Путь ERK1/2 связан с регулированием пролиферации клеток. Доказано, что в образцах человеческих ДК, культивируемых из периферийных моноцитов CD14+, воздействие ДНХБ приводит к активации сигнальных путей p38 и JNK (см. [4]). В [33] убедительно продемонстрировали значимость сигнального пути p38 MAPK в процессе активации ДНХБ ДК-подобных клеток, представляющих линию моноцитарного лейкоза человека THP-1; впоследствии данные наблюдения были подтверждены в [31]. Кроме того, пути p38 MAAPK и ERK1/2 могут быть активированы тринитрохлорбензолом (ТНБХ) (соединением, очень похожим на ДНБХ); в этом случае активация может быть ингибирована при помощи тиолового антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина, который предотвращает гаптенизацию (см. [15]).
В качестве вторичных посредников, контролирующих широкий спектр системных последствий, выступают активные формы кислорода. В частности, ими обеспечивается контроль над созреванием ДК за счет фосфорилирования белков после окисления тиола (т.е. цистеина). В [41] приведен пример активации методом «доза — эффект» с фосфорилированием путей p38 MAPK и JNK и ингибированием пути ERK1/2 при воздействии ДНХБ. Взаимосвязь между окислительным стрессом и активацией p38 MAPK, а также ингибированием ERK1/2 была продемонстрирована путем предварительной обработки антиоксидантом N-ацетил-L-цистеином.
Этап 5. Кератиноциты представляют собой наиболее многочисленную разновидность клеток в составе кожного эпидермиса. Известно, что они являются первичными пунктами метаболизма в структуре кожи и играют важную роль в активации эпителиальных ДК.
На примере кератиноцитов человека (клеток HaCaT) согласно [32] провели оценку отдельных генов, связанных с тремя видами сигнальных путей в клетках (Keap1/Nrf 2/ARE/EpRE, ARNT/AhR/XRE и Nrf1/MTF/MRE), активация которых, как считается, происходит при воздействии сенсибилизирующих агентов. Если коротко, была определена относительная распространенность одиннадцати генов, экспрессия каждого из которых контролируется при помощи какого-либо из этих путей. К генам, контролируемым Nrf2/ARE/EpRE, относятся: 1) NQO1, 2) AKR1C2, 3) тиоредоксин (TXN), 4) интерлейкин 8 (IL8), 5) альдегид-дегидрогеназа 3A (ALDH3A), 6) гемоксигеназа 1 (HMOX1), 7) ген мышечно-апоневротической фибросаркомы (MafF), а также 8) GCLC. Ген, контролируемый XRE, — это 9) CYP1A1. К генам, контролируемым MRE, относятся: 10) металлотионеин 1 (MT1), 11) металлотионеин 2 (MT2). Экспрессия генов оценивалась по шкале 4+, 3+, 2+, + и «без изменений». По данным отчета [32] для ДНХБ уровень экспрессии составил: NQO1 = 4+; AKR1C2 = 2+; TXN = без изменений; IL8 = +; CYP1A1 = +; ALDH3A = без изменений; HMOX = без изменений; MafF = +; GCLC = без изменений; MT1A = без изменений и MT2A = 2+. Микроматричный анализ обработанных ДНХБ клеток HaCaT (см. [44]) показал аналогичные результаты.
Метод KeratinoSens (см. [18]) предназначен для исследования зависимости «доза — эффект» (как правило, на трех параллельно обрабатываемых образцах для двенадцати концентраций) с целью выявления существенного повышения активности генов в условиях in vitro с использованием репортерного гена люциферазы, контролируемого одиночной копией ARE-элемента человеческого гена AKR1C2 в виде стабильной вставки в кератиноциты человека, принадлежащие к клеточной линии HaCaT. В соответствии со стандартной операционной процедурой (см. [18]) получены необходимые экспериментальные данные и определены значения средней максимальной индукции активности генов (Imax) и средней концентрации вещества, вызывающей повышение активности генов на 50% относительно контрольных значений (EC1.5). Последние получены путем линейной экстраполяции значений, находящихся выше и ниже порога индукции (как при определении значения EC3 для метода LLNA). Проведенные далее меж- и внутрилабораторные исследования сенсибилизирующей способности ДНХБ по методу KeratinoSens [34] свидетельствуют о повторяемом и воспроизводимом характере результатов (см. таблицу A.2).
Результаты меж- и внутрилабораторных исследований ДНХБ с применением метода KeratinoSens
| Лаборатория | Imax (кратная индукция) | EC 1,5, мкМ |
|---|---|---|
| A (по данным прошлых наблюдений) | 14,8 | 2,5 |
| A | 12,9 | 3,3 |
| B | 4,3 | 2,1 |
| C | 12,2 | 3,0 |
| D | 19,5 | 1,4 |
| E | 15,6 | 2,1 |
Культуры клеточной линии кератиноцитов человека NCTC 2544 подвергались воздействию ДНХБ с последующей оценкой клеточно-ассоциированного IL-18 спустя 24 ч после начала такого воздействия (см. [16]). Внутриклеточное содержание IL-18 оценивалось путем специальных процедур иммуноферментного анализа (ИФА) типа «сэндвич»; результаты были приведены как содержание из расчета пг/мг общего внутриклеточного белка. Воздействие ДНХБ приводит к существенному увеличению выработки IL-18 согласно зависимости «доза — эффект»; тем не менее это увеличение выглядит достаточно умеренным по сравнению с другими, более изученными аллергенами. Факт выработки IL-18 клетками HaCaT и HEL-30 при воздействии ДНХБ подтверждается данными, приведенными в [45].
Этап 6. Дендритные клетки для исследований in vitro могут быть получены из человеческих моноцитов или из прогениторных клеток пуповинной крови человека. Кроме того, характеристиками, присущими дендритным клеткам, обладают клетки некоторых иммортализованных линий. Незрелые ДК приобретают фенотип, отличительной особенностью которого является снижение экспрессии E-кадгерина и повышение экспрессии отдельных поверхностных клеточных маркеров (например, CD54 и CD86) с одновременным усилением секреции воспалительных цитокинов (например, IL1\beta , IL-8 и TNF\alpha ).
При использовании длительного времени экспозиции (24 и 48 ч) для ДК, полученных из моноцитов, воздействие ДНХБ, как указано в [5], вызывает существенное усиление экспрессии поверхностных биомаркеров CD54, CD86 и HLA-DR.
Согласно [42] дендритные клетки из периферических моноядерных клеток крови отвечают на воздействие ДНХБ активацией костимуляторной молекулы CD86, молекулы межклеточной адгезии CD54 и антигена HLA-DR.
В соответствии с [7] сообщается об активации CD86 и интернализации молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса II в ДК-подобных клетках линии моноцитарного лейкоза человека THP-1 после 24-часовой обработки ДНХБ; при этом, по их наблюдениям, эффект активации усиливался в случае, когда одновременно с ДНХБ применялся гамма-интерферон.
У ДК, полученных из периферических моноцитов CD14+, воздействие ДНХБ вызывает экспрессию CD86 и выработку цитокина IL-8 по пути p38 MAPK [41].
У ДК из клеток пуповинной крови человека CD34+ воздействие ДНХБ вызывает экспрессию CD40 и HLA-DR и выработку IL-8 для всех из них вне зависимости от пути NF-кВ (см. [1]).
Доказано, что при использовании клеток ДК-подобной миелоидной линии U937 для проведения исследований по методу MUSST воздействие ДНХБ вызывает экспрессию CD86 при дозе, не являющейся цитотоксичной (см. [37]).
При использовании клеток линии HTP-1 для проведения исследований по методу h-CLAT было доказано, что воздействие ДНХБ вызывает увеличение экспрессии CD86 и молекул поверхностной клеточной адгезии CD54 на 150% и 200% соответственно (см. [39], [35]). Сообщают о значениях в размере 2,30 и 2,66 мкг/мл для CD86 EC150 и CD54 EC200 соответственно, достаточно высоких по сравнению со средними показателями группы, включающей в общей сложности 70 сенсибилизаторов, для которых были установлены такого рода значения.
В основу метода VITOSENS положено наблюдение (при помощи метода ПЦР в реальном времени) за дифференциальной экспрессией модулятора цАМФ-чувствительных элементов (CREM) и рецептора моноцитарного хемотоксического белка-1 (CCR2) в ДК CD34+ после 6, 11 и 24 ч экспозиции (см. [24]). Разница экспрессии генов была определена как кратные изменения (т.е. как отношения уровней экспрессии для проб, подвергнутых воздействию, и контрольных проб растворителя) при воздействии ДНХБ, приводящем к существенному увеличению значений экспрессии как для CREM, так и для CCR2.
Установлено, что воздействие ДНХБ на клетки THP-1 усиливает экспрессию двух Nrf2-зависимых ARE-чувствительных генов, гемоксигеназы-1 (HMOX1) и NAD(P)H:хинон оксиредуктаза 1 (NQO1); ингибированную преинкубацией с N-ацетил-Б-цистеном экспрессию CD86, а также экспрессию таких генов, как HMOX1 и NQO1 (см. [2]).
Этап 7a. Интернализация поверхностных молекул ГКГС класса II путем эндоцитоза антиген-презентирующими клетками рассматривается как важная стадия выработки антигенов. Согласно [29] были изучены возможность использования в исследовательских целях явления эндоцитоза веществ, вызывающих контактную сенсибилизацию, дендритными клетками мышей. Если коротко, ДК, находящиеся в суспензии эпидермальных клеток, помечались анти-ГКГС-класс-II моноклональными антителами. Затем посредством проточной цитофлуориметрии с использованием вторичных реагентов, помечаемых чувствительными к pH флуорохромами, определялись различия в средней интенсивности флуоресценции для интернализованных меток. Эндоцитоз комплексов на основе ГКГС при попадании в кислую среду (в лизосомы) приводил к снижению интенсивности флуоресценции, в то время как в случае интернализации в компартментах с меньшей кислотностью (в иммуносомах) уровень флуоресценции сохранялся. Воздействие DНХБ, 2,4-динитро-1-фторбензола и ТНХБ обеспечивало флуоресценцию на уровне, в 1,7 — 2 раза превышающем интенсивность флуоресценции в клетках, обработанных ДМСО.
Согласно [17] были выполнены измерения плотности дендритных клеток в ухе мыши с интервалом в 4 и 17 ч после воздействия 1%-ного ДНХБ. Кроме того, было определено количество ДК, появляющихся в лимфатическом узле, с интервалом 24, 48 и 72 ч после аналогичного воздействия, и в обоих случаях констатировали существенное увеличение числа ДК.
Трехмерные модели реконструированного человеческого эпидермиса (reconstituted human epidermal — RHE) представляют собой человеческие клетки, выращенные на мембране на поверхности раздела воздушной и жидкостной сред. Данный метод сокультивирования клеточного материала позволяет выращивать многослойную культуру клеток с образованием контактов между отдельными клетками, что делает ее похожей на соответствующие фрагменты кожи человека. При использовании моделей RHE, в состав которых были включены ДК CD34+, поверхностное нанесение ДНХБ вызывало экспрессию CD86 в этих ДК [20].
Модель кожи, состоящая из кератиноцитов, фибробластов и дендритных клеток, подвергалась воздействию ДНХБ, что приводило к экспрессии CD86 и выбросу цитокинов (см. [43]).
Этап 7b. В [21] сообщается о 6-кратном увеличении насыщенности клетками лимфатических узлов после воздействия 0,25%-ного раствора ДНХБ, главным образом в связи с пролиферацией T-клеток CD4+ и CD8+.
В [23] сообщается об эффектах, наблюдавшихся in vivo, в лимфоидной ткани мышей при воздействии ДНХБ и очень похожего на него соединения — ДНФБ. В однопроцентной концентрации воздействие ДНХБ приводило к заметному повышению иммунной активности и 5-кратному повышению клеточной насыщенности лимфоидной ткани в сочетании с 6-кратным увеличением поглощения тритилированного тимидина. Уменьшение концентрации ДНХБ до 0,1% явилось следствием пропорционального изменения активности. Образцы клеток лимфатических узлов, взятые у подопытных мышей после воздействия ДНХБ и ДНФБ, характеризовались повышенными уровнями содержания цитокина Th1 IFN - \gamma и пониженными уровнями содержания цитокинов Th2 IL-5 и IL-10, а также митогениндуцированного IL-4.
Этап 8. Как в [13], так и в [23] отмечается высокая способность ДНХБ вызывать сенсибилизацию при проведении экспериментов по методу LLNA.
Этап 11. В [28] сообщается, что ДНХБ проявляет сенсибилизирующие свойства при воздействии на кожу in vivo.
Тест максимизации на морских свинках (Guinea Pig Maximisation Test — GPMT) представляет собой высокочувствительный метод с применением как внутридермального, так и поверхностного способа обработки и закрытой провокационной пробы. ДНХБ приводит к положительным результатам при проведении провокационной пробы GPMT уже при концентрации 0,1%, что располагает его в верхних позициях перечня сенсибилизирующих веществ, исследованных при помощи метода GPMT.
Тест Бюлера на морских свинках предусматривает повторяющееся закрытое поверхностное нанесение вещества при проведении индукции и закрытую провокационную пробу. Результаты применения теста Бюлера для ДНХБ — положительные.
СОПОСТАВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ НАСТОЯЩЕГО СТАНДАРТА СО СТРУКТУРОЙ ПРИМЕНЕННОГО В НЕМ МЕЖДУНАРОДНОГО ДОКУМЕНТА
| Структура настоящего стандарта | Структура международного документа | |||
| Разделы | Пункты | Перечисления | Пункты | Перечисления |
| Введение | Общая информация | - | ||
| Раздел 1 | Основные положения | |||
| Раздел 2 | - | Общее представление структуры AOP | - | |
| 2.1 | - | Схема промежуточных событий, связанных с AOP | - | |
| 2.2 | - | Сводка ключевых событий в составе AOP | - | |
| Раздел 3 | - | Формирование химических категорий для классификации веществ по способности вызывать сенсибилизацию кожи | - | |
| Раздел 4 | - | Интегрированные подходы к испытаниям и оценке (IATA) для исследования веществ, вызывающих сенсибилизацию кожи | - | |
| Приложение A | - | Приложение 1 | - | |
| Библиография | Ссылки | |||
| УДК 661:615,099:006.354 | МКС 71.040.10; 13.020.01 | MOD |
| Ключевые слова: химическая продукция, сенсибилизация кожи, ковалентное связывание с белками, AOP, ключевые события, промежуточные события | ||