ГОСТ 34877.1-2022. Межгосударственный стандарт. Путь неблагоприятного исхода для сенсибилизации кожи, вызванной ковалентным связыванием с белками. Часть 1. Научные доказательства. Серия по испытаниям и оценке № 168
(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.11.2025 № 1566-ст)
Примечание
Документ вводится в действие с 01.11.2026 с правом досрочного применения. Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, в результате применения которых на добровольной основе обеспечивается соблюдение требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» (ТР ТС 009/2011) (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22.12.2020 № 177).
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 ноября 2025 г. № 1566-ст
ПУТЬ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА ДЛЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ КОЖИ, ВЫЗВАННОЙ КОВАЛЕНТНЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С БЕЛКАМИ
НАУЧНЫЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА. СЕРИЯ ПО ИСПЫТАНИЯМ И ОЦЕНКЕ № 168
The adverse outcome pathway for skin sensitisation. Initiated by covalent binding to proteins. Part 1. Scientific evidence. Series on testing and assessment № 168
(ENV/JM/MONO(2012)10/PART1:2012, MOD)
13.020.01
Дата введения 1 ноября 2026 года с правом досрочного применения
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 31 августа 2022 г. № 153-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 ноября 2025 г. № 1566-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34877.1-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2026 г. с правом досрочного применения
5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу ENV/JM/MONO(2012)10/PART1:2012 «Путь неблагоприятного исхода для сенсибилизации кожи, вызванной ковалентным связыванием с белками. Часть 1. Научные доказательства. Серия по испытаниям и оценке № 168» («The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment № 168», MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).
В тексте стандарта библиографические ссылки приведены не в порядке возрастания из-за особенностей построения примененного международного документа.
Международный документ разработан международной Организацией экономического сотрудничества и развития (OECD).
Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа приведено в дополнительном приложении ДА
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Введение
В декабре 2010 г. ОЭСР было организовано проведение научно-практического семинара на тему «Использование механистической информации при формировании классов опасности химической продукции». Целью семинара было определение исходного набора научных данных, которые могли бы способствовать дальнейшей разработке и применению концепции путей неблагоприятного исхода (AOP). Одна из его задач заключалась в обсуждении предложений, касающихся возможности упорядочения информации о механизме или способе токсического воздействия в виде описания ключевых событий и процессов, представляющих собой элементы пути неблагоприятного исхода, для содействия классификации химической продукции (см. [85]). AOP в рамках данного семинара рассматривался как структурированное представление, последовательно описывающее документированные, аргументированные и экспериментально проверенные процессы, в ходе которых химическая продукция вызывает определенные молекулярные нарушения и соответствующие им биологические эффекты, и определяющее, каким образом эти молекулярные нарушения приводят к дальнейшим последствиям, наблюдаемым на уровне субклеток, клеток, ткани, органа, на уровне животного, а также (при необходимости) на уровне популяции в целом (см. [85]).
На семинаре были представлены материалы по нескольким прикладным исследованиям, послужившие основой для дискуссии. С учетом преимуществ и недостатков данных исследований был предложен для соблюдения ряд обоснованных принципов, рекомендуемых для разработки AOP с целью классификации химической продукции (см. [85]). Согласно данным принципам, AOP должен базироваться на известном одиночном исходном молекулярном событии и должен быть связан с подтвержденным опасным последствием (группой последствий), которое наблюдается in vivo. Важно, чтобы любая модель, используемая для разработки AOP, включала в себя обобщенную информацию об экспериментальных данных, подтверждающих его обоснованность, а также сведения, касающиеся: 1) уровня качественной интерпретации AOP; 2) согласованности экспериментальных данных; 3) степени достоверности AOP и 4) уровня количественной интерпретации AOP (см. [85]).
Кроме того, была достигнута договоренность о том, что оценка уровня качественной интерпретации AOP должна включать документированные сведения о: 1) исходном молекулярном событии и локализации воздействия; 2) ключевых реакциях клеток; 3) ткани/органе(ах), выступающих в качестве мишени, и ключевых реакциях этих ткани или органа; 4) ключевых реакциях на уровне всего организма, рассматриваемых как с физиологической, так и с анатомической точки зрения, а также 5) (при необходимости) ключевых реакциях на уровне популяции (см. [85]).
Было также отмечено, что при оценке свидетельств, подтверждающих обоснованность AOP, следует учитывать критерии, предусмотренные методической схемой IPCS (International Programme on Chemical Safety) (см. [25]).
В степени достоверности, обеспечиваемой AOP, можно удостовериться исходя из ответов на следующие вопросы:
1. Насколько подробно охарактеризован AOP?
2. Насколько убедительно представлена причинно-следственная связь исходного события и последующих ключевых событий с конечным неблагоприятным исходом?
3. Какие факторы накладывают ограничения на возможность получения свидетельств, подтверждающих актуальность AOP?
4. Является ли рассматриваемый AOP характерным для конкретных видов тканей, жизненных стадий/возрастных классов?
5. Предполагается ли, что исходное событие и последующие ключевые события будут однотипными для различных таксонов?
Оценка уровня количественной интерпретации должна включать в себя документированные сведения о: 1) исходном молекулярном событии; 2) последующих ключевых событиях; 3) соотношении «воздействие — эффект», необходимом для преобразования токсического проявления(й) in vitro в последствии in vivo (см. [85]).
Наконец, было выработано согласованное мнение о том, что определение параметров соответствующего химического пространства критически важно для классификации химической продукции и обеспечивается путем получения ответов на следующие вопросы:
1. Воздействие какой химической продукции может приводить или не приводить к исходному молекулярному событию, предусматриваемому AOP?
2. Какие химические характеристики повышают/снижают вероятность отнесения последствий воздействия химической продукции к определенному AOP?
3. Имеют ли место схожие ключевые события для ряда химической продукции, обуславливающие общий AOP?
4. Имеются ли у химической продукции различия, которые могли бы служить основанием для отнесения ее к подклассам опасности?
Участники семинара договорились о подготовке ряда рекомендаций, касающихся совершенствования использования концепции AOP (см. [85]). Данные рекомендации предусматривали привлечение специалистов в области токсикологии, а также других научных сотрудников к участию в дискуссиях, касающихся AOP, с целью интенсификации межотраслевого взаимодействия при разработке AOP для хорошо изученных нежелательных проявлений, таких как сенсибилизация кожи.
Если сформулировать вкратце, то AOP представляет собой последовательность фактов и событий от химической структуры продукции, включая исходное молекулярное событие, до исследуемых последствий in vivo. AOP является способом представления имеющихся знаний о взаимосвязи(ях) между исходным молекулярным событием и неблагоприятным исходом на уровне отдельного организма или целой популяции. Несмотря на то что изначально AOP могут представляться как линейные процессы, на практике количество деталей и линейный характер варианта развития исходного молекулярного события до неблагоприятного исхода могут существенно различаться, в особенности при наблюдении за показателями здоровья человека, в случае когда нежелательные последствия являются результатом воздействия на ряд органов (например, сенсибилизация кожи), наступления ряда событий (например, токсичность повторной дозы), которые накапливаются с течением времени (например, нейротоксичность), либо присущи определенной жизненной стадии организма (например, эмбриофетальная токсичность).
AOP предусматривает, что химические взаимодействия происходят на молекулярном уровне, а не на уровне всего живого организма. Таким образом, неблагоприятные последствия, наблюдаемые in vivo, являются результатом множества биологических реакций в сочетании с химической структурой токсического вещества. Важной задачей при разработке AOP является исключение смешения информации от разнообразных механизмов воздействия (например, различные исходные молекулярные события, способные приводить к одному и тому же нежелательному исходу in vivo, при разных AOP). Если исходное молекулярное событие тесно связано с реакцией, наблюдаемой in vivo, специалист может легко определить класс опасности химической продукции или общепринятую количественную зависимость «структура — активность» (quantitative structure — activity relationship — QSAR) между показателем in vivo и химической структурой (например, острая токсичность у рыб). В рамках предлагаемого ОЭСР программного инструментария QSAR Toolbox (далее — программный инструментарий) (www.oecd.org/env/hazard/qsar) эта цель достигается путем профилирования (т.е. формирования классов опасности химической продукции) с использованием механистических модулей-профилировщиков и последующего заполнения недостающих данных путем применения метода аналогий или анализа тенденций изменений (т.е. посредством упрощенного QSAR-анализа), исходя из результатов наблюдений in vivo, содержащихся в базах данных. В то же время подобного рода прямые взаимосвязи достаточно редко встречаются, если речь идет о показателях здоровья человека. Более того, в отсутствие понятного описания вероятного прогрессирования неблагоприятных последствий на тех или иных уровнях биологической системы представляется затруднительным достоверное формирование классов опасности химической продукции на основе сходства 2-мерных химических структур и подклассов опасности — на основе близости их токсических свойств, двух критически важных аспектов для данного инструментария. Применение AOP способствует решению указанных проблем, поскольку оно обеспечивает возможность отнесения различной химической продукции к определенным классам, с одновременным учетом как восходящих химических, так и нисходящих биологических процессов. Внедрение понятия AOP смещает акценты в работе по классификации химической продукции с простого изучения их собственной химической активности в сторону комплексного изучения химической активности и ключевых событий, отмечаемых на различных уровнях биологической системы. В этом смысле AOP представляют собой надежную механистическую платформу для логических рассуждений, чтобы способствовать применению метода аналогий и классификации химической продукции, исключая непосредственные исследования на острую токсичность, могут быть полезны для целей дальнейшего совершенствования применяемого программного инструментария за счет включения в базу данных имеющих отношение токсикологических профилей с соответствующими изученными AOP.
Термин «сенсибилизация кожи» используется для обозначения регламентируемых опасных факторов, известных как аллергический контактный дерматит у человека или контактная гиперчувствительность у грызунов, важных с медицинской точки зрения показателей, принимаемых в расчет при оценке опасностей и рисков, сопряженных с использованием химической продукции. Сенсибилизация кожи — это хорошо изученное неблагоприятное последствие химического воздействия, аспекты которого явились предметом для сотен научных публикаций, издававшихся в течение последнего десятилетия (из последнего см. [4], [17], [3]). Поскольку нековалентные взаимодействия с металлами и окислительно-восстановительный цикл увязывают с сенсибилизацией кожи, основное внимание при проведении исследований все же уделяется химической продукции, способной образовывать ковалентные связи с тиолом и/или первичными аминогруппами, присутствующими в белках кожи. С учетом исследуемой химической продукции варианты одного и того же AOP могут различаться в зависимости от предпочитаемых целевых заместителей и преобладающих химических реакций, однако основные нисходящие биологические ответные реакции для них одинаковы.
Сенсибилизация кожи — это иммунологический процесс, при описании которого выделяют две фазы, а именно: индукцию сенсибилизации и последующее развитие иммунной реакции (см. [52]). Первая фаза включает в себя ряд событий описываемых в данном AOP. Несмотря на наличие консенсуса в отношении общей структуры этих событий, понимания лежащих в основе особенностей большинства ключевых событий достигнуть пока не удалось. В то же время, в противоположность принципам и концепциям, предусмотренным методической схемой IPCS MOA (Mode of Action) (см. [25]), глубокое понимание природы всех событий не является обязательным при использовании AOP для классификации химической продукции. В силу множества биологических составляющих (т.е. органов и различных типов клеток) оценка сенсибилизации кожи, как правило, осуществлялась в прошлом и продолжает осуществляться до настоящего времени на основе данных испытаний in vivo, хотя на стадии разработки или предварительной валидации уже находится ряд альтернативных методов (см. [4], [3]).
Хотя некоторые из процессов, рассматриваемых в настоящем стандарте, также играют существенную роль в формировании иммунного ответа по отношению к металлам или аллергенам биологического происхождения, приведенный AOP концентрируется на органической химической продукции, в частности такой, которая способна вступать в реакцию с тиолом (т.е. цистеином) и первичными аминами (т.е. лизином). С учетом указанного, ведущая роль Toll-подобного рецептора 4 в сенсибилизации по отношению к никелю (см. [102]) должна быть подробно рассмотрена в рамках отдельного AOP, в котором следует также обосновывать, почему наиболее часто применяемый в настоящее время для оценки кожной сенсибилизации у мышей in vivo метод изучения реакции регионарных лимфатических узлов (Local Lymph Node Assay — LLNA) не обеспечивает достоверную классификацию воздействия никеля.
В фазе индукции, или накопления, химическая продукция, или аллерген, проникает сквозь наружный слой эпидермиса кожи. В течение данного пассажа химическая продукция потенциально может подвергаться процессам биологической трансформации, что в свою очередь может повышать или понижать ее аллергенный потенциал. Исходная химическая продукция или метаболит формируют стабильные конъюгаты с белками-носителями, локализующимися в толще кожи. С образовавшимися стабильными конъюгатами, или гаптен-белковыми комплексами, взаимодействуют затем эпидермальные дендритные клетки (так называемые клетки Лангерганса) и дермальные дендритные клетки, которые, последовательно созревая, мигрируют из эпидермиса в регионарные лимфатические узлы. Гаптен-белковые комплексы также могут реагировать с кератиноцитами, вызывая у них активный ответ, после чего те в свою очередь взаимодействуют с дендритными клетками. В лимфатических узлах дендритные клетки предъявляют молекулы главного комплекса гистосовместимости, содержащие части гаптен-белкового комплекса, нативным T-лимфоцитам (T-клеткам). Это приводит к дифференциации и пролиферации специфичных к аллергену T-клеток памяти, некоторые из которых начинают циркулировать по всему телу (см. рисунок 1).
Фаза развития, или фаза провокации, наступает при последующем контакте с тем же самым аллергеном. В этом случае снова образуются гаптен-белковые конъюгаты, которые захватываются эпидермальными дендритными клетками и другими антигенпрезентирующими клетками. Аллергенспецифичные активированные T-клетки, циркулирующие в организме, реагируют выделением специфичных цитокинов, что приводит к высвобождению воспалительных цитокинов и мобилизации цитотоксических T-клеток, а также иных воспалительных клеток из потока крови. Эти клетки мигрируют в эпидермис кожи, вызывая местную воспалительную реакцию, характерным признаком которой служит появление красных высыпаний, пузырьков, крапивницы, сопровождаемое ощущениями зуда и жжения кожи (см. рисунок 2).
Рисунок 1 — Фаза индукции сенсибилизации кожи
Согласно установившейся практике, к ошибке при распознавании продукции, дающей положительный и отрицательный ответ при проведении опытов на интактных животных, как регулирующие органы, так и другие стороны, заинтересованные в получении результатов эксперимента, за исключением отдельных случаев, относятся с пониманием. Но если раньше достаточными для классификации химической продукции по ее способности оказывать сенсибилизирующее воздействие считались данные визуального осмотра подопытных морских свинок, то с началом применения метода LLNA для мышей (см. [15], [54]), в сочетании с использованием показателя EC3 (эффективной концентрации исследуемого вещества, необходимой для получения индекса стимуляции, равного 3) (см. [18]), особое внимание уделяется вопросам отнесения химической продукции к группам, различающимся по степени такого воздействия (например, очень сильное, сильное, умеренное, слабое и отсутствие аллергенного действия).
В настоящее время метод LLNA зачастую используют для промежуточной оценки новых предлагаемых подходов. Наряду с тем, что метод LLNA может быть полезен для целей валидации других методов, сведения о точности данного метода являются неполными (см. [16]), что вызывает интерес в практике оценки сенсибилизации кожи по совокупности имеющихся свидетельств (см. [12]). В любом случае активные попытки замены методов испытаний in vivo одним альтернативным методом или сочетанием таких методов (см. [3]) продолжаются. В противоположность методам in vivo, предусматривающим проведение испытаний в интактных динамических системах, альтернативные подходы, включающие in chemico или in vitro, являются относительно статическими и сосредотачиваются на описании или количественной оценке отдельных химических, биохимических и/или клеточных событий для последующего использования в рамках опирающегося на AOP интегрированного подхода к испытаниям и/или оценке.
Рисунок 2 — Фаза развития сенсибилизации кожи
Обобщенные результаты первых работ в области изучения молекулярных основ сенсибилизации кожи были приведены в [59]. В дальнейшем круг знаний о механизме ее развития продолжил расширяться. В более поздних обзорных материалах на данную тему (см. [38], [48], [113], [4], [17], [3]) последовательно упоминаются одни и те же факты и события, соответствующие ключевым этапам, которые предшествуют появлению сенсибилизации. Таковыми предлагается считать биодоступность кожи и ее метаболизм, формирование гаптенов (например, способность химической продукции вступать в реакцию с белками кожи), воспаление эпидермиса, инициируемое сигнальной системой кератиноцитов и/или дендритных клеток, активацию, созревание и миграцию дендритных клеток, а также пролиферацию T-лимфоцитов (T-клеток).
1 Область применения
Целью настоящего стандарта является предоставление известных сведений об AOP для сенсибилизации кожи, обусловленной ковалентным связыванием с белками, об оценивании совокупности имеющихся свидетельств, подтверждающих обоснованность AOP, определении его ключевых событий и указании существующих баз данных, в которых содержатся результаты испытаний, связанные с такими ключевыми событиями.
2 Общее представление структуры AOP
Доступный объем информации о структуре AOP применительно к сенсибилизации кожи как следствию ковалентного связывания химической продукции с белками стремительно вырос за последнее десятилетие, что позволяет описать его основные этапы следующим образом.
Этап 1. Вещество-мишень должно обладать биодоступностью (т.е. оно должно быть способно проникать через роговой слой эпидермиса).
Этап 2. Вещество-мишень должно относиться непосредственно к активным электрофильным веществам, превращаться метаболическим путем из химически неактивной субстанции (проэлектрофила) в активный метаболит либо в результате абиотического процесса, чаще всего окисления, превращаться из химически неактивной субстанции (преэлектрофила) в активное производное.
Этап 3. Местом воздействия на молекулярном уровне являются нуклеофильные участки-мишени (например, цистеиновые и лизиновые остатки) белков эпидермиса.
Этап 4. Исходное молекулярное событие представляет собой необратимое нарушение ковалентной структуры белков кожи (т.е. формирование гаптен-белкового комплекса или полного антигена). В условиях in vivo ответом на него является выработка специфичных T-клеток памяти.
Этап 5. Биохимические пути негативного воздействия конкретных электрофильных веществ на молекулярные мишени изучены недостаточно хорошо, но чаще всего они предусматривают пути, связанные с формированием воспалительного процесса, включая явления митоген-активируемого протеинкиназного сигнального каскада и реакции на окислительный стресс, прежде всего в кератиноцитах и дендритных клетках.
Этап 6. Последствия воздействия на уровне клеток/ткани также изучены не полностью, но известно, что они включают в себя определенные эпидермальные реакции, а именно: 1) иммунное распознавание химических аллергенов кератиноцитами, специализированными эпидермальными дендритными клетками (клетками Лангерганса) и дермальными дендритными клетками; 2) ответ в виде экспрессии специфических поверхностных клеточных маркеров, таких как молекулы адгезии, хемокины и цитокины, включая IL - 1\beta или IL-12p70, что, как правило, свидетельствует о созревании дендритных клеток.
Этап 7. К реакциям на уровне органов относятся:
- миграция дендритных клеток в лимфатические узлы, где они предъявляют молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) нативным T-лимфоцитам (T-клеткам), с
- последующей дифференциацией T-клеток и пролиферацией аллергенспецифичных T-клеток памяти.
Этап 8. В роли органа-мишени (органов-мишеней) выступают кожа и регионарные лимфатические узлы; в роли клеточных популяций-мишеней — популяции клеток иммунитета, в первую очередь эффекторных T-клеток.
Этап 9. Ключевой физиологической реакцией на данном этапе является появление сенсибилизации.
Этап 10. Ключевая реакция организма выражается в формировании воспаления после провоцирующего воздействия химического вещества в фазе развития. Подобный ответ объясняется стимулированием специфичных T-клеток памяти, выработанных в фазе индукции.
Этап 11. Системными последствиями воздействия химического вещества у млекопитающих следует считать аллергический контактный дерматит у человека и контактную гиперчувствительность у грызунов соответственно.
Обобщенная информация, лежащая в основе качественной интерпретации AOP, приведена в таблице 1, в которой перечислены известные ключевые события, приведены ссылки на документы с подтверждающими экспериментальными данными по каждому такому событию, а также дана оценка уровня достоверности имеющихся научных свидетельств для этого события.
2.1 Схема промежуточных событий, связанных с AOP
Схема, иллюстрирующая пути и промежуточные этапы развития сенсибилизации кожи, приведена на рисунке 3. Объяснение пути взято из [85].
Рисунок 3 — Структурная схема путей сенсибилизации кожи
2.2 Перечень ключевых событий в составе AOP
Краткое описание качественной интерпретации AOP приведено в таблице 1, в которой указаны ключевые события, документальная база с подтверждающими экспериментальными данными по каждому такому событию, а также дана субъективная оценка преимущества научного обоснования для этого события.
Перечень ключевых событий в составе AOP
3 Научные свидетельства, подтверждающие AOP
3.1 Перечень научных свидетельств, подтверждающих AOP
AOP может рассматриваться как обоснованный или как вероятный, в зависимости от объема (т.е. глубины и широты) доступных научных свидетельств, подтверждающих приемлемость данного AOP, а также от пределов, в которых ключевые события в условиях эксперимента были определены и признаны согласующимися с имеющимися данными о других ключевых событиях. Соответственно, следует считать, что AOP в целом представляет собой динамическое понятие. Оценка научных свидетельств, подтверждающих предлагаемый AOP, может быть проведена исходя из ответов на предварительно подготовленные вопросы. Применительно к AOP для сенсибилизации кожи задаваемые вопросы и ответы на них имеют следующий вид:
- Насколько подробно охарактеризован AOP? AOP для сенсибилизации кожи следует считать достаточно подробно охарактеризованным по меньшей мере с качественной точки зрения, когда значимые упоминаемые в нем события являются общепризнанными научным сообществом.
- Насколько убедительно представлена причинно-следственная связь исходного события и других ключевых событий с последствиями? Исходное молекулярное событие (реакции связывания с белками) основывается на долговременных, хорошо изученных органо-химических механизмах и реакциях. Наблюдаемая сенсибилизация обусловлена активностью кератиноцитов, пролиферацией T-клеток, а также в меньшей степени активацией/созреванием дендритных клеток.
- Какие имеются ограничения на получение свидетельств, подтверждающих AOP? Поскольку AOP для сенсибилизации кожи, как установлено выше, в целом считается пригодным для выявления опасных и вредных факторов, выраженных в качественной форме, отсутствует единое мнение по поводу того, какие показатели помимо реакционной способности необходимы для отражения потенциальных возможностей вызывать неблагоприятный исход.
- Является ли AOP характерным для конкретных жизненных стадий/возрастных классов (т.е. существуют ли критические этапы развития, на которых воздействие с наибольшей вероятностью приводит к неблагоприятным последствиям)? Либо: известно ли, что текущий этап развития не оказывает влияния на условия, приводящие к AOP, тем не менее конкретные ключевые события в ходе его реализации различаются в зависимости от этапа развития? Предполагаемый AOP для сенсибилизации кожи не зависит от этапа развития, пола или возраста.
- Предполагается ли, что исходное событие и последующие ключевые события будут сохраняться для различных таксонов? Несмотря на то что при проведении испытаний in vivo основное внимание уделяется избранным видам млекопитающих, включая человека, ключевые события согласно данному AOP следует считать типичными для всех млекопитающих.
Более подробно перечисленные аспекты раскрываются ниже в тексте настоящего стандарта.
3.2 Оценка по совокупности имеющихся свидетельств для подтверждения AOP
Дополнительным аспектом оценки предполагаемого AOP является использование критериев Хилла (см. [43]) для подтверждения его приемлемости по совокупности имеющихся свидетельств. Применительно к предполагаемому AOP для сенсибилизации кожи в этой связи подлежат рассмотрению следующие аспекты:
- Согласованность зависимости «доза — эффект». Несмотря на невозможность приведения конкретных ссылок на источники, которые содержали бы требуемые выводы, анализ данных, полученных экспериментальным путем на примере отдельных соединений (например, 1-хлор-2,4-динитробензола), в целом свидетельствует о согласованности зависимости «доза — эффект» как в пределах промежуточных показателей, так и между ними (см. приложение A). За некоторыми исключениями, такая согласованность имеется для обладающих аллергенным действием веществ, действие которых обусловлено ковалентным связыванием с белками, а также не обладающих аллергенным действием веществ на мышах, морских свинках и человеке; это особенно верно в случае веществ, обладающих очень сильным и сильным аллергенным действием, и в наименьшей степени — веществ, обладающих слабым аллергенным действием и не обладающих аллергенным действием. Единственное возражение здесь может вызвать тот факт, что результаты ряда прошлых экспериментов, в частности с использованием морских свинок, изначально не были предназначены для изучения зависимости «доза — эффект». Сведения о реакционной способности веществ свидетельствуют об очень высоком уровне согласованности зависимости «доза — эффект» независимо от применяемого метода. В основном же имеющиеся данные по испытаниям in vitro носят фрагментарный характер и зачастую представлены лишь качественными оценками (т.е. да/нет).
- Согласованность во времени ключевых событий и неблагоприятного исхода. Последовательность биохимических и физиологических событий, конечным результатом которых становится сенсибилизация кожи, характеризуется высокой степенью соответствия (см. [38], [48], [114], [4], [17], [3]).
- Выраженность, закономерность и специфичность зависимости между неблагоприятным исходом и исходным событием. Следует отметить чрезвычайно высокую степень выраженности, обоснованную закономерность, а также высокую специфичность зависимости между развитием сенсибилизации кожи in vivo и связыванием белков in chemico. Это в первую очередь действительно для реакций, первоочередной молекулярной мишенью в которых является тиол (см. [106]). Данные линейного регрессионного анализа свидетельствуют о чрезвычайно высокой степени корреляции результатов для разных лабораторий/отдельных протоколов как в рамках применения методов с деплецией (обеднением) нуклеофилов или образованием аддуктов, так и между этими методами (см. [106]).
- Биологическая правдоподобность, когерентность и непротиворечивость экспериментальных свидетельств. Доступные экспериментальные свидетельства, полученные in chemico, in vitro и in vivo, логически последовательны и не вступают в противоречие с механистической моделью, в которой используются ковалентные реакции и которая построена на основе существующих теоретических представлений о связывании белков (см. [38], [48], [3]). В отдельно взятых случаях (например, при исследованиях 1-хлор-2,4-динитробензола), когда одно и то же соединение подвергается различным испытаниям (см. приложение A), когерентность и непротиворечивость имеющихся экспериментальных данных достигают высокого уровня.
- Альтернативные механизмы, которые логически существуют, и область, в которой они могут отвлекать от предполагаемого AOP. Следует отметить, что альтернативные механизмы воздействия, в случае их признания, требуют отдельного AOP. В то время как ковалентные реакции с тиоловыми группами и в меньшей степени с аминными группами очевидным образом подтверждают предполагаемый AOP, реакции, мишенью которых выступают иного рода нуклеофилы, могут как подтвердить, так и не подтвердить предполагаемый AOP. Имеющиеся ограниченные данные по химической реакционной способности указывают на возможность протекания двух параллельных реакций, из которых преимуществом обладает та, которая протекает быстрее. Тем не менее данная гипотеза должна быть доказана путем проведения испытаний in vitro или in vivo.
- Наличие неопределенностей, несоответствий и пробелов в данных. Факторы неопределенности включают структурные и физико-химические ограничения в части теоретической и полученной в результате измерений реакционной способности (см. [106]), приоритетность наиболее вероятных аминокислотных мишеней (например, цистеина по сравнению с лизином) (см. [86]), приоритетность экспрессии Th1, или типа 1 (IFN - \gamma) по сравнению с Th2, или типа 2 (IL-2, IL-4, IL-13), профили секреции цитокинов (см. [45]), а также показатели сенсибилизации на отличающихся моделях in vivo.
Кроме того, имеющиеся данные в отдельных случаях демонстрируют несоответствия. Так, существуют расхождения в ответе, получаемом in vitro, для близкосхожих химических веществ (см. [74], [67]). Наблюдаются расхождения для очень схожей химической продукции как в пределах отдельных групп результатов испытаний, так и между ними при проведении исследований in vivo (см. приложение C публикации Европейского центра экотоксикологии и токсикологии химических веществ [34]). В высокой степени гидрофобная химическая продукция, характеризующаяся аллергенными свойствами в условиях in vivo, не проявляет активности при испытаниях в водной среде в условиях in chemico или in vitro. Специалистам пока только предстоит разобраться в специфике взаимосвязи между раздражением и сенсибилизацией.
Пробелы в данных. Несмотря на имеющиеся сведения о более чем 50 химических реакциях, обусловленных ковалентным связыванием с тиолом или первичными аминогруппами (см. [86]), данные о результатах исследований in vitro для кератиноцитов, дендритных клеток и T-клеток, а также данные по сенсибилизации при наблюдениях in vivo являются неполными, поскольку они не охватывают целиком соответствующие химические пространства, относящиеся к данным реакциям; совокупность данных, полученных в условиях in chemico, также не отличается полнотой, особенно в отношении реакций, предпочтительной мишенью которых выступают аминокислоты, отличные от цистеина.
Заключительная составляющая подхода, реализуемого ОЭСР при использовании концепции AOP, — это оценка количественных характеристик AOP. Она включает анализ экспериментальных данных и моделей, используемых для количественного определения как исходных молекулярных событий, так и последующих ключевых событий. Кроме того, она предполагает понятное определение пороговых значений и зависимости «ответ — ответ», необходимых для ранжирования данных о явлениях, наблюдаемых in chemico и in vitro, применительно к последствиям, которые могут иметь место in vivo.
Что касается непосредственно сенсибилизации кожи, то наибольшим затруднением здесь является переход от качественной к количественной интерпретации AOP. В то время как совокупность сведений, полученных экспериментальным путем, доступные эмпирические данные и необходимый уровень доверительности AOP, формируемый по совокупности имеющихся свидетельств, подтверждают приемлемость AOP как способа для выявления и описания потенциальной способности химической продукции оказывать сенсибилизирующее воздействие, дальнейшая оценка этих же показателей ясно указывает на недостаточные на сегодняшний день возможности по достоверному прогнозированию такой способности в относительном выражении. Европейский центр по валидации альтернативных методов на сегодняшний день использует в своей работе критерии оценки по совокупности имеющихся свидетельств при проведении валидационных исследований.
Один из вопросов, нуждающихся в рассмотрении, касается данных in vivo, на основе которых следует осуществлять ранжирование зависимости «ответ — ответ». С учетом того, что метод LLNA позволяет непосредственно количественно оценивать величину неблагоприятных последствий (см. [16]), с недавнего времени соответствующие базы данных представлены в открытом доступе (см. [39], [51]). Результаты испытаний по методу LLNA зачастую сравнивают с результатами, которые были получены с использованием альтернативных методов (например, как описано в [11], [67]). Такое взаимно однозначное сопоставление, однако, может оказаться не лучшим подходом. Согласно [16] LLNA имеет свои определенные ограничения, включая непостоянство значений EC3 или любых других значений (т.е. ECx) в пределах механистически выделяемых классов химической продукции с одинаковой или приблизительно одинаковой реакционной способностью. Специалистам, таким образом, пока только предстоит разобраться в специфике взаимосвязи между раздражением и сенсибилизацией in vivo.
3.3 Подробная информация для подтверждения AOP
При том что наиболее существенные факторы, определяющие наступление нежелательных последствий, как следует полагать, имеют токсикологическую природу, очевидно также, что абсорбция через кожу и в меньшей степени ее проницаемость могут иметь большое значение для оценки способности химической продукции вызывать сенсибилизацию кожи. Само собой разумеется, что химическая продукция не может приводить к тем или иным реакциям, трактуемым как сенсибилизация, в глубоко лежащих слоях эпидермиса до тех пор, пока вначале она не абсорбируется и не проникнет сквозь его верхние слои (см. [20]). Эпидермис, и в первую очередь его роговой слой (т.е. омертвевшие кератинизованные клетки эпидермиса), представляет собой важнейший барьер для дермального поглощения. Таким образом, под биологической доступностью при сенсибилизации кожи чаще всего подразумевают проницаемость рогового слоя. Исследователями были приложены значительные усилия к выполнению количественного определения проницаемости рогового слоя кожи (см. [66]) и оценке постоянного уровня абсорбции кожей органических веществ при нанесении их в виде водных растворов (см. [91]). Внутрикожный перенос вещества происходит за счет пассивной диффузии как следствие градиента концентрации между поверхностью нанесения и границей раздела эпидермис — дерма. Несмотря на наличие утвержденных необходимых руководств по проведению испытаний in vivo и in vitro (см. [79], [80] соответственно) имеющихся экспериментальных данных недостаточно для разрешения всех вопросов, касающихся переноса веществ в эпидермисе (см. [28]), при этом особые затруднения вызывает вопрос взаимосвязи относительной абсорбции химической продукции и создаваемой ею дермальной нагрузки (т.е. количеством химической продукции на единицу площади). Дополнительно анализ экспериментальных данных свидетельствует, что на биодоступность дермы также могут оказывать влияние коэффициент распределения «октанол — вода», размер молекул, а также летучесть или испаряемость (см. [26], [42], [95]).
Для оценки биологической доступности разработаны соответствующие модели in silico, как фармакокинетические, основанные на физиологических процессах, так и традиционные, структурно-активностные, а также методы экспериментальных исследований in vitro и in vivo. Большинство применяемых подходов предусматривает достижение баланса между скоростью испарения химической продукции и скоростью ее абсорбции кожей. В структурно-активностных моделях in silico зачастую используются такие параметры, как давление пара, коэффициент распределения «1-октанол — вода», растворимость в воде и/или молекулярные массы в качестве молекулярных дескрипторов.
Основу для моделей, реализуемых in silico, как правило, составляет ряд допущений, в частности следующих: 1) общая доза химической продукции находится в пределах минимальной дозы, при которой можно наблюдать абсорбцию первого порядка; значения верхнего предела обычно принимаются равными 100 мкг·см-2; 2) процессы испарения и абсорбции протекают независимо друг от друга; 3) рассматриваемое соединение не связывается необратимо с кожей; 4) абсорбционный поток представляет собой часть максимального потока, причем последний прямо пропорционален растворимости в липидах и обратно пропорционален молекулярной массе; и 5) поток испарения увязан с законом Генри, где эпидермальный липид является относительным растворителем с поправкой на поток воздуха. Модели, реализуемые in vitro и in vivo, обычно предусматривают следующее: 1) проницаемость кожи и поток испарения обладают температурной зависимостью (в диапазоне температур от 20 °C до 40 °C), ионизация оказывает влияние на процесс дермальной абсорбции (необходимо, чтобы не менее 10% химической продукции находилось в неионизированном состоянии); 2) система растворителей не должна негативно сказываться (по сравнению с использованием воды) на барьерных функциях кожи (см. [91]).
Интенсивность дермальной абсорбции зависит от концентрации вещества; в то же время точная зависимость между концентрацией и процентной долей поглощаемого вещества в настоящее время неизвестна (см. [28]). В отсутствие единой общепризнанной модели действует консервативный, но широко используемый подход, в соответствии с которым уровень абсорбции предполагается считать равным 100% (см. [92]). Поскольку оценка биологической доступности вещества может быть частью любого исследования, сама по себе она не рассматривается как неотъемлемая часть процесса классификации химической продукции, и использовать ее результаты следует с учетом тех известных неопределенностей, которые присущи имеющимся данным.
Этапы 2 — 4. Ключевое событие 1). Реакции связывания с белками. Реакционная способность и метаболизм
Начиная с 1930-х гг. увеличивается количество свидетельств, подтверждающих, что основным этапом, позволяющим оценить способность промышленных органических соединений вызывать сенсибилизацию кожи, является образование ими устойчивых гаптен-белковых конъюгатов (см. [94], [38], [48]). Соответственно, в качестве исходного молекулярного события, приводящего к сенсибилизации кожи, в рамках настоящего AOP рассматривается ковалентное связывание электрофильных химических агентов с определенными нуклеофильными участками в молекулах белков кожи (см. [38], [48]). Реакции связывания с белками являются инструментом для выявления разнообразных химических структур, способных вызывать сенсибилизацию кожи, которые могут приводить либо не приводить к различного рода проявлениям при последующих ключевых событиях AOP.
В противоположность химическим взаимодействиям, опосредуемым рецепторами (например, связыванию с эстрогеновыми рецепторами), электрофилы не обладают какой-либо избирательностью в отношении молекулярных мишеней. Так, например, согласно [117] по результатам изучения состояния митохондриальных белков клеток после обработки последних двумя различными электрофильными веществами констатировали факт образования аддуктов с более чем 800 белками. Кроме того, некоторые химические вещества, такие как акролеин и изотиоцианаты, способны реагировать сразу с несколькими различными нуклеофильными химическими заместителями. Как следствие, выявление конкретных белков-мишеней в рамках настоящего AOP не рассматривается как особо важное с точки зрения достоверной точности прогнозирования развития сенсибилизации кожи. Также предлагается считать, что реакционная способность, фактически установленная при помощи определенной нуклеофильной мишени или на определенной нуклеофильной модели, не обязательно связана с конкретной химической реакцией, поскольку многие реакции могут быть направлены на один и тот же химический заместитель [106].
Химическая реакционная способность как таковая, а также результаты ее измерений и оценки были подвергнуты анализу в целом ряде недавних работ (см. [38], [93], [36], [86], [106]). В случае сенсибилизации кожи и иных токсикологических оцениваемых показателей, для которых существенным является связывание с белками, роль биологических нуклеофилов предположительно должна принадлежать отдельным аминокислотам. Вероятность образования аддуктов с каждой такой аминокислотой зависит от относительной жесткости/мягкости электрофилов и нуклеофилов (см. [106]). К нуклеофильным участкам, взаимодействие с которыми может вызывать сенсибилизацию кожи, в порядке убывания жесткости относятся следующие: 1) тиоловые группы цистеина и глутатиона; 2) атомы серы метионина; 3) первичные аминогруппы лизина и аргинина; а также 4) вторичные аминогруппы гистидина (см. [106]). Безрезультатность определения конкретного биологического нуклеофила должна рассматриваться как менее значимое обстоятельство по сравнению с информацией об электрофилах. В соответствии с концепцией жестких и мягких кислот и оснований мягкий электрофил обладает относительным преимуществом перед мягким нуклеофилом, тогда как жесткий электрофил обладает относительным преимуществом перед жестким нуклеофилом. Таким образом, для ряда электрофилов, механистически относимых к одной и той же группе в пределах конкретной предметной области, относительная скорость реакции между каждым электрофилом и потенциальным нуклеофилом должна оставаться одинаковой.
Другими словами, если показатели абсолютной реакционной способности при проведении испытаний могут различаться от протокола к протоколу, относительная реакционная способность, как правило, не должна существенно различаться (см. [106]).
Экспериментальное исследование связывания с низкомолекулярными модельными нуклеофилами показывает, что в рамках конкретных реакций в пределах действующего механизма уровень реакционной способности в значительной степени различается. Кроме того, если одни соединения связываются исключительно с тиолами или аминами, то другие способны образовывать связи с широким перечнем нуклеофилов. Тем не менее в целом каждый отдельно взятый электрофил, вероятнее всего, проявляет предпочтение к конкретному нуклеофилу. Например, доказано, что изотиоцианаты преимущественно связываются с лизиновыми остатками (см. [14]), хотя в то же самое время они энергично и быстро реагируют с цистеином (см. [104]). Изотиоционаты способны также оказывать генотоксическое действие (см. [49]), что свидетельствует о возможности их реакции с нуклеиновыми кислотами. Природу такого их поведения чаще всего объясняют, ссылаясь на данные квантового химического анализа реакционной способности аминокислот и нуклеиновых кислот (см. [64]).
В более сложных системах предпочтительный характер выбора нуклеофильной мишени может маскироваться рядом других факторов. Само собой разумеется, что возможность взаимодействия с мишенью определяется количеством имеющихся у белка цистеиновых или лизиновых остатков. Например, у сывороточного альбумина, основного белка сыворотки крови, 10% аминокислотных остатков приходятся на лизин, и в то же самое время альбумин имеет очень мало свободных остатков цистеина. Очевидно также, что участки-мишени (например, цистеиновые или лизиновые), расположенные на внешней поверхности молекулы белка, с большей вероятностью могут вступать в реакцию с электрофилами, чем аналогичные участки, находящиеся в бороздках или складках белка. Такие пространственные ограничения обусловлены как особенностями первичной структуры (т.е. последовательностью расположения аминокислот), присущей молекулам пептидов и белков, так и наличием у последних вторичной и третичной структур, формирование которых происходит за счет образования дисульфидных мостиков, а также за счет складывания и сворачивания аминокислотных цепочек. Аналогичным образом на вероятность протекания той или иной реакции может влиять микросреда в месте расположения такого реакционно-активного участка (например, гидрофильная или гидрофобная). В частности, свободные цистеиновые остатки в изобилии представлены у белков, находящихся в водном цитозоле, а не у тех, которые локализуются в безводных наномембранах (см. [45]).
В качестве событий, дополнительно подтверждающих факт связывания с белками, могут рассматриваться явления метаболизма и/или абиотической трансформации (например, автооксидации) (см. [58]). В условиях in vivo кератиноциты выступают как первичные пункты метаболизма в структуре кожи (см. [107]). Существуют методы in silico для определения активных метаболитов (см. [31], [89], [96]), однако достоверность прогнозирования в случае их применения может сильно различаться в зависимости от конкретной моделируемой реакции. Подготовлено предложение о возможности проведения анализа метаболических реакций in vitro с использованием смеси на основе содержащихся в коже цитохромов P450 (см. [22]). Не так давно появилась публикация [35], в которой описывается метод исследований in vitro с использованием новой линии репортерных клеток-кератиноцитов, обладающих метаболическим потенциалом. Согласно [40] разработан способ моделирования in vitro путем форсирования процессов окисления с использованием системы «пероксидаза — пероксид» для имитации окислительных преобразований. Последний из указанных методов (см. [40]) в настоящее время является наиболее перспективным. В его пользу говорит то, что, с одной стороны, критерии протокола испытаний должны быть достаточно жесткими, чтобы исключить ложноотрицательные результаты, с другой стороны, вероятность получения ложноположительных результатов в подобных условиях возрастает.
Реакции окисления простых соединений, таких как полифенолы и ненасыщенные спирты, подробно описаны и легко моделируются in silico (см. [13]). Напротив, метаболизм более структурно-сложной химической продукции, в особенности той, которая обладает потенциалом для множественных реакций, изучен гораздо хуже, а построение прогнозов для них осложняется недостаточным пониманием того, какие метаболиты с большой вероятностью могут образовываться (см. [31], [89], [96]).
Этап 5. Ключевое событие 2). Биохимические пути развития сенсибилизации кожи
Биохимические или внутриклеточные пути развития ответа в связи с воздействием активной химической продукции на молекулярные мишени к настоящему времени исследованы не полностью. Тем не менее, по имеющимся сведениям, ответ при сенсибилизации может сопровождаться реакцией гаптен-белковых конъюгатов (далее — гаптены) с белками на поверхности клеток, что в свою очередь приводит к активации сигнальных путей митогенактивируемых протеинкиназ. В частности, доказано, что биохимические пути с участием киназ, управляемых внеклеточным сигналом (c-Jun N-терминальных киназ и киназ p38), активируются при воздействии химической продукции, способной образовывать связи с белками (см. [109]). Роль этих путей особенно велика при развитии ответа на воздействие кожных аллергенов в кератиноцитах и дендритных клетках.
Этап 6. Ключевое событие 2). События в кератиноцитах
Гаптены также могут вступать в реакцию с белками на поверхности клеток и активировать пути ответа в кератиноцитах (см. [116]). Поглощение гаптенов кератиноцитами влечет за собой целый ряд событий, включая выброс провоспалительных цитокинов и возбуждение цитопротекторных клеточных путей. Активация провоспалительного цитокина IL-18 обусловлена расщеплением неактивного белка-предшественника IL-18 каспазой-1 при посредстве инфламмасом (см. [62]). Аллергены могут активировать инфламмасомы ([108], [115]) и тем самым вызывать выработку IL-18. Внутриклеточные Nod-подобные рецепторы (Nod-like receptors — NLR) включают в себя ряд сенсоров повреждений клеточных структур. После активации (ее механизм в настоящее время неизвестен) NLR олигомеризуются, образуя молекулярные комплексы (т.е. инфламмасомы), которые принимают участие в активации воспалительных каспаз, в том числе каспазы-1. Изменение уровней содержания IL-18 внутри клетки свидетельствует о формировании ответа на воздействие химических аллергенов, на основе которого может быть дана оценка способности этих веществ вызывать сенсибилизацию (см. [112]).
Кроме того, воздействие аллергенов на кератиноциты приводит к возбуждению сигнальных путей, включающих элемент антиоксидантного/электрофильного ответа (ARE/EpRE) (см. [74]). Если сформулировать коротко, реакционно способная химическая продукция связывается с Keap1 (Kelch-подобным ECH-ассоциированным протеином 1), который в нормальном случае ингибирует ядерный фактор 2, связанный с эритроидным фактором 2 (Nrf2). Освобожденный Nrf2 взаимодействует с другими ядерными белками и, образуя связи, активирует пути ARE/EpRE, в которых наряду с остальными принимают участие цитопротекторные гены НАДФН-хинон-оксидоредуктаза 1 (NQ01) и глутатион-S-трансфераза (GSHST) (см. [74], [1]). Анализ in vitro по гену-репортеру на основе активации через элемент ARE/EpRE подтвердил наличие ответа на известные аллергены в кератиноцитах HaCaT [35]. Наблюдение за экспрессией ARE/EpRE-зависимых генов, а также других цитопротекторных генов (в том числе CYP1A1, MT1 и MT2) в клетках HaCaT — это в данном случае одна из составляющих проприетарного комплексного подхода in vitro, который может применяться для определения способности химической продукции вызывать сенсибилизацию (см. [67]). Исследовательским группам Natsch и McKim удалось доказать, что этот сигнальный путь носит количественный характер, который взаимосвязан с интенсивностью сенсибилизирующего действия, определяемого по методу LLNA (например, высокая, умеренная, слабая).
Этап 6. Ключевое событие 3). События в дендритных клетках
Как отмечается в предлагаемом AOP, при контакте аллергена с кожей незрелые дендритные клетки эпидермиса, также известные как клетки Лангерганса, и дермальные дендритные клетки выполняют роль антигенпрезентирующих клеток (см. [98], [99], [53]) и в этом качестве обеспечивают распознавание и поглощение гаптен-белковых комплексов, образующихся в результате ковалентного связывания. В итоге дендритные клетки теряют возможность захватывать новые гаптен-белковые комплексы и приобретают способность предъявлять комплексные образования аллерген-ГКГС нативным T-клеткам, данный процесс часто называют созреванием дендритных клеток. Одновременно под воздействием хемокинов фибробластных эндотелиальных клеток крови и эндотелиальных клеток лимфы (например, CCL19, CCL21), а также цитокинов эпидермиса (например, интерлейкина (IL), IL - 1\alpha , IL - 1\beta , IL-18, фактора некроза опухоли-альфа (TNF - \alpha) ) созревающие дендритные клетки мигрируют из эпидермиса в дерму кожи, а затем — в ближайшие лимфатические узлы, где и предоставляют T-клеткам соответствующие гаптен-белковые комплексы на молекулах главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) (см. [7], [87]). Активация дендритных клеток при воздействии аллергенов вызывает также определенные функциональные изменения в клетках. В частности, такие изменения затрагивают секрецию хемокинов и цитокинов, а также экспрессию хемокиновых рецепторов (см. [33]). Помимо этого, созревание дендритных клеток сопровождается активацией молекул главного комплекса гистосовместимости, костимуляторных молекул и молекул межклеточной адгезии (например, CD40, CD86, а также DC11 и CD54 соответственно) (см. [33], [110], [53]).
Изменениям в экспрессии поверхностных белковых маркеров и секреции хемокинов или цитокинов предшествуют каскады трансдукции клеточных сигналов. В роли отдельных составляющих путей трансдукции сигналов выступают киназы, при помощи которых осуществляются фосфорилирование или дефосфорилирование разнообразных субстратов, необходимые для реализации изменений в экспрессии или секреции целевых молекул. Отсюда следует, что эти составляющие каскадов трансдукции сигналов могут интерпретироваться как биологические маркеры, позволяющие проводить различия между обладающими аллергенным действием и не обладающими аллергенным действием веществами (см. [56]). В порядке изучения указанной возможности в рамках немногочисленных исследований по данной теме были организованы измерения экспрессии киназ для различных путей трансдукции сигналов (например, таких как P38 MAPK, ERK, PGK и NFkB) (см. [109], [33]). Миядзаве (Miyazawa) и его коллегам (см. [69], [70]) удалось проанализировать выработку P38 MAPK, митогенактивируемой протеинкиназы, ERK, киназы, регулируемой внеклеточными сигналами, в клетках линии THP-1. Важно отметить, что для активации киназных путей при экспозиции умеренных и слабых аллергенов концентрацию последних приходилось увеличивать в 10 и в 100 раз соответственно по сравнению с концентрацией, которая применялась при работе с сильными аллергенами. Результаты исследований, посвященных вероятной интерпретации явления притока кальция как одного из событий начального этапа активации дендритных клеток, позволяют предположить, что приток кальция — это второе по счету событие, следующее за индукцией активных форм кислорода (см. [71]). Сложность функций, выполняемых дендритными клетками в процессе развития сенсибилизации кожи, дополнительно подтверждается данными исследований перекрестных зависимостей между активностью киназ, притоком кальция и окислительным стрессом (см. [4]).
Геномные и протеомные исследования также позволяют выявлять биомаркеры в рамках анализа дендритных клеток. Анализ, выполняемый при помощи искусственно созданных матриц последовательностей нуклеотидов или путем проведения качественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для отдельных генов, в настоящее время уже применяется на практике при проведении исследований, посвященных определению различных, обладающих аллергенным действием и не обладающих аллергенным действием, веществ (см. [33]). Метод VITOSENS, основанный на использовании человеческих дендритных клеток, полученных из прогениторов CD34+ (CD34-DC), предусматривает наблюдение за дифференциальной экспрессией модулятора цАМФ-чувствительных элементов (cAMP-responsive element modulator — CREM) и рецептора моноцитарного хемотаксического белка-1 (CCR2), что позволяет различать исследуемую химическую продукцию по их способности или неспособности вызывать сенсибилизацию кожи (см. [44]). Кроме того, разработан метод геномного тестирования для раннего обнаружения аллергенов (Allergen Rapid Detection test — GARD), использующий сигнатуры биологических маркеров и предназначенный для выявления соответствующей химической продукции, воздействие которой может приводить к аллергическим реакциям у человека (см. [23]). В его основе лежит использование человеческой миеломоноцитарной клеточной линии MUTZ-3. Таким образом, в настоящее время определение уровней экспрессии иРНК при воздействии химической продукции в первую очередь может осуществляться при посредстве микроматриц ДНК, состоящих из 200 генов, о которых известно, что они принимают участие в путях развития соответствующих биологических реакций, таких как окислительный стресс или различные виды иммунного ответа на воздействие ксенобиотиков. Дополнительные средства оценки сенсибилизирующей способности того или иного соединения в условиях in vitro могут быть реализованы благодаря применению другой генной платформы, SENS-IS, которая предусматривает выполнение измерений повышенной экспрессии трех известных наборов генов посредством ПЦР в реальном времени (см. [41]).
Этап 7. Ключевое событие 4). События в лимфоцитах
T-клетки, как правило, реагируют на белково-гаптеновые комплексы, предъявляют им дендритные клетки при помощи молекул ГКГС.
Понимание механизма данного процесса на молекулярном уровне за последние годы изменилось в лучшую сторону (см. [61]). Если описывать коротко, ГКГС представляет собой мембранный белок, предназначенный для презентации низкомолекулярных антигенспецифичных пептидов, которые закрепляются в специальных «бороздках» молекул ГКГС в процессе их внутриклеточного синтеза и транспортировки к поверхности клетки. В связи с особенностями молекул ГКГС на поверхности клеток низкомолекулярные антигенспецифичные пептиды могут распознаваться рецепторами T-клеток как собственные или как несобственные (т.е. чужеродные). Если, например, пептид (часть упомянутого выше гаптен-протеинового комплекса) был распознан как чужеродный, T-клетка активируется, превращаясь в T-клетку памяти, которая затем начинает размножаться. В случае повторной активации этих T-клеток памяти путем презентации аналогичных пептидов дендритными клетками кожи они запускают процесс развития аллергического контактного дерматита (см. [114]).
Высокая важность процесса предъявления антигенов (т.е. прайминга T-клеток) способствовала разработке соответствующих аналитических методов in vitro (см. [61]). И если первое поколение таких методов позволяло выявлять сильные и очень сильные аллергены, то более поздние разработки, с использованием образцов нормальной периферической крови человека, из которых были предварительно удалены регуляторные клетки, препятствующие, как правило, переходу в фазу сенсибилизации, обеспечивают значительно более высокую достоверность определения пролиферации T-клеток (см. [113]). Другой родственный метод основывается на гипотезе, согласно которой существует корреляция между активностью контактных аллергенов и частотой встречаемости T-клеток, а также иммунным ответом T-клеточных рецепторов (см. [55]). Поскольку предположение о корреляции сенсибилизирующей активности с размером популяций специфичных для определенного контактного аллергена эффекторных и регуляторных T-клеток и их разнообразием имеет веское основание, в дальнейшем можно ожидать появления еще одного нового поколения методов in vitro для изучения прайминга подобных клеток. В этой связи следует отметить, что пролиферация клеток лимфатических узлов является основой метода LLNA.
Предположительно наиболее заметной особенностью поведения лимфоидных тканей при сенсибилизации является избирательный характер секреции цитокинов. Согласно результатам работ, ранее проведенных Дирманом и его коллегами (см. [45]), лимфоидные ткани мышей, подвергнутые воздействию классических электрофилов, которые образуют конъюгаты с белками путем нуклеофильного замещения гало-нитроароматических соединений (например, 1-хлор-2,4-динитробензола и 1-фтор-2,4-динитробензола), проявляют высокие уровни содержания цитокина Th1 IFN - \gamma и при этом низкие уровни цитокинов Th2 IL-5 и IL-10. Напротив, в случае воздействия на такие ткани 2,4-динитробензолсульфонилхлоридом, образующим конъюгаты с белками путем нуклеофильного замещения сульфонилгалогенидов, ацилирующего агента тримеллитового ангидрида или флуоресцинизотиоцианата, который образует конъюгаты с белками путем нуклеофильного присоединения к атому углерода изотиоцианатной группы (-N=C=S), отмечаются высокие уровни содержания цитокинов Th2 IL-5 и IL-10 и низкие уровни цитокина Th1 IFN - \gamma (см. [45]).
Таким образом, исходя из характерного связывания с белками клеток и сыворотки (см. [45]) представляются доказательства, что химическая продукция, стимулирующая Th1-цитокиновый ответ, избирательно образует связи с белками клеток, а стимулирующая Th2-цитокиновый ответ — с белками сыворотки крови. Впрочем, как бы ни было заманчиво считать, что электрофилы, которые преимущественно связываются с цистеином, вызывают экспрессию цитокинов по профилю Th1, а электрофилы, которые преимущественно связываются с лизином, вызывают экспрессию цитокинов по профилю Th2, в реальности данный механизм, скорее всего, не отличается подобной простотой.
Этапы 9 — 11. Сенсибилизация кожи in vivo
Исследованиям in vivo, включая те из них, которые проводятся на людях, принадлежит ключевая роль в эволюции знаний о процессе сенсибилизации кожи. При испытаниях с целью контроля степени сенсибилизации человеческой кожи применяется так называемый метод патч-теста на повторное повреждение кожи человека (human repeat insult patch test — HRIPT), с подробным описанием которого можно ознакомиться в [68]. Показателем, определяемым экспериментальным путем для данного вида исследований, может являться неблагоприятный исход, обозначаемый как аллергический контактный дерматит. Предполагается, что воздействие кожных аллергенов приводит к появлению нежелательных последствий только по достижении пороговой дозы. Считается также, что после превышения этой пороговой дозы степень выраженности нежелательных последствий возрастает пропорционально дозе, а следовательно, общая доза на единицу площади кожи (например, мкг/см2) должна рассматриваться как важнейший определяющий фактор подобного воздействия. В этом отношении имеющиеся клинические данные для человека полностью подтверждаются данными соответствующих опытов на животных (см. [8]). Результаты наблюдений согласуются с механизмом развития иммунной реакции, принятым согласно настоящему AOP и устанавливающим, что для наступления неблагоприятного исхода требуется активация некоторого числа дендритных клеток с их последующей миграцией в лимфатические узлы для инициирования дальнейших последовательных биологических событий (см. [8]).
В настоящее время данные опытов in vivo с использованием животных моделей остаются главным источником информации при оценке сенсибилизирующей активности химической продукции. Обзор применяемых для этого методов, позволяющих получить оценку сенсибилизации кожи, приведен в [3]. К ним относятся окклюзионный патч-тест на морских свинках (см. [27], [78], тест максимизации Магнуссона — Клигмана на морских свинках [60], [78], [63] и метод LLNA с использованием мышей [15], [52], [82] - [84]. Положительным результатом при проведении окклюзионного патч-теста и теста максимизации на морских свинках считается наступление неблагоприятного исхода, определяемого как развитие контактной гиперчувствительности.
Сходства и различия результатов, получаемых с помощью тестов на морских свинках, посредством применения метода LLNA, а также при возможности путем проведения испытаний на человеке, рассматриваются в рамках методической схемы IPCS MOA (см. [25]) и подлежат интерпретации в соответствии с критериями Бредфорда Хилла. Они имеют значение для оценки рисков для здоровья человека и классификации и маркировки химической продукции в соответствии с действующими стандартами, однако в гораздо меньшей степени они существенны для одобрения AOP и его использования при формировании классов опасности химической продукции и выработки соответствующих подходов к проведению испытаний и оценки.
3.4 Методы и базы данных для ключевых событий AOP
При переходе от качественной формы AOP к количественной форме AOP возникает ряд затруднений. Одним из таких затруднений является ответ на вопрос: как результаты неблагоприятного исхода in vivo преобразовать в соответствующую шкалу для AOP? Однако с учетом того, что метод LLNA позволяет непосредственно количественно оценить величину неблагоприятных последствий (см. [16]), а соответствующие базы данных с недавнего времени находятся в открытом доступе (см. [39], [51]), результаты, полученные по методу LLNA, нередко используются для сравнения с результатами, получаемыми при применении альтернативных методов (см., например, [10], [74], [11], [67]).
Главное ограничение преобразования выраженного в качественной форме AOP для сенсибилизации кожи, обусловленной ковалентным связыванием с белками, в количественную форму AOP, таким образом, заключается в отсутствии баз данных с результатами испытаний, характеризующими отдельные ключевые события, которые имеют место на пути развития неблагоприятного исхода. Промежуточным решением для последовательного ранжирования химической продукции по активности вызывать сенсибилизацию кожи могут служить предпринимаемые в настоящее время попытки группирования данной продукции по ее относительной сенсибилизирующей активности (например, очень сильное, сильное, умеренное, слабое и отсутствие аллергенного действия).
Этапы 2 — 4. Ключевое событие 1). Реакции. Реакционная способность и метаболизм
Методы и базы данных для количественной оценки процессов связывания с белками смогли дальше продвинуться в своем развитии, чем методы и базы для других ключевых событий (см. [106]). Из числа последних наиболее представительные базы данных к настоящему времени собраны для таких явлений, как ответ кератиноцитов, в первую очередь с использованием клеточного сигнального пути Keap1/Nrf2/ARE/EpRE (результаты применения метода KeratinoSens), и активация дендритных клеток (результаты тестов на кожную сенсибилизацию Myleoid U-937 и тестов на активацию линии клеток человека).
Согласно общепринятому мнению методы, основанные на реакциях, в отличие от других способов определения химического подобия, обеспечивают более легкую интерпретацию результатов и более высокий уровень доверительности при их применении (см. [37]). Химические реакции, которые обуславливают ковалентное связывание с белками, не так давно были подвергнуты анализу (см. [94], [36], [86]). Кроме того, также были проанализированы экспериментальные исследования и оценка реакционной способности химической продукции (см. [38], [106]). Осуществляется разработка методик вычисления или методов in silico для прогнозирования такой химической реакционной способности; причем они различаются по сложности: от сравнительно простого подхода, заключающегося в классификации на основе двухмерных структурных признаков (т.е. зависимости «структура — активность», обеспечивающей качественное определение химических субструктур, потенциально обладающих реакционной способностью), как в случае с программным инструментарием ОЭСР — QSAR Toolbox (www.oecd.org/env/hazard/qsar), до более сложных моделей QSAR (т.е. количественного прогнозирования относительной реакционной способности), которые были описаны в [105].
Протоколы и базы данных in chemico
В то время как метионин, гистидин и серин обладают нуклеофильными группами, обнаруживаемыми в белках кожи, чаще всего изучается группа -SH в составе цистеина и группа \epsilon - NH_{2} в составе лизина. Слабые электрофильные взаимодействия с вовлечением тиоловой группы могут быть смоделированы при помощи малых молекул, таких как меркаптопропионат, пропантиолят или нитробензолтиол (см. [106]), а также цистеина, ацетилцистеина либо белков, содержащих цистеиновый остаток (см. [77], [76], [38], [5]). Наиболее широко используемый в экспериментах на слабую электрофильную реакционную способность модельный нуклеофил — это глутатион (GSH, L - \gamma - \text{глутамил} - L - \text{цистеинил} - \text{глицин} ) (см. [50], [104], [24]), основной клеточный тиол и наиболее часто встречающийся пептид с низкой молекулярной массой в клетках эукариотов (см. [10]).
Несмотря на разнообразие существующих протоколов, разработанных для проведения испытаний in chemico (см. [94], [106]), значительная часть из них предполагает использование GSH в качестве модельного нуклеофила, как правило, с растворением его в водном фосфатном буферном растворе. Применение протоколов, предусматривающих использование водных растворов, согласуется с предположением о том, что целевые тиолы по большей части ограничены цитозолем, прежде всего пространством между митохондриями (см. [117]). Как правило, по истечении времени, отведенного для протекания реакции, выполняется измерение концентрации свободных тиоловых групп. Подобные эксперименты на истощение молекулярных мишеней предполагают образование аддуктов, которое обычно не подтверждается. Доказана взаимосвязь между реакционной способностью с GSH и уровнем его токсичности, например, несмотря на структурное сходство, водная токсичность метакрилатов, кротонатов и акрилатов различается, что может быть объяснено их неодинаковой реакционной способностью по отношению к GSH. В данном случае наименее активными являются метакрилаты, активность кротонатов находится на среднем уровне, а у акрилатов она особенно высока (см. [118]).
Важность химических реакций в развитии сенсибилизации кожи свидетельствует, что определение границ химических пространств реакций является решающим для целей применения предлагаемого AOP. Ведется разработка систематизированных баз данных для химических пространств характерных реакций. В качестве примера можно привести существующие базы данных с результатами определения in chemico реакционной способности для акцепторов Михаэля (см. [118], [24], [95]). Использование модельных нуклеофилов, содержащих первичные аминогруппы (-NH2) наподобие лизина у аминокислот, недостаточно хорошо документировано, в этом случае применяется принцип определения относительной реакционной способности, как и для тиолов (см. [38]). В частности, в качестве заменителей для первичных аминов, таких как лизин, выступают n-бутиламин и пиридоксиламин. В настоящее время базы данных для аминов не в достаточной степени сформированы. Хорошо известно, что ацилгалогениды и ангидриды карбоновых кислот, а также в меньшей степени сульфонилгалогениды подвергаются гидролизу, оказавшись в водной среде. Этим объясняется тот факт, что ацилгалогениды, ангидриды карбоновых кислот и в меньшей степени сульфонилгалогениды зачастую не проявляют ожидаемой реакционной активности при их исследовании с применением протоколов, предусматривающих использование водных растворов.
Этап 5. Ключевое событие 2). Биохимические пути развития сенсибилизации кожи
В целом принято считать, что биохимические или внутриклеточные пути развития событий, обусловленные воздействием реакционно-способной химической продукции, имеют отношение к процессу сенсибилизации кожи, однако имеющиеся знания по данной проблеме не являются исчерпывающими. Доказано, что c-Jun N-терминальные киназы и киназы p38 активируются при воздействии химической продукции, способной образовывать связи с белками (см. [109]). Тем не менее данные соответствующих исследований затрагивают лишь малую часть известных соединений, в частности 1-хлор-2,4-динитробензол. В нескольких случаях в порядке изучения указанной возможности были организованы измерения экспрессии киназ для различных путей трансдукции сигналов (например, таких как p38 MAPK, ERK, PGK и NFkB) (см. [33]). Согласно [69], [70] Миядзава (Miyazawa) и его коллеги проанализировали поведение P38 MAPK (митогенактивируемой протеинкиназы) и ERK (киназы, регулируемой внеклеточными сигналами) в клетках THP-1 и подтвердили, что 1-хлор-2,4-динитробензол, будучи очень сильным аллергеном, активирует оба вида клеточных путей и стимулирует высвобождение фактора TNF - \alpha , вызывая последующие фенотипические изменения в клетках. Как уже отмечалось выше, сигнальный путь Keap1/Nrf2/ARE/EpRE представляет собой потенциальный клеточный маркер сенсибилизации, поскольку Keap1 известен как насыщенный тиолами сенсорный белок, поддающийся ковалентной модификации электрофилами, что в свою очередь приводит к активации ARE-зависимых генов (см. [32]) (ARE — элемент антиоксидантной реакции).
Этап 6. Ключевое событие 2). События в кератиноцитах
В последние годы большое внимание исследователей привлекает поведение элемента антиоксидантного ответа ДНК (ARE), также иногда называемого элементом электрофильного ответа (см. [72]). В системе KeratinoSens, применяемой исследовательской группой Натча, для этого используется репортерный ген люциферазы, контролируемый одиночной копией ARE-элемента человеческого гена AKR1C2, в виде стабильной вставки в иммортализованные человеческие кератиноциты (клетки HaCaT) (см. [35]). Применение данной экспериментальной схемы обеспечивает получение робастных результатов для исследуемой химической продукции, испытания которой обычно проводятся в двенадцати различных концентрациях для каждого из трех обрабатываемых образцов, с последующим анализом существенных проявлений индукции активности генов (см. [73]). Одним из преимуществ данного метода является то, что он предположительно позволяет устранить вопросы, связанные с метаболизмом (см. [35]). В то время как на основе итоговых данных экспериментов, описанных в [74], был подготовлен целый ряд вариантов выполнения анализа активности ARE с использованием гена люциферазы, в [75] была приведена оценка предполагаемых рабочих характеристик метода на базе ARE путем сопоставления с известными данными исследований по методу LLNA для более чем 100 химических веществ. Сравнительные данные свидетельствуют о 79%-ном уровне согласованности, 79%-ном уровне чувствительности и 81%-ном уровне специфичности метода (см. [75]). Метод исследований in vitro, основанный на наблюдениях за индукцией IL-18 в кератиноцитах человека (клеточная линия NCTC 2544), также позволяет различать продукцию с сенсибилизирующим и раздражающим действием (см. [29], [65]). Другие исследования в данной области содержат сведения о хемокинах (например, CCL2, CCL4) и рецепторах (например, CCR7) (см. [33]).
Кроме того, метод анализа системы клеточных сигналов Keap1/Nrf2/ARE/EpRE также имеет механистическую основу для работ по изучению сенсибилизации кожи химической продукцией, осуществляемых компанией CeeTox Inc. (см. [67]). Данные работы предусматривают выполнение количественных измерений с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени показателей относительной распространенности иРНК для семи выбранных генов. Несмотря на то что основная часть полученной информации носит закрытый, корпоративный характер, опубликованные результаты представляют интерес. Следует отметить, что как в [35], так и в [67] имеющиеся сведения о клеточных сигналах объединяются с данными по химической реакционной способности в виде соответствующих алгоритмов, что может рассматриваться как первый шаг в использовании AOP для количественной оценки.
Этап 6. Ключевое событие 3). События в дендритных клетках
Как отмечается в работе [67], геномные и протеомные исследования также позволяют выявлять биологические маркеры, связанные с развитием сенсибилизации. VITROSENS представляет собой метод исследования in vitro, предусматривающий использование человеческих дендритных клеток, которые были получены из прогениторных клеток CD34+, содержащихся в пуповинной крови человека (CD34-ДК), и основанный на явлении дифференциальной экспрессии модулятора цАМФ-чувствительных элементов (CREM) и рецептора моноцитарного хемотаксического белка-1 (CCR2), что обеспечивает возможность различать продукцию, способную и неспособную вызывать сенсибилизацию кожи, основываясь на результатах шестичасовой экспозиции (см. [44]). В [44] описаны 13 целевых генов, локализованных при помощи микрочипов и затем подвергнутых скрининговому анализу посредством количественной ПЦР. Результаты, полученные при применении метода VITROSENS, позволили отделить группу из 10 веществ, способных вызывать сенсибилизацию, от группы из 11 веществ, не вызывающую сенсибилизацию, с 89%-ным уровнем согласованности, 97%-ным уровнем специфичности и 83%-ным уровнем чувствительности (см. [57]).
Анализ in vitro для поверхностных клеточных маркеров, цитокинов и хемокинов
Изменения в молекулах межклеточной адгезии, цитокинах и хемокинах представляют собой часть иммунного ответа при сенсибилизации кожи и могут выступать в качестве биологических маркеров такой сенсибилизации. Экспрессия подобных маркеров in vitro измерялась на примере клеточных линий, выведенных на основе эндотелиальных клеток, кератиноцитов и дендритных клеток.
Первичные клетки, включая дендритные клетки, производные от CD34+, и дендритные клетки, производные от моноцитных клеток CD14+, а также клетки, подобные дендритным, в том числе относящиеся к клеточной линии моноцитарного лейкоза человека (THP-1), клеточной линии гистиоцитарной лимфомы человека (U937), клеточной линии CD34+ острого миелоидного лейкоза человека (MUTZ-3), клеточной линии острого миелогенного лейкоза костного мозга (KG-1), клеточной линии острого промиелоцитарного лейкоза (HL-60), а также клеточной линии эритролейкемии человека (K562), использовались в исследованиях биологических маркеров для разделения веществ, обладающих и не обладающих сенсибилизирующим действием (см. [33], [110], [4], [53]).
С учетом того, что созревание дендритных клеток после воздействия сенсибилизирующего агента сопровождается изменениями в экспрессии поверхностных маркеров, такие поверхностные маркеры рассматриваются как перспективные кандидаты на роль первичных биологических маркеров активации дендритных клеток при разработке новых методов исследований in vitro на клеточных культурах. Как показывает анализ литературных источников, из всего многообразия биологических маркеров, активируемых в результате созревания дендритных клеток, к числу наиболее подробно изученных молекул межклеточной адгезии и костимуляторных молекул, экспрессия которых наблюдается в этом случае, на сегодняшний день относятся молекулы CD86, а также с некоторым отставанием CD54 и CD40. Выполнение тестов на активацию линии клеток человека (h-CLAT) (см. [100], [11]) посредством проточной цитофлуориметрии позволило оценить экспрессию CD86 и CD54 в клетках THP-1 после обработки их исследуемой химической продукцией. Сопоставление прогнозных заключений, подготовленных в соответствии с методом h-CLAT для 100 известных химических веществ, с данными исследований, проведенных по методу LLNA, свидетельствовало о 84%-ном уровне согласованности, 88%-ном уровне чувствительности и 75%-ном уровне специфичности метода (см. [11]). Несмотря на то что метод h-CLAT изначально разрабатывался для подготовки заключений в виде «да/нет» в отношении сенсибилизирующего действия исследуемых веществ, он также допускает возможность получения информации количественного характера в виде значений CD86 EC150 и CD54 EC200; причем оба этих показателя коррелируют с соответствующими значениями LLNA EC3 (см. [100]). В числе других примеров исследований с использованием клеток THP-1 можно упомянуть исследования, описанные в публикации [134]. Еще одна разновидность анализа, тест на сенсибилизацию кожи с использованием линии клеток U937 (myeloid U937 skin sensitisation test — MUSST), основана на измерениях экспрессии CD86 посредством проточной цитофлуориметрии (см. [2], [90], [88]). Модель построения прогнозов для нее формируется исходя из пороговой величины жизнеспособности (CV70), положительных результатов исследований (CD86 EC150) контрольной пробы растворителя. Сопоставление прогнозных заключений, подготовленных в соответствии с методом MUSST для 50 известных химических веществ, с данными исследований, проведенных по методу LLNA, подтвердило 83%-ный уровень согласованности, 81%-ный уровень чувствительности и 84%-ный уровень специфичности метода (см. [11]). Общие показатели результативности методов h-CLAT и MUSST при проведении сличительных испытаний выглядят весьма обнадеживающими (см. [101]).
После созревания дендритных клеток изменения, затрагивающие как секрецию цитокинов и хемокинов, так и экспрессию рецепторов, создают условия для миграции этих клеток в лимфатический узел. В центре внимания при проведении исследований по изучению сенсибилизации кожи находился целый ряд различных цитокинов (см. [53]). Среди хемокинов при этом наиболее многообещающим с точки зрения возможности различения веществ, способных и не способных вызывать сенсибилизацию кожи, был признан вариант IL-8. Данные исследований свидетельствуют, что в случае усиления секреции или транскрипции IL-8 может рассматриваться как самостоятельный биологический маркер, не уступающий в чувствительности изменениям экспрессии CD86; кроме того, для количественного определения содержания IL-8 может применяться метод ферментного иммуносорбентного анализа, который более простой и практичный с точки зрения выполнения скрининга с высокой пропускной способностью, чем метод проточной цитофлуориметрии, служащий для измерений экспрессии CD86 (см. [33]).
Подтвержденное явление экспрессии других разновидностей цитокинов при развитии сенсибилизации кожи, включая цитотоксичные IL - 1\alpha , IL - 1\beta , IL-18 и TNF - \alpha , может выступать как основа для последующей разработки альтернативных методов исследований, предусматривающих наблюдение за дендритными клетками. Если обобщить сказанное выше, то усиление секреции цитокинов/хемокинов либо экспрессии рецепторов должно отмечаться при испытаниях веществ, способных вызывать сенсибилизацию, но отсутствовать при воздействии веществ, не обладающих сенсибилизирующим действием. Следует, однако, иметь в виду, что в настоящее время количество химических веществ, испытанных с учетом данного критерия с применением более чем одного метода, ограничено, а полученные для некоторых из них результаты выглядят достаточно противоречивыми.
Чаще всего для исследований используется клеточная линия THP-1, обеспечивающая отслеживание наиболее хорошо изученных поверхностных маркеров CD86, IL-8, TNF - \alpha и p38 MAP, представляющих группы цитокинов, хемокинов и киназ соответственно. С учетом того, что основная цель использования биологических маркеров заключается в корректном распознавании веществ, обладающих и не обладающих сенсибилизирующим действием, выбор конкретного типа клеток или определенного маркера(ов) не должен оказывать существенного влияния на показатели повторяемости, воспроизводимости и специфичности метода.
Этап 7. Ключевое событие 4). События в лимфоцитах
Поскольку завершающей стадией процесса сенсибилизации является активация наивных T-лимфоцитов в регионарных лимфатических узлах, методы in vitro, предусматривающие использование T-клеток, должны быть пригодны как для подтверждения предлагаемого AOP, так и для определения химических веществ, способных вызывать сенсибилизацию. Как отмечалось выше, в большинстве случаев активация T-клеток, приводящая к формированию T-клеток памяти, происходит под влиянием гаптен-белковых комплексов, представленными дендритными клетками на молекулах ГКГС. Понимание данного процесса на молекулярном уровне за последние годы значительно улучшилось (см. [61]). В подавляющем числе применяемых протоколов процессу презентации антигена уделяется большое внимание, поэтому методы in vitro, основанные на использовании T-клеток, обычно оперируют данными о сокультурах, обработанных аллергеном дендритных клеток и модифицированных T-лимфоцитов с экспрессией определенных биологических маркеров (например, гамма-интерферона) или пролиферацией T-клеток в качестве искомых результатов. Многие из этих исследований в последнее время были рассмотрены в рамках [61]. В этой связи следует также напомнить, что процесс пролиферации клеток лимфатических узлов положен в основу метода LLNA.
Этапы 9 — 11. Сенсибилизация кожи in vivo
До настоящего времени результаты исследований in vivo остаются определяющими для оценки сенсибилизирующей способности химической продукции (см. [3]). Как упоминалось ранее, для исследований сенсибилизаций кожи человека применяется метод HRIPT (см. [68]). Другие методы in vivo предусматривают окклюзионный патч-тест на морских свинках (см. [78]), тест максимизации Магнуссона — Клигмана на морских свинках (см. [78]), а также метод LLNA с использованием мышей (см. [82] - [84]). В то время как данные, полученные при испытаниях на морских свинках, использовались для разработки количественных моделей, метод LLNA изначально разрабатывался для непосредственной количественной оценки сенсибилизирующей способности. Если сформулировать коротко, то относительная способность химической продукции вызывать сенсибилизацию кожи определяется путем получения значения ECx, которое представляет собой концентрацию химической продукции, необходимую для X-кратного увеличения пролиферации клеток в лимфатическом узле относительно параллельно используемого контрольного растворителя (т.е. порогового значения положительного ответа) (см. [18]). Поскольку метод LLNA не распространяется на фазу провокации, его можно рассматривать как усеченный метод исследования сенсибилизации in vivo. На основании данных, получаемых с помощью метода LLNA, исследуемые химические агенты могут быть разбиты на группы в зависимости от проявляемой ими сенсибилизирующей способности (например, очень сильный, сильный, умеренный и слабый аллерген и отсутствие аллергенного действия). Тем не менее согласно [19] метод LLNA имеет свои недостатки, в том числе вариабельность значений EC3 или любых других значений (т.е. ECx) в пределах механистически выделяемых изореактивных классов веществ. В настоящее время активизируются усилия по продвижению подхода, предусматривающего оценку способности продукции вызывать или не вызывать in vivo сенсибилизацию кожи, исходя из совокупности данных, получаемых с применением метода LLNA, путем опытов на морских свинках, а также в ходе исследований на людях.
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ 1-ХЛОР-2,4-ДИНИТРОБЕНЗОЛА (ДНХБ) К ВЕЩЕСТВАМ, СПОСОБНЫМ ВЫЗЫВАТЬ СЕНСИБИЛИЗАЦИЮ КОЖИ, С ПРИМЕНЕНИЕМ КОНЦЕПЦИИ ПУТИ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА (AOP)
Доступный объем информации AOP применительно к сенсибилизации кожи как следствию ковалентного связывания химических веществ с белками стремительно вырос за последнее десятилетие, что позволяет описать основные этапы данного AOP следующим образом.
Этап 1. Вещество-мишень должно обладать биодоступностью (т.е. оно должно быть способно проникать через роговой слой кожи эпидермиса).
Этап 2. Вещество-мишень должно относиться непосредственно к активным электрофильным веществам, превращаться метаболическим путем из химически неактивной субстанции (проэлектрофила) в активный метаболит либо в результате абиотического процесса, чаще всего окисления, превращаться из химически неактивной субстанции (преэлектрофила) в активное производное.
Этап 3. Местом воздействия на молекулярном уровне являются нуклеофильные участки-мишени (например, цистеиновые и лизиновые остатки) белков эпидермиса.
Этап 4. Исходное молекулярное событие представляет собой необратимое нарушение ковалентной структуры белков кожи (т.е. формирование гаптен-белкового комплекса или полного антигена). В условиях in vivo ответом на него является выработка специфичных T-клеток памяти.
Этап 5. Биохимические пути негативного воздействия конкретных электрофильных веществ на молекулярные мишени изучены недостаточно хорошо, но чаще они включают пути, связанные с формированием воспалительного процесса, в том числе явления митоген-активируемого белкового сигнального каскада и реакции на окислительный стресс, прежде всего в кератиноцитах и дендритных клетках.
Этап 6. Последствия воздействия на уровне клеток/ткани также изучены не полностью, но известно, что они включают в себя определенные эпидермальные реакции, а именно: 1) иммунное распознавание химических аллергенов кератиноцитами, специализированными эпидермальными дендритными клетками (т.е. клетками Лангерганса) и 2) дермальными дендритными клетками. Ответ в виде экспрессии специфических поверхностных клеточных маркеров, таких как молекулы адгезии, хемокины и цитокины, включая IL1\beta или IL-12p70, как правило, считается свидетельством созревания дендритных клеток.
Этап 7. К реакциям на уровне органов относятся:
a) миграция дендритных клеток в лимфатические узлы, где они предъявляют молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) нативным T-лимфоцитам (T-клеткам), с
b) последующей дифференциацией T-клеток и пролиферацией аллергенспецифичных T-клеток памяти.
Этап 8. В роли органа-мишени (органов-мишеней) выступают кожа и регионарные лимфатические узлы, в роли клеточных популяций-мишеней — популяции клеток иммунитета, в первую очередь T-клеток.
Этап 9. Ключевым физиологическим ответом на данном этапе является появление сенсибилизации.
Этап 10. Ключевая реакция организма выражается в формировании воспаления после провоцирующего воздействия химического вещества в фазе развития. Подобный ответ объясняется стимулированием специфичных T-клеток памяти, ранее выработанных в фазе индукции.
Этап 11. Системными последствиями воздействия химического вещества у млекопитающих следует считать аллергический контактный дерматит у человека и контактную гиперчувствительность у грызунов соответственно.
К конкретным доказательствам сенсибилизирующей способности ДНХБ на перечисленных этапах AOP относятся:
Этап 1. С учетом значения коэффициента распределения «октанол — вода» logKow = 2,40, небольших размеров молекул и умеренной летучести ДНХБ приведенная в литературных источниках информация не дает оснований полагать, что проникновение через кожу или биодоступность могут являться смягчающим фактором при развитии сенсибилизации под действием данного вещества.
Этап 2. Хотя ДНХБ усиливает экспрессию цитохромов P450 (см. [67]), экспериментально полученные доказательства того, что метаболизм может являться смягчающим фактором при развитии сенсибилизации под действием ДХНБ, отсутствуют.
ДНХБ представляет собой типичный электрофил, поддающийся ароматическому нуклеофильному замещению (SnAr) и относящийся к области применимости механизма SnAr (см. [36]). В соответствии с [106] данные, полученные для ДНХБ, свидетельствуют о его высокой реакционной способности при применении различных методов in chemico (см. таблицу A.1).
Сводная информация об определении реакционной способности ДНХБ in chemico
ДНХБ способен реагировать с множеством нуклеофилов. Относительные показатели его реакционной способности по сравнению с другими химическими веществами, ранее исследованными в соответствии с тем же протоколом, однозначно свидетельствуют о его высоком реакционном потенциале.
| Идентиф. N | Нуклеофил | Параметр, единица измерения | Значение | Время, с; pH; растворитель | Время реакции; соотношение нуклеофил:электрофил | Библиографический источник | Метод |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 26 | Глутатион (GSH) | t1/2(GSH) мин |
200 | 22; 7; ЭДТА-буферный раствор |
макс. 16 ч; 50:1 |
[136] | ВЭЖХ-УФ (210 — 300 нм) |
| 596 | Cor1C-420 (AcNKKCDLF) | RC50(Cor1) мМ |
0,07 | 37; 7,5; фосфатный буферный раствор (ФБР) 0,1 М |
150 мин; 1:10 |
[76] | УФ (непрореагировавший цистеин в реакции с монобромобиманом; возбуждение 385 нм, 480 эмиссия) |
| 735 | Глутатион | krel(GSH): CDNB 1 = CDNB |
1,00E+00 | 25; 7.5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[137] | УФ (GSH-конъюгат). k относительно 1-хлор-2,4-динитробензола |
| 855 | 4-нитробензил-пиридин (NBP) | k1(NBP) мин-1 | -2,71 | 80; 2-бутанон |
60 мин; 30:1 |
[138] | УФ (~560 нм) |
| 961 | Пиперидин | k(пиперидин) М-1 мин-1 | 1,15E+00 0,06 |
25 | - | [135] | - |
| 962 | Пиперидин | k(пиперидин) М-1 мин-1 | 9,20E-01 -0,04 |
25; этанол |
- | [135] | - |
| 1043 | Натрия метилат | k(метилат) М-1 мин-1 |
1,51E+00 0,18 |
25; метанол |
- | [135] | - |
| 1044 | Натрия метилат | k(метилат) М-1 мин-1 |
1,11E-01 -0,95 |
0; метанол |
- | [135] | - |
| 1171 | Глутатион | k(GSH) М-1 мин-1 |
0,72 — 0,14 | 22; 7; ЭДТА-буферный раствор |
макс. 16 ч; 50:1 |
[136] | - |
| 1172 | Глутатион | k(GSH) М-1 мин-1 |
0,42 — 0,38 | 25; 6,5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[137] | - |
| 1173 | Глутатион | k(GSH) М-1 мин-1 |
3,8 0,58 | 25; 7,5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[137] | УФ (GSH-конъюгат) |
| 1174 | Глутатион | k(GSH) М-1 мин-1 |
0,58 | 25; 7,5; ФБР 0,1 М |
15 мин; 1:1 |
[137] | Уст. по pH 6.5: k2 (уст. pH 7,5) = 10·k2 (эксп. pH 6,5); УФ |
| 1408 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
4,95E+00 0,69 |
25; этанол |
- | [135] | - |
| 1409 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
3,90E-01 -0,41 |
0; этанол |
- | [135] | - |
| 1410 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
1,05 0,02 | 10; этанол |
- | [135] | - |
| 1411 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
1,63 0,21 | 15; этанол |
- | [135] | - |
| 1412 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
2,90 0,46 | 20; этанол |
- | [135] | - |
| 1413 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
2,98 0,47 | 25; этанол |
- | [135] | - |
| 1414 | Натрия этилат | k(этилат) М-1 мин-1 |
3,26 0,51 | 15; этанол |
- | [129] | - |
| 1597 | Анилин | k(анилин) М-1 мин-1 |
1,79E-02 -1,75 |
50; этанол |
- | [135] | - |
| 1598 | Анилин | k(анилин) М-1 мин-1 |
9,75E-03 -2,01 |
35; этанол |
- | [135] | - |
| 1599 | Анилин | k(анилин) М-1 мин-1 |
2,13E-02 -1,67 |
35; этанол |
- | [135] | - |
| 1600 | Анилин | k(анилин) М-1 мин-1 |
1,93E-03 -2,71 |
50; этанол |
- | [135] | - |
| 1723 | Анилин | DPE(анилин) % деплеции (обеднение) | > 90 | 100; этанол |
2 ч | [129] | Метод: паровая баня; > 90 = выделение более 90% галогена |
| 2155 | Глутатион | DP(GSH): Gerberic % деплеции (обеднение) | 43,6 | 25; 7,4; ФБР |
15 мин; 1:100 |
[139] | 0,2 GSH : 20 мМ Эл; ОФ-ВЭЖХ (производная GSH/GSSH с ДНФБ; [141] |
| 2240 | Цисцеин-пептид (Cys-P.) (AcRFAACAA) | DP(Cys-P.): Natsh % деплеции (обеднение) |
100 | 30; ФБР 20 мМ |
24 ч; 1:100 |
[77] | ВЭЖХ-ДМД 214 нм |
| 2684 | Cor1C-420 (AcNKKCDLF) | DP(Cor1) % деплеции (обеднение) | > 98 | 37; 7,5; ФБР 0,1 М |
31 ч; 1:10 |
[76] | - |
| 2766 | Аргинин-пептид (Arg-P.) (AcFAARAA) | DP(Arg-P.): Aleksic % деплеции (обеднение) |
-1,73 | 37; 10; карбонатный буфер 50 мМ |
24 ч 1:100 |
[5] | ЖХ-МС/МС (электроспрей); с AcFAGAGA в качестве внутреннего стандарта |
| 2948 | Цистеин | Аддукт (Cys) (да/нет) |
Да | Водный раствор, NaOH | 10 мин; 1:1 |
[140] | Комнатная температура; титрование спиртовым раствором йода |
Этапы 3 и 4. Согласно [45] установлено, что ДНХБ преимущественно (в пять раз чаще) связывается с клеточными, а не сывороточными белками и что это не является специфической реакцией на белок. Клеточные белки считаются тиолонасыщенными, а сывороточные — тиолоненасыщенными белками. В соответствии с [67] 75% ДНХБ связывается с глутатионом после его 24-часовой деплеции (обеднения) (т.е. потери свободных тиолов).
Как отмечается в [124], [109], взаимодействие ДНХБ с дендритными клетками (ДК) происходит из-за деплеции (обеднения) глутатиона.
Этап 5. Предполагается, что в созревании ДК должны быть задействованы клеточные сигнальные пути, такие как MAPKs и NF-kappaB (кВ). Пути JNK и p38 MAPK подтверждают первичную активность при проявлении различного рода внешних стрессовых факторов, включая окислительный стресс и высвобождение воспалительных цитокинов. Путь ERK1/2 связан с регулированием пролиферации клеток. Доказано, что в образцах человеческих ДК, культивируемых из периферийных моноцитов CD14+, воздействие ДНХБ приводит к активации сигнальных путей p38 и JNK (см. [120]). В [70] убедительно продемонстрирована значимость сигнального пути p38 MAPK в процессе активации ДНХБ ДК-подобных клеток, представляющих линию моноцитарного лейкоза человека THP-1; впоследствии данные наблюдения были подтверждены в [65]. Кроме того, пути p38 MAPK и ERK1/2 могут быть активированы тринитрохлорбензолом (ТНБХ) (соединением, очень похожим на ДНБХ); в этом случае активация может быть ингибирована при помощи тиолового антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина, который предотвращает гаптенизацию (см. [124]).
В качестве вторичных посредников, контролирующих широкий спектр системных последствий, выступают активные формы кислорода. В частности, ими обеспечивается контроль над созреванием ДК за счет фосфорилирования белков после окисления тиола (т.е. цистеина). В [109] приведен пример активации методом «доза — эффект» с фосфорилированием путей p38 MAPK и JNK и ингибированием пути ERK1/2 при воздействии ДНХБ. Взаимосвязь между окислительным стрессом и активацией p38 MAPK, а также ингибированием ERK1/2 была продемонстрирована путем предварительной обработки антиоксидантом N-ацетил-L-цистеином.
Этап 5. Кератиноциты представляют собой наиболее многочисленную разновидность клеток в составе кожного эпидермиса. Известно, что они являются первичными пунктами метаболизма в структуре кожи и играют важную роль в активации эпителиальных ДК.
На примере кератиноцитов человека (клеток HaCaT) согласно [67] провели оценку отдельных генов, связанных с тремя видами сигнальных путей в клетках (Keap1/Nrf 2/ARE/EpRE, ARNT/AhR/XRE и Nrf1/MTF/MRE), активация которых, как считается, происходит при воздействии сенсибилизирующих агентов. Если коротко, была определена относительная распространенность одиннадцати генов, экспрессия каждого из которых контролируется при помощи какого-либо из этих путей. К генам, контролируемым Nrf2/ARE/EpRE, относятся: 1) NQO1, 2) AKR1C2, 3) тиоредоксин (TXN), 4) интерлейкин 8 (IL8), 5) альдегид-дегидрогеназа 3A(ALDH3A), 6) гемоксигеназа 1 (HMOX1), 7) ген мышечно-апоневротической фибросаркомы (MafF), а также 8) GCLC. Ген, контролируемый XRE, — это 9) CYP1A1. К генам, контролируемым MRE, относятся: 10) металлотионеин 1 (MT1), 11) металлотионеин 2 (MT2). Экспрессия генов оценивалась по шкале 4+, 3+, 2+, + и «без изменений». По данным отчета [67], для ДНХБ уровень экспрессии составил: NQO1 = 4+; AKR1C2 = 2+; TXN = без изменений; IL8 = +; CYP1A1 = +; ALDH3A = без изменений; HMOX = без изменений; MafF = +; GCLC = без изменений; MT1A = без изменений и MT2A = 2+. Микроматричный анализ обработанных ДНХБ клеток HaCaT (см. [111]) показал аналогичные результаты.
Метод KeratinoSens (см. [126]) предназначен для исследования зависимости «доза — эффект» (как правило, на трех параллельно обрабатываемых образцах для двенадцати концентраций) с целью выявления существенного повышения активности генов в условиях in vitro с использованием репортерного гена люциферазы, контролируемого одиночной копией ARE-элемента человеческого гена AKR1C2 в виде стабильной вставки в кератиноциты человека, принадлежащие к клеточной линии HaCaT. В соответствии со стандартной операционной процедурой (см. [126]) получены необходимые экспериментальные данные и определены значения средней максимальной индукции активности генов (Imax) и средней концентрации вещества, вызывающей повышение активности генов на 50% относительно контрольных значений (EC1.5). Последние получены путем линейной экстраполяции значений, находящихся выше и ниже порога индукции (как при определении значения EC3 для метода LLNA). Проведенные далее меж- и внутрилабораторные исследования сенсибилизирующей способности ДНХБ по методу KeratinoSens (см. [73]) свидетельствуют о повторяемом и воспроизводимом характере результатов (см. таблицу A.2).
Результаты меж- и внутрилабораторных исследований ДНХБ с применением метода KeratinoSens
| Лаборатория | Imax (кратная индукция) | EC 1,5, мкМ |
|---|---|---|
| A (по данным прошлых наблюдений) | 14,8 | 2,5 |
| A | 12,9 | 3,3 |
| B | 4,3 | 2,1 |
| C | 12,2 | 3,0 |
| D | 19,5 | 1,4 |
| E | 15,6 | 2,1 |
Культуры клеточной линии кератиноцитов человека NCTC 2544 подвергались воздействию ДНХБ с последующей оценкой клеточно-ассоциированного IL-18 спустя 24 ч после начала такого воздействия (см. [29]). Внутриклеточное содержание IL-18 оценивалось путем специальных процедур иммуноферментного анализа (ИФА) типа «сэндвич»; результаты были приведены как содержание из расчета пг/мг общего внутриклеточного белка. Воздействие ДНХБ приводит к существенному увеличению выработки IL-18 согласно зависимости «доза — эффект»; тем не менее это увеличение выглядит достаточно умеренным по сравнению с другими, более изученными аллергенами. Факт выработки IL-18 клетками HaCaT и HEL-30 при воздействии ДНХБ подтверждается данными, приведенными в [112].
Этап 6. Дендритные клетки для исследований in vitro могут быть получены из человеческих моноцитов или из прогениторных клеток пуповинной крови человека. Кроме того, характеристиками, присущими дендритным клеткам, обладают клетки некоторых иммортализованных линий. Незрелые ДК приобретают фенотип, отличительной особенностью которого является снижение экспрессии E-кадгерина и повышение экспрессии отдельных поверхностных клеточных маркеров (например, CD54 и CD86) с одновременным усилением секреции воспалительных цитокинов (например, IL1\beta , IL-8 и TNF\alpha ).
При использовании длительного времени экспозиции (24 и 48 ч) для ДК, полученных из моноцитов, воздействие ДНХБ, как указано в [121], вызывает существенное усиление экспрессии поверхностных биомаркеров CD54, CD86 и HLA-DR.
Согласно [132] дендритные клетки из периферических моноядерных клеток крови отвечают на воздействие ДНХБ активацией костимуляторной молекулы CD86, молекулы межклеточной адгезии CD54 и антигена HLA-DR.
В соответствии с [122] отмечается активация CD86 и интернализация молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса II в ДК-подобных клетках линии моноцитарного лейкоза человека THP-1 после 24 ч обработки ДНХБ; при этом, согласно наблюдениям, эффект активации усиливался в случае, когда одновременно с ДНХБ применялся гамма-интерферон.
У ДК, полученных из периферических моноцитов CD14+, воздействие ДНХБ вызывает экспрессию CD86 и выработку цитокина IL-8 по пути p38 MAPK (см. [109]).
У ДК из клеток пуповинной крови человека CD34+ воздействие ДНХБ вызывает экспрессию CD40 и HLA-DR и выработку IL-8 для всех из них вне зависимости от пути NF-кВ (см. [119]).
Доказано, что при использовании клеток ДК-подобной миелоидной линии U937 для проведения исследований по методу MUSST воздействие ДНХБ вызывает экспрессию CD86 при дозе, не являющейся цитотоксичной (см. [88]).
При использовании клеток линии HTP-1 для проведения исследований по методу h-CLAT было доказано, что воздействие ДНХБ вызывает увеличение экспрессии CD86 и молекул поверхностной клеточной адгезии CD54 на 150% и 200% соответственно (см. [100]). В [131] отмечено, что значения концентрации 2,30 и 2,66 мкг/мл для CD86 EC150 и CD54 EC200 соответственно достаточно высокие по сравнению с установленными для более чем 70 веществ, способных вызывать сенсибилизацию.
В основу метода VITOSENS положено наблюдение (при помощи метода ПЦР в реальном времени) за дифференциальной экспрессией модулятора цАМФ-чувствительных элементов (CREM) и рецептора моноцитарного хемотоксического белка-1 (CCR2) в ДК CD34+ после 6, 11 и 24 ч экспозиции (см. [44]). Разница экспрессии генов была определена как кратные изменения (т.е. как отношения уровней экспрессии для проб, подвергнутых воздействию, и контрольных проб растворителя) при воздействии ДНХБ, приводящем к существенному увеличению значений экспрессии как для CREM, так и для CCR2.
Установлено, что воздействие ДНХБ на клетки THP-1 усиливает экспрессию двух Nrf2-зависимых ARE-чувствительных генов, гемоксигеназы-1 (HMOX1) и NAD(P)H:хинон оксиредуктаза 1 (NQO1); ингибированную преинкубацией с N-ацетил-L-цистеном экспрессию CD86, а также экспрессию таких генов, как HMOX1 и NQO1 (см. [1]).
Этап 7a. Интернализация поверхностных молекул ГКГС класса II путем эндоцитоза антигенпрезентирующими клетками рассматривается как важная стадия выработки антигенов. Согласно [130] были изучены возможности использования в исследовательских целях явления эндоцитоза веществ, вызывающих контактную сенсибилизацию, дендритными клетками мышей. Если коротко, ДК, находящиеся в суспензии эпидермальных клеток, помечались анти-ГКГС-класс-II моноклональными антителами. Затем посредством проточной цитофлуориметрии с использованием вторичных реагентов, помечаемых чувствительными к pH флуорохромами, определялись различия в средней интенсивности флуоресценции для интернализованных меток. Эндоцитоз комплексов на основе ГКГС при попадании в кислую среду (в лизосомы) приводил к снижению интенсивности флуоресценции, в то время как в случае интернализации в компартментах с меньшей кислотностью (в иммуносомах) уровень флуоресценции сохранялся. Воздействие DНХБ, 2,4-динитро-1-фторбензола и ТНХБ обеспечивало флуоресценцию на уровне, в 1,7 — 2 раза превышающем интенсивность флуоресценции в клетках, обработанных ДМСО.
Согласно [125] были выполнены измерения плотности дендритных клеток в ухе мыши с интервалом в 4 и 17 ч после воздействия 1%-ного ДНХБ. Кроме того, было определено количество ДК, появляющихся в лимфатическом узле, с интервалом 24, 48 и 72 ч после аналогичного воздействия, и в обоих случаях констатировали существенное увеличение числа ДК.
Трехмерные модели реконструированного человеческого эпидермиса (reconstituted human epidermal — RHE) представляют собой человеческие клетки, выращенные на мембране на поверхности раздела воздушной и жидкостной сред. Данный метод сокультивирования клеточного материала позволяет выращивать многослойную культуру клеток с образованием контактов между отдельными клетками, что делает ее похожей на соответствующие фрагменты кожи человека. При использовании моделей RHE, в состав которых были включены ДК CD34+, поверхностное нанесение ДНХБ вызывало экспрессию CD86 в этих ДК (см. [127]).
Модель кожи, состоящая из кератиноцитов, фибробластов и дендритных клеток, подвергалась воздействию ДНХБ, что приводило к экспрессии CD86 и выбросу цитокинов (см. [133]).
Этап 7b. В [128] сообщается о 6-кратном увеличении насыщенности клетками лимфатических узлов после воздействия 0,25%-ного раствора ДНХБ, главным образом в связи с пролиферацией T-клеток CD4+ и CD8+.
В [45] сообщается об эффектах, наблюдавшихся in vivo, в лимфоидной ткани мышей при воздействии ДНХБ и очень похожего на него соединения — ДНФБ. В однопроцентной концентрации воздействие ДНХБ приводило к заметному повышению иммунной активности и 5-кратному повышению клеточной насыщенности лимфоидной ткани в сочетании с 6-кратным увеличением поглощения тритилированного тимидина. Уменьшение концентрации ДНХБ до 0,1% явилось следствием пропорционального изменения активности. Образцы клеток лимфатических узлов, взятые у подопытных мышей после воздействия ДНХБ и ДНФБ, характеризовались повышенными уровнями содержания цитокина Th1 IFN - \gamma и пониженными уровнями содержания цитокинов Th2 IL-5 и IL-10, а также митоген-индуцированного IL-4.
Этап 8. Как в [124], так и в [45] отмечается высокая способность ДНХБ вызывать сенсибилизацию при проведении экспериментов по методу LLNA.
Этап 11. В [129] сообщается, что ДНХБ проявляет сенсибилизирующие свойства при воздействии на кожу in vivo.
Тест максимизации на морских свинках (Guinea Pig Maximisation Test — GPMT) представляет собой высокочувствительный метод с применением как внутридермального, так и поверхностного способа обработки и закрытой провокационной пробы. ДНХБ приводит к положительным результатам при проведении провокационной пробы GPMT уже при концентрации 0,1%, что располагает его в верхних позициях перечня сенсибилизирующих веществ, исследованных при помощи метода GPMT.
Тест Бюлера на морских свинках предусматривает повторяющееся закрытое поверхностное нанесение вещества при проведении индукции и закрытую провокационную пробу. Результаты применения теста Бюлера для ДНХБ — положительные.
СОПОСТАВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ НАСТОЯЩЕГО СТАНДАРТА СО СТРУКТУРОЙ ПРИМЕНЕННОГО В НЕМ МЕЖДУНАРОДНОГО ДОКУМЕНТА
| Таблица ДА.1 | ||||
| Структура настоящего стандарта | Структура международного документа | Разделы | Пункты | Перечисления |
| Пункты | Перечисления Введение | Предпосылка | ||
| Введение | - | Раздел 1 | ||
| Краткое содержание | Раздел 2 | - | ||
| Общее представление структуры AOP | - | 2.1 | ||
| Схема промежуточных событий, связанных с AOP | 2.2 | - | ||
| Сводка ключевых событий в составе AOP | - | Раздел 3 | - | |
| Научные свидетельства, подтверждающие достоверность AOP - | ||||
| 3.2 | - | Сводка научных свидетельств, подтверждающих достоверность AOP | - | |
| 3.2 | - | Оценка по совокупности имеющихся свидетельств для подтверждения достоверности AOP | - | |
| 3.3 | - | Подробная информация для подтверждения достоверности AOP | - | |
| 3.4 | - | Методы и базы данных для ключевых событий AOP | - | |
| Приложение A | - | Приложение 1 | - | |
| Библиография | Ссылки | |||
| УДК 661:615,099:006.354 | МКС 71.040.10; 13.020.01 | MOD |
| Ключевые слова: химическая продукция, сенсибилизация кожи, ковалентное связывание с белками, AOP, ключевые события, промежуточные события | ||