ГОСТ 34876-2022. Межгосударственный стандарт. Метод отбора образцов тканей глаза для проведения гистологических исследований и получения данных. Серия по испытаниям и оценке № 160

(введен в действие Приказом Росстандарта от 26.11.2025 № 1515-ст)

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 ноября 2025 г. № 1515-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОД ОТБОРА ОБРАЗЦОВ ТКАНЕЙ ГЛАЗА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ПОЛУЧЕНИЯ ДАННЫХ. СЕРИЯ ПО ИСПЫТАНИЯМ И ОЦЕНКЕ № 160

Method for selecting eye tissue samples for histological examinations and obtaining data. Test and evaluation series No. 160

(ENV/JM/MONO(2011)45/REV1:2018, Guidance document on the collection of eye tissues for histological evaluation and collection of data series on testing and assessment. Number 160, MOD)

ГОСТ 34876-2022

МКС 71.040.10;

13.020.01

Дата введения 1 ноября 2026 года с правом досрочного применения

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 31 августа 2022 г. № 153-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО «Национальный орган по стандартизации и метрологии» Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узбекское агентство по техническому регулированию

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 ноября 2025 г. № 1515-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34876-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2026 г. с правом досрочного применения

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу ENV/JM/MONO(2011)45/REV1:2018 «Руководящий документ по отбору образцов тканей глаза для проведения гистологических исследований и сбору серий данных по тестированию и оценке. Номер 160» («Guidance document on the collection of eye tissues for histological evaluation and collection of data series on testing and assessment. Number 160», MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

В тексте стандарта библиографические ссылки приведены не в порядке возрастания из-за особенностей построения примененного международного документа.

Приложения в настоящем стандарте обозначены согласно требованиям ГОСТ 1.5, так как их обозначение в примененном международном документе противоречит практике межгосударственной стандартизации.

Международный документ разработан Международной организацией экономического сотрудничества и развития (OECD).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»

Введение

Положения настоящего стандарта дополняют метод исследования помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота (BCOP) [43] и метод исследования с использованием извлеченного глаза курицы (ICE) [46]. Данный стандарт включает рекомендации по сбору данных гистологических исследований, используемых в рамках методов исследования in vitro и/или in vivo химической продукции при попадании в глаза. Основным назначением настоящего стандарта является: (i) оказание содействия сбору гистологических данных; (ii) обеспечение руководства по подготовке гистологических заключений; (iii) обеспечение более глубокого понимания полезности и ограничений гистологического анализа как дополнительного источника информации для повышения точности методов исследования in vitro безопасности воздействия на глаза; (iv) предоставление подробных протоколов для методов BCOP и ICE с целью гармонизации реализуемых подходов; а также (v) для химической продукции (т.е. веществ и смесей), испытания которой приходится проводить in vivo, — установление стандартных процедур извлечения, фиксации и обработки образцов глаз после выполнения тестов на глазу кролика in vivo с целью их последующего гистологического исследования. Необходимо иметь в виду, что в случае проведения комплексного анализа деструктивных последствий для глаз, наступающих при интенсивном воздействии химического вещества, следует соблюдать требования Руководящего документа по интегрированным подходам к исследованиям и оценке (Integrated Approaches for Testing Assessment — IATA) [44]. В частности, подход, предусматриваемый IATA, подразумевает первоочередную реализацию таких рекомендованных программ исследования, которые опирались бы на применение методов исследования in vitro, а также использование информации, получаемой из иных источников, перед тем как может быть рассмотрен вопрос проведения испытаний на живых животных.

Методы гистологического анализа могут быть востребованы для: (i) оценки тяжести поражений тканей, вызываемых воздействием химических веществ определенных классов или их отдельных соединений, подробную характеристику которых не удается получить при помощи упомянутых выше методов исследования; (ii) определения механизма такого воздействия; (iii) оценки вероятности отдаленных последствий; (iv) оценки глубины поражений, которую предлагается рассматривать как меру обратимости или необратимости наступивших последствий [38]; (v) более детального исследования серьезности или масштабов повреждений, если в этом имеется необходимость [26], [30], [38]; (vi) подготовки окончательного решения, в случаях когда реакция на воздействие исследуемой химической продукции является пограничной с точки зрения отнесения ее к тому или иному известному классу опасности в соответствии с заданными для применяемого метода критериями принятия решений. По этой причине пользователям рекомендуется сохранять образцы тканей для их дальнейшего гистологического исследования.

Кроме того, гистологический анализ может применяться при дальнейшей разработке новых методов исследования in vitro химических веществ при воздействии на глаза (например, метода с использованием извлеченного глаза кролика [29], метода контроля на помутнение и проницаемость роговицы глаза свиньи [63], а также различных методов с использованием трехмерных моделей тканей роговицы человеческого глаза [9], в том числе методов с использованием реконструированного эпителия роговицы человека [47]. В случае когда не представляется возможным обойтись без проведения тестов на глазу кролика in vivo, гистологическое исследование, в зависимости от ситуации, может способствовать получению дополнительной, более подробной информации о характере и масштабах поражений, причиняемых исследуемой продукцией, а также данных, которые могут использоваться как контрольные при оценке результатов испытаний in vitro. Эти дополнительные данные также могут быть полезны при разработке новых, более точных, установленных с учетом механизма развития поражения тканей методов исследования in vitro, составляющих альтернативу испытаниям на глазу кролика in vivo. Хотя испытания на раздражение глаз in vivo, которым подвергаются кролики, предоставляют возможность выполнения последующего гистологического анализа обработанных химической продукцией глаз с целью получения дополнительных сведений о воспалительном процессе, подобный подход не отвечает требованиям современности на практике. Стандартной процедурой испытаний на раздражение глаз у кроликов предусмотрено, что подопытные животные могут быть умерщвлены по окончании установленного периода наблюдения, однако к этому времени представляющие интерес деструктивные изменения в тканях могут стать менее выраженными или исчезнуть полностью. В случае если ввиду исключительной тяжести причиненных поражений животных пришлось умертвить ранее положенного срока или наступившие деструктивные изменения сохраняются до самого конца периода наблюдения, отбор и гистологический анализ образцов таких глаз могут быть оправданными, например, с точки зрения возможности изучения механизма поражения от химического воздействия.

Согласно общепринятому мнению, в обозримом будущем появления одного метода для исследования раздражения глаз in vitro, позволяющего прогнозировать весь спектр реакций, вызываемых химической продукцией различных классов, который мог бы заменить применяемый в настоящее время тест Дрейза in vivo, ожидать не приходится. IATA [44] включает в себя несколько модулей, в которых сгруппированы источники получения информации и инструменты для анализа, и содержит необходимые указания по: (i) обобщению и использованию имеющихся данных, полученных в ходе испытаний или иным путем, для оценки способности химической продукции вызывать деструктивные последствия для глаз, а также (ii) выбору оптимального подхода при возникновении потребности в дополнительных испытаниях [44]. Таким образом, выверенное сочетание нескольких альтернативных методов исследований, реализуемых в рамках единой (многоуровневой) стратегии исследования, вполне может оказаться способным заменить собой вышеупомянутый тест Дрейза [44]. В частности, считается, что применение нисходящего подхода уместно для случаев, когда, исходя из уже имеющейся информации, исследуемая химическая продукция предположительно должна обладать высокой раздражающей способностью, в то время как к восходящему подходу следует прибегать в ситуациях, когда способность этой химической продукции вызывать раздражение глаз, по всей вероятности, в недостаточной степени выражена для присвоения ей конкретного класса опасности [57], [44]. Как установлено в [43] и [46], данные, получаемые с применением методов BCOP и ICE, могут быть использованы для классификации и маркировки исследуемой химической продукции, вызывающей серьезные повреждения глаз (т.е. относящейся к классу опасности 1 согласно СГС ООН), а также не требующей классификации как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз (т.е. класс опасности отсутствует согласно СГС ООН) [43], [46]. Следовательно, такие данные одновременно допускают интерпретацию в контексте как нисходящего, так и восходящего подхода, что позволяет охватить сразу два уровня рекомендуемой стратегии [44] при применении одного испытания in vitro, при условии что исследуемая химическая продукция относится к соответствующей области применения метода и на нее не распространяются ограничения по его применению, предусмотренные для какого-либо из этих уровней. Вместе с тем, с учетом значительной доли (69%) исследуемой химической продукции, не требующей классификации, которой может быть ошибочно присвоен класс опасности при исследованиях по методу BCOP, начинать исследования с применения восходящего подхода представляется нежелательным [43]. Кроме того, любое применение методов в соответствии с восходящим подходом в рамках схем классификации, отличающихся от СГС ООН, должно быть заблаговременно согласовано с соответствующими регулирующими органами. Наконец, если не получилось подготовить ни одно из двух возможных прогнозных заключений, результаты применения методов BCOP или ICE могут быть использованы в рамках подходов IATA в сочетании с другими данными, полученными как путем испытаний, так и иным путем, для дальнейшей оценки по совокупности имеющихся свидетельств потенциальной опасности исследуемой химической продукции, включая способность к умеренному или слабому раздражению (т.е. для различения подклассов опасности 2A и 2B согласно СГС ООН) [44]. В настоящем стандарте приведены также иные сведения о критериях принятия решений и протоколах для указанных выше двух методов, включая использование данных гистологических исследований наряду с другими полученными данными.

В соответствии с последними достижениями в области гистопатологии при проведении исследований по методу ICE стандарт включает рекомендации по реализации внутрилабораторной системы независимой экспертной оценки результатов, применению полуколичественной системы оценки гистологических последствий, а также использованию специализированного атласа, описывающего типичные примеры таких последствий. В частности, результат гистологических исследований признается в качестве дополнительного параметра для более надежного определения химической продукции, подлежащей отнесению к классу опасности 1 согласно СГС, при применении ICE [46] в отдельных случаях, например при исследовании воздействия моющих средств и сурфактантов, не характеризующихся экстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5) [46], [48], [8]. Для целей гистологического анализа в рамках метода ICE установлены соответствующая полуколичественная система оценки, а также критерии принятия решений в отношении таких моющих средств и сурфактантов с неэкстремальными значениями pH (см. 4.2.1, 4.6.12 и 4.6.13). Перед тем как приступить к применению полуколичественной системы оценки данных и/или критериев принятия решений, предусмотренных для метода ICE, в сочетании с каким-либо другим методом(ами) или в какой-либо другой области(ях) применения, следует удостовериться в ее/их пригодности с этим новым методом(ами) и/или областью(ями) применения. При наличии расхождений в порядке отбора, хранения, подготовки, оценки и интерпретации результатов испытаний лабораторных образцов роговицы или образцов глаз in vivo при применении метода BCOP или методов исследования in vivo лаборатории, осуществляющие гистологический анализ оболочек глаза согласно установившейся практике, могут продолжать применять свои действующие методики. В случае появления новой дополнительной информации по данному вопросу в стандарт будут внесены соответствующие изменения.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод отбора, хранения и подготовки образцов тканей глаза, полученных in vitro или in vivo, для выполнения их гистологических исследований.

2 Термины и определения

2.1 боуменова мембрана (Bowman's layer): Передняя оболочка роговицы глаза некоторых видов (например, гоминидов, птиц и китообразных), расположенная между стромой роговицы и ее эпителиальным слоем (см. приложение А).

2.2 валидированный метод испытаний (validated test method): Метод испытаний, для которого завершены валидационные исследования с целью определения его релевантности (включая точность) и надежности для конкретной цели. Важно отметить, что валидированный метод не обязательно обеспечивает достаточную результативность с точки зрения его точности и надежности для признания его пригодным для конкретной цели [41].

2.3 вещество (substance): Химические элементы и их соединения, представленные в естественном состоянии или полученные при выполнении производственного процесса, включая любые добавки, необходимые для сохранения стабильности продукта, а также любые примеси, наличие которых обусловлено применяемым процессом, но исключая любые растворители, удаление которых не сказывается на стабильности вещества или на его составе [62].

2.4 восходящий подход (Bottom-Up Approach): Поэтапный подход, применяемый при исследовании химической продукции, предположительно не требующей классификации опасности как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз, при котором в первую очередь определяется химическая продукция, не требующая классификации (отрицательный результат), для выделения ее из числа прочей химической продукции (положительный результат).

2.5 гистопатология (histopathology): Наука или область науки, изучающие гистологическую структуру аномальных или пораженных тканей.

2.6 денситометр (opacitometer): Прибор, используемый для измерений «непрозрачности роговицы» путем получения количественной оценки пропускания света роговицей. Такой прибор имеет два отделения; каждое из них оборудовано своим источником освещения и имеет свой светочувствительный элемент. Одно отделение предназначено для измерений обработанных образцов роговицы, в то время как другое служит для калибровки прибора и установки его на ноль. Интенсивность света галогеновой лампы, который проходит через контрольное отделение (пустую камеру, не имеющую окошек или не содержащую жидкости) и попадает на светочувствительный элемент, сравнивается с интенсивностью света, который проходит через второе измерительное отделение с установленной в нем камерой, содержащей образец роговицы, и попадает на другой светочувствительный элемент. Разница в светопропускании, улавливаемая светочувствительными элементами, оценивается как числовое значение непрозрачности, которое выводится на цифровое показывающее устройство.

2.7 десцеметова мембрана (Descemet's membrane): Задний покровный слой роговицы, граничащий с дальней стенкой стромы и предшествующий слою эндотелия (см. приложение А).

2.8 доля ложноположительных заключений (false positive rate): Доля всей химической продукции, дающей отрицательный результат, которая ошибочно идентифицирована как дающая положительный результат. Это один из показателей результативности метода.

2.9 доля ложноотрицательных заключений (false negative rate): Доля всей химической продукции, дающей положительный результат, которая ошибочно была идентифицирована как дающая отрицательный результат. Это один из показателей результативности метода.

2.10 достоверный метод исследования (valid test method): Метод исследования, признаваемый в достаточной степени релевантным и надежным для применения в конкретной области и базирующийся на научно обоснованных принципах. Ни один метод исследования не является достоверным в абсолютном смысле и может рассматриваться как таковой только для ограниченной области применения [41].

2.11 заливка (embedding): Процесс заключения гистологических образцов в плотную, а в ряде случаев твердую среду, такую как парафин, воск, целлоидин или синтетические смолы, который делает возможным получение тонких срезов исследуемых тканей для их последующего изучения при помощи микроскопа.

2.12 исследование (test): Системное проведение экспериментов для получения информации о нежелательных последствиях воздействия вещества. Синоним термина: «анализ».

2.13 исследуемая химическая продукция (test chemical): Химическая продукция (вещества или смеси), которая подвергается испытаниям.

2.14 класс опасности 1 согласно СГС ООН (UN GHS Category 1): См. «серьезные повреждения глаз» и/или «необратимые последствия для глаз».

2.15 класс опасности 2 согласно СГС ООН (UN GHS Category 2): См. «раздражение глаз» и/или «обратимые последствия для глаз».

2.16 класс опасности согласно СГС ООН отсутствует (UN GHS No Category): Химическая продукция, не удовлетворяющая критериям классификации для химической продукции класса опасности 1 или 2 (подклассы опасности 2A или 2B) согласно СГС ООН. Синоним термина: «не требует классификации».

2.17 контрольная проба растворителя [вещества-носителя] (solvent/vehicle control): Ничем не обработанная проба, включающая в себя все составляющие испытательной системы, содержащая растворитель [вещество-носитель] и используемая наряду с пробами, содержащими исследуемое вещество, и другими контрольными пробами для определения начального эффекта для образцов, обработанных исследуемым веществом, разведенным в том же растворителе [веществе-носителе]. При параллельном использовании с отрицательной контрольной пробой также позволяет выяснить, взаимодействует ли растворитель [вещество-носитель] с испытательной системой.

2.18 контрольная проба эталонного вещества (benchmark control): Проба, включающая в себя все составляющие испытательной системы и обрабатываемая с использованием известного вещества (т.е. эталонного вещества), способного давать заведомо известный эффект. Данная проба используется параллельно с пробами, содержащими исследуемую химическую продукцию, а также другими контрольными пробами и служит для сравнения эффекта, вызываемого исследуемой химической продукцией и эталонным веществом, что позволяет оценить уровень чувствительности метода при анализе химических веществ или продукции определенного класса.

2.19 корнеосклеральный диск (corneoscleral button): Роговица, иссеченная из извлеченного глаза и обычно имеющая каемку склеральной ткани шириной 2 — 3 мм.

2.20 лимб (limbus): Переходная зона между корнеосклерой и конъюктивой, в которой расположены собирающие сосуды для отвода глазной жидкости, а также стволовые клетки, служащие для регенерации эпителия при его повреждении.

2.21 метод исследования (test method): Процесс или процедура, служащие для получения информации о свойствах веществ или их смесей. Методы токсикологических исследований позволяют получить информацию о способности вещества или смесей веществ вызывать определенную биологическую реакцию при определенных условиях воздействия. Синонимы термина: «испытание» и «анализ». См. также «валидированный метод исследования».

2.22 многокомпонентное вещество (multi-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором две или более основные структурные составляющие содержатся в количестве >= 10% (по массе), но < 80% (по массе). Образование многокомпонентного вещества происходит в процессе производства. Различие между смесью и многокомпонентным веществом состоит в том, что смесь образуется путем соединения двух или более веществ при отсутствии химической реакции. Многокомпонентное вещество, напротив, образуется в результате химической реакции.

2.23 многоуровневая стратегия исследования (tiered testing strategy): Стратегия, предусматривающая поэтапное проведение исследования, при котором вся существующая информация об исследуемой химической продукции анализируется в определенном порядке, с рассмотрением на каждом уровне совокупности имеющихся свидетельств с целью определения достаточности доступной информации для принятия решения о классификации по степени опасности перед переходом на следующий уровень. Если способность исследуемой химической продукции вызывать раздражение может быть подтверждена на основе существующей информации, дальнейшее исследование не требуется. Если способность химической продукции вызывать раздражение не может быть подтверждена на основе существующей информации, исследование продолжается в виде поэтапно выполняемой серии испытаний до тех пор, пока исследуемая химическая продукция не будет однозначно классифицирована.

2.24 моющие средства (detergents): Смесь, содержащая один или несколько сурфактантов (исключая растворы одного отдельно взятого сурфактанта) с конечной концентрацией > 3% и предназначенная для использования при мытье и чистке. Моющие средства могут быть представлены в любой форме (в виде жидкости, порошка, пасты, бруска, таблетки, плитки, формованной фигурки и т.п.) и размещаться на рынке для использования в бытовых условиях, организациями или промышленными предприятиями.

2.25 надежность (reliability): Показатель того, что метод испытаний может быть реализован с получением воспроизводимых результатов в рамках одной или различных лабораторий в течение продолжительного времени при применении одного и того же протокола. Он оценивается путем вычисления внутри- и межлабораторной воспроизводимости и внутрилабораторной повторяемости [41].

2.26 надлежащая лабораторная практика (Good Laboratory Practice) (GLP): Правила проведения исследований в соответствии с нормами и требованиями, установленными рядом государств и национальных регулирующих органов, определяющие ведение записей процедур обеспечения качества при использовании лабораторных журналов, которые служат источником информации, предоставляемой в регулирующие органы. Вопросам надлежащей лабораторной практики посвящена серия публикаций ОЭСР «Принципы надлежащей лабораторной практики и контроль соответствия».

2.27 не требует классификации (not classified): Химическая продукция, которая не подлежит классификации как вызывающая раздражение (класс опасности 2, подклассы опасности 2A или 2B согласно СГС ООН) или серьезное повреждение глаз (класс опасности 1 согласно СГС ООН). Синоним термина: «класс опасности согласно СГС ООН отсутствует».

2.28 необратимые последствия для глаз (irreversible effects on the eye): См. «серьезные повреждения глаз» и «класс опасности 1 согласно СГС ООН».

2.29 непрозрачность роговицы (corneal opacity): Поддающаяся измерению степень помутнения роговицы после воздействия на нее исследуемой химической продукцией. Повышение непрозрачности роговицы является характерным признаком ее поражения. Оценка непрозрачности может выполняться на основе либо субъективных, как при проведении теста Дрейза на глазу кролика, либо объективных критериев, когда для этого используется соответствующий прибор — денситометр.

2.30 нейтральный буферный раствор формалина (10%); 10%-ный НБФ (Neutral Buffered Formalin (10%)): 10%-ный нейтральный буферный раствор формалина представляет собой раствор для фиксации образцов тканей, содержащий в своем составе от 37% до 40% раствора формальдегида в 0,1 М фосфатном буферном растворе, pH 7,4.

2.31 нисходящий подход (Top-Down Approach): Поэтапный подход, применяемый для исследования химической продукции, предположительно вызывающей серьезное повреждение глаз, при котором в первую очередь определяется химическая продукция, способная быть причиной серьезного повреждения глаз (положительный результат), для выделения ее из числа прочей химической продукции (отрицательный результат).

2.32 обезвоживание (dehydration): Процесс удаления естественной влаги из образцов тканей путем обработки их растворителем, например этанолом, смешанным с водой, с последовательным увеличением его концентрации.

2.33 обратимые последствия для глаз (reversible effects on the eye): См. «раздражение глаз» и «класс опасности 2 согласно СГС ООН».

2.34 обрезка (trimming): Процесс удаления избыточных, не являющихся критически важными для анализа фрагментов ткани, перед фиксацией или после нее путем их срезания при помощи скальпеля или ножниц в целях уменьшения размеров образца, для того чтобы он содержал только участки, подлежащие оценке.

2.35 однокомпонентное вещество (mono-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором одна основная структурная составляющая содержится в количестве не менее чем 80% (по массе).

2.36 окрашивание (staining): Добавление к образцам тканей веществ, которые окрашивают исследуемые ткани и обеспечивают их визуализацию после проводки, получения срезов и размещения на предметных стеклах.

2.37 опасность (hazard): Изначально присущее свойство конкретной химической продукции или ситуации, заключающееся в их потенциальной способности вызывать деструктивные последствия в случаях, когда организм, система или субпопуляция подвергаются их воздействию.

2.38 осветляющий растворитель (clearing solvent): Вещество, способное смешиваться как с этанолом или иным веществом, предназначенным для обезвоживания образцов, так и с веществом для их заливки, например парафином. Проникновение такого растворителя в ткани образца приводит к очистке или повышению прозрачности тканей.

2.39 отечность роговицы (corneal swelling): Объективно воспринимаемый показатель, определяемый при проведении исследования по методу ICE и характеризующий набухание роговицы после воздействия на нее исследуемой химической продукцией. Она выражается в процентах и вычисляется исходя из результатов исходных (до нанесения продукции) измерений толщины роговицы и результатов измерений ее толщины, выполняемых с равными временными интервалами после контакта с исследуемой химической продукцией в ходе проведения испытаний по методу ICE. Степень отечности роговицы свидетельствует о степени ее поражения.

2.40 отрицательная контрольная проба (negative control): Ничем не обработанная, используемая параллельно проба, включающая в себя все составляющие испытательной системы. Используется наряду с пробами, обработанными исследуемой химической продукцией и другими контрольными пробами для выяснения, взаимодействует ли используемый растворитель с испытательной системой.

2.41 оценка по совокупности имеющихся свидетельств (weight-of-evidence): Процесс рассмотрения преимуществ и недостатков различной имеющейся информации при подготовке и обосновании заключения о потенциальной опасности исследуемой химической продукции.

2.42 показатель раздражающей способности; IVIS (in vitro Irritancy Score (IVIS)): Значение показателя in vitro, применяемого в методе BCOP, вычисленное при использовании формулы, полученной экспериментальным путем, согласно которой суммируются средние значения непрозрачности и средние значения проницаемости для каждой обработанной группы образцов. IVIS = среднее значение непрозрачности + (15 x среднее значение проницаемости).

2.43 положительная контрольная проба (positive control): Используемая параллельно проба, содержащая все компоненты испытательной системы и обрабатываемая с использованием вещества, заведомо дающего положительный результат. Чтобы обеспечить возможность учитывать изменчивость во времени отклика, получаемого для данной пробы, этот положительный результат не должен быть слишком завышенным.

2.44 получение срезов (cutting): Использование микротома или иного режущего инструмента, оснащенного лезвием, для получения тонких полосок ткани (например, толщиной от 3 до 8 мкм), которые могут быть помещены на предметные стекла перед окрашиванием.

2.45 проводка тканей (tissue processing): Протокол обработки образцов тканей, включающий в себя фиксацию и последующую обрезку, обезвоживание, очистку и заливку тканей с целью их гистологического исследования.

2.46 проницаемость роговицы (corneal permeability): Количественно измеряемое повреждение эпителия роговицы посредством определения количества флуоресцеина натрия, прошедшего через все клеточные слои роговицы.

2.47 пропитка (infiltration): Пассивная диффузия обезвоживающего растворителя, очищающего растворителя или жидкого материала для заливки в образец ткани после его фиксации.

2.48 радужная оболочка (iris): Подвижная диафрагма с отверстием в центре (зрачком), от особенностей пигментации которого зависит цветовая окраска глаза.

2.49 раздражение глаз (eye irritation): Распознаваемые in vivo изменения, наступающие в глазах после воздействия на их поверхность исследуемой химической продукцией, которые могут быть полностью обратимы по истечении 21 дня с момента такого воздействия [62]. Синонимы термина: «обратимые последствия для глаз» или «класс опасности 2 согласно СГС ООН».

2.50 релевантность (relevance): Показатель соответствия метода исследования результату, полученному при исследованиях, а также его обоснованности и пригодности для определенных целей применения. Данный показатель указывает пределы, в которых метод позволяет правильно измерить или спрогнозировать исследуемый биологический эффект. Оценка релевантности включает оценку точности (согласованности) метода исследований [41].

2.51 роговица (cornea): Прозрачная часть передней оболочки глазного яблока, закрывающая радужную оболочку и зрачок и пропускающая лучи света внутрь глаза.

2.52 Согласованная на глобальном уровне система классификации и маркировки химической продукции (ООН); СГС (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN); GHS): Система, предусматривающая классификацию химической продукции (веществ и смесей) в зависимости от характерных видов и уровней физической опасности, опасности для здоровья человека или опасности для окружающей среды, с применением соответствующих средств информирования, таких как пиктограммы, сигнальные слова, краткая характеристика опасности, меры по предупреждению опасности и паспорта безопасности, чтобы обеспечить информацией о ее негативном воздействии с целью защиты людей (в том числе предпринимателей, работников, перевозчиков, потребителей и представителей аварийных служб) и окружающей среды [62].

2.53 серьезные повреждения глаз (serious eye damage): Распознаваемое in vivo развитие повреждений глазных тканей либо обусловленное физическими причинами существенное ухудшение зрения после воздействия на поверхность глаза испытуемой химической продукцией, которые не являются полностью обратимыми по истечении 21 дня с момента такого воздействия [62]. Синонимы термина: «необратимые последствия для глаз» или «класс опасности 1 согласно СГС ООН».

2.54 склера (sclera): Волокнистый слой, образующий наружную оболочку глазного яблока, за исключением 1/6 его передней поверхности, где находится роговица.

2.55 смесь (mixture): Смесь или раствор, состоящие из двух или более веществ, в которых они не вступают в реакцию друг с другом [1].

2.56 согласованность (concordance): Показатель результативности метода испытаний, применимый к тем методам, которые позволяют получить однозначные результаты, и являющийся одним из аспектов релевантности. Данный термин, иногда применяемый взамен термина «точность» (accuracy), обозначает долю всей химической продукции, достоверно классифицированной как дающая при испытаниях положительный или отрицательный результат. Показатель согласованности в значительной степени зависит от преобладания среди исследуемой химической продукции таких видов продукции, которая при исследовании дает положительный результат [41].

2.57 специфичность (specificity): Доля всей дающей отрицательный результат/неактивной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для метода испытаний, позволяющего получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности такого метода [41].

2.58 способность удерживать флуоресцеин (fluorescein retention): Субъективно воспринимаемый показатель, определяемый при проведении исследования по методу ICE и характеризующий количество флуоресцеина натрия, удерживаемого эпителиальными клетками роговицы после воздействия исследуемой химической продукцией. Степень удерживания флуоресцеина свидетельствует о степени повреждения эпителия роговицы.

2.59 стандартные операционные процедуры; СОП (Standard Operating Procedures (SOP)): Надлежащим образом изложенные в письменном виде процедуры и подробно описывающие, каким образом должна быть организована повседневная деятельность в определенной области и каким должен быть порядок выполнения операций в лаборатории при проведении конкретных видов исследований. Их наличие предусмотрено надлежащей лабораторной практикой.

2.60 строма (stroma): Совокупность соединительной ткани и кератоцитов, формирующих структуру глаза. Ближняя область стромы начинается за боуменовой мембраной или передней оболочкой глаза и заканчивается у десцеметовой мембраны или задней оболочки глаза, предшествующей клеточному слою эндотелия.

2.61 сурфактант; поверхностно-активное вещество (surfactant): Вещество и/или его раствор (в соответствующем растворителе/веществе-носителе), содержащие в своей химической структуре одну или несколько гидрофобных групп, которые способны вызывать уменьшение поверхностного натяжения жидкости и формировать диффузные или адсорбционные монослои на границе раздела «вода — воздух», и/или образовывать эмульсии, и/или микроэмульсии, и/или мицеллы, и/или адсорбироваться на границе раздела «жидкость — твердое тело».

2.62 ткань (tissue): Совокупность аналогичных клеток и окружающих их межклеточных веществ. В живых организмах представлены четыре основных вида тканей: 1) эпителиальная; 2) соединительная, в том числе кровь, костная и хрящевая ткани; 3) мышечная; 4) нервная.

2.63 точность (accuracy): Близость результата испытаний, полученного с применением соответствующего метода испытаний, к принятому эталонному значению величины. Точность является показателем результативности метода и одним из аспектов релевантности. Данный термин часто применяется как взаимозаменяемый с термином «согласованность» для указания доли корректных результатов, полученных с применением соответствующего метода испытаний [41].

2.64 фиксация (fixation): Процесс выдерживания образца ткани в 5 — 10 объемах вещества, заведомо способного стабилизировать состояние ткани и защитить ее от разложения (например, в 10%-ном НБФ или фиксирующем растворе Дэвидсона). Этот процесс должен выполняться в кратчайший срок после получения и обрезки образца. Время, необходимое для пропитки ткани фиксирующим раствором, зависит от его химических свойств (например, 24 ч для 10%-ного НБФ, но не более 24 ч для раствора Дэвидсона).

2.65 фиксирующий раствор Дэвидсона (Davidson's fixative): Раствор для быстрой фиксации, который может использоваться взамен 10%-ного НБФ, снижая при этом степень сжатия фиксируемой ткани, что особенно существенно при обработке крупных образцов глазных тканей (например, извлеченных в целом виде глазных яблок).

2.66 химическая продукция (chemical): Вещество или смесь веществ.

2.67 чувствительность (sensitivity): Доля всей дающей положительный результат/активной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для методов испытаний, позволяющих получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности таких методов [41].

2.68 щелевая лампа с микроскопом (slit-lamp microscope): Прибор, служащий для выполнения непосредственных измерений на образцах глаз, увеличение в котором обеспечивается бинокулярным микроскопом, способным давать прямое стереоскопическое изображение. Метод исследования ICE предусматривает использование данного прибора при визуальном изучении структур передней части образцов глаз курицы, а также при выполнении объективных измерений толщины роговицы с помощью соответствующего глубиномерного приспособления.

2.69 эндотелий (endothelium): Однослойный пласт плоских гексагональных клеток, являющийся продолжением радужно-роговичного угла передней камеры глаза. Эндотелий играет активную роль в поддержании прозрачности роговицы путем регулирования ее влагообмена с внутриглазной жидкостью ([56], см. также приложение А).

2.70 эпителий (epithelium): Наружный эпителий, покрывающий переднюю поверхность роговицы глаза. Он включает в себя тонкую базальную мембрану, состоящую из цилиндрических эпителиальных клеток, следующие за ней два или три слоя многогранных шиповатых клеток, а также несколько слоев некератинизированных чешуйчатых клеток ([56], см. также приложение А).

2.71 эталонная химическая продукция (benchmark chemical): Химическая продукция, используемая как эталон для сравнения с исследуемой химической продукцией. Эталонная химическая продукция должна (1) происходить из стабильного и надежного источника(ов); обладать следующими свойствами: (2) структурным и функциональным сходством с классом исследуемой продукции; (3) хорошо изученными физико-химическими характеристиками; (4) наличием подтверждающих данных об известных воздействиях, а также (5) известным уровнем активности в диапазоне ожидаемого эффекта.

2.72 UVCB (substances of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials): Вещества неизвестного или переменного состава, продукты комплексных реакций или вещества биологического происхождения.

3 Гистологический анализ в методах исследования химической продукции при воздействии на глаза

3.1 Общие сведения

3.1.1 За исключением ряда научных проектов [13], [31], [38], только некоторые исследования раздражающего действия на глаза in vivo предусматривают выполнение гистологического анализа. Недостаточность информации в этой области препятствует определению важнейших гистологических показателей, которые могли бы использоваться при проведении испытаний на раздражение/разъедание глаз in vivo, а также для разработки новых методов исследования химической продукции при воздействии на глаза in vitro. В настоящем стандарте приведены примеры оценки и интерпретации гистологических данных, однако следует иметь в виду, что признаки поражения, наблюдаемые в извлеченных образцах глаз или роговицы, отличаются от таковых в глазных тканях, которые были обработаны исследуемой химической продукцией in vivo. Так, например, при применении методов исследования ex vivo исключается возможность наблюдения за изначальной воспалительной реакцией. Вместе с тем сведения об определяемой в процессе гистологического анализа степени поражений извлеченных образцов роговицы позволяют спрогнозировать тяжесть таких поражений и продолжительность последствий повреждающего воздействия [38].

3.1.2 Для обеспечения возможности использования результатов гистологических исследований в качестве конечных критериев при оценке in vitro и in vivo опасности химической продукции для глаз пользователям методов рекомендовано направлять свои данные и гистологические образцы, полученные с соблюдением требований настоящего стандарта, в соответствующие международные центры валидации (а именно: Межведомственный центр валидации токсикологических методов, функционирующий в рамках Национальной программы по токсикологии США [US-NICEATM], Референтную лабораторию по валидации альтернативных методов EC [EURL-ECVAM] либо Японский центр валидации альтернативных методов [JaCVAM]).

3.2 Источники образцов тканей для гистологического анализа

3.2.1 Источником тканей для гистологического анализа могут выступать глаз целиком либо извлеченные части переднего сегмента глаза (например, роговицы), полученные после завершения исследований химической продукции при воздействии на глаза с применением соответствующего метода in vitro или in vivo. Всю информацию, касающуюся конкретного отобранного образца ткани и процедуры его обработки, следует включать в отчет об испытаниях.

3.2.2 Все процедуры с образцами глаз животных должны выполняться с соблюдением действующих территориальных нормативных актов и правил, применяемых в испытательной лаборатории при работе с материалами животного происхождения, в том числе тканями и тканевыми жидкостями. Рекомендуется руководствоваться общепринятыми положениями о мерах безопасности, установленными для всех лабораторий [58].

3.3 Идентификация образцов

Каждому образцу должен присваиваться индивидуальный идентификационный номер, позволяющий обеспечить его прослеживаемость при исследовании, для проведения которого он был отобран [7], [26], [30].

3.4 Подготовка образцов тканей

3.4.1 В случае применения метода исследования in vitro с использованием извлеченного глаза курицы (ICE) образцы глаз, обработанных исследуемой химической продукцией, отбирают по завершении всех операций, выполнение которых предусмотрено [46], а именно через четыре часа после обработки. Для гистологического анализа используют все три образца глаз, на которые в соответствии со стандартными требованиям метода ICE [46] наносилась исследуемая химическая продукция. Гистологическое исследование считается пригодным для получения данных, которые могут быть использованы для подготовки общей оценки последствий воздействия химической продукции наряду со стандартными показателями, определяемыми по методу ICE. Образцы глаз можно рассечь, произведя скальпелем почти сквозной разрез непосредственно за хрусталиком сквозь стекловидное тело и оставив лишь небольшой фрагмент тканей задней части глаза, чтобы удерживать за него образец (впоследствии он удаляется), что позволит не повредить роговицу при опускании образца на поверхность в процессе обработки, а также одновременно обеспечит оптимальные условия проникновения в ткани фиксирующего вещества (см. 3.5.1 - 3.5.5).

3.4.2 В случае применения метода исследования in vitro для оценки помутнения и проницаемости роговицы крупного рогатого скота (BCOP) после определения значений проницаемости флуоресцеина согласно [43] оставшийся флуоресцеин и рабочую среду удаляют из держателей роговицы, сами держатели осторожно разбирают, извлекают из них образцы роговицы и помещают каждый образец в отдельную маркированную кассету. Роговицу укладывают эндотелиальной поверхностью вниз на пористую подложку, чтобы предохранить эндотелий от повреждения. Кассеты погружают в маркированные емкости, наполненные 10%-ным НБФ, и выдерживают при комнатной температуре в течение не менее 24 ч.

3.4.3 Образцы роговицы для гистологического анализа, которые отбирались после завершения исследований in vivo с соблюдением требований [45], в случае когда согласно IATA [45] проведение исследований серьезного повреждения глаз и раздражения глаз в условиях in vitro не представляется возможным, поддерживают в увлажненном состоянии каплями физиологического раствора (подогретого до температуры от 31 °C до 32 °C), наносимыми в течение всего процесса препарирования. Соответствующий порядок действий подробно описан учеными-специалистами, обладающими значительным опытом препарирования тканей [27]. Мигательную перепонку оттягивают в сторону пинцетом и разрезают конъюнктиву, используя для этого изогнутый пинцет и ножницы с изогнутыми лезвиями. Извлекают глазное яблоко, слегка надавливая пальцами на участки выше и ниже орбиты. Удаляют остатки конъюнктивальных тканей, орбитальные мышцы и оптический нерв (фрагмент нерва длиной порядка 5 — 10 мм оставляют прикрепленным во избежание потери интраокулярного давления) и освобождают глазное яблоко из орбиты. После этого все посторонние ткани, примыкающие к глазному яблоку, аккуратно срезают и осторожно промывают образец в физиологическом растворе для удаления любых прилипших частиц.

3.5 Сохранение образцов тканей

3.5.1 Фиксирующие растворы предотвращают аутолиз тканей за счет инактивации атолитических ферментов, выделяющихся в посмертный период [5]. Кроме того, процедура фиксации повышает прочность тканевой структуры, позволяя выполнять тонкие срезы с минимальным количеством артефактов, обусловленных механическими повреждениями (например, сдавливанием тканей). К числу факторов, которые могут оказывать влияние на эффективность фиксации, относят продолжительность обработки фиксирующим раствором и соблюдаемую при этом температуру раствора, соотношение объема используемого раствора и размеров образца, физико-химические свойства фиксатора, а также его концентрацию в растворе [5], [25]. Для исключения пересыхания тканей, что может привести к существенным артефактам, их следует сохранять погруженными в фиксирующий раствор вплоть до дальнейшей обработки и заливки парафином.

3.5.2 Образцы тканей должны располагаться в предварительно маркированных контейнерах, наполненных фиксирующим раствором. Большинством протоколов гистологических исследований рекомендовано использовать такие объемы фиксирующего раствора, которые в 5 — 10 раз превышают размеры исследуемых образцов тканей [7], [32], [56], в то же время согласно [5] рекомендуется придерживаться 30-кратного объемного соотношения. В случае метода ICE образцы глаз курицы (рассеченные или нерассеченные) помещают в контейнер, содержащий достаточное количество раствора фиксирующего реактива (например, приблизительно 20 мл 10%-ного раствора формалина (см. 3.5.4) на срок не менее 24 ч). В случае применения метода BCOP образцы роговицы глаз крупного рогатого скота помещают в 10%-ный НБФ из расчета порядка 20 образцов на 300 мл раствора.

3.5.3 Все образцы тканей должны быть полностью погружены в фиксирующий раствор. Мелкие образцы могут размещаться непосредственно в гистологических кассетах; при этом для обеспечения единообразия изготовления срезов своей эпителиальной (передней) поверхностью они всегда должны быть обращены к верху кассеты [26], [30].

3.5.4 Глубина проникновения большинства фиксаторов прямо пропорциональна квадратному корню продолжительности фиксации t и зависит от коэффициента диффузионной способности к соответствующего фиксатора, который составляет в среднем 1 для большинства используемых фиксаторов. Таким образом, продолжительность фиксации определяется значением квадрата расстояния, преодолеваемого фиксатором в толще ткани. При скорости проникновения 1 мм/ч время фиксации сферического образа диаметром 10 мм в 10%-ном НБФ должно составлять (5) 2 или 25 ч [25]. Это означает, что в общем случае образцы необходимо фиксировать в течение не менее 24 ч при комнатной температуре. Вместе с тем описанный по результатам исследований диапазон времени фиксации составляет от 4 до 48 ч [33], [34], а некоторые протоколы, кроме того, предусматривают выполнение фиксации при температуре 4 °C [37].

3.5.5 Наиболее часто используемыми фиксирующими растворами глазных тканей являются 10%-ный НБФ и раствор Дэвидсона [3], [60]. Тем не менее предварительно рассеченные образцы глаз, исследуемые по методу ICE, обычно фиксируют при помощи 4%-ного нейтрального водного фосфатного буферного раствора формальдегида (т.е. 10%-ного формалина) [53]. Раствор Дэвидсона целесообразно использовать для обработки непрепарированных образцов, ввиду того что спирт, входящий в состав раствора, способствует более быстрому и глубокому проникновению фиксатора в ткани [35]. Опыт исследований извлеченных образцов роговицы по методу BCOP свидетельствует, что образцы после фиксации демонстрируют заметно меньшее количество артефактов, если они были помещены в 10%-ный НБФ, а не в раствор Дэвидсона. К другим фиксирующим растворам, пригодным для исследований глазных тканей, относятся 4%-ный раствор глутарового альдегида [12], смесь 2,5%-ного раствора глутарового альдегида и 2%-ного раствора формальдегида [33], [64], а также 4%-ный раствор параформальдегида [34], [37].

3.6 Обрезка образцов тканей после фиксации

Перед следующим этапом обработки края исследуемых образцов можно обрезать для обеспечения в достаточной степени их обезвоживания и пропитки парафином. Любую обрезку образцов тканей, обработанных фиксирующим раствором, всегда следует осуществлять при помощи острого скальпеля, ножниц и/или бритвенного лезвия для минимизации артефактов в тканях. В случае применения метода ICE образец после фиксации обрезают ножницами таким образом, чтобы получить для заливки парафином тонкий фрагмент глаза, полностью включающий в себя роговицу и прилегающую к ней склеру.

3.7 Проводка и заливка образцов тканей

3.7.1 Содержание воды в глазных тканях составляет приблизительно 75% [5], по этой причине перед заливкой их следует подвергнуть тщательному обезвоживанию. Обычно это достигается путем погружения фиксированных образцов ткани в спиртовые растворы с повышающейся концентрацией, в частности растворы этанола с концентрацией от 60% до 70%, от 90% до 95% и 100% [55], [60]. Растворы с низким содержанием спирта, например 30%-ный раствор этанола, рекомендуется использовать для проводки особенно чувствительных тканей [60]. Подтверждена возможность успешного использования других смешивающихся с водой растворителей (например, н-бутанола, диоксана, изопропанола, пропанола, тетрагидрофурана и тетрагидрофурфурилового спирта) [5], [22], [32], [49]. При применении метода ICE, как правило, используют следующую последовательность концентраций этанола: 50%, 70%, 80%, 96%, 100%.

3.7.2 Поскольку спирты не смешиваются с парафином, используемым при заливке, для промежуточной обработки образцов следует использовать вещество, способное смешиваться с этанолом и парафином в отсутствие воды. Выполнение данной операции (так называемой очистки тканей) способствует также повышению прозрачности получаемых срезов [56], [60]. Ксилол является наиболее часто используемым растворителем, хотя допускается использование и других растворителей, в том числе бензола, хлороформа, н-бутанола, н-бутилацетата, амилацетата, лигроина, нефтяных растворителей (преимущественно гексанов), толуола и трихлорэтана либо терпенов, таких как кедровое масло, лимонен, терпинеол [5], [22], [32], [49]. Многие из перечисленных растворителей являются токсичными либо могут обладать потенциальным канцерогенным действием, поэтому перед их использованием важно ознакомиться с соответствующими требованиями безопасности для организации надлежащих условий работы с такими веществами.

3.7.3 С учетом вероятности повреждения тканей и появления связанных с ним артефактов морфологического характера при воздействии высоких температур (т.е. при нагревании) оптимальными условиями для выполнения операций обезвоживания и очистки образцов следует считать значения температуры от комнатной до умеренно повышенной. Например, в случае применения метода ICE извлеченные образцы, как правило, обезвоживают при температуре 40 °C.

3.7.4 Для заливки образцов глазных тканей обычно используют парафин — поликристаллическую смесь твердых углеводородов [6], [10], [12], [26], [30], [37]. Существует практика заливки тканей глазного яблока или роговицы кролика пластмассой, например гликоль метакрилатом [33]. Метод заливки пластмассой обеспечивает определенные преимущества перед методом заливки парафином при выполнении гистологического анализа роговичного диска (например, более слабое тепловое воздействие, менее выраженные оптические искажения) [36].

3.7.5 Если проводке подвергается только извлеченная роговица (например, в случае применения метода BCOP или использования иных моделей с извлеченными образцами роговицы), исследуемый образец после пропитки жидким парафином следует рассечь таким образом, чтобы обе его половины могли быть залиты в одном и том же блоке.

3.7.6 Образцы тканей при выполнении проводки заливают парафином таким образом, чтобы после его остывания они сохраняли нужную ориентацию внутри затвердевшего блока. Например, при необходимости определения толщины роговицы, в том числе для оценки степени ее отечности, как правило, требуется получить ее правильные поперечные срезы (т.е. от передней до задней поверхности), которые позволяли бы выполнять точные измерения последствий воздействия исследуемой химической продукции с целью сравнения их результатов с результатами, полученными для отрицательной контрольной пробы (данное условие не относится к методу ICE, согласно которому отечность роговицы измеряется непосредственно при помощи щелевой лампы с микроскопом до начала гистологического анализа). В любом случае образец тканей должен располагаться внутри затвердевшего блока, по его краю, в правильной ориентации, которая обеспечивала бы получение пригодных для анализа срезов в зависимости от вида проводимых исследований.

3.7.7 Стандартная схема проводки образцов глаз, полученных in vivo, с использованием гистопроцессора приведена в [6]. Вначале извлеченные глазные яблоки фиксируют, оставляя на ночь в 10%-ном НБФ, и обезвоживают в растворе, содержащем 4% фенола/70% спирта, в течение 1 ч. Фенол добавляют с целью размягчения тканей склеры и хрусталика. Затем образцы глаз выдерживают в двух раздельных порциях 95%-ного спирта (в течение 1 ч в каждой) и двух раздельных порциях 100%-ного спирта (в течение 1,5 ч в каждой). Этап очистки образцов ткани включает в себя инкубацию в растворе, содержащем 50% спирта/50% ксилола в течение 2 ч, с последующей обработкой в двух раздельных порциях 100%-ного ксилола (в течение 2 ч в каждой). Ткани затем подвергают пропитке жидким парафином, выдерживая их раздельно дважды в течение 2 ч. В данную схему могут вноситься изменения в зависимости от типа гистопроцессора и рекомендаций его изготовителя, например, как описано выше.

3.8 Микротомирование тканей и приготовление срезов

3.8.1 После заливки ткани, как правило, нарезают на тонкие пластины при помощи микротома с заточенным стальным лезвием. В зависимости от типа используемого микротома толщина срезов ткани обычно составляет 3 — 8 мкм [5], [22], [56], [60], [36]. Если применяется метод ICE или BCOP, серию срезов, с шагом 4 — 5 мкм, выполняют в центральной части роговицы в продольном направлении, а полученные срезы затем окрашивают. Для минимизации вибраций микротом должен располагаться на устойчивой поверхности из твердого материала (например, на мраморной столешнице). Вибрация оборудования при микротомировании может привести к появлению в срезах тканей существенных артефактов [26], [30], [60].

3.8.2 При микротомировании блоков с образцами глазных яблок или образцами роговицы, рассеченными пополам, срезы получают из каждой половины глазного яблока в области, содержащей исследуемую роговичную ткань, или из каждой половины образца роговицы соответственно и укладывают на поверхность предметных стекол для дальнейшего окрашивания (срезы, в ходе изготовления которых кромка каждого последующего среза слипается с кромкой предыдущего, согласно общему правилу вначале помещают в емкость с теплой водой, чтобы снизить вероятность образования на них складок, и лишь затем переносят на предметные стекла) [5], [26], [32]. В случае применения метода ICE обычно приготавливают по одному срезу для каждого глаза, в то время как в случае применения метода BCOP (там, где роговицу рассекают пополам) из каждого образца роговицы обычно приготавливают по два среза соответственно. Важно удалять ткань из воды до того, как она набухнет и создаст искусственные пространства между тканями, клетками и внеклеточными волокнами [56], [60]. Предельная продолжительность времени, в течение которого срезы могут находиться в воде, не нормируется, однако обычно их извлекают после того, как они, расправившись, приняли размеры, приблизительно соответствующие размерам граней парафинового блока, из которого они были получены.

3.8.3 Для обеспечения прочного сцепления срезов ткани с предметными стеклами в процессе окрашивания часто используют стекла с поли-L-лизиновым покрытием. Альтернативно в емкость с водой может добавляться желатин [60].

3.8.4 Ножи микротома всегда должны быть острыми. Использование тупых ножей приводит к тому, что на полученных срезах могут присутствовать артефакты, например линии сжатия, засечки, разрывы, и/или эти срезы могут иметь неравномерную толщину [56], [60].

3.9 Окрашивание образцов тканей

3.9.1 В повседневной практике гистологические срезы тканей обычно окрашивают с помощью гематоксилина и эозина (H&E) [4], [22]. Более подробная информация по окрашиванию и другим аспектам гистологического анализа приведена в соответствующих руководствах по гистологии [3], [4].

3.9.2 В случае применения метода ICE рекомендуется следовать указаниям, содержащимся в руководстве AFIP по лабораторным методам в гистотехнологии [54], и использовать для окрашивания реактив Шиффа (PAS), описанный ранее [53]. Возможность использования H&E (гематоксилин-эозин) также не исключается, однако наилучшая видимость базальной мембраны может быть достигнута только посредством использования PAS. За исключением возможности визуального контроля базальной мембраны, оба метода окрашивания в равной степени пригодны для проведения гистологических исследований по всем показателям, существенным для методов ICE и BCOP. Внешние различия срезов тканей, окрашенных двумя способами, приведены в приложении А.

3.10 Оценка качества срезов роговицы и их пригодности для выполнения анализа

3.10.1 Ткани животных/образцов, подвергаемые воздействию исследуемой химической продукции, обрабатывают одновременно положительной и отрицательной контрольной пробой. Параллельное воздействие на ткани отрицательной контрольной пробой (или контрольной пробой растворителя, если таковая использовалась) может потребоваться для определения пригодности для анализа других срезов серии. Кроме того, такое исследование может быть полезно для оценки качества окрашивания, наличия артефактов, особенностей тканевой структуры, а также для определения толщины тканей [26], [30]. Данные параллельного воздействия положительной контрольной пробы позволяют убедиться в соблюдении условий проведения исследования соответствующей реакции тканей. Более того, имеющиеся данные о воздействии положительной контрольной пробой, получаемые от испытательных лабораторий, могут использоваться для формирования информационной базы данных по повреждениям глаз химической продукцией с сильным раздражающим действием, что позволит проводить сравнительную оценку наблюдаемых последствий воздействия исследуемой химической продукцией. Эталонная химическая продукция может использоваться для определения возможных механизмов воздействия, исходя из характера повреждений, типичных для соответствующего класса или вида химической продукции (например, для окислителей, сурфактантов). Использование эталонной химической продукции, физические свойства которой (например, цвет, агрегатное состояние, вязкость и т.п.) аналогичны свойствам исследуемой химической продукции, способствует более точной оценке неблагоприятного эффекта исследуемой продукции. Иными словами, использование соответствующей эталонной химической продукции может быть важным и должно оцениваться в каждом конкретном случае.

3.10.2 До начала применения методов гистологического анализа в сфере законодательного регулирования лабораториям рекомендуется сформировать собственную карту морфологических изменений на основе данных о воздействии отрицательных контрольных проб, а также определить диапазон гистологических изменений, как показано в приложении А.

4 Данные и отчеты об испытаниях

4.1 Изучение срезов

4.1.1 Ранее приготовленные срезы на стеклах в дальнейшем следует архивировать. Кроме того, если возможно, для этих же целей целесообразным является получение и сохранение дополнительно к имеющимся оригиналам срезов их цифровых сканированных изображений. При применении метода ICE считается достаточным для проведения исследований использовать три образца глаз из расчета на каждую химическую продукцию и один срез из расчета на каждый глаз. В случае применения метода BCOP также используют по три образца глаза из расчета на каждую химическую продукцию, однако из роговицы каждого глаза изготавливают, как правило, два среза (см. 3.8.2).

4.1.2 Все гистологические исследования должны проводиться персоналом, подготовленным для выявления характерных морфологических изменений в образцах глаз или роговицы, обработанных исследуемой продукцией. Непосредственно для оценки желательно использовать оригиналы срезов на стеклах.

4.1.3 Если результаты гистологического анализа должны использоваться в сфере законодательного регулирования, в целях получения согласующихся, корректных и воспроизводимых данных гистологических наблюдений рекомендуется принятие комплексных мер по обучению специалистов, обеспечению переносимости результатов метода и оценке компетентности лаборатории. Использование оригиналов срезов (а не их микрофотоснимков) считается предпочтительным, поскольку некоторые эффекты требуют трехмерной оценки тканей. Кроме того, рекомендуется использование системы внутренней экспертной оценки патологии, прежде всего в тех случаях, когда гистологические исследования проводятся с целью оценки рисков или принятия решения о соответствующей классификации и маркировке химической продукции в соответствии с существующими рекомендациями [39], а также с учетом положений [42]. В рамках данного процесса патолог (имеющий опыт работы с конкретными видами тканей) проводит независимую оценку ряда срезов и соответствующих им патологических данных (например, для одного из каждых трех образцов глаз), способствуя тем самым уточнению заключений и интерпретаций патологических исследований, которые подготавливаются специалистом, непосредственно выполняющим исследования. Процесс позволяет обеспечить надлежащий контроль и повысить надежность и качество таких заключений и интерпретаций.

4.2 Система оценки данных

4.2.1 При применении метода ICE была разработана полуколичественная система оценки [53] для получения согласующихся данных наблюдений за проявлениями воздействия на ткани и обеспечения сравнения последствий воздействия различной химической продукции; также см. приложение А. В таблице 1 описаны типичные последствия воздействия химической продукции на извлеченные образцы глаза курицы и присвоенные этим последствиям баллы, после того как были проведены фиксация, обрезка и заливка парафином образцов, приготовление и окрашивание срезов.

Таблица 1

Полуколичественная балльная система оценки гистологических данных, применяемая для извлеченных образцов глаз курицы после их фиксации, обрезки, заливки парафином, приготовления и окрашивания срезов

Параметр	Наблюдаемое состояние	Количество баллов	Описание
Эпителий: разъедание	Очень слабая	1/2	От нескольких отдельных клеток до отдельного поверхностного слоя
	Слабая	1	До трех поверхностных слоев
	Умеренная	2	До 50% эпителиального слоя <1>
	Сильная	3	Эпителиальный слой поврежден вплоть до базальной мембраны
Эпителий: вакуолизация. Отдельно оценивается состояние верхней, средней и нижней частей эпителия <2>	Очень слабая	1/2	От одной до нескольких разрозненных клеток
	Слабая	1	Группы вакуолизированных клеток или одиночная цепочка клеток с небольшими вакуолями
	Умеренная	2	До 50% эпителия состоит из вакуолизированных клеток
	Сильная	3	От 50% до 100% эпителия состоит из вакуолизированных клеток
Эпителий: некроз <3>	В норме	-	< 10 омертвевших клеток <4>
	Очень слабый	1/2	10 — 20 омертвевших клеток <4>
	Слабый	1	20 — 40 омертвевших клеток <4>
	Умеренный	2	Большое количество омертвевших клеток, при этом затронуто < 50% эпителиального слоя
	Сильный	3	От 50% до 100% эпителиального слоя омертвело
Строма: пикнотизация клеточных ядер <5>, <6> в верхней или нижней части	В норме	-	< 5 пикнотических ядер
	Слабая	1	5 — 10 пикнотических ядер
	Умеренная	2	> 10 пикнотических ядер
Разупорядоченная структура волокон стромы <6>	Присутствует	Р	Волокна располагаются в беспорядке
Эндотелий: некроз	Присутствует	Р	Поскольку эндотелий состоит только из одного слоя, степени тяжести поражения тканей в этом случае не рассматриваются
Примечание — В приложение А включен специализированный атлас с микрофотоснимками типичных примеров обработанных и необработанных образцов глаз курицы, иллюстрирующими различные возможные гистологические последствия химического воздействия, указанные выше. <1> По всей поверхности роговицы, за исключением случаев обработки такой исследуемой химической продукцией (например, твердой химической продукцией), при воздействии которой, несмотря на равномерное ее нанесение в соответствии с требованиями [[46]](#p101846), возникают лишь разрозненные деструктивные изменения. В подобной ситуации оценка должна основываться на сведениях о локальных последствиях воздействия химической продукцией на том участке(ах), где они проявились. <2> Верхняя, средняя и нижняя части эпителия представляют собой его равные трети по толщине соответственно. При отсутствии верхнего слоя эпителия его средний слой не должен рассматриваться как «новый» верхний, а по-прежнему считается средним слоем (подробнее см. приложение А). <3> Только некроз описанных клеток/тканей. <4> Подсчет количества омертвевших клеток производится на всей протяженности роговицы (необходимость в выборе конкретной фиксированной длины участка для подсчета отсутствует в силу того, что общая длина роговицы на каждом срезе остается практически постоянной, поскольку размеры глаз курицы и, соответственно, размеры подвергаемых микроскопическому исследованию материалов варьируются в минимальных пределах). Применяемая система начисления баллов оперирует либо абсолютными значениями количества клеток для оценок от «в норме» до «слабый», либо процентными значениями для «умеренный» и «сильный». Указанное различие связано с особенностями характеристик, оцениваемых исследователем: омертвевшие клетки рассматриваются как отдельные объекты. Если их много, то они, как правило, разрознены и исследователю приходится осуществлять их подсчет, для того чтобы составить представление о масштабах некроза. Напротив, при наблюдении за эрозией первое, на что обращает внимание исследователь, это утрата определенной части эпителия, так что в данном случае логичным будет использовать процентную оценку выявленных потерь. <5> Метод исследования ICE уже включает в себя выполнение прецизионных измерений толщины роговицы при помощи щелевой лампы с микроскопом. Поэтому отечность стромы не рассматривается отдельно, и за нее не начисляются баллы при проведении последующего гистологического анализа. <6> К учитываемым изменениям в строме относятся: (1) пикнотизация клеточных ядер, как это предусматривает система оценивания, взятая на вооружение Маурером [[84]](#p101922) и сформированная исходя из результатов его собственных наблюдений за реакцией роговицы глаза кролика на воздействие при испытаниях in vivo (эта реакция была описана как утрата кератоцитов/некроз), и (2) разупорядоченная структура волокон. Что касается пункта (1), то присутствие пикнотизированных клеточных ядер обнаруживается лишь в определенных ситуациях, а вероятность их появления предлагается увязывать с глубиной повреждений и/или интенсивностью воспалительного процесса в роговице (in vivo). Кроме того, с учетом удлиненной формы стромальных фибробластов существует вероятность ошибочного распознавания нормальных клеточных ядер как пикнотизированных в зависимости от направления сечения клеток. По пункту (2) следует отметить, что адекватное наблюдение и оценка нарушенного расположения волокон может оказаться непростой задачей, потому что для структуры стромальных волокон сама по себе характерна некоторая «естественная» разупорядоченность. Обработка роговицы, проводимая перед микроскопическим исследованием, также может усугублять их беспорядочное расположение. В обоих случаях (пикнотизация ядер или разупорядоченная структура волокон) предполагается, что такие свидетельства должны согласовываться со сведениями о сильных деструктивных изменениях в роговице, полученными к этому моменту путем осмотра при помощи щелевой лампы с микроскопом, а также сведениями о видимом воздействии, которое химическая продукция оказала на средние и нижние слои эпителия.

4.2.2 Требования [46] предусматривают равномерное нанесение исследуемой химической продукции на поверхность извлеченных образцов глаз курицы. Таким образом, воздействие исследуемой химической продукции обычно влечет за собой однородные изменения в роговице наблюдаемых образцов, что позволяет говорить о возможности формирования усредненного результата гистологического анализа по всему срезу, пригодного для последующего присвоения оценки. С другой стороны, при воздействии отдельной исследуемой химической продукции такие изменения могут локализоваться вокруг нескольких центров, принимая вид разрозненных пятен, независимо от того, насколько равномерно продукция была распределена по поверхности образца (например, в случае некоторой твердой исследуемой продукции). Если в процессе применения метода ICE были выявлены (множественные) очаговые поражения такого рода, то в дальнейшем на это следует обратить внимание специалиста, выполняющего гистологический анализ, чтобы в его оценке могли быть учтены указанные локальные повреждения, вызванные воздействием исследуемой химической продукции. Кроме того, при наличии сомнений (например, в случае если возникли расхождения между результатами, полученными по методу ICE, и результатами гистологического анализа) дополнительно могут быть приготовлены срезы других участков роговицы, подтверждающие присутствие локально выраженных изменений в изученном сечении.

4.2.3 Баллы при оценке присваиваются только за действительно наблюдаемые последствия воздействия химической продукции. Подготовка заключений в виде предположений не допускается (например, если верхний слой эпителия отсутствует, то, соответственно, не могут быть выставлены баллы за вакуолизацию в этом слое). Деструктивные последствия/характерные изменения, наблюдаемые на участках, примыкающих к лимбу, следует засчитывать только при условии сохранения ненарушенной структуры тканей. С другой стороны, не следует засчитывать аналогичного рода последствия/изменения внутри области, ограниченной лимбом, если они вызваны процессами, не связанными с воздействием химической продукции.

4.2.4 Крайне важно уметь отличать фактические последствия, вызванные обработкой химической продукцией, от артефактов, которые могли возникнуть при гистологическом исследовании, и/или от особенностей строения органа птицы; в первую очередь это касается оценки степени вакуолизации (см. приложение А). В этих целях в Атласе, приведенном в приложении А, рассматриваются оба этих случая. Наконец, для получения согласующихся, корректных и воспроизводимых данных гистологических наблюдений рекомендовано принятие комплексных мер по обучению специалистов, обеспечению переносимости результатов метода и оценке компетентности лаборатории (см. 4.1.3).

4.3 Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен включать в себя следующую информацию.

Исследуемая и контрольная химическая продукция:

• однокомпонентное вещество: химическое наименование, а именно наименование(я) по IUPAC или CAS, регистрационный номер(а) CAS, коды SMILES или InChI, структурную формулу и/или другие идентифицирующие признаки;
• многокомпонентное вещество, вещество с неопределенным или переменным составом (UVCB) или смесь веществ: как можно более полные сведения о наименовании(ях), степени чистоты, количественном содержании и соответствующих физико-химических характеристиках его составляющих;
• сведения о степени чистоты, наименовании(ях) примесей (при возможности и целесообразности) и т.п.;
• сведения об агрегатном состоянии, летучести, показателе pH, стабильности, классе химических соединений, растворимости в воде, других показателях, важных для целей исследования;
• способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);
• сведения об условиях хранения и стабильности, если таковые имеются.

Информация об организации, осуществлявшей финансирование, и лаборатории, проводившей испытания:

• наименование и адрес организации/лица, осуществлявших финансирование, лаборатории, где проводились испытания, имя руководителя исследования, а также имя специалиста-патолога, если таковой принимал участие в исследовании;
• сведения об источнике, из которого поступили образцы глаз (например, о предприятии, на котором они были отобраны);
• условия хранения и транспортирования образцов глаз (например, дата и время их отбора, продолжительность времени, прошедшего перед началом испытаний);
• отличительные характеристики особей, у которых были отобраны образцы глаз для исследования, если эти характеристики известны (например, сведения об их возрасте, поле, породе, массе).

Данные гистологического исследования:

• уникальный идентификационный номер исследуемого образца;
• тип исследованных тканей (например, роговица, глаз целиком);
• вид животных, у которых были отобраны образцы тканей (например, крупный рогатый скот, кролики);
• время убоя животных и/или отбора образцов глаз, а также время фиксации тканей;
• сведения о количестве образцов тканей, использованных для каждого исследуемого вещества или контрольного вещества (например, n = 3);
• сведения о действующей системе экспертной оценки, если имеется;
• дополнительно, если соответствующие сведения не нашли отражения, например, в СОП или если подобная процедура не предусмотрена, в отчете должна быть представлена также следующая информация:
• описание комплексных мер по обучению специалистов и обеспечению переносимости результатов метода;
• сведения об использованных фиксирующих, обезвоживающих и осветляющих реактивах и соответствующих протоколах;
• сведения об использованных материалах для заливки образца и инфильтрирующих растворителях вместе с соответствующими значениями концентрации;
• сведения о толщине срезов тканей;
• сведения об использованном красителе (согласно отчету) и соответствующем применявшемся протоколе окрашивания;
• информация об использованном оборудовании.

Результаты:

• при возможности цифровые снимки или цифровые сканированные изображения срезов;
• подробное описание всех патологических изменений и артефактов на основе действующей полуколичественной балльной системы оценки результатов либо с использованием стандартной терминологии в области гистопатологии;
• сведения о том, учитывались ли при оценке гистологические, локально выраженные изменения, если такие изменения имели место;
• описание критериев принятия решений, использованных при оценке;
• данные для каждого отдельного образца в табличной форме и при необходимости сводные таблицы.

4.4 Критерии принятия решений для всех классов опасности для глаз

4.4.1 Согласно [43] и [46] методы BCOP и ICE в заданных условиях и с соблюдением определенных ограничений могут применяться для классификации веществ и их смесей по степени опасности, которую они могут представлять для глаз. Полученные с их помощью результаты признаются в качестве достоверных источников информации в рамках подходов IATA, перед тем как может быть рассмотрен вопрос проведения испытаний на живых животных [44]. Несмотря на то что методы ICE и BCOP не являются полноценной альтернативой тестам на глазу кролика in vivo, оба этих метода исследования могут применяться для определения химической продукции, вызывающей серьезное раздражение глаз (т.е. относящейся к классу опасности 1 согласно СГС ООН), а также химической продукции, не требующей классификации как способная вызывать раздражение или серьезное повреждение глаз (т.е. не требующей классификации согласно СГС ООН) [43], [46] и нанесения на нее соответствующей маркировки.

4.4.2 В соответствии с требованиями IATA, если в отношении вещества или смеси веществ не удается достоверно предположить их принадлежность к способным вызывать серьезное повреждение глаз либо к не классифицируемым как способные вызывать раздражение или серьезное повреждение глаз, то для целей их окончательной и однозначной классификации должна использоваться дополнительная информация, полученная из других источников, например результаты дополнительных исследований (in vitro и/или также in vivo — при крайней необходимости). Но даже в случаях, когда достоверное заключение не может быть подготовлено на основе классификации согласно [43] и [46], результаты, полученные при применении методов BCOP или ICE, рассматриваются как пригодные для использования в рамках подходов IATA в сочетании с другими данными, полученными как путем испытаний, так и иным путем, для дальнейшей оценки по совокупности имеющихся свидетельств потенциальной опасности исследуемой химической продукции. В этой связи для них устанавливаются четко определенные критерии принятия решений, приведенные ниже и применимые ко всем классам опасности в рамках системы СГС ООН. Соответствующие выводы могут затем указываться в отчетах наряду с остальной имеющейся информацией.

4.5 Метод исследования BCOP

4.5.1 Подробный протокол проведения исследования по методу BCOP включен в приложение Г. В соответствии с положениями [43] средние значения непрозрачности и проницаемости роговицы ОП490 для каждой обрабатываемой серии образцов объединяют для вычисления значения показателя раздражающей способности (IVIS) по следующей формуле:

IVIS = среднее значение непрозрачности +

• (15 x среднее значение ОП490).

4.5.2 Вещество или смесь веществ со значением IVIS > 55 при этом рассматривают как способное вызывать серьезное повреждение глаз (класс опасности 1 согласно СГС ООН), а вещество или смесь веществ со значением IVIS <= 3,0 — как не требующие классификации согласно СГС ООН (класс опасности отсутствует). Рекомендуемые критерии принятия решений, в случае если метод BCOP планируется применять для определения других классов опасности, приведены в таблице 2.

Таблица 2

Общие критерии классификации по методу BCOP

Классификация согласно СГС ООН [[43]](#p101840)	Прогнозное заключение по результатам применения метода in vitro <*> [[29]](#p101812)	Диапазон значений IVIS
Класс опасности отсутствует	Не требует классификации	<= 3
Прогнозирование не представляется возможным	Слабое воздействие	> 3, <= 25
	Умеренное воздействие	> 25, <= 55
Класс опасности 1	Сильное воздействие	> 55
<*> В соответствии с критериями, используемыми в [[43]](#p101840).

4.5.3 Возможность применения метода BCOP для определения продукции, способной оказывать раздражающее действие на глаза, в соответствии с требованиями систем классификации EPA [17], EU [20] и СГС ООН [62] была в надлежащем порядке изучена ICCVAM [29]. Как следует из имеющихся данных о практическом применении метода BCOP (база данных для n = 211 наименований химической продукции) [28], общая доля правильных результатов классификации находится в диапазоне от 49% (91/187) до 55% (102/187) в зависимости от выбранной системы классификации. Исходя из имеющихся статистических данных, исследования по методу BCOP не могут рассматриваться в качестве полноценной замены тестам in vivo, проводимым на глазу кролика.

4.5.4 Несмотря на то что метод BCOP не позволяет полностью отказаться от испытаний на живых животных, он, при условии соблюдения требований [43], может тем не менее успешно применяться для определения химической продукции, относящейся к классу опасности 1, а также химической продукции, не требующей классификации согласно СГС ООН, без необходимости проведения дальнейших исследований. В тех случаях, когда соответствующее заключение не может быть подготовлено на основе классификации согласно [43], данные исследований, полученные по методу BCOP, могут использоваться в рамках подходов IATA [44] в сочетании с другими данными, полученными как путем испытаний, так и иным путем, для дальнейшей оценки по совокупности имеющихся свидетельств потенциальной опасности исследуемой продукции [44]. Подробные критерии принятия решений согласно таблице 2 могут использоваться в процессе дальнейшей оценки эффективности и возможных ограничений метода BCOP для определения классов опасности по способности вызывать раздражение глаз.

4.5.5 После накопления соответствующих данных упомянутые выше критерии могут быть уточнены в целях оптимизации метода BCOP для определения химической продукции, обладающей слабым и умеренным раздражающим действием (т.е. относящейся к подклассам опасности 2A и 2B согласно СГС ООН). Кроме того, проведение параллельно испытаний с использованием эталонной химической продукции (см. 3.10.1) или продукции, которая по своим химическим свойствам и составу сходна с исследуемой химической продукцией, и продукции, в отношении которой имеются объективные и достаточные данные, необходимые для ее достоверной классификации по степени опасности для глаз, может обеспечить основу построения прогнозных заключений о потенциальной опасности для глаз исследуемой химической продукции в соответствии с подходом по совокупности имеющихся свидетельств.

4.6 Метод исследования ICE

4.6.1 Подробный протокол проведения исследования по методу ICE включен в приложение В. Согласно [46] классификацию исследуемой химической продукции по степени опасности in vitro проводят, выбирая такой класс опасности согласно [62], который соответствует сочетанию классов опасности в отношении отечности роговицы, непрозрачности роговицы и способности удерживать флуоресцеин (см. таблицу 8). Дополнительный этап анализа при этом предусматривает наблюдение морфологических изменений.

4.6.2 Степень отечности роговицы определяют по результатам измерений ее толщины, которые выполняются при помощи оптического пахиметра, установленного на щелевой лампе с микроскопом. Ее выражают в процентах и вычисляют исходя из результатов последовательных измерений толщины роговицы по следующей формуле:

4.6.3 Среднее значение показателя отечности роговицы в процентах всех исследуемых образцов глаз вычисляют для всех временных точек. В зависимости от наибольшего среднего значения, зафиксированного по всем временным точкам, каждой исследуемой химической продукции присваивают соответствующий класс ICE (см. таблицу 3).

Таблица 3

Критерии классификации по методу ICE по отечности роговицы

Среднее значение показателя отечности роговицы, %	Класс ICE
От 0 по 5	I
От > 5 по 12	II
От > 12 по 18 (> 75 мин после обработки)	II
От > 12 по 18 (= 75 мин после обработки)	III
От > 18 по 26	III
От > 26 по 32 (> 75 мин после обработки)	III
От > 26 по 32 (= 75 мин после обработки)	IV
> 32	IV

4.6.4 Шкала оценки отечности роговицы в соответствии с приведенной таблицей применима только при условии использования для измерения ее толщины щелевой лампы с микроскопом модели Haag-Streit BP900 (либо модели Haag-Streit BQ900), с глубиномерной насадкой № 1 и со значением ширины щели, установленным на 91/2, что соответствует 0,095 мм. Пользователям следует иметь в виду, что при использовании щелевых ламп с другими заданными значениями щели могут быть получены несовпадающие значения при измерении толщины роговицы. В случае использования щелевой лампы с микроскопом, глубиномерной насадки или настроек измерения, отличных от указанных выше, эквивалентность получаемых результатов должна быть подтверждена и/или должен быть заново определен диапазон параметров для классификации.

4.6.5 При оценке непрозрачности роговицы ориентируются на те ее участки, в которых обнаруживается наиболее интенсивное помутнение, и присваивают баллы в соответствии с таблицей 4. Среднее значение показателя непрозрачности роговицы всех исследуемых образцов вычисляют для всех временных точек. В зависимости от наибольшего среднего значения показателя непрозрачности, зафиксированного в любой временной точке, каждой исследуемой химической продукции присваивают соответствующий класс ICE (см. таблицу 5).

Таблица 4

Значения показателя непрозрачности роговицы

Количество баллов	Наблюдаемое состояние
0	Роговица полностью прозрачная
0,5	Очень слабое помутнение
1	Присутствуют разрозненные или диффузные участки помутнения; рисунок радужной оболочки глаза хорошо просматривается
2	Отчетливо выделяется участок с частичной потерей прозрачности; рисунок радужной оболочки просматривается нечетко
3	Сильное помутнение; отдельные элементы рисунка радужной оболочки неразличимы; размеры зрачка определяются с трудом
4	Роговица полностью утратила прозрачность; радужная оболочка не видна

Таблица 5

Критерии классификации по методу ICE по непрозрачности роговицы

Максимальное среднее значение показателя непрозрачности	Класс ICE
0,0 — 0,5	I
0,6 — 1,5	II
1,6 — 2,5	III
2,6 — 4,0	IV

4.6.6 Способность к удерживанию флуоресцеина оценивают только для временной точки, соответствующей 30 мин наблюдения, присваивая баллы в соответствии с таблицей 6. Среднее значение показателя способности удерживать флуоресцеин для всех исследуемых образцов глаз вычисляют по результатам, полученным по истечении 30-минутного периода, и используют его для присвоения каждой исследуемой химической продукции соответствующего класса ICE (см. таблицу 7).

Таблица 6

Показатели способности удерживать флуоресцеин

Количество баллов	Наблюдаемое состояние
0	Отсутствие удержания флуоресцеина
0,5	Очень слабое окрашивание одиночных клеток
1	Окрашивание разрозненных одиночных клеток по всей площади обработанной области роговицы
2	Очаговое или сливающееся интенсивное окрашивание отдельных клеток
3	Присутствуют сливающиеся обширные участки роговицы, удерживающие флуоресцеин

Таблица 7

Критерии классификации по методу ICE по способности удерживать флуоресцеин

Среднее значение показателя способности удерживать флуоресцеин через 30 мин после обработки	Класс ICE
0,0 — 0,5	I
0,6 — 1,5	II
1,6 — 2,5	III
2,6 — 3,0	IV

4.6.7 Морфологические изменения также оцениваются, включая «разъедание» эпителия роговицы или «отслаивание» эпителия, «загрубление» поверхности роговицы, а также «прилипание» к ней остатков исследуемой химической продукции. Такого рода последствия могут иметь различную степень выраженности и могут проявляться одновременно. Классификация данных изменений — в соответствии с интерпретацией исследователя.

4.6.8 Результаты, полученные для показателей непрозрачности роговицы, отечности роговицы и способности удерживать флуоресцеин, должны оцениваться по отдельности с целью присвоения исследуемой химической продукции соответствующего класса ICE. После этого установленные по отдельным показателям значения классов ICE объединяют для прогнозирования класса опасности, который должен быть присвоен исследуемой химической продукции, исходя из результатов испытаний in vitro (см. таблицу 8). Классификацию исследуемой химической продукции по степени опасности in vitro проводят, выбирая такой класс опасности согласно [62], который соответствует сочетанию классов ICE для отечности, непрозрачности роговицы и ее способности удерживать флуоресцеин, согласно таблице 8.

Таблица 8

Общие критерии классификации по методу ICE

Классификация согласно СГС ООН [[46]](#p101846)	Прогнозное заключение по результатам применения метода in vitro [[48]](#p101850)	Сочетание трех показателей
Класс опасности отсутствует	Не требует классификации <2>	3 x I
		2 x I, 1 x II
		2 x II, 1 x I
Прогнозирование не представляется возможным	Слабое воздействие <3>	3 x II
		2 x II, 1 x III
		2 x I, 1 x III **
		1 x I, 1 x II, 1 x III
Прогнозирование не представляется возможным	Умеренное воздействие <4>	3 x III
		2 x III, 1 x I
		2 x III, 1 x II
		2 x III, 1 x IV
		2 x I, 1 x IV **
		2 x II, 1 x IV **
		1 x I, 1 x II, 1 x IV **
		1 x I, 1 x III, 1 x IV **
		1 x II, 1 x III, 1 x IV **
Класс опасности 1	Сильное воздействие <5>	3 x IV
		2 x IV, 1 x III
		2 x IV, 1 x II **
		2 x IV, 1 x I **
		Непрозрачность роговицы = 3 через 30 мин (не менее чем на 2 образцах глаз)
		Непрозрачность роговицы = 4 в любой временной точке (не менее чем на 2 образцах глаз)
		Интенсивное отслоение эпителия (не менее чем на 1 образце глаз)
Примечание — ** Сочетания с меньшей вероятностью, встречающиеся на практике.

4.6.9 При определении химической продукции, способной вызывать серьезные повреждения глаз (класс опасности 1 согласно СГС ООН), полученные результаты испытаний по методу ICE (без проведения гистологического анализа) демонстрируют общую точность прогнозирования на уровне 83% (142/172), долю ложноположительных заключений на уровне 7% (9/127) и долю ложноотрицательных заключений на уровне 47% (21/45) при сравнении с результатами классификации согласно СГС ООН, проведенной по данным тестов на глазу кролика in vivo [48].

4.6.10 При определении химической продукции, не требующей классификации как вызывающая раздражение или серьезное повреждение глаз, полученные результаты испытаний по методу ICE демонстрируют общую точность прогнозирования на уровне 88% (161/184), долю ложноположительных заключений на уровне 24% (20/83) и долю ложноотрицательных заключений на уровне 3% (3/101) при сравнении с результатами классификации согласно СГС ООН, проведенной по данным тестов на глазу кролика in vivo [48]. Если исключить из базы данных химическую продукцию определенных видов (т.е. лакокрасочные материалы с антиобрастающим эффектом, содержащие органические растворители), то метод ICE в рамках системы классификации СГС ООН демонстрирует общую точность прогнозирования на уровне 88% (159/181), долю ложноположительных заключений на уровне 24% (20/83) и долю ложноотрицательных заключений на уровне 2% (2/99).

4.6.11 В процессе дальнейшей оценки пригодности и возможных ограничений применения метода ICE для определения веществ, относящихся к различным классам опасности по способности вызывать раздражение глаз, рекомендуется использовать критерии общей схемы классификации по методу ICE (см. таблицу 8) и приводить полученные таким образом данные в отчете наряду с другими сведениями, например полученными при реализации подхода IATA [44]. При накоплении соответствующих данных упомянутые выше критерии могут быть пересмотрены в целях оптимизации метода ICE для определения химических веществ, обладающих слабым и умеренным раздражающим действием (т.е. относящихся к подклассам опасности 2A и 2B согласно СГС ООН).

4.6.12 Если гистологические исследования проводятся после воздействия моющих средств и сурфактантов, не характеризующихся экстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5), должны применяться критерии принятия решений, приведенные в таблице 9. Кроме того, в случае если наблюдаемый показатель пикнотизации клеточных ядер стромы >= «слабая» (1 балл) не менее чем у 2 из 3 образцов глаз или не менее чем у 2 из 3 образцов глаз обнаружены повреждения эндотелия, такие проявления должны фиксироваться как результаты, полученные путем наблюдений, для указания опасности воздействия.

Таблица 9

Критерии принятия решений при проведении гистологического анализа дополнительно к испытаниям, проводимым в соответствии со стандартным валидированным методом ICE, для определения моющих средств и сурфактантов, не обладающих экстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5), подлежащих отнесению к классу опасности 1 согласно СГС ООН

Слой ткани

Изменения, приводящие к серьезным повреждениям глаз (класс опасности 1 согласно СГС)

Эпителий

- разъедание = «умеренное» (2 балла) не менее чем у 2 из 3 образцов глаз; - и/или любые проявления вакуолизации (= «очень слабая», 1/2 балла), наблюдаемые в средней и/или нижней части эпителия не менее чем у 2 из 3 образцов глаз; - или разъедание = «умеренное» (2 балла) у 1 из 3 образцов глаз + вакуолизация = «очень слабая» в средней и/или нижней части эпителия (1/2), наблюдаемая не менее чем на одном из 3 образцов глаз; - и/или некроз = «умеренный» (2 балла), наблюдаемый на 2 из 3 образцов глаз

4.6.13 Далее должна использоваться модель построения прогнозов согласно таблице 10. Следует отметить, что накопленный на сегодняшний день объем данных не позволяет только на основании результатов гистологического исследования определять принадлежность химической продукции к классу опасности 2 согласно СГС ООН или к продукции, не требующей классификации согласно СГС ООН. Кроме того, критерии гистологического анализа и модель построения прогнозов для метода ICE, приведенные в таблицах 9 и 10 соответственно, применимы только для идентификации моющих средств и сурфактантов класса опасности 1 согласно СГС ООН, не обладающих экстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5).

Таблица 10

Модель построения прогнозов для определения моющих средств и сурфактантов, не обладающих экстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5), на основе результатов гистологического анализа

Заключение по методу ICE	Критерии гистологического анализа для метода ICE согласно таблице 9	Класс опасности в соответствии с СГС ООН
Прогнозирование не представляется возможным	Критерии выполнены	Класс опасности 1 согласно СГС ООН
	Критерии не выполнены	Прогнозирование не представляется возможным

4.6.14 В целом, если данные гистологического анализа используются в качестве дополнительных оцениваемых показателей для идентификации моющих средств и сурфактантов, не обладающих экстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5) и подлежащих отнесению к классу опасности 1 согласно СГС ООН, доля ложноотрицательных заключений (по сравнению с данными тестов Дрейза in vivo, а также данными для класса опасности 1 при исследованиях по методу LVET (left ventricular ejection time)) для метода ICE уменьшается (с 64% до 27% (n = 22)), а его общий уровень точности повышается (с 53% до 77% (n = 30)), при этом соблюдаются приемлемые значения доли ложноположительных заключений (от 0% до 12,5% (n = 8)) [48].

4.7 Критерии приемлемости для результатов исследований

Соответствующие критерии приемлемости результатов исследований по методам BCOP и ICE приведены в [43] и [46] соответственно.

4.8 Отчет об испытаниях

Сведения, подлежащие включению в отчет по итогам проведения исследований по методам BCOP и ICE, указаны в [43] и [46] соответственно.

Приложение А (обязательное)

АТЛАС ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ, ВЫЯВЛЯЕМЫХ НА ИЗВЛЕЧЕННЫХ ОБРАЗЦАХ ГЛАЗА КУРИЦЫ

(разработан компанией Triskelion, Зейст, Нидерланды)

А.1 Общие указания

При проведении исследования по методу ICE образцы глаз (роговицы), которые отбираются у молодых особей кур, поступивших на бойню, подвергают воздействию исследуемой химической продукции с соблюдением соответствующих стандартных протоколов. По окончании исследования образцы глаз сохраняют для дальнейшей обработки с целью их анализа на наличие гистологических изменений, который должен выполняться с использованием средств оптической микроскопии. Назначение настоящего Атласа заключается в предоставлении микрофотоснимков роговицы глаза курицы, как в ее нормальном, здоровом состоянии, так и после обработки химической продукцией, для того чтобы показать разнообразие возможных гистологических изменений.

А.2 Полуколичественная микроскопическая оценка роговицы

Образцы глаз фиксируют в фосфатном буферном растворе формалина, обрезают, заливают парафином, приготавливают из них срезы номинальной толщиной 5 мкм и окрашивают с использованием реактива Шиффа (если действующим протоколом не предусмотрено иное).

Степень выраженности наблюдаемых изменений оценивают исходя из критериев, приведенных в таблице 1. Микрофотоснимки, демонстрирующие разъедание, вакуолизацию и некроз эпителия, а также изменения в строме и некроз эндотелия, приведены в разделе А.4. Установленные критерии обеспечивают выполнение максимально объективной полуколичественной оценки последствий контакта с химической продукцией, которая позволяет проводить сопоставление с результатами воздействия другой химической продукции. Используя данную систему, опытный исследователь должен быть способным выявлять незначительные изменения и отличать последствия обработки исследуемой химической продукцией от артефактов.

А.2.1 Другие наблюдаемые изменения

Сморщивание	На роговице образуются складки, которые присутствуют в эпителиальном слое, но отсутствуют в базальной мембране
Бугристость	На роговице образуются складки, которые захватывают эпителиальный слой и базальную мембрану
Расслоение	Эпителиальный слой (частично) отстает от базальной мембраны

Перечисленные изменения могут быть охарактеризованы только в описательной форме. Их затруднительно оценивать, они никогда не встречаются на контрольных образцах, а следовательно, могут служить убедительным свидетельством химического воздействия.

А.2.2 Общие положения

Во многих случаях, если не указано иное, поражение роговицы происходит диффузно. Особенность диффузного поражения заключается в том, что центральная область роговицы, как правило, повреждается сильнее, чем ее периферийные участки. Вероятно, это можно объяснить снижением концентрации исследуемой химической продукции, помещаемой в центр роговицы, по мере растекания нанесенной пробы от центра к краям. Напротив, локальный характер выявленных повреждений, которые принимают вид отдельных пятен, позволяет говорить об очаговом или многоочаговом поражении роговицы. Подобный результат можно наблюдать при нанесении порошкообразной химической продукции.

Состояние частей роговицы, непосредственно примыкающих к лимбу, оценивать не следует.

В случае диффузного поражения, вызванного, например, воздействием жидкой исследуемой химической продукции, при оценке такого патологического показателя, как «вакуолизация», должна приниматься во внимание общая картина повреждений. Пример: в эпителии роговицы отмечена полная вакуолизация в среднем слое в одном или нескольких местах. Несмотря на то что в указанных местах вакуолизированы все 100% клеток среднего слоя, применяется критерий «группа вакуолизированных клеток», а следовательно, вакуолизации среднего слоя присваивается 1 балл («слабое»). Напротив, в случае твердой или вязкой исследуемой химической продукции, которая вызывает локальные эффекты, баллы следует присваивать на основе данных локализованных эффектов.

Для балльной оценки разъедания предусмотрен отличающийся подход: если хотя бы на одном участке слой эпителия по результатам наблюдений отсутствует вплоть до базальной мембраны, это свидетельствует о потенциальной способности исследуемой химической продукции подобным образом разрушить весь эпителий, что является основанием для присвоения 3 баллов («сильное»). Аналогичный подход должен применяться для очаговых поражений, имеющих место при исследовании порошкообразной химической продукции.

Гистологическим изменениям баллы следует присваивать, только если такие изменения действительно наблюдаются на срезах. На основе предположений оценку не присваивают. Пример: полное отсутствие верхнего слоя эпителия дает основания предполагать, что его клетки (клетки верхней трети эпителиального слоя) подверглись некрозу и это в свою очередь послужило причиной разъедания. Тем не менее в баллах должно оцениваться только разъедание. Если же омертвевшие клетки отделились от эпителиального слоя, но по-прежнему присутствуют на срезе, их следует учитывать.

Иногда последствия токсического воздействия могут быть представлены сочетанием изменений, так, например, на образце может отмечаться сильное разъедание, при этом на сохранившихся участках эпителия может наблюдаться некроз клеток. В подобных случаях баллы присваиваются за оба изменения.

Возможна ситуация, когда сам слой эпителия частично отделяется от базальной мембраны. Данное изменение следует отразить в отчете в виде соответствующего примечания.

А.2.3 Проявления вакуолизации

Вакуолизация — это одна из разновидностей дегенеративных изменений. Вакуоли могут включать в себя воду, жиры, а также разрушившиеся клеточные органеллы (либо их части). Причиной образования вакуолей могут быть патологические метаболические изменения клетки или повреждение клеточной мембраны, в результате которых клетка теряет способность поддерживать свой гомеостаз. В любом случае вакуолизация носит внутриклеточный характер. Вакуоли имеют сферическую форму и обычно выглядят как участки пустого пространства различных размеров. Иногда их появление приводит к существенному увеличению объема («вздутию») клетки. Особенно мелкие вакуоли придают цитоплазме «пенистый» вид.

В отдельных случаях вокруг клеточных ядер также можно наблюдать образовавшиеся узкие зазоры (наподобие ореолов). Это артефакты сжатия ядра, которые не следует смешивать с вакуолизацией. Гистологическая обработка тканей может привести к вытеснению ядер из клеток, в силу чего на их прежнем месте остается незанятое пространство (такие клетки называют призрачными). Подобные изменения также следует считать артефактами.

Клетка с признаками дегенеративных изменений может быть восстановлена при условии, если не достигнута точка невозврата, в противном случае клетка погибает. При разрушении мембран рядом расположенных клеток с большими вакуолями эти вакуоли сливаются. Соответственно, расположенный над ними слой эпителия теряет связь с нижерасположенным слоем. Начиная с этого момента, при присвоении балльной оценки следует говорить не о вакуолизации, а о разъедании.

При оценке вакуолизации следует указывать конкретную часть эпителиального слоя, в которой наблюдалось данное изменение: верхнюю (наружная поверхность эпителиального слоя), среднюю или нижнюю (примыкающую к боуменовой мембране). Согласно рисунку А.1 верхняя, средняя и нижняя части эпителия представляют собой его равные трети по толщине соответственно. Если верхний слой эпителия отсутствует, его средний слой не должен рассматриваться как новый верхний, а по-прежнему считается средним слоем. В отличие от балльной оценки за вакуолизацию (для трех различных слоев) балльная оценка за разъедание и некроз должна применяться для всей роговицы в целом.

Рисунок А.2.1 — Схематическое представление верхнего, среднего и нижнего слоев эпителия при проведении исследования по методу ICE

А.2.4 Артефакты

В процессе обработки образца роговицы могут быть повреждены элементы межклеточных контактов, называемые десмосомами. На приготовленном срезе это может выглядеть как повторяющиеся разрывы (увеличенные промежутки между клетками). Пока еще не определено, может ли выбор применяемых гистологических процедур повлиять на то, насколько заметными будут эти разрывы. Данное изменение иногда на первый взгляд может напоминать вакуолизацию. Тем не менее его не следует отождествлять с вакуолизацией и присваивать ему баллы в процессе оценки, так как оно не связано с внутриклеточными дегенеративными процессами, указанными выше. Подобные дефекты, если они действительно имеют место, всегда сопровождаются целым рядом других гистологических изменений, подробный учет которых предусмотрен в рамках действующей модели построения прогнозов, соответственно, их можно не принимать во внимание при выполнении гистологического анализа.

Разумеется, при изучении срезов образцов под микроскопом исследователь должен считаться с вероятностью неверного истолкования природы наблюдаемых морфологических изменений. Типичные артефакты следует четко интерпретировать как таковые, не смешивая их со значимыми для результатов анализа патологическими последствиями воздействия исследуемой химической продукции (иллюстрации с примерами наиболее часто встречающихся артефактов приведены в А.4.8). К ним, в частности, относятся:

• неодинаковая интенсивность окрашивания образцов. Причиной данного явления могут быть незначительные расхождения в качестве реактивов разных партий, использованных для окрашивания, или изменение процедур окрашивания (см. также примечания в А.4.3);
• пилообразная поверхность эпителия. Верхний слой эпителия имеет повторяющийся рисунок, напоминающий зубья пилы. Данное явление может быть ошибочно расценено как признак очень слабого разъедания, хотя в действительности оно возникает на этапе обрезки краев образца, выполнение которой иногда дает такой побочный результат;
• отмечаемое в редких случаях полное отслоение эндотелия. Сам эндотелий при этом выглядит неповрежденным, однако отсоединился от роговицы и расположение его необычное, например, он свернут пополам и прилегает к хрусталику. Подобное явление не может быть объяснено воздействием исследуемой химической продукции, и его следует расценивать как артефакт, возникший в процессе гистологической подготовки образца;
• разрывы или складки тканей. Могут образовываться при выполнении процедур гистологических исследований, как указано выше;
• отсутствие части эпителия, неровные края обрыва;
• артефакт усадки образца, при которой отчетливо наблюдаются ореолы вокруг клеточных ядер;
• появление «призрачных» клеток, обусловленное утратой ими ядра.

А.2.5 Окрашивание гистологических срезов

Извлеченные образцы глаз курицы погружают в 4%-ный нейтральный водный фосфатный буферный раствор формальдегида через 4 ч после обработки согласно стандартным испытаниям по методу ICE [46]. Для этих целей образцы предварительно рассекают, произведя скальпелем почти сквозной разрез непосредственно за хрусталиком сквозь стекловидное тело и оставив лишь небольшой фрагмент тканей задней части глаза для удерживания за него образца (впоследствии он удаляется), для того чтобы роговица не была повреждена при соприкосновении образца с твердой поверхностью в процессе обработки. Иссеченные таким образом глазные яблоки помещают в сосуд, содержащий приблизительно 20 мл формалина. После фиксации в течение не менее 24 ч излишки тканей обрезают ножницами таким образом, чтобы получить для заливки парафином тонкий фрагмент глаза, полностью включающий в себя роговицу и прилегающую к ней склеру. Из центральной части роговицы приготавливают последовательные продольные срезы (с шагом 5 мкм), которые затем окрашивают. При окрашивании срезов соблюдают указания согласно руководству AFIP по лабораторным методам в гистотехнологии [54], используя реактив Шиффа (PAS) [53].

Проводят полуколичественную микроскопическую оценку окрашенных PAS образцов роговицы в соответствии с критериями, приведенными в настоящем стандарте.

Альтернативный способ окрашивания с использованием HE (гематоксилин-эозина) также позволяет получить хорошие результаты. Тем не менее наилучшая видимость базальной мембраны может быть достигнута при использовании PAS. За исключением степени отчетливости рисунка базальной мембраны, оба метода окрашивания пригодны для проведения гистопатологической оценки по всем показателям, существенным для метода ICE. Примеры, демонстрирующие различия двух упомянутых способов окрашивания, приведены на рисунках в А.4.9.

А.2.6 Независимая экспертная оценка

Лаборатории, выполняющие гистологические исследования извлеченных образцов глаз курицы, должны иметь собственную систему независимой экспертной оценки, в рамках которой некоторое количество изучаемых срезов (например, 1 из 3) должно повторно оцениваться другим специалистом. Эта мера позволяет повысить качество, сопоставимость и воспроизводимость результатов оценки. Как основной исследователь, так и лицо, ответственное за повторную оценку, должны обладать достаточным опытом в части выполнения анализа извлеченных образцов глаз курицы и применения на практике системы оценки патологических изменений.

А.3 Гистологические критерии для идентификации химической продукции в соответствии с требованиями СГС ООН

В настоящее время определены только критерии для идентификации в рамках СГС ООН химической продукции, относящейся к классу опасности 1. Международная ассоциация производителей моющих средств и продуктов по уходу за домом (International Association for Soaps, Detergents and Maintenance Products — A.I.S.E.) в период с 2010 по 2012 гг. провела масштабное исследование in vitro, входе которого была подтверждена зависимость между определенными видами гистологических последствий, наблюдаемых при применении метода ICE, и повреждениями глаз, классифицируемыми как серьезные, которые могут возникать при воздействии на них моющих средств, обладающих неэкстремальными значениями pH [8], [93]. В совокупности специалистами была изучена реакция роговицы на 30 видах моющих средств с неэкстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5) [8] и 18 видах моющих средств с экстремальными значениями pH (pH <= 2 или pH >= 11,5) [93]. Было установлено, что вакуолизация эпителия (в среднем и нижнем слое) и его разъедание (по меньшей мере на умеренной глубине) являются наиболее типичными проявлениями токсического воздействия моющих средств с неэкстремальными значениями, относящихся к классу опасности 1 согласно СГС ООН по результатам исследований in vivo. Применение гистологических критериев обеспечило возможность существенного повышения чувствительности стандартной модели построения прогнозов при исследованиях по методу ICE для класса опасности 1 согласно СГС ООН (от 0% до не менее чем 75%, n = 8) с хорошим уровнем согласованности (73%, n = 30) и приемлемым уровнем специфичности (от 100% до 73%, n = 22). В частности, благодаря им удалось достоверно определить степень опасности 5 из 6 моющих средств с неэкстремальными значениями pH, относящихся к классу опасности 1 согласно СГС ООН на основании данных о сохранении деструктивных изменений по истечении 21 дня с момента воздействия веществ в процессе испытаний in vivo в условиях, когда последствия их воздействия могут быть недостаточно выражены для гарантированного присвоения указанным веществам класса опасности 1 только на основании тяжести этих изменений [8]. Напротив, что касается моющих средств с экстремальными значениями pH, 5 из 6 таких веществ при испытаниях in vivo присвоен класс опасности 1 с учетом выраженности отрицательных последствий, а не продолжительности их сохранения. В этом случае использование гистологических критериев, установленных A.I.S.E., не привело к повышению чувствительности стандартного метода исследования ICE (83%, n = 6), однако радикально уменьшило его специфичность (от 83% до 33%, n = 12) и согласованность (от 83% до 50%, n = 18) [93].

Приведенные факты свидетельствуют о том, что гистологический анализ образцов, подготовленных по методу ICE, имеет лишь ограниченную область применения в ситуациях, когда речь идет об изучении последствий воздействия моющих средств, что, по всей видимости, объясняется особенностями в характере их воздействия. Таким образом, соответствующие критерии принятия решений, разработанные A.I.S.E. (см. ниже), могут свободно применяться к моющим средствам с неэкстремальными значениями pH, но не к данным средствам, обладающим экстремальными значениями. Для расширения области применения гистологических критериев принятия решений метода ICE к другим видам химической продукции необходимо будет получить соответствующие и релевантные данные для подтверждения такой применимости.

А.3.1 Гистологические критерии для идентификации моющих средств с неэкстремальными значениями pH, подлежащих отнесению к классу опасности 1 согласно СГС ООН

В соответствии с результатами исследования, описанного выше, A.I.S.E. были разработаны дополнительные критерии принятия решений для использования со стандартной моделью построения прогнозов в соответствии с валидированным методом ICE [46] (см. таблицу А.1).

Гистологические критерии принятия решений, предлагаемые A.I.S.E. и приведенные в таблице А.1, были признаны оптимальными для целей идентификации моющих и чистящих средств, обладающих неэкстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5), относящихся к классу опасности 1 согласно СГС ООН преимущественно исходя из продолжительности сохранения деструктивных изменений при испытаниях in vivo, и действительно могут использоваться в дополнение к стандартной модели построения прогнозов в соответствии с валидированным методом ICE [46]. Показатели межлабораторной воспроизводимости результатов, получаемых с учетом описанных ниже критериев, в настоящее время оцениваются.

Таблица А.1

Рекомендуемые критерии принятия решений при проведении гистологического анализа дополнительно к испытаниям в соответствии со стандартным валидированным методом ICE для определения моющих средств <*>, обладающих неэкстремальными значениями pH (2 < pH < 11,5), относящихся к классу опасности 1 согласно СГС ООН

Слой ткани	Изменения, приводящие к серьезным повреждениям глаз (класс опасности 1 согласно СГС)
Эпителий	- разъедание >= «умеренное» (2 балла) не менее чем у 2 из 3 образцов глаз, - и/или любые проявления вакуолизации (>= «очень слабая», 1/2 балла), наблюдаемые в средней и/или нижней части эпителия не менее чем у 2 из 3 образцов глаз, - или разъедание >= «умеренное» (2 балла) у 1 из 3 образцов глаз + вакуолизация >= «очень слабая» в средней и/или нижней части эпителия (1/2 балла), наблюдаемая не менее чем у одного из 3 образцов глаз, - и/или некроз >= «умеренный» (2 балла), наблюдаемый не менее чем у 2 из 3 образцов глаз
<*> Под моющими средствами здесь понимаются смеси, содержащие один или несколько сурфактантов (кроме раствора отдельно взятого поверхностно-активного вещества) с конечной концентрацией > 3% и предназначенные для использования в процессе мытья и чистки. Моющие средства могут быть представлены в любой форме (в виде жидкости, порошка, пасты, бруска, таблетки, плитки, формованной фигурки и т.п.) и могут использоваться либо поставляться на рынок для использования в бытовых условиях, организациями или промышленными предприятиями.

Кроме того, в случае если пикнотизация клеточных ядер стромы >= «слабая» (1 балл) не менее чем у 2 из 3 образцов глаз или не менее чем у 2 из 3 образцов глаз обнаружены повреждения эндотелия, такие проявления должны отмечаться как результаты, полученные путем наблюдений, указывающие на опасность воздействия. Указанные проявления, однако, не могут рассматриваться в качестве неотъемлемой составляющей критериев принятия решений, поскольку в соответствии с действующим принципом глубины распространения повреждений [38] изменения в строме и в эндотелии могут наблюдаться только в том случае, когда соответствующие изменения уже имеют место в среднем и/или нижнем слоях эпителия.

А.4 Атлас

Сканирование срезов выполнялось при помощи сканирующего микроскопа 3DHistech Midi с последующей обработкой изображений с использованием специального программного обеспечения Pannoramic Viewer. Исключение составляют рисунки А.4.4.8, А.4.4.9 и А.4.6.2, полученные при помощи цифровой камеры Zeiss AxioCam ICc 1, установленной на оптическом микроскопе. Были приложены максимальные усилия, для того чтобы получить все имеющиеся изображения оптимального качества. Тем не менее при подборе иллюстраций в ряде случаев не удалось избежать присутствия на изображениях характерных патологических изменений без артефактов, а также гарантировать безупречную равномерность окраски образцов и резкость контуров запечатленных на микрофотоснимках участков тканей.

Для наглядного представления большинства аналогичных повреждений было использовано несколько изображений, чтобы в необходимых пределах ознакомить пользователя с их биологическим разнообразием, которое может быть на практике. Кроме того, незначительные изменения в гистологическом процессе (квалификация специалистов, температура, толщина срезов и т.п.) могут также быть причиной морфологических отклонений.

В будущем ожидается постоянное пополнение базы данных срезов, иллюстрирующих характерные морфологические изменения.

Соответственно, материалы Атласа планируется регулярно актуализировать путем включения в него новых изображений и замены прежних изображений на более качественные, если таковые будут получены.

А.4.1 Общие сведения

Рисунок А.4.1.1 — Донор образцов глаз — молодая курица

Рисунок А.4.1.2 — Глаз курицы в разрезе (По материалам: http://www.class.cvm.uiuc.edu/j-eurell/eye14.htm)

Рисунок А.4.1.3 — Вид образца после обрезки; для дальнейших исследований используется только передняя часть глаза

А.4.2 Контрольный образец роговицы

Рисунок А.4.2.1 — Контрольный образец роговицы (состояние после обработки физиологическим раствором)

Рисунок А.4.2.2 — Контрольный образец роговицы. Нормальный эпителий представлен 6 — 8 слоями эпителиальных клеток. Между эпителием и стромой видны базальная и боуменова мембраны

А.4.3 Эпителий: разъедание

Рисунок А.4.3.1 — Разъедание «очень слабое» (1/2 балла): от нескольких отдельных клеток до целого поверхностного слоя

Рисунок А.4.3.2 — Разъедание «очень слабое» (1/2 балла): от нескольких отдельных клеток до целого поверхностного слоя

Рисунок А.4.3.3 — Разъедание «очень слабое» (1/2 балла): от нескольких отдельных клеток до целого поверхностного слоя

Рисунок А.4.3.4 — Разъедание «слабое» (1 балл): утрачено до трех клеточных слоев

Рисунок А.4.3.5 — Разъедание «умеренное» (2 балла): утрачено до 50% эпителиального слоя

Рисунок А.4.3.6 — Разъедание «умеренное» (2 балла): утрачено до 50% эпителиального слоя

Рисунок А.4.3.7 — Разъедание «умеренное» (2 балла): утрачено до 50% эпителиального слоя

Примечание - Рисунки А.4.3.5 - А.4.3.7 иллюстрируют небольшие морфологические различия в картине повреждений, которые могут быть обусловлены, например, окрашиванием, видимостью отдельных клеток, качеством изучаемых срезов и т.п. Главный вывод, однако, заключается в констатации утраты до 50% всего эпителиального слоя, что позволяет диагностировать «умеренное» разъедание (2 балла).

Рисунок А.4.3.8 — Разъедание «сильное» (3 балла): эпителиальный слой разрушен вплоть до базальной мембраны. Основная часть эпителия утрачена. Боуменова мембрана все еще присутствует

Рисунок А.4.3.9 — Разъедание «сильное» (3 балла): эпителиальный слой разрушен вплоть до базальной мембраны. Базальная и боуменова мембраны утрачены

Рисунок А.4.3.10 — Разъедание «сильное» (3 балла): эпителиальный слой разрушен вплоть до базальной мембраны. Базальная и боуменова мембраны утрачены

Примечание - Рисунки А.4.3.8 - А.4.3.10 иллюстрируют небольшие морфологические различия в картине повреждений, которые могут быть обусловлены, например, окрашиванием, видимостью отдельных клеток, качеством изучаемых срезов и т.п. Главный вывод, однако, заключается в констатации отсутствия эпителиального слоя вплоть до базальной мембраны, что позволяет диагностировать «сильное» разъедание (3 балла).

А.4.4 Эпителий: вакуолизация

Рисунок А.4.4.1 — Контрольный образец роговицы

Рисунок А.4.4.2 — Вакуолизация «очень слабая» (1/2 балла), в глубине эпителия: несколько разрозненных клеток (показаны стрелками). Разъедание «очень слабое» (1/2 балла): от нескольких отдельных клеток до целого отдельного поверхностного слоя

Рисунок А.4.4.3 — Вакуолизация «очень слабая» (1/2 балла), в глубине эпителия: несколько разрозненных клеток (показаны стрелками). Разъедание «очень слабое» (1/2 балла): от нескольких отдельных клеток до целого отдельного поверхностного слоя

Рисунок А.4.4.4 — Вакуолизация «умеренная» (1 балл), в верхнем слое: группы вакуолизированных клеток или одиночная цепочка клеток с небольшими вакуолями

Рисунок А.4.4.5 — Вакуолизация «умеренная» (1 балл), в верхнем слое: группы вакуолизированных клеток или одиночная цепочка клеток с небольшими вакуолями. Разъедание «слабое» (1 балл): утрачено до трех клеточных слоев

Рисунок А.4.4.6 — Вакуолизация «умеренная» (1 балл), в среднем и нижнем слоях (показано стрелкой): группы вакуолизированных клеток или одиночная цепочка клеток с небольшими вакуолями. Разъедание «умеренное» (2 балла): утрачено до 50% эпителиального слоя

Рисунок А.4.4.7 — Вакуолизация «умеренная» (2 балла), в верхнем слое: до 50% эпителия состоит из вакуолизированных клеток. Разъедание «слабое» (1 балл): утрачено до трех клеточных слоев

Рисунок А.4.4.8 — Вакуолизация «умеренная» (2 балла), в верхнем слое: до 50% эпителия состоит из вакуолизированных клеток. Сморщивание эпителия (с частичным отставанием от базальной мембраны). Пикнотизация клеточных ядер в строме. Окрашивание гематоксилином-эозином

Рисунок А.4.4.9 - Рисунок А.4.4.8 при большем увеличении

Рисунок А.4.4.10 — Вакуолизация «сильная» (3 балла), в среднем слое: от 50% до 100% эпителия состоит из вакуолизированных клеток

А.4.5 Эпителий: некроз

Рисунок А.4.5.1 — Контрольный образец роговицы

Рисунок А.4.5.2 — Некроз «слабый» (1 балл), в эпителиальном слое. Омертвевшие клетки показаны стрелками. На рисунке приведена лишь часть роговицы, в то время как по всей длине роговицы зафиксировано 20 — 40 омертвевших клеток

Рисунок А.4.5.3 — Некроз «умеренный» (2 балла), в эпителиальном слое. Обнаружено несколько омертвевших эпителиальных клеток с пикнотическими ядрами (показаны стрелками). На рисунке приведена лишь часть роговицы, в то время как по всей длине роговицы зафиксированы многочисленные (> 40) омертвевшие клетки, что составляет менее 50% эпителиального слоя

Рисунок А.4.5.4 — Некроз «умеренный» (2 балла), в эпителиальном слое. Большинство клеток поверхностного слоя эпителия имеет признаки некроза, т.е. видны пикнотические ядра и разрушенные клеточные оболочки (показаны стрелками). На рисунке приведена лишь часть роговицы, в то время как по всей длине роговицы зафиксированы многочисленные (> 40) омертвевшие клетки, что составляет менее 50% эпителиального слоя

Рисунок А.4.5.5 — Некроз «сильный», очаговый (3 балла), в эпителиальном слое. Сквамозный эпителий частично отслоился: разъедание (на участке, ограниченном стрелками). На дне очага поражения — группа омертвевших эпителиальных клеток

По обе стороны от очага эпителиальные клетки в нормальном состоянии. В данном случае исследуемое вещество было твердым. Соответственно, в отличие от воздействия жидкостью наблюдаемые повреждения носят локальный характер и балльная оценка применяется к пораженному участку.

Рисунок А.4.5.6 - Рисунок А.4.5.2 при большем увеличении. Омертвевшие эпителиальные клетки: оболочки клеток разрушены, видны пикнотические ядра и фрагменты разрушенных клеток (показаны стрелками)

Рисунок А.4.5.7 — Некроз «сильный» (3 балла), в эпителиальном слое (показан стрелками). Жизнеспособные клетки отсутствуют. Кроме того, произошел некроз клеток стромы

Рисунок А.4.5.8 — Некроз «сильный» (3 балла), в эпителиальном слое. Весь эпителий состоит из «призрачных» омертвевших клеток

А.4.6 Поражение стромы

Рисунок А.4.6.1 — Контрольный образец роговицы

Рисунок А.4.6.2 — Несколько пикнотических ядер (показаны стрелками) в клетках стромы (1 балл: 5 — 10 пикнотических ядер)

Рисунок А.4.6.3 — Некроз стромальных кератоцитов с полной потерей ими ядра. Наблюдаются также признаки некроза эпителия

Рисунок А.4.6.4 — Разупорядоченная структура волокон стромы. Наблюдаются также признаки некроза стромальных кератоцитов и эндотелия

А.4.7 Поражение эндотелия

Рисунок А.4.7.1 — Контрольный образец роговицы. Нормальное состояние эндотелия

Рисунок А.4.7.2 — Некроз эндотелия с утратой клеточных ядер. Аморфные остатки тканей (400000)

А.4.8. Артефакты

Рисунок А.4.8.1 — Артефакт: пилообразный профиль сквамозного слоя

Рисунок А.4.8.2 — Артефакт: складки на срезе тканей (показаны стрелками)

Рисунок А.4.8.3 — Артефакт: вмятина на краю среза ткани

Рисунок А.4.8.4 — Артефакт: частичная утрата эпителиального слоя, виден резкий переход от нормального эпителия (слева) до полного его отсутствия (справа)

Рисунок А.4.8.5 — Артефакт: локальный разрыв стромы

Рисунок А.4.8.6 — Артефакт: диагональный разрез в строме

Рисунок А.4.8.7 — Артефакт: отслоение эндотелия вместе с десцеметовой мембраной

А.4.9 Окрашивание с помощью HE или PAS

В данном разделе для целей сравнения приведены микрофотоснимки срезов роговицы с аналогичными изменениями, окрашивание которых осуществлялось с использованием HE (слева) или PAS (справа) соответственно.

Рисунок А.4.9.1 — Разъедание «очень слабое» (1/2 балла) эпителия

Рисунок А.4.9.2 — Разъедание «очень слабое» (1/2 балла) эпителия

Рисунок А.4.9.3 — Разъедание «умеренное» (2 балла) эпителия

Рисунок А.4.9.4 — Разъедание «сильное» (3 балла) эпителия

Рисунок А.4.9.5 — Вакуолизация «слабая» (1 балл) эпителия

Рисунок А.4.9.6 — Вакуолизация «слабая» (1 балл) эпителия

Рисунок А.4.9.7 — Разъедание «очень слабое» (1/2 балла) и вакуолизация «слабая» (1 балл) эпителия

Рисунок А.4.9.8 — Вакуолизация «слабая» (1 балл) и отслоение эпителия

Приложение Б (обязательное)

УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ОБРАЗЦОВ ГЛАЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ЦЕЛЕЙ АНАЛИЗА ИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ НЕПРОЗРАЧНОСТИ И ПРОНИЦАЕМОСТИ (МЕТОД BCOP)

ИНСТИТУТ ПО НАУЧНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ IN VITRO (INSTITUTE FOR IN VITRO SCIENCES, INC.)

Б.1 Введение в метод исследования помутнения и проницаемости роговицы крупного рогатого скота

Метод BCOP был разработан докторами Пьером Готроном [75] и Джо Синой [87] для определения потенциальной способности фармацевтических промежуточных продуктов, используемых в санитарных целях в промышленном производстве, вызывать раздражение глаз. Метод предусматривает выполнение измерений, позволяющих проследить, как изменяются показатели непрозрачности (определяемые по изменению светопропускания) и проницаемости (исходя из увеличения проницаемости флуоресцеина) роговицы глаза, испытавшей на себе воздействие химической продукции. Значения показателей непрозрачности и проницаемости используются для вычисления показателя раздражающей способности in vitro, который позволяет оценить степень раздражающего воздействия исследуемой химической продукции на глаза в реальных условиях. В настоящее время метод нашел широкое применение в различных отраслях промышленности и реализуется в отношении широкого перечня химической продукции различных классов и состава. Механизм(ы) деструктивного воздействия значительного количества данной продукции изучен достаточно хорошо. Обычно в этом случае речь идет о лизисе клеточных мембран, коагуляции белков и омылении, которые в конечном итоге и приводят к раздражению глаз. Применение метода BCOP обеспечивает достоверное моделирование не только большинства начальных стадий взаимодействия раздражающей химической продукции с роговицей глаза, но и ряда более отдаленных во времени последствий раздражающего воздействия, таких как значительные изменения в тканях стромы поврежденной роговицы. Как показывает имеющийся опыт Института по научным исследованиям in vitro (IIVS), показатели непрозрачности и проницаемости в целом достаточно точно позволяют оценить степень изменений в эпителии и строме, определяемых как перечисленные повреждения. Вместе с тем установлено, что прогнозирование способности вызывать раздражение глаз в отношении химической продукции, вступающей в реакцию с нуклеиновыми кислотами, митохондриальными белками или иными мишенями внутри клетки, взаимодействие с которыми не приводит к незамедлительной утрате ее целостности (в особенности это касается клеток эпителия), на основе одних только данных о показателях непрозрачности и проницаемости представляется в целом более затруднительным, а ограниченная продолжительность времени, в течение которого роговица может сохраняться в культуре органа, препятствует полноценному наблюдению за восстановлением тканей после контакта с раздражающей химической продукцией, если такое восстановление возможно. В этой связи результаты дополнительного гистологического исследования приобретают особую важность для подготовки прогнозного заключения.

Можно утверждать, что метод BCOP оптимально сочетается с гистологическими исследованиями, поскольку он предполагает использование образцов тканей роговицы ex vivo, которые сохраняются в полностью жизнеспособном состоянии благодаря применению стандартных для поддержания культуры органа процедур в рамках протокола BCOP и фактически остаются пригодными для анализа на протяжении 24 ч и более при условии регулярного обновления среды. В роговице глаз крупного рогатого скота интерес для гистологического исследования представляют три ее слоя: эпителий, строма и эндотелий, оценка состояния которых необходима для различения химической продукции с незначительным, слабым, умеренным и сильным раздражающим действием. Использование стандартной гистологической техники подготовки образцов в свою очередь позволяет проследить за изменениями, происходящими в этих трех слоях на клеточном и общем структурном уровнях. Наконец, если типовой протокол исследования BCOP в сочетании с гистологическими исследованиями предназначен для определения первичных масштабов повреждений роговицы после воздействия большинства химической продукции, то доработанная и расширенная версия этого протокола дает возможность выявлять изменения в клетках и клеточных ядрах, приводящие к деструктивным последствиям, в течение до 20 ч с момента такого воздействия.

Б.2 Глубина повреждений как показатель для прогнозирования глубины и устойчивости поражения глазных тканей

Джестер [79], Маурер [85], [86] и др. убедительно продемонстрировали, что для ряда химической продукции различных классов глубина повреждений, наблюдаемых в первые часы после контакта продукции с роговицей, позволяет подготовить достаточно достоверный прогноз относительно степени выраженности и длительности сохранения офтальмологических последствий, обусловленных ее воздействием. Так, на примере роговицы кролика установлено, если повреждения охватывают только эпителий, то это свидетельствует о возможности ее эффективного восстановления, при условии что слой базальных клеток не был пораженным. Более глубокие повреждения, достигающие стромы, влекут за собой более существенные последствия, при этом если они носят сквозной характер и сопряжены с нарушением целостности или утратой эндотелия, то такие последствия можно предварительно охарактеризовать как серьезные. При условии дополнения результатов, получаемых с применением метода BCOP, результатами гистопатологического анализа глубины наносимых поражений данный метод будет удовлетворять большинству требований, сформулированных Маурером и Джестером. Если считать достоверной гипотезу Джестера, Маурера и др. о том, что на основании данных о площади и глубине первичных повреждений тканей можно судить о продолжительности времени, необходимого для их последующего восстановления, и пределах, до которых такое восстановление вообще представляется возможным, то результаты измерений, предусмотренных методом BCOP, также могут использоваться для прогнозирования способности к восстановлению.

Поскольку при проведении исследований по методу BCOP исследуемая химическая продукция наносится на наружную поверхность эпителия роговицы глаз крупного рогатого скота, последовательность выполнения анализа состояния тканей по направлению снаружи внутрь достоверно отражает вероятность их поражения в зависимости от глубины проникновения исследуемой химической продукции в толщу роговицы, равно как и вероятность связанных с этим проникновением токсических воздействий. Таким образом, наблюдение за изменениями, появившимися в тканях обработанных образцов роговицы, должно начинаться с поверхности чешуйчатого эпителия в месте химического воздействия и продолжаться в более глубоких ее слоях вплоть до эндотелия.

В [86] приведена оценка эффективности применения метода BCOP в сочетании с гистологическим исследованием роговицы для прогнозирования способности вызывать раздражение глаз в отношении серии антимикробных препаратов, предлагаемых для использования в составе моющих и чистящих средств, классификация которых в прошлом осуществлялась на основе данных испытаний in vivo, с использованием модели глубины повреждений как базовой для присвоения химической продукции соответствующего класса опасности in vitro. Результаты гистологических исследований, проведенных в сочетании с исследованиями по методу BCOP, показали, что антимикробные препараты, для которых по итогам исследований in vivo был присвоен класс опасности IV согласно EPA (приблизительно соответствует «не требует классификации» в рамках СГС), обычно вызывали повреждения клеток или структурные изменения тканей роговицы in vitro на глубине не более середины толщины слоя эпителия. В то же время препараты, предварительно определяемые в условиях in vivo как принадлежащие к классу опасности III согласно EPA (приблизительно соответствует подклассу опасности 2B в рамках СГС), обычно вызывали повреждения клеток или структурные изменения тканей роговицы in vitro в эпителии, а также на глубине не более верхней трети стромы. Данная продукция, предварительно определяемая в условиях in vivo как принадлежащая к классу опасности II согласно EPA (приблизительно соответствует подклассу опасности 2A в рамках СГС), обычно вызывала структурные изменения тканей роговицы in vitro на глубине не далее верхних двух третей стромы. Наконец, продукция, предварительно определяемая в условиях in vivo как принадлежащая к классу опасности I согласно EPA (приблизительно соответствует классу опасности 1 в рамках СГС), обычно вызывала структурные изменения тканей роговицы in vitro на глубине, включая нижнюю треть стромы.

Б.3 Гистологические исследования для определения потенциальной способности химической продукции вызывать раздражение глаз

При проведении исследований по методу BCOP не во всех случаях требуется выполнение гистологического анализа. В случае когда характер воздействия активной химической продукции на роговицу глаза очевиден и легко поддается объяснению, показателей непрозрачности и проницаемости роговицы достаточно для прогнозирования ее раздражающей способности. В то же время включение гистологического анализа в протокол исследований совместно с методом BCOP может быть оправданным по ряду причин. При оценке степени опасности химической продукции гистологический анализ выполняют для определения существенных изменений в роговице от воздействия исследуемой продукции в сравнении с отрицательной контрольной пробой и, в случае наличия таких изменений, с целью документирования их глубины и степени выраженности. Методы гистологического анализа могут либо дополнять метод BCOP, помогая выявлению клеточных и структурных изменений, связанных с увеличением непрозрачности роговицы и повышением ее проницаемости для флуоресцеина, либо обеспечивать получение таких свидетельств повреждения роговицы, которые не могут быть получены при использовании метода BCOP. При разработке новой продукции, а также при проведении научных исследований применение методов гистологического анализа позволяет более четко охарактеризовать виды поражения глаз, которые могут быть связаны с воздействием определенной продукции, а также объяснить механизм такого воздействия.

Включение параллельного анализа химически сходной по структуре эталонной продукции способствует интерпретации результатов исследований. В случае когда смеси содержат реакционно способные вещества (например, пероксиды, отбеливающие вещества и т.п.), воздействие которых не всегда сопровождается незамедлительным изменением прозрачности роговицы или ее барьерных функций, проведение гистологического анализа настоятельно рекомендуется. Мауер [84] и др. продемонстрировали на примерах, что окисляющие вещества вызывают отложенную токсическую реакцию in vivo, оказывая особенно разрушительное воздействие на стромальные кератоциты. Собственный опыт разработчиков свидетельствует, что подготовка заключения по пероксидсодержащим смесям требует проведения гистологического исследования в целях достоверной оценки глубины повреждений [88], поскольку изменения в клетках/клеточных ядрах, наблюдаемые гистологически, необходимы для прогнозирования нисходящих процессов разрушения роговицы. Соответственно, для новых видов химической продукции, механизм воздействия которой не представляется возможным спрогнозировать или в составе которой предполагается присутствие реакционно способных веществ, как правило, после воздействия исследуемой продукции в дополнение к стандартному протоколу BCOP требуется применение уточненного расширенного протокола в сочетании с гистологическим анализом [70]. Кроме того, обязательным является использование положительной и отрицательной контрольной пробы [69]. Положительная контрольная проба определяет меру воспроизводимости испытательной системы и процесса эксперимента, тогда как отрицательная контрольная проба позволяет определить исходный уровень, с которым сравниваются гистологические изменения.

Б.4 Обзор основных гистологических процедур, выполняемых IIVS

Б.4.1 Нумерация рабочих образцов роговицы

В нормальных условиях проведения эксперимента по методу BCOP каждому образцу роговицы присваивается собственный номер, соответствующий номеру используемого для него держателя. Если образцы роговицы подлежат гистологическому исследованию, каждому образцу дополнительно присваивают уникальный учетный номер, позволяющий связать воедино номер держателя роговицы, идентификационные данные использованной для обработки химической продукции или контрольной пробы, время экспозиции, дату отбора и другую сопутствующую информацию. Данная информация сохраняется в журнале исследования и в журнале гистологических наблюдений.

Б.4.2 Фиксация образцов роговицы

Фиксацию образцов роговицы выполняют после завершения этапа проверки на проницаемость флуоресцеина в рамках протокола метода BCOP, обеспечивая таким образом возможность дальнейшей гистологической оценки тех же образцов роговицы, которые использовались для определения показателей непрозрачности и проницаемости. Внутрилабораторное исследование показало, что обработка флуоресцеином не влияет на морфологию тканей. После отбора пробы на содержание флуоресцеина из задней камеры держателя роговицы остатки жидкости сливают и держатель отсоединяют. Каждый образец помещают в отдельную кассету, маркированную предварительно соответствующим учетным номером и выстланную специальной пористой подложкой во избежание повреждений поверхности эндотелия. Образец укладывают на подложку эпителием вверх. Обращаться с образцами тканей следует с большой осторожностью, при этом необходимо позаботиться о том, чтобы защитить их от пересыхания в процессе транспортирования. Кассеты закрывают и погружают в 10%-ный НБФ. Важно, чтобы слой раствора полностью покрывал поверхность тканей. Для фиксации приблизительно 20 кассет достаточно объема жидкости в количестве 300 мл. Фиксацию образцов выполняют при комнатной температуре в течение не менее чем 24 ч перед дальнейшей обработкой.

В связи с тем, что раствор Дэвидсона часто рекомендуется для проведения быстрой фиксации тканей цельных глазных яблок, внутрилабораторное сравнение образцов роговицы извлеченных глаз крупного рогатого скота, фиксированных в растворе Дэвидсона и 10%-ном НБФ, показало, что последний обеспечивает лучшую фиксацию тканей.

Б.4.3 Приготовление срезов

Обрезкой образцов роговицы, заливкой их парафином, приготовлением и окрашиванием срезов должна заниматься соответствующая установленным требованиям гистологическая лаборатория. При выполнении перечисленных процедур лабораторией должны соблюдаться следующие правила.

Фактические размеры роговицы и ее обработанного участка приведены на рисунке Б.1. В центре показаны: участок, обработанный химической продукцией, и участок, представляющий интерес для гистологического исследования.

Рисунок Б.1 — Вид образца роговицы после разборки держателя. После фиксации образцы роговицы доставляют в гистологическую лабораторию. Вместе с образцами доставляется сопроводительная документация. При поступлении в лабораторию образцы должны быть зарегистрированы в системе учета образцов тканей

Полученные образцы при необходимости могут подлежать обрезке для удаления излишков склеры за пределами наружной границы области деформации, однако роговица должна быть пропитана полностью. Перед загрузкой образцов роговицы в машину для пропитки, их переднюю (эпителиальную) поверхность накрывают еще одной пористой подложкой. Это выполняется для того, чтобы снизить вероятность скручивания тканей в процессе пропитки. В соответствии с установившейся практикой в IIVS при установке кассет в аппарат передняя поверхность образцов всегда должна быть обращена к верхней крышке аппарата. Не следует допускать, чтобы растворы, используемые для пропитки, имели повышенную температуру.

Пропитанные парафином образцы роговицы рассекают так, чтобы две части каждого образца могли быть залиты в одном и том же блоке. На роговице могут присутствовать складки, в связи с чем во многих случаях целесообразно выполнять разрез поперек складок (если те имеют определенное направление) для получения качественных срезов.

Рисунок Б.2 — Рассеченный пополам образец роговицы внутри парафинового блока

Микротомирование должно обеспечивать как можно более точную ориентацию плоскости поперечных срезов роговицы (перпендикулярно ее передней и задней поверхности). Правильно выполненные поперечные срезы позволяют лучше измерить увеличение толщины роговицы образца (при отеке, вызванном воздействием исследуемой продукции) по отношению к толщине роговицы образца, обработанного отрицательной контрольной пробой. Для заливки необходимо использовать большие глубокие лотки и при укладке в них образцов тканей обеспечивать соответствующую ориентацию. Две части образца роговицы помещают в лоток плоскостью сечения вниз, выравнивая их по вертикали и располагая таким образом, чтобы их продольная ось была параллельна продольной плоскости лотка.

Если размеры образца не позволяют разместить его в лотке, внешние края образца (на рисунке Б.2 видны как темные наружные области) могут быть обрезаны. Оптимальным, однако, следует считать такой вариант, при котором темные, деформированные участки тканей также присутствуют на срезе, так как в этом случае изучению подвергается все поперечное сечение роговицы. Наличие двух фрагментов тканей, ориентированных параллельно продольной оси предметного стекла (после нанесения на него срезов), значительно облегчает процесс оценки.

Образцы тканей нарезают с шагом приблизительно 5 мкм и помещают по два таких среза (по одному от каждой половины образца роговицы) на предметное стекло. Микротомирование тканей подразумевает удаление из срезов (при помощи микротома) тех участков, которые были ранее повреждены в процессе рассечения образца, чтобы привнесенные при этом артефакты не могли быть интерпретированы как изменения, наступившие в результате воздействия исследуемой продукции. Срезы должны включать в себя всю площадь поперечного сечения образца роговицы (эпителий, строму и эндотелий). Строма роговицы — это достаточно нежная ткань, склонная к артефактам от излишнего растяжения срезов при попытке расправить их в воде. Кроме того, такое излишнее растяжение может приводить к образованию разрывов между эпителием и стромой, ошибочно принимаемых за последствия воздействия исследуемой продукцией. В завершение процедуры срезы тканей окрашивают смесью гематоксилина и эозина (H&E).

Б.5 Гистологическая оценка роговицы

Б.5.1 Оценка срезов роговицы (обзор)

Целью гистологического исследования является обнаружение изменений у испытуемого образца роговицы по отношению к контрольному образцу, определение природы, глубины и степени выраженности наблюдаемых гистологических изменений в обработанных образцах. На наличие таких гистологических изменений проверяют все три слоя тканей каждого образца. Обычно исследование тканей проводят по направлению сверху вниз, начиная с верхнего слоя эпителия и переходя затем к нижележащим эпителиальным слоям, строме и эндотелию роговицы. Поскольку исследуемая продукция наносится местно на наружную поверхность эпителия роговицы, проведение оценки по нисходящей достоверно отражает вероятность возникновения гистологических изменений в зависимости от глубины проникновения исследуемой химической продукции в толщу роговицы, а также вероятность связанных с этим проникновением токсических проявлений.

В некоторых случаях выраженные или заметные изменения наблюдаются на образцах роговицы после обработки соответствующей химической продукцией. Например, грубые изменения или разъедание структуры роговицы, как ограниченные по глубине поражения тканей, так и охватывающие все слои роговицы. Другие повреждения могут носить менее выраженный характер и определяться всего лишь по нетипичному окрашиванию клеточных ядер, свидетельствующему, например, о проявлениях апоптоза. В таких случаях подобного рода изменения могут означать прогрессирующую утрату роговицей присущих ей функций, что не обязательно будет отражаться на показателях непрозрачности и проницаемости, контролируемых в процессе краткосрочного исследования по методу BCOP. В целом, если в отношении глубины изменений, наблюдаемых в роговице глаз крупного рогатого скота, в отчете об испытаниях могут быть представлены сведения, то степень и последствия многих наблюдаемых изменений не могут быть оценены полностью или известны. Так, результаты наблюдения за нетипичным окрашиванием ядер стромальных кератоцитов не просто охарактеризовать в баллах шкалы или степени патологии. Предпочтительно в связи с этим указывать относительную частоту встречаемости обнаруженных изменений по сравнению с образцами роговицы для отрицательного контроля. Другой пример: отечность стромы может описываться как наблюдаемая глубина расширения стромальных тканей, но характеризуется при этом скорее как относительная степень набухания верхнего, среднего и нижнего стромальных слоев. Кроме того, отечность стромы, связанная исключительно с нарушением барьерных функций эпителия, не обязательно означает такие же последствия с точки зрения потенциального восстановления роговицы, как отечность, при которой происходит разрушение стромальных кератоцитов, или отечность, сопровождаемая осаждением белков. Поэтому интерпретация результатов гистологического исследования должна обеспечивать возможность объединения всех выявленных изменений для подготовки окончательного заключения.

Б.5.2 Оценка качества и пригодности срезов роговицы

Образцы роговицы, использовавшиеся для целей отрицательного контроля, обрабатывают вместе с образцами, подвергаемыми воздействию исследуемой продукции, в одной серии, что позволяет использовать результаты гистологических исследований образцов роговицы с отрицательной контрольной пробой для оценки качества/пригодности всех подготовленных срезов. До оценки результатов гистологического анализа образцов, подвергнутых воздействию исследуемой химической продукции, необходимо определить качество срезов, окрашенных H&E, для получения представления о характере и масштабе артефактов, которые могли возникнуть как в процессе проведения исследования по методу BCOP, так и при выполнении гистологических исследований. С этой целью срезы, обрабатываемые отрицательной контрольной пробой, проверяют на наличие артефактов, которые могут иметь место у образцов всей серии. Они также используются для определения «нормального» уровня окрашивания (насыщения каждого слоя/типа клеток гематоксилином/эозином), ненарушенной структуры и типичной толщины тканей. Окрашивание срезов обычно осуществляется с помощью H&E, но не исключается использование и других красителей. На рисунках ниже приведены примеры срезов образцов роговицы, обработанных отрицательной контрольной пробой (деионизированной водой, подготовленной для работы с клеточными культурами).

Исследуемые срезы тщательно изучают с использованием микроскопа. Каждый поперечный срез каждой роговицы в составе обрабатываемой серии изучают вначале при слабом увеличении, чтобы оценить состояние тканей в целом до выполнения подробного гистологического анализа. Осмотр срезов роговицы проводят по всей площади сечения между областями деформации (под областью деформации следует понимать наружный периметр роговицы, вдоль которого она прижималась уплотнительным кольцом для закрепления внутри камеры держателя; эти области отчетливо выделяются на срезах при гистологическом исследовании). Нередко отдельные участки срезов тканей имеют артефакты или иные нарушения, возникшие в процессе подготовки, что исключает возможность использования этих участков для целей гистологического исследования. Более того, артефакты, непреднамеренным образом возникающие при работе с образцами, могут распространяться на всю площадь одного или двух срезов роговицы, что приводит к их непригодности для указанной цели.

Оптимальной считается ситуация, при которой срезы тканей имеют правильное поперечное сечение, а не тангенциальное. Тем не менее на практике часть срезов (или отдельные участки сечения среза) могут не обладать правильным поперечным срезом, не позволяя тем самым достоверно оценить фактическую толщину и структуру изучаемых тканей. В некоторых случаях тангенциальную ориентацию могут иметь лишь некоторые участки конкретного среза, при том что основная его часть будет выполнена в строго поперечном направлении. На контрольных образцах или образцах роговицы с минимальным поражением толщина стромы является признаком правильности поперечного сечения. Толщина десцеметовой мембраны также является показателем правильности поперечного сечения. Для этого толщину десцеметовой мембраны на срезах образцов, обработанных исследуемой химической продукцией, сравнивают с толщиной соответствующего слоя на наиболее удачном срезе контрольного образца роговицы. Такое сравнение может быть особенно полезным, если обработанные образцы роговицы демонстрируют явные признаки расширения коллагеновой матрицы и отечности стромы.

Рисунок Б.3 — Срез образца роговицы глаза крупного рогатого скота после обработки деионизированной водой, подготовленной для работы с клеточными культурами, о тангенциальном сечении которого свидетельствует наличие в области десцеметовой мембраны двух различающихся по толщине участков

Важно, чтобы срез включал в себя все слои, составляющие роговицу. При неправильной обрезке блоков в получаемых срезах может недоставать части этих слоев (например, могут отсутствовать нижняя часть стромы и эндотелий). В таких случаях срезы должны быть приготовлены повторно.

Рисунок Б.4 — Срез образца роговицы глаза крупного рогатого скота после обработки деионизированной водой, подготовленной для работы с клеточными культурами, на котором отсутствуют нижняя часть стромы и эндотелий (а) или эпителий (б)

Для окрашивания срезов обычно используют соответствующее автоматическое приспособление (стейнер). Интенсивность окрашивания зависит от целого ряда факторов и может немного отличаться при каждом новом исследовании. Недостаточное окрашивание гематоксилином/эозином не существенно влияет на правильность интерпретации и качество снимков. Такие срезы подлежат повторному окрашиванию, в противном случае вместо них следует приготовить новые срезы. Важно иметь в виду, что при сильном набухании коллагена стромы ее окрашивание также может показаться недостаточным, однако причиной, по которой складывается подобное впечатление, является наличие обширного неокрашенного пространства между окрашенными волокнами.

Рисунок Б.5 — Срез образца роговицы глаза крупного рогатого скота после обработки деионизированной водой, подготовленной для работы с клеточными культурами, на котором заметно гипоэозинофильное окрашивание эпителия (а) и области гипоэозинофильного окрашивания стромы (б)

Известно также много других видов гистологических артефактов, которые не включены в настоящий стандарт. Ниже приведены изображения образцов роговицы глаза крупного рогатого скота после обработки деионизированной водой, подготовленной для работы с клеточными культурами, на которых присутствуют различные гистологические артефакты, способные затруднять интерпретацию повреждений, вызванных воздействием исследуемой химической продукции. К ним, в частности, относятся артефакты, обусловленные образованием складок и скручиванием тканей, вибрированием лезвия ножа при изготовлении срезов, присутствием на лезвии заусенцев, а также недостаточным обезвоживанием образца.

Рисунок Б.6 — Образование складки ткани, мешающей наблюдению за эпителием и стромой

Рисунок Б.7 — Артефакты микротомирования (порезы эндотелия, отслоение эпителия от передней пограничной пластинки роговицы)

Рисунок Б.8 — Расслоение коллагеновых волокон в строме как следствие вибрирования образца в процессе резки

Рисунок Б.9 — Множественное расслоение ткани по всей толщине в связи присутствием на лезвии ножа заусенцев

Рисунок Б.10 — Артефакт микротомирования, выражающийся в отслоении эпителия от передней пограничной пластинки роговицы и появлением ореола вокруг ядер эпителиальных клеток

Рисунок Б.11 — Артефакты, выглядящие как пузырьки и вызванные недостаточным обезвоживанием ткани

Б.5.3 Регистрация результатов исследований

Результаты исследований обработанных образцов роговицы регистрируют. Регистрируемые данные включают сведения о принадлежности к определенной обработанной серии образцов, (учетные) номера образцов, время экспозиции, время выдерживания после экспозиции, дату нанесения исследуемой химической продукции, сведения о наблюдениях за каждым слоем ткани роговицы, а также номера соответствующих изображений (при наличии). По завершении исследований их результаты оформляют в виде отчета о проведении гистологического исследования. Результаты исследований обычно подвергаются независимой экспертной оценке, и, в случае если такая оценка не выявила противоречий, отчет о проведении гистологического исследования подписывается с указанием соответствующей даты руководителем исследовательской группы/ведущим гистопатологом, а также экспертом, выполнявшим оценку.

Б.5.3.1 Оценка образцов роговицы, обработанных отрицательной контрольной пробой

Образцы роговицы, предназначенные для отрицательного контроля, обрабатывают стерильной деионизированной водой или физиологическим раствором параллельно с образцами для положительного контроля и образцами, на которые наносят исследуемую химическую продукцию. Общая толщина слоев роговицы глаза крупного рогатого скота составляет от 850 до 1 000 мкм.

Эпителий. Эпителий образца, обработанного отрицательной контрольной пробой, состоит из трех слоев. Слой базальных клеток — это сформированная цилиндроклеточная область, непосредственно примыкающая к базальной мембране над передней пограничной пластинкой роговицы. Базальные клетки всегда очень плотно прилегают друг к другу. Базальный слой с цилиндрическими клетками покрывают несколько слоев шиповатых клеток. В двух указанных слоях клеточные ядра демонстрируют наличие диффузного хроматина без четко очерченных ядрышек. Митотические фигуры в базальном слое наблюдаются редко. Сквамозный (чешуйчатый) слой сглаженный, с умеренным количеством видимой цитоплазмы и высокой концентрацией ядер.

Строма. Стромальные элементы сосредоточены в роговице в области около передней пограничной пластинки и представлены достаточно хорошо упорядоченной матрицей коллагеновых волокон с разрозненными кератоцитами. Морфология ядер кератоцитов чрезвычайно разнообразна: от клеточных ядер умеренной величины (меньше, чем у клеток эпителия) с диффузным базофильным окрашиванием до узких, вытянутых или сжатых с темным базофильным окрашиванием. Окрашивание цитоплазмы, если оно имеет место, характеризуется как умеренно базофильное. В редких случаях встречаются клетки с эозинофильным цитоплазматическим окрашиванием. Пучки коллагеновых волокон расположены преимущественно параллельно и упорядоченно. Десцеметова мембрана отчетливо выделяется и образует основание стромы. Общая толщина стромы приблизительно соответствует полю микроскопического наблюдения при 20-кратном увеличении при условии получения на срезе качественного поперечного сечения.

Эндотелий. Эндотелий — это одиночный слой плоских клеток, прикрепленных к базальной поверхности десцеметовой мембраны. Клеточные ядра вытянутые и сплюснутые. В поперечном сечении видна лишь малая область цитоплазмы. В основном клетки прочно прикрепляются к десцеметовой мембране, однако в некоторых областях (на некоторых участках) они могут быть отделены или утрачены вследствие механического повреждения.

Б.5.3.2 Оценка гистологических изменений роговицы

Целью оценки повреждений и изменений роговицы является регистрация сведений о природе, степени и глубине таких изменений в каждом слое тканей. В большинстве случаев отдельные образцы роговицы в обработанной серии не оцениваются по отдельности, а усредняются в интересах установления преобладающего типа повреждений. Значения показателей непрозрачности и проницаемости образцов должны быть определены перед исследованием срезов. Если наблюдается значительная изменчивость среди образцов роговицы как в части косвенно определенных показателей, так и гистологических изменений, в отчете могут приводиться подробные данные по конкретным образцам роговицы в составе обрабатываемой серии.

Эпителий. К характерным гистологическим изменениям, наблюдаемым в эпителии, относятся утрата части клеток, коагуляция клеток (в особенности в сквамозном слое эпителия), вакуолизация ядер (набухание), конденсация ядер (пикноз или осаждение белков ядра и/или ДНК), цитоплазматическая вакуолизация, осаждение цитоплазмы (остается только клеточный скелет) и отслоение клеток от передней пограничной пластинки. Оценка выраженности изменений может носить субъективный характер. Она может основываться на удельном количестве клеток, демонстрирующих гистологические изменения, либо на масштабе гистологических изменений, наблюдаемых в клетках или в соответствующем клеточном слое (например, на степени цитоплазматической вакуолизации). Под глубиной гистологических изменений понимают количество пораженных слоев клеток. Факты повреждения или утраты передней пограничной пластинки в отчете отражают вместе с данными о состоянии эпителия.

Строма. Гистологические изменения в строме для целей отчета делятся на две категории: изменения во внеклеточной коллагеновой матрице и изменения в кератоцитах. К преобладающим гистологическим изменениям внеклеточной коллагеновой матрицы относятся ее расширение (вызываемое нарушением нормальной упорядоченной структуры волокон) и коагуляция стромы либо ее денатурация. Отечность стромы может подтверждаться присутствием расширяющихся «прорех» в упорядоченной структуре коллагеновой матрицы. Их появление означает, что внутри матрицы скопилась жидкость, раздвигающая в стороны волокна. В отчете приводятся сведения о глубине (см. ниже) и степени такого расширения. Под степенью понимают относительную встречаемость и размер расширяющихся «прорех» внутри матрицы. По мере увеличения степени и/или глубины расширения увеличивается соответственно и общая толщина стромы. Коагуляция стромы часто проявляется образованием в ней областей, состоящих из плотно соединенных коллагеновых волокон с гиперэозинофильным окрашиванием. Эти области с плотно соединенными волокнами могут перемежаться с областями, характеризующимися отечностью стромы или расширением коллагеновой матрицы.

Ввиду того что показатель глубины повреждений стромы (как вне-, так и внутриклеточных) важен для результатов анализа, в рамках анализа должен быть предусмотрен соответствующий порядок контроля данного показателя. Процедура определения глубины может оказаться достаточно сложной. С учетом местного характера нанесения исследуемой химической продукции на поверхность эпителия следует ожидать, что воздействие на строму будет распространяться из области, находящейся сразу под передней пограничной пластинкой и далее через толщу стромы вплоть до десцеметовой мембраны. В извлеченных образцах роговицы не развивается внешний воспалительный процесс, а значит, можно предположить, что область поражения в данном случае будет соответствовать области воздействия. Это означает, что деструктивные изменения в строме в первую очередь должны наступать в зоне, прилегающей к передней пограничной пластинке. По мере увеличения степени повреждений ими могут быть затронуты также нижерасположенные стромальные слои. Отсюда следует, что повреждения должны последовательно распространяться от передней (передняя пограничная пластинка) до задней (десцеметова мембрана) границы стромы, а их величина может быть представлена как доля общей толщины стромы, охваченная поражением. Вместе с тем необходимо иметь в виду, что расширение коллагеновой матрицы увеличивает толщину стромы. Соответственно, измерение глубины повреждений стромы может быть затруднительным ввиду изменения ее общей толщины. Глубину повреждения стромы указывают в отчете как процентную долю нормальной высоты (поперечного сечения) роговицы, затронутой изменениями, которую отсчитывают начиная от ее передней границы (передней пограничной пластинки).

В то же время, в связи с необходимостью учета отечности или расширения стромы, данная глубина фактически должна оцениваться, исходя из процентной доли поперечного сечения стромы, которая остается неповрежденной (отсчитывается от задней границы). Например, если глубина расширения коллагеновой матрицы в образце роговицы составляет 30%, то это означает, что 70% поперечного сечения данного образца (начиная от десцеметовой мембраны) не подвержено такому расширению.

Обычный порядок развития расширения стромы в направлении от передней до задней ее границы нарушается в случае утраты образцом эндотелиального слоя клеток. Поскольку эндотелий отвечает за поддержание водного баланса в нижней части стромы, его отсутствие (как вследствие механического повреждения образца, так и по причине токсического воздействия исследуемой химической продукцией) может привести к появлению отечности тканей стромы на достаточно большой глубине. Важно четко отличать повреждения энодотелия от сопутствующего им расширения тканей, вызванных воздействием исследуемой химической продукции, от возможных повреждений иного рода (например, механических). В случае механического повреждения отечность в глубоких слоях стромы может наблюдаться при отсутствии какого-либо расширения тканей в ее передней части. Следует ориентироваться на то, что повреждения, вызванные исследуемой химической продукцией, должны распространяться в глубину в толще роговицы и отмечаться как в передней, так и в задней части стромы. Если на определенных срезах или частях срезов эндотелий отсутствует и при этом наблюдается отечность (расширение коллагеновой матрицы) в нижних слоях стромы, а аналогичная отечность в верхних слоях отсутствует, то это с большой вероятностью свидетельствует о механическом повреждении эндотелия образца на ранней стадии эксперимента (в ходе инкубирования). Соответственно, для анализа рекомендуется отбирать срезы роговицы, не имеющие подобных повреждений.

Гистологические изменения кератоцитов могут затрагивать как цитоплазму, так и ядро. Признаки быстрой некротической гибели клеток, которая может последовать за воздействием сильных щелочей, органических растворителей или сурфактантов, обычно хорошо заметны, поскольку в этом случае происходит стремительное разрушение клеточных компонентов. Следы окислительного повреждения клеток или алкилирования их ДНК могут (на начальной стадии) быть менее ярко выраженными, однако эти процессы также выступают причинами их гибели (отложенной) и выброса медиаторов воспаления. Развитие повреждений подтверждается изменениями, наступающими в клеточных ядрах (пикнозом или кариорексисом). Прогрессирующий пикноз ядер или их полное разрушение свидетельствуют о тех же процессах. Изменения в цитоплазме включают в себя образование вакуолей или утрату базовых элементов (например, иРНК), также свидетельствующих о начале дегенеративного процесса. Цитоплазма клетки в нормальных условиях окрашивается как базофильным (гематоксилин), так и ацидофильным (эозин) красителями. При отсутствии базовых элементов преобладает эозинофильное окрашивание. Данное изменение называется эозинофилией кератоцитов.

Эндотелий. Гистологические изменения, возможные в данном слое, включают в себя утрату клеток и дистрофию цитоплазмы (вакуолизацию). Поскольку данный слой состоит из всего лишь одного ряда клеток, любое механическое повреждение может существенно исказить результаты оценки. Если в исследуемой области среза эндотелий отсутствует, необходимо проверить прилегающие к ней участки на наличие нормального слоя эндотелия. Поскольку исследуемая химическая продукция равномерно наносится на всю наружную поверхность роговицы, неоднородность изменений в основной части эндотелия дает основания предполагать, что они были вызваны механическими повреждениями отдельных участков, а не химическим воздействием этой химической продукции. Если механические повреждения были нанесены на поздних стадиях эксперимента или после фиксации образца (например, в процессе проводки), предполагается, что в этом случае отечность или расширение стромы будут неглубокими или незначительно выраженными.

Б.5.4 Подготовка микрофотоснимков

Микрофотоснимки гистологических изменений, приведенные в настоящем стандарте, были отобраны таким образом, чтобы обеспечить репрезентативность результатов проведенных исследований и соответствующей тяжести и глубины повреждений тканей в серии образцов, подвергнутых химическому воздействию. При этом не ставилась цель документировать все выявленные повреждения либо предложить для ознакомления всю совокупность имеющихся данных. Для получения и обработки снимков использовались цифровая камера Spot Insight и соответствующее программное обеспечение Spot 4.0.8 (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI). Параметры цветового баланса полученных снимков в отдельных случаях были дополнительно скорректированы для приведения их в соответствие с изображением, доступным для визуального наблюдения в микроскоп. Все микрофотоснимки зафиксированы в журнале цифровых изображений, ведение которого осуществлялось в процессе соответствующего исследования. По завершении исследований этот журнал был распечатан на бумаге и заверен подписью ответственного научного специалиста с указанием текущей даты. Заверенная копия журнала была сохранена в общем журнале исследования. Электронные версии снимков были импортированы методом «вставки изображений» в текст отчета о проведении гистологического исследования.

Б.6 Краткая подборка микрофотоснимков, иллюстрирующих (нормальное) состояние тканей роговицы крупного рогатого скота после обработки химической продукцией и отрицательной контрольной пробой, а также отдельные виды гистологических изменений в указанных тканях

В серии микрофотоснимков, приведенных ниже, иллюстрируется нормальная морфология образцов роговицы глаза крупного рогатого скота и некоторые примеры гистологических изменений, которые могут наблюдаться в эпителии, строме и эндотелии подобных образцов. Приведенные микрофотоснимки не содержат все возможные гистологические изменения, однако они иллюстрируют основные виды таких изменений, которые обычно упоминаются при обсуждении возможных повреждений роговицы. В описании ряда иллюстраций дополнительно указываются наименование химической продукции и время экспозиции. В случае когда микрофотоснимки были заимствованы из неопубликованных результатов исследований, проводившихся по заявке заказчиков, фактические наименования исследуемой химической продукции не упоминаются.

Б.6.1 Образцы роговицы, обработанные отрицательной контрольной пробой

Рисунок Б.11 — Роговица, обработанная отрицательной контрольной пробой (стерильная, деионизированная вода, экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч). Общая толщина (увеличение 4x)

Рисунок Б.12 — Роговица, обработанная отрицательной контрольной пробой (стерильная, деионизированная вода, экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч). Эпителий (увеличение 20x)

Рисунок Б.13 — Роговица, обработанная отрицательной контрольной пробой (стерильная, деионизированная вода, экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч). Верхняя часть стромы с ненарушенной структурой коллагеновой матрицы и морфологией кератоцитов (увеличение 40x)

Рисунок Б.14 — Роговица, обработанная отрицательной контрольной пробой (стерильная, деионизированная вода, экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч). Нижняя часть стромы и эндотелий (увеличение 4x)

Б.6.2 Повреждения эпителия

Рисунок Б.15 — Натрия лаурилсульфат (1% НЛС, экспозиция 30 мин). Утрата эпителиальных клеток под воздействием сурфактанта (увеличение 40x)

Рисунок Б.16 — Натрия лаурилсульфат (5% НЛС, экспозиция 30 мин). Утрата эпителиальных клеток под воздействием сурфактанта (увеличение 40x)

Рисунок Б.17 — Этанол (неразбавленный), экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Коагуляция в сквамозном слое, вакуолизация цитоплазмы и клеточных ядер в слое шиповатых клеток и базальном слое (увеличение 20x)

Рисунок Б.18 — Кислотосодержащий состав «A» (неразбавленный), экспозиция 3 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Умеренная коагуляция, аномальная конденсация хроматина и вакуолизация цитоплазмы в сквамозном слое и верхнем слое шиповатых клеток (увеличение 40x)

Рисунок Б.19 — Кислотосодержащий состав «B» (неразбавленный), экспозиция 3 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Выраженная коагуляция чешуйчатых клеток, аномальная конденсация хроматина, нарушение сцепления базальных клеток с базальной пластинкой (увеличение 40x)

Рисунок Б.20 — Кислотосодержащий состав «B» (неразбавленный), экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Сильная коагуляция чешуйчатых клеток, аномальная конденсация хроматина (осаждение), выраженная эозинофилия цитоплазмы (увеличение 40x)

Рисунок Б.21 — (неразбавленный), экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Гипохромное окрашивание верхней части эпителия и выраженный пикноз клеточных ядер, а также поверхностная гиперэозинофилия в глубоких слоях эпителия (увеличение 20x)

Рисунок Б.22 — Вызванное воздействием органического растворителя разрушение клеточной структуры и утрата компонентов цитоплазмы в эпителиальном слое

Рисунок Б.23 — Общее разрушение эпителия и отслоение от базальной пластинки. Особое внимание следует обратить на эозинофильный осадок между передней пограничной пластинкой и базальными клетками (увеличение 20x)

Рисунок Б.24 — Повреждения эпителия и верхней части стромы, повлекшие за собой полную утрату жизнеспособности и ослабление окрашивания тканей

Рисунок Б.25 — Состав для отбеливания (неразбавленный), экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Эпителий характеризуется полным обесцвечиванием клеточных ядер и цитоплазмы в сквамозном слое и верхнем слое шиповатых клеток

Рисунок Б.26 — Отбеливающее вещество (неразбавленное), экспозиция 3 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. На эпителии видна микровакуолизация клеточной структуры и цитоплазмы

Б.6.3 Гистологические изменения в строме

Рисунок Б.27 — Натрия лаурилсульфат (1,5% НЛС), экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Пример слабого расширения коллагеновой матрицы непосредственно под передней пограничной пластинкой

Рисунок Б.28 — Натрия лаурилсульфат (1% НЛС), экспозиция 30 мин. Пример умеренного расширения коллагеновой матрицы в верхней части стромы

Рисунок Б.29 — Натрия лаурилсульфат (5% НЛС), экспозиция 30 мин. Пример от умеренного до сильного нарушения структуры коллагеновой матрицы и расширения верхней части стромы. Следует также обратить внимание на изменения в ядрах кератоцитов

Рисунок Б.30 — Натрия лаурилсульфат (10%-ный НЛС), экспозиция 30 мин. Сильное расширение коллагеновой матрицы, явившееся следствием разрушения эпителия. Следует также обратить внимание на разрушение кератоцитов в верхних слоях

Б.6.4 Гистологические изменения клеток эндотелия

Рисунок Б.31 — Хинокрин (20%-ный раствор хинокрина в среде MEM, экспозиция 4 ч). Вакуолизация клеток эндотелия (сильная)

Рисунок Б.32 — Состав для отбеливания, экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Повреждения эндотелиального слоя клеток, расширение цитоплазмы и коллагеновой матрицы в нижней части стромы (сильное)

Рисунок Б.33 — Этанол (неразбавленный), экспозиция 10 мин, выдержка после экспозиции 2 ч. Сильные повреждения эпителия и расширение верхней части стромы. Эндотелий не поврежден. Заметно небольшое расширение в нижней части стромы

Рисунок Б.34 — Пример большой отечности стромы, явившейся следствием утраты как эпителия, так и эндотелия (сильно выраженной)

Приложение В (обязательное)

ПОДРОБНЫЙ ПРОТОКОЛ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО МЕТОДУ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗВЛЕЧЕННОГО ГЛАЗА КУРИЦЫ

Настоящий протокол описывает технические процедуры, рекомендуемые компанией Triskelion, разработчиком метода исследования химической продукции с использованием для него извлеченных образцов глаз курицы [50], [14], [51]. Данный протокол использовался в качестве основы при проведении соответствующих валидационных исследований с целью оценки эффективности применения метода ICE Межведомственным координационным комитетом по валидации альтернативных методов [2], [11], [29] при участии Европейского центра по валидации альтернативных методов и Японского центра по валидации альтернативных методов, которые включали выполнение международной независимой научной экспертной оценки результатов валидации и научной обоснованности применения метода ICE.

В.1 Сущность метода ICE

Исследуемую химическую продукцию однократно наносят на поверхность роговицы не менее чем трех образцов глаз и подвергают их экспозиции в течение 10 с. Перед нанесением исследуемой продукции для каждого из образцов глаз определяют базовые значения соответствующих показателей, необходимых для дальнейшей оценки последствий ее воздействия на роговицу. Один необработанный образец при этом выступает в качестве контрольного для условий проведения эксперимента. Реакцию роговицы образцов на исследуемую продукцию после проведенной обработки проверяют через равномерные промежутки времени, не превышающие 4 ч. Исходя из средних значений показателей отечности и непрозрачности роговицы, ее способности удерживать флуоресцеин, принимают решение о способности исследуемой продукции вызывать раздражение глаз по шкале от полного отсутствия раздражения до сильного раздражения. Микроскопическая оценка «глубины повреждения» может быть получена путем изучения и документирования патологических изменений роговицы.

В.2 План эксперимента

В.2.1 Оборудование и инвентарь

Отбор куриных голов:

• емкости для транспортирования голов (например, пластиковые контейнеры с крышками);
• мясницкий нож;
• спецодежда (в соответствии с требованиями скотобоен);
• резиновые сапоги или пластиковые бахилы для обуви;
• хирургические перчатки и защитные рукавицы (при необходимости).

Извлечение образцов глаз:

• хирургический пинцет;
• анатомический пинцет (изогнутый);
• ножницы (по меньшей мере один экземпляр с изогнутыми лезвиями и тупыми концами);
• впитывающие подложки;
• держатели для образцов глаз;
• 2%-ный (масс/объем) раствор флуоресцеина натрия (производства Minims® или аналогичный);
• физиологический солевой раствор (используется также на последующих этапах исследования).

Работа с извлеченными образцами глаз:

• аппарат суперфузии (см. рисунок В.1);

Позиция	Описание
1	Выпускной патрубок для теплой воды
2	Выдвижная дверца
3	Аппарат суперфузии
4	Оптический измерительный прибор
5	Впускной патрубок для теплой воды
6	Физиологический раствор
7	Теплая вода
8	Впускной патрубок для физиологического раствора
9	Отдельный отсек камеры
10	Держатель образца
11	Глаз курицы
12	Выпускной патрубок для физиологического раствора
13	Установочный винт
14	Верхняя регулируемая консоль
15	Нижняя фиксированная консоль

Рисунок В.1 — Аппарат суперфузии

• перистальтический насос с достаточным количеством каналов (см. рисунок В.2);

Рисунок В.2 — Перистальтический насос

• водяная баня с соответствующим рабочим диапазоном (например, от 30 °C до 60 °C) (см. рисунок В.3).

Рисунок В.3 — Водяная баня

Исследование образцов глаз:

• щелевая лампа с микроскопом (мод. BP 900, Haag-Streit AG, Liebefeld-Bern, Швейцария). Альтернативно может использоваться щелевая лампа Haag-Streit BQ900, в случае если возможна установка глубиномерной насадки с шириной щели, равной 0,095;
• глубиномерная насадка № 1.

Нанесение исследуемой химической продукции:

• аналитические весы;
• бумага для взвешивания;
• ступка и пестик или кофемолка (для твердой продукции);
• микропипетка с прямым вытеснением, обеспечивающая дозирование по 30 мкл;
• исследуемая химическая продукция;
• репитер-пипетка, предназначенная для многократного равномерного дозирования (диапазон от 1 до 10 мл), с бутылкой вместимостью от 500 до 600 мл.

Оценка всех данных исследования по всем временным точкам:

• соответствующая форма оформления результатов оценки;
• критерии оценки согласно [46].

В.2.2 Настройки оборудования и общие указания

Аппарат суперфузии. Специальные настройки не требуются.

Перистальтический насос

Скорость подачи устанавливают равной 3 — 4 капли физиологического раствора в минуту.

Примечание - Наиболее интенсивное промывание применяют для удаления остатков нанесенного флуоресцеина во временной точке t = 30 мин наблюдения.

Водяной насос с терморегулятором

Водяной насос соединяют с аппаратом суперфузии при помощи пластиковых трубок.

Первую трубку одним концом присоединяют к выпускному патрубку водяного насоса, а другим к впускному патрубку аппарата суперфузии (справа внизу) соответственно. Вторую трубку присоединяют одним концом к выпускному патрубку аппарата суперфузии (слева вверху), а другой конец для возврата жидкости выводят в резервуар для воды насоса.

Значение температуры на уровне (32 +/- 1,5) °C в камерах аппарата суперфузии поддерживают путем соответствующих настроек температуры, определяемых заранее. Один раз подобранные оптимальные настройки температуры в дальнейшем могут использоваться на постоянной основе (проведение контроля один раз в год считается достаточным).

Примечание - Достаточно один раз установить температуру в диапазоне (32 +/- 1,5) °C в аппарате суперфузии. Дополнительная проверка необходима только в том случае, если настройки температуры подвергались изменениям.

Щелевая лампа с микроскопом (Haag-Streit 900 BP)

Вначале проверяют настройку обоих окуляров. Если настройка выполнена правильно, она впоследствии может использоваться без изменений на протяжении всего исследования.

Устанавливают значение увеличения для щелевой лампы (10, 16 или 25) равным 16 (см. рисунок В.4).

При необходимости исследования образца глаза целиком с целью оценки показателей непрозрачности роговицы и ее окрашивания флуоресцеином выполняют следующие настройки:

Рисунок В.4

Непрозрачность:

Регулятор интенсивности освещения устанавливают в положение 1/2 (см. рисунок В.5).

Рисунок В.5

Длина щели	Полная длина	Верхний рычаг (1) — источник узконаправленного света: крайнее левое положение
		Рифленая поворотная ручка (2) в верхней части источника узконаправленного света: положение 8
Ширина щели	Полное открытие	Нижняя рифленая ручка (3): положение «бесконечность»

Рисунок В.6

Исследуют роговицу следующим образом:

• фокусируют пучок света на поверхности роговицы (тонком слое физиологического раствора), используя рычаг управления перемещением лампы (джойстик) у основания прибора для получения четкого изображения поверхности роговицы;
• выполняют наблюдение.

Окрашивание флуоресцеином:

• регулятор интенсивности освещения устанавливают в положение 1/2

Длина щели	Полная длина	Верхний рычаг (1) — источник узконаправленного света: положение, отмеченное символом зеленого цвета
		Рифленая поворотная ручка (2) в верхней части источника узконаправленного света: положение 8
Ширина щели	Полное открытие	Нижняя рифленая ручка (3): положение «бесконечность»

Рисунок В.7

Исследуют роговицу следующим образом:

• наносят одну каплю раствора флуоресцеина на поверхность роговицы (образец глаза при этом остается в камере), затем промывают физиологическим раствором, увеличивая скорость подачи капель физиологического раствора до максимального значения. По окончании наблюдения возвращают скорость подачи к обычному значению;
• фокусируют узконаправленный пучок света на поверхности роговицы (тонком слое физиологического раствора), используя рычаг управления перемещением (джойстик) у основания прибора для получения четкого изображения поверхности роговицы;
• выполняют наблюдение.

Длина щели	Полная длина	Верхний рычаг (1) — источник узконаправленного света: положение символа зеленого цвета
		Рифленая поворотная ручка (2) в верхней части источника узконаправленного света: положение 8
Ширина щели	Полное открытие	Нижняя рифленая ручка (3): положение точно между отметками 9 и 10 (91/2)

Для измерений толщины роговицы выполняют следующие настройки:

• регулятор интенсивности освещения устанавливают в положение 2 (см. рисунок В.7).

Рисунок В.8

При определении толщины роговицы с использованием щелевой лампы с микроскопом производства Haag-Streit, оборудованной глубиномерной насадкой № 1, соблюдают следующий порядок действий:

• устанавливают прибор на щелевой лампе;
• заменяют правый окуляр на окуляр для измерения глубины так, чтобы обозначение «I 16x» располагалось сверху.

Рисунок В.9

Удостоверяются, что пучок света проходит от лампы через щель измерительного приспособления. Если нет — выполняют необходимые настройки;

• фокусируют пучок света в центре роговицы;
• определяют точную толщину роговицы, выражаемую в единицах шкалы прибора, поворачивая колесико на приборе и глядя при этом только в правый окуляр до тех пор, пока изображения верхней и нижней половины щелевого пучка света не примут правильное положение (см. рисунок ниже);
• по достижении необходимого положения считывают показания шкалы.

Примечание - Чтобы получить максимально точные результаты измерения, наблюдаемые части изображения вначале разводят полностью, а затем снова совмещают в правильном положении (см. рисунок В.10).

Рисунок В.10

Микропипетка (может применяться, например, для нанесения жидкой исследуемой продукции (см. В.2.6)).

Необходимость в калибровке отсутствует, поскольку 30 мкл считаются избыточной дозой и в большем количестве продукция не наносится.

Подготавливают микропипетку к использованию.

Устанавливают объем на 30 мкл.

Наполняют микропипетку и удаляют из нее воздух.

Размещают кончик над центром роговицы глаза, который помещается в открытый пластиковый контейнер или на слой ткани.

Выдавливают 30 мкл на роговицу, плавно нажимая на поршень до упора.

Примечание - Если капля(и) исследуемой химической продукции скатывается с роговицы или неравномерно растекается по ее поверхности, для обеспечения надлежащих условий экспозиции допускается использовать дополнительный объем. Записывается приблизительный нанесенный объем.

Бутылочный дозатор типа Seripettor (может применяться, например, для промывания образцов глаз (см. В.2.4 и В.2.6)).

Наполняют бутылку физиологическим раствором.

Устанавливают регулятор дозируемого объема приблизительно на 5 мл.

Наносят физиологический солевой раствор в количестве 5 мл, поднимая (плавно) рукоять дозатора в крайнее верхнее положение, а затем опуская в крайнее нижнее положение со скоростью приблизительно 3 — 4 с на 5 мл.

При промывке после воздействия исследуемой химической продукцией описанную выше операцию повторяют 4 раза (используя в общей сложности 20 мл раствора).

При работе с порошкообразной продукцией первую порцию физиологического раствора объемом 5 мл рекомендуется наносить в виде отдельных капель, а не струи.

Если верхняя консоль зажимного приспособления не полностью прилегает к глазному яблоку, обеспечивают проведение дополнительного промывания в области над верхней консолью для удаления любых остатков исследуемой продукции. Данная операция не требует отдельного упоминания при ведении записей в процессе выполнения работ, так как не относится непосредственно к роговице.

В.2.3 Отбор образцов глаз курицы

В начале дня, на который запланировано проведение исследования, куриные головы (обычно цыплята массой около 2 кг) получают в месте убоя, ближайшем к месту расположения лаборатории (оптимальное расстояние — не более 45 мин в пути). Если используются цыплята различной массы, должны быть подготовлены данные, подтверждающие пригодность использования цыплят разной массы.

Процедура отбора следующая:

На месте убоя:

• головы птиц отделяют в месте обескровливания (после оглушения и вскрытия горла для обескровливания), до того как тушки попадут в горячую ванну для ошпаривания (следующий этап производственного процесса).

Примечание - Головы отделяют с осторожностью, ни в коем случае не касаясь глаз!;

• каждую голову помещают в соответствующий контейнер;
• контейнеры, в которых находятся куриные головы, как можно скорее доставляют к месту проведения исследования при температуре окружающей среды (в зимний период контейнеры следует перевозить в салоне с водителем, а не в грузовом отделении). После доставки в лабораторию наименование организации, где осуществлялся убой, и приблизительное время убоя отмечают в журнале.

В.2.4 Извлечение глазных яблок

Глазные яблоки препарируют с соблюдением необходимых предосторожностей в срок, не превышающий 2 ч после убоя птицы.

Глаза извлекают из орбит и помещают в аппарат суперфузии, выполняя для этого следующую последовательность действий:

• как можно аккуратнее срезают веки на одном из глаз головы;
• в центр роговицы помещают небольшую каплю флуоресцеина;
• сразу же смывают ее 5 мл физиологического раствора (при температуре окружающей среды);
• контролируют роговицу на месте при помощи микроскопа (см. наблюдение образца глаза целиком), чтобы убедиться в отсутствии окрашивания, которое свидетельствовало бы о повреждении эпителиальных клеток.

Примечание - Для исследования используют только те образцы, на роговице которых не было обнаружено следов окрашивания (наличие нескольких разрозненных окрашенных клеток с максимальным баллом по шкале оценки, не превышающим 0,5, допускается). Образец, пригодный для дальнейшего препарирования, помимо этого, не должен иметь признаков помутнения или иных дефектов, в противном случае указанные выше операции повторяют на другом глазе;

• освобождают глазное яблоко из орбиты, прочно удерживая за мигательную перепонку хирургическим пинцетом и разрезая глазные мышцы при помощи изогнутых ножниц с тупыми концами.

Примечание - Извлекая глаз, стараются не прилагать к нему чрезмерных усилий, так как это может привести к помутнению роговицы;

• после извлечения выкладывают образец глаза на впитывающую подложку и срезают с него мигательную перепонку и другие окружающие роговицу соединительные ткани, тщательно избегая контакта с ее поверхностью. В сомнительных случаях целесообразно проведение повторной оценки целостности роговицы с помощью флуоресцеинового теста;
• закрепляют образец глаза с роговицей в держателе.

Примечание - При установке образца в держатель следят, чтобы давление держателя на образец не было чрезмерным. Благодаря тому, что глазное яблоко курицы снабжено довольно плотной склерой, для его устойчивой фиксации в держателе достаточно самого легкого усилия;

• при наличии подозрений, что роговица все же могла быть повреждена, и для их исключения снова проводят флуоресцеиновый тест;
• результаты данного или предшествующего теста принимают в качестве исходного показателя для начисления баллов (t = 0), о чем делают соответствующую запись;
• помещают держатель с образцом в одну из камер аппарата суперфузии;
• настраивают капельную подачу физиологического раствора на поверхность роговицы (см. соответствующие настройки);
• повторяют описанную последовательность действий до тех пор, пока количество подготовленных указанным способом образцов глаз не будет достаточным для проведения исследования;
• измеряют толщину роговицы (см. соответствующие настройки) и записывают полученные значения для t = -45 мин. Отмечают фактическое значение времени в соответствующей колонке (для времени) и в журнале текущих операций. Дополнительно в данной колонке также могут быть заранее указаны планируемые контрольные временные точки. Фактические значения времени регистрируют в журнале по ходу проведения исследования;
• выдерживают образцы глаз с целью их акклиматизации в аппарате суперфузии в течение 45 — 60 мин.

В.2.5 Определение исходных значений показателей

По окончании периода акклиматизации, обычно приблизительно за 5 мин до начала воздействия (t = 0), оценивают показатели отечности и непрозрачности роговицы и ее способности удерживать флуоресцеин, как указано ниже:

• проверяют каждую роговицу на наличие помутнения или иных дефектов;
• измеряют толщину роговицы каждого образца и записывают значения для t = 0;
• положение нижней рифленой ручки прибора, соответствующее 9 1/2, не изменяют до тех пор, пока не будет оценена толщина роговицы для t = 30 мин.

Примечание - Увеличение толщины роговицы на данном этапе не должно превышать от 5% до 7% (или 3 единицы шкалы прибора). Небольшое уменьшение толщины (вплоть до 7%), которое в этом случае также может иметь место, считается нормальным при работе с препарированными образцами. Ни один из образцов глаз не должен демонстрировать отчетливых признаков помутнения. Вместе с тем очень незначительное помутнение является допустимым, при условии что оно имеется не на всех наблюдаемых образцах.

В.2.6 Нанесение исследуемой химической продукции

После определения исходных значений показателей роговицы исследуемую химическую продукцию однократно наносят на каждый испытуемый образец глаза. Контрольный образец глаза не подвергается воздействию исследуемой химической продукции, однако все другие этапы обработки для него также выполняются.

Жидкая продукция

Жидкости наносят с помощью микропипетки, стандартный объем дозирования при этом составляет 30 мкл. Если в силу необходимости используется другой объем, в записях делают об этом соответствующие пометки.

Пасты можно разводить теплой водой (около 70 °C), собирать микропипеткой и наносить после охлаждения до комнатной температуры, если не предусмотрено иное. Аналогичную процедуру применяют при работе с высоковязкими жидкостями, если их дозирование при комнатной температуре представляется затруднительным. Информацию о выполняемых действиях регистрируют.

Дополнительно перед началом или в процессе исследования можно убедиться в наличии у исследуемой жидкой химической продукции гидрофобных или гидрофильных свойств. Данную характеристику легко определить, проследив за поведением химической продукции при непосредственном нанесении на роговицу глаза либо при ее контакте с водой в отдельной емкости. Результаты подобных наблюдений позволяют получить общее представление о природе исследуемой химической продукции, в ряде случаев достаточное для понимания характера деструктивных изменений, которые эта исследуемая химическая продукция может вызывать в тканях роговицы глаза.

Примечание - Пипетки, использующие давление воздуха, для указанных целей не применяются, поскольку они не обеспечивают надлежащим образом дозирование соответствующих малых объемов (особенно при нанесении вязких жидкостей). Вместо них рекомендуется выбирать пипетки прямого вытеснения с поршнем.

Твердая продукция

Если на образец требуется нанести твердую продукцию, ее измельчают до тонкого порошкообразного состояния и наносят путем посыпания ею поверхности роговицы в стандартном количестве, соответствующем 30 мг, с бумаги для взвешивания.

Примечание - В отдельных случаях при работе с высоко гигроскопичной порошкообразной продукцией (такой как NaOH) или очень густыми пастами для их равномерного распределения по поверхности роговицы дополнительно используют лопатку или наконечник дозирующего шприца. Очень вязкие или тестообразные пасты иногда приходится наносить в виде предварительно сформованной массы, которую помещают непосредственно на поверхность роговицы. В этих случаях точная масса дозы несущественна. Важнее обеспечить плотный контакт исследуемой химической продукции с роговицей глаза.

Обработку каждого образца глаз выполняют в следующем порядке:

Испытуемые образцы глаз:

• извлекают первый образец из камеры и укладывают его на тканевую подложку или в пластиковый контейнер роговицей вверх;
• наносят исследуемую химическую продукцию в центральную часть роговицы, соблюдая указания, приведенные в настоящем разделе. Регистрируют информацию обо всех непредвиденных событиях, например, таких как стекание продукции с поверхности образца, что характерно для гидрофобных материалов, или мгновенное помутнение роговицы. Если продукция распределилась по поверхности роговицы неравномерно, этот факт также следует зафиксировать;
• закончив нанесение исследуемой химической продукции, выдерживают ее на поверхности роговицы в течение 10 с;
• после этого тщательно, но с большой осторожностью промывают роговицу 20 мл физиологического солевого раствора при комнатной температуре из бутылочного дозатора (4 порциями по 5 мл каждая). Записывают информацию обо всех непредвиденных событиях, таких как прилипание исследуемой химической продукции к роговице или ее осаждении на поверхности роговицы;
• возвращают держатель с образцом обратно в камеру;
• выполняют данную процедуру со всеми испытуемыми образцами.

Примечание - Если по результатам внешнего осмотра на поверхности роговицы все еще присутствуют остатки исследуемой химической продукции, промывку повторяют, стараясь добиться полного их удаления. Приблизительный объем израсходованной химической продукции записывают. Если полностью удалить остатки исследуемой химической продукции путем повторной промывки не удалось, этот факт также отмечают в записях.

Контрольный образец глаза:

• извлекают контрольный образец из камеры и укладывают его на тканевую подложку или в пластиковый контейнер роговицей вверх;
• осторожно промывают роговицу 20 мл физиологического раствора при комнатной температуре;
• возвращают держатель с образцом обратно в камеру.

В.2.7 Наблюдение и оценка воздействия на роговицу

Анализ испытуемых образцов глаз и контрольного образца проводят в соответствии с критериями и системой балльной оценки, приведенными в [46], через промежутки времени, приблизительно соответствующие 30, 75, 120, 180 и 240 мин (+/- 10 мин для всех временных точек за исключением 30 мин) после их обработки. Во всех случаях для осмотра образцов используют щелевую лампу с микроскопом.

Временная точка t = 30 мин:

• в первую очередь проверяют толщину роговицы каждого глаза (устанавливая t = 0 мин) и записывают результаты наблюдений;
• проверяют все образцы глаз на помутнение роговицы;
• если в ходе осмотра на поверхности роговицы были замечены остатки исследуемой химической продукции, их стараются удалить, осторожно промывая роговицу физиологическим раствором, и записывают результаты этой операции;
• затем помещают на поверхность роговицы каждого образца глаза одну каплю раствора флуоресцеина (все три испытуемых образца можно обрабатывать одновременно);
• немедленно смывают флуоресцеин с образцов, увеличив для этой цели капельную подачу солевого раствора;
• сразу же после этого выполняют наблюдения и записывают их результаты.

Другие временные точки:

• повторяют операции, описанные выше, за исключением проверки на окрашивание флуоресцеином, и записывают результаты, полученные для соответствующих интервалов.

Примечание - Если роговица покрыта налипшими остатками исследуемой химической продукции, то по возможности также оценивают окрашивание флуоресцеином на тех участках, где эту продукцию удалось удалить. Помимо этого, степень окрашивания образца флуоресцеином можно проконтролировать параллельно с определением толщины роговицы, наблюдая за глубиной проникновения флуоресцеина внутрь роговицы или в низлежащие слои тканей (чем больше глубина, тем сильнее окрашивание). Оценка непрозрачности роговицы может быть дана аналогичным образом — путем изучения поперечных срезов, используемых при измерениях толщины. Смешанные эффекты проявления последствий воздействия исследуемой химической продукцией в роговице, такие как общее легкое помутнение в сочетании с отчетливо выделяющимися непрозрачными участками, при присвоении соответствующих баллов могут обозначаться сочетанием цифр 1(3). Аналогичный подход применяется при балльной оценке способности поглощать флуоресцеин. Для вычисления среднего балла используют баллы за наиболее сильное поражение (в данном случае 3).

В.2.8 Отбор и фиксация образцов роговицы

После завершения всех операций испытуемые и контрольный образцы глаз сохраняют в 4%-ном нейтральном водном буферизованном фосфатном растворе формальдегида для последующего гистологического анализа. Для этой цели вначале на образцах при помощи скальпеля выполняют практически сквозной разрез непосредственно за хрусталиком сквозь стекловидное тело (не затрагивая роговицу!). Каждое надрезанное таким образом глазное яблоко помещают в контейнер, содержащий приблизительно 20 мл формалина. После фиксации в течение 24 ч половину образца, содержащего роговицу и хрусталик, обрезают ножницами таким образом, чтобы используемый для дальнейшей обработки небольшой фрагмент включал в себя все ткани роговицы без хрусталика.

Подробные указания по подготовке образцов к гистологическому исследованию приведены в приложении А.

Приложение Г (обязательное)

ПОДРОБНЫЙ ПРОТОКОЛ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОМУТНЕНИЯ И ПРОНИЦАЕМОСТИ РОГОВИЦЫ ГЛАЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Общие положения

Настоящий протокол основан на результатах работ по всестороннему изучению преимуществ метода исследования BCOP, выполненных Межведомственным координационным комитетом по валидации альтернативных методов [29] при участии Европейского центра по валидации альтернативных методов и Японского центра по валидации альтернативных методов, которые предусматривали проведение независимой экспертной оценки валидации и научной обоснованности применения метода BCOP. При подготовке протокола были использованы (1) информация, предоставленная Институтом по научным исследованиям in vitro (IIVS), независимой некоммерческой организацией, применяющей с 1997 г. метод BCOP для проведения исследований на базе собственной испытательной лаборатории, деятельность в которой осуществляется в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice — GLP), а также (2) положения протокола [15], идентичного протоколу превалидационных исследований метода BCOP, которые проводились при финансовой поддержке Европейского сообщества в 1997 — 1998 гг. В обоих случаях действующие протоколы основывались на методе исследования BCOP, применение которого было впервые описано в [91]. Предполагается, что последующие работы в данном направлении будут способствовать получению дополнительных сведений об эффективности и возможных ограничениях применения метода исследования BCOP для принятия решений по совокупности имеющихся свидетельств в сфере государственного регулирования. Пользователям метода следует иметь в виду, что содержание предлагаемого ниже протокола может быть в любое время пересмотрено, исходя из вновь открывающихся возможностей по его усовершенствованию и/или с учетом результатов очередных валидационных исследований, которые возможно будут организованы в будущем. ICCVAM в этой связи рекомендует пользователям по мере необходимости сверяться с информацией, представленной на сайте NICEATM — ICCVAM (http://iccvam.niehs.nih.gov/), чтобы быть уверенными в том, что они используют наиболее актуальную редакцию протокола.

Г.1 Назначение и применение

Настоящий протокол предназначен для описания процедур оценки потенциальной опасности для глаз, которую может представлять исследуемая химическая продукция, исходя из результатов определения ее способности вызывать помутнение и повышать проницаемость извлеченных образцов роговицы глаз крупного рогатого скота. Измеряемые последствия, таким образом, выражаются в (1) снижении светопропускания роговицы (уменьшении прозрачности) и (2) увеличении количества проходящего через ее толщу красителя — флуоресцеина натрия (повышении проницаемости), а кроме того, при наличии соответствующей возможности (3) поддаются оценке, исходя из результатов исследования зафиксированных и микротомированных образцов, выполняемого с использованием оптического микроскопа. Значения показателей непрозрачности и проницаемости роговицы после воздействия на нее исследуемой химической продукцией определяются по отдельности, потом объединяются при помощи формулы для получения значения показателя раздражающей способности in vitro (IVIS), используемого затем для классификации данной химической продукции в зависимости от уровня вызываемого ею раздражения. Гистологический анализ роговицы может быть полезен для выявления таких патологических изменений в клеточных слоях, которые не приводят к их заметному помутнению или к существенному изменению их проницаемости. Более того, результаты гистологических исследований могут способствовать достоверному определению глубины и тяжести повреждения внутренних слоев роговицы, что в свою очередь помогает достоверно оценить вероятность ее последующего восстановления.

Основное внимание в протоколе уделяется использованию метода BCOP для выявления химической продукции, способной вызывать серьезное повреждение глаз (класс опасности 1 согласно СГС ООН) [62], а также для определения химической продукции, не требующей классификации как вызывающая раздражение или серьезное повреждение глаз (класс опасности отсутствует согласно СГС ООН). До настоящего времени метод BCOP не был надлежащим образом валидирован для применения его с целью определения химической продукции, которая не может быть классифицирована как химическая продукция, относящаяся к классу опасности 1 согласно СГС ООН, или как химическая продукция, для которой класс опасности согласно СГС ООН отсутствует (например, принадлежащая к классу опасности 2, подклассам опасности 2A и 2B согласно СГС ООН) [62], хотя на практике исследования подобной химической продукции в соответствии с данным протоколом также проводились. Если результаты, полученные с применением метода BCOP, не позволяют отнести исследуемую химическую продукцию к определяемым с его помощью классам опасности, эти результаты могут быть использованы в рамках подходов IATA, например для дальнейшей оценки потенциальной опасности химической продукции по совокупности имеющихся свидетельств в сочетании с другими данными, полученными как путем испытаний, так и иным путем, для определения химической продукции, обладающей умеренным и слабым раздражающим действием (т.е. продукции, которой присваивается подкласс опасности 2A или 2B согласно СГС ООН).

Г.2 Техника безопасности и меры предосторожности

Все процедуры с образцами глаз и роговицы крупного рогатого скота должны выполняться с соблюдением действующих норм и требований, применяемых в соответствующем исследовательском учреждении при работе с материалами животного происхождения, в том числе тканями и тканевыми жидкостями. Рекомендуется соблюдать общие меры предосторожности, такие как ношение лабораторных халатов, использование защитных очков и перчаток. Сведения о необходимых дополнительных мерах предосторожности при обращении с исследуемой химической продукцией также могут содержаться в паспорте безопасности на данную продукцию.

Г.3 Оборудование, рабочие и расходные материалы

Г.3.1 Источники образцов глаз крупного рогатого скота

Образцы глаз крупного рогатого скота отбирают в месте убоя животных, расположенном в максимальной близости от испытательной лаборатории. Донорами образцов (вне зависимости от породы) могут являться взрослые коровы, телки, выхолощенные и невыхолощенные быки. С учетом того, что собственная масса животных может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от породы, возраста и пола, какое-либо рекомендованное значение массы тела на момент проведения убоя для них отсутствует.

Использовать в качестве образцов глаза пожилых животных не рекомендуется, поскольку роговица глаз таких особей зачастую характеризуется увеличенным горизонтальным диаметром и повышенной толщиной в вертикальном направлении, что может отрицательно сказаться на результатах эксперимента [16]. Кроме того, не рекомендуется использование образцов, которые могут быть получены от неполовозрелых телят, поскольку толщина и диаметр роговицы глаз у них, напротив, существенно уступают аналогичным параметрам глаз взрослых животных. Таким образом, в обычном случае для проведения исследований желательно использовать образцы глаз, полученные от особей крупного рогатого скота в возрасте от 12 до 60 мес. Возможность использования образцов роговицы молодых животных (в возрасте от 6 до 12 мес) не исключается, при условии что результаты испытаний положительных и отрицательных контрольных проб для них при многократном повторении укладываются в установленные диапазоны приемлемости.

Г.3.2 Приборы и реактивы

Держатели роговицы.

Препаровальные инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты).

Электрический гайковерт/шуруповерт.

Конические центрифужные пробирки (50 мл).

Инкубатор или водяная баня.

Не оставляющий следов очищающий раствор на основе моющего средства для ухода за медицинскими и лабораторными инструментами (например, Alconox Liquinox® ).

Микропланшетный ридер или оптический спектрофотометр.

Микропипетки и наконечники к ним.

Оптический денситометр.

Чашки Петри.

Пластиковые контейнеры для отбора и транспортирования образцов глаз.

Пробирки для проб (вместимостью 5 мл, стеклянные) для определения проницаемости роговицы.

Лопатка.

Специализированный гайковерт для извлечения окошка с фиксирующим кольцом.

Стандартные лабораторные инструменты и оборудование для работы с клеточными культурами.

Стерильная деионизированная вода.

Шприцы (вместимостью 10 мл) и дозирующие иглы с тупыми концами (19 G).

Вакуумный насос.

96-луночные планшеты (полистирол) или кюветы подходящих размеров для использования с оптическим спектрофотометром.

Г.3.3 Химическая продукция

Этанол (100%-ный, абсолютный, безводный, степень чистоты ACS/USP).

Диметилформамид.

Имидазол.

Пенициллин.

Натрия хлорид.

Натрия флуоресцеин.

Стрептомицин.

Г.3.4 Растворы

При использовании готовых маточных (исходных) растворов соблюдают рекомендации изготовителя по условиям и срокам их хранения.

0,9%-ный (масс/объем) раствор NaCl в стерильной деионизированной воде (физиологический раствор).

Сбалансированный солевой раствор Хэнкса 1x с Ca++ и Mg++ (Hanks' Balanced Salt Solution — HBSS) с добавлением 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline — DPBS).

Минимальная эссенциальная среда «Игла» (Eagle's Minimum Essential Medium — EMEM) без добавления красителя фенолового красного, подогретая до 32 °C.

Минимальная эссенциальная среда «Игла» с добавлением красителя фенолового красного (используется только для смывания исследуемой химической продукции), подогретая до 32 °C.

Раствор натрия флуоресцеина (Na-флуоресцеина) в DPBS с концентрацией 4 мг/мл для исследования жидкой или 5 мг/мл для исследования твердой химической продукции.

Г.4 Подготовка исследуемой химической продукции

Оптимальным решением для всех случаев является приготовление свежих растворов исследуемой химической продукции непосредственно в день ее использования.

Г.4.1 Жидкая химическая продукция, не обладающая поверхностно-активными свойствами

Жидкая химическая продукция, как правило, исследуется без предварительного разбавления. Тем не менее, при наличии соответствующих указаний, водорастворимая химическая продукция перед исследованием разбавляется 0,9%-ным раствором хлорида натрия, дистиллированной водой либо иным растворителем, о котором известно, что он не оказывает нежелательного влияния на испытательную систему.

Г.4.2 Твердая химическая продукция, не содержащая поверхностно-активных веществ

Твердая химическая продукция, не содержащая поверхностно-активных веществ, должна быть приготовлена в виде 20%-ных (масса/объем) растворов или суспензий в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, дистиллированной воде или ином растворителе, не оказывающем нежелательного влияния на испытательную систему.

Г.4.3 Сурфактанты

Твердые и концентрированные жидкие сурфактанты должны быть приготовлены и испытаны в виде 10%-ного (масса/объем) раствора в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, дистиллированной воде или другом растворителе, о котором достоверно известно, что он не оказывает нежелательного влияния на испытательную систему. В обоснованных случаях при разбавлении концентрированных жидких сурфактантов допускается использовать другие соотношения вещества и разбавителя.

Г.4.4 Продукция, содержащая сурфактанты

Продукция, содержащая сурфактанты (т.е. состав продукции), может исследоваться либо в исходном состоянии, либо с добавлением 0,9%-ного раствора хлорида натрия, дистиллированной воды или другого растворителя, о котором достоверно известно, что он не оказывает нежелательного влияния на испытательную систему. Так, например, если очищающие растворы на основе сурфактантов, поставляемые в концентрации, рассчитанной на их непосредственное использование конечным пользователем, обычно не требуют разбавления перед исследованием, то сильно концентрированные жидкое мыло, шампуни, гели для мытья требуется предварительно разбавить с целью получения рекомендованной для использования конечным пользователем концентрации либо с целью воспроизведения условий, в которых сурфактант наиболее полно проявляет свои свойства.

Г.5 Контрольные пробы

Г.5.1 Отрицательная контрольная проба

При проведении повседневных исследований включают отрицательную контрольную пробу (в качестве которой могут выступать, например, деионизированная или дистиллированная вода или 0,9%-ный раствор хлорида натрия) для обеспечения возможности выявления неспецифических изменений в испытательной системе, а также определения базовых (исходных) значений измеряемых показателей для последующей оценки данных анализа. Кроме того, включение в эксперимент отрицательной контрольной пробы позволяет убедиться, что наблюдаемые нежелательные последствия в действительности не были связаны с ненадлежащими условиями проведения испытания.

Г.5.2 Контрольная проба растворителя/вещества-носителя

При исследовании разбавленной химической продукции в эксперимент дополнительно включают контрольную пробу используемого растворителя/вещества-носителя с целью выявления неспецифических изменений в испытательной системе, а также определения базовых (исходных) значений измеряемых показателей для последующей оценки данных анализа. Только растворитель/вещество-носитель, для которого подтверждено отсутствие отрицательного влияния на испытательную систему, может использоваться в процессе исследования. Соответственно, испытания контрольной отрицательной пробы и пробы растворителя рекомендуется проводить параллельно в целях обнаружения отклонений, потенциально обусловленных нежелательным влиянием растворителя.

Г.5.3 Положительная контрольная проба

Испытания исследуемой химической продукции, о которой известно, что она вызывает положительный результат, включают в каждый эксперимент для параллельного положительного контроля, позволяющего оценить целостность испытательной системы и правильность проведения испытания. Тем не менее, чтобы обеспечить возможность учитывать изменчивость во времени, результат, получаемый при положительном контроле, не должен быть слишком завышенным.

Примерами положительных контрольных проб для жидкостей могут служить 100%-ный этанол и 100%-ный диметилформамид. Примером положительной контрольной пробы для твердой химической продукции в свою очередь может служить 20%-ный (масса/объем) раствор имидазола в 0,9%-ном растворе хлорида натрия.

Г.5.4 Эталонная химическая продукция (если используется)

Эталонную химическую продукцию целесообразно использовать при исследовании неизвестной химической продукции, представляющей определенный класс химической продукции, для оценки ее способности вызывать раздражение глаз или при исследовании конкретного вещества, способного вызывать такое раздражение, для оценки его относительной раздражающей способности в пределах определенного диапазона раздражающего воздействия. Использование эталонной химической продукции, физико-химические свойства которой (например, цвет, агрегатное состояние, вязкость и т.п.) аналогичны свойствам исследуемой химической продукции, способствует более точной оценке патологических изменений последней. Эталонная химическая продукция должна обладать следующими свойствами:

• происхождением из стабильного и надежного источника(ов);
• структурным и функциональным сходством с классом исследуемой продукции;
• хорошо изученными физико-химическими характеристиками;
• наличием вспомогательных данных об известных вызываемых реакциях in vivo;
• известным уровнем активности в диапазоне ожидаемого ответа.

Г.6 Структура эксперимента

Г.6.1 Условия отбора и транспортирования образцов глаз крупного рогатого скота

Образцы глаз крупного рогатого скота обычно отбирают на местной скотобойне, где их извлекают из тел животных сразу же после их убоя. Данную операцию необходимо выполнять с осторожностью, чтобы не допустить повреждения роговицы извлекаемых образцов. Извлеченные из тела образцы должны быть полностью погружены в раствор HBSS, которым наполняют контейнеры подходящей вместимости; их последующее транспортирование в лабораторию должно осуществляться таким образом, чтобы не допустить порчи и/или бактериального заражения образцов. Поскольку образцы глаз отбираются в процессе убоя, на них могут присутствовать кровь и иные биологические субстанции, в том числе бактерии и другие микроорганизмы. В этой связи важно свести вероятность заражения тканей, предназначенных для проведения исследований, к минимуму (например, сохранять контейнер с образцами глаз на «жидком льду» (т.е. в водо-ледяной смеси) во время отбора и транспортирования, добавлять в раствор HBSS, в котором транспортируются образцы, антибиотики (например, пенициллин в концентрации 100 МЕ/мл и стрептомицин в концентрации 100 мкг/мл)). Для предотвращения заражения грибами в HBSS может добавляться фунгизон. Следует позаботиться о том, чтобы временной интервал между отбором образцов глаз и использованием полученной роговицы для исследований также был минимальным (оптимально образцы должны быть отобраны и использованы в один и тот же день) и имелись достаточные основания утверждать, что он не оказывает влияния на результаты анализа.

Г.6.2 Получение образцов роговицы

Поскольку извлеченные глаза (цельные глазные яблоки) доставляются со скотобойни большими партиями как сырье, значительная их часть впоследствии отбраковывается испытательной лабораторией по причине его ненадлежащего качества. Пригодность получаемых из него образцов роговичных тканей оценивается многократно на протяжении всего процесса подготовки к исследованиям, начиная от первичной приемки цельных глазных яблок и заканчивая последними предшествующими эксперименту измерениями прозрачности препарированной роговицы. Таким образом, в качестве соответствующей требованиям испытательной системы для проведения исследований по методу BCOP могут рассматриваться только установленные в специальные держатели образцы роговицы, которые были признаны удовлетворяющими применяемым критериям качества на всех обязательных этапах подготовки.

a) Перед препарированием каждое цельное глазное яблоко подвергают тщательному макроскопическому анализу путем внешнего осмотра. Образы с нежелательными дефектами, такими как помутнение, царапины и признаки неоваскуляризации, отбраковывают.

b) Образцы глаз, при предварительном обследовании которых не выявлено указанных дефектов, подвергают дальнейшей обработке. С этой целью аккуратно удаляют роговицу с каждого отобранного глаза, а именно: вначале выполняют скальпелем надрез на расстоянии 2 — 3 мм от наружного края роговицы, а затем обрезают роговицу по кругу препаровальными ножницами, оставляя узкую каемку склеры для удобства обращения с вырезанным таким образом диском. Осторожно отделяют от роговицы радужную оболочку и хрусталик, чтобы на препарированном образце не осталось фрагментов этих тканей. При выполнении описанных выше операций особое внимание уделяют тому, чтобы не повредить эпителий и эндотелий отобранной для исследования роговицы.

c) Укладывают извлеченные образцы роговицы в чашки Петри с раствором HBSS, где они сохраняются до установки их в держатели. Непосредственно перед установкой в держатели образцы еще раз проверяют на отсутствие нежелательных дефектов. В случае выявления на данном этапе дефектов, не замеченных ранее, образцы роговицы, на которых они были обнаружены, также отбраковываются. В держателях закрепляют только такие образцы, которые без нареканий прошли все предварительные этапы проверки. Каждый используемый для роговицы держатель должен иметь свой уникальный номер, позволяющий в дальнейшем безошибочно идентифицировать и отслеживать каждый исследуемый образец роговицы после установки его в держатель.

d) Закрепляют образцы роговицы в держателях (по одному образцу в держателе). Для этого образец располагают эндотелиальной стороной вниз на уплотнительном кольце задней камеры. Накрывают образец передней камерой и соединяют две камеры вместе с помощью крепежных винтов. В процессе сборки держателя следят за тем, чтобы камеры не смещались друг относительно друга, так как при их перемещении может быть повреждена роговица.

e) Заливают в обе камеры свежеприготовленную минимальную эссенциальную среду (MEM) (в количестве приблизительно 5 мл). Первой всегда должна наполняться задняя камера, так как это помогает вернуть роговице ее естественную выпуклую форму. При заполнении любыми жидкостями задней камеры следует соблюдать особую осторожность, чтобы не допустить образования в камере пузырьков воздуха, а также свести к минимуму воздействие касательных сил на эндотелиальный слой роговицы.

f) Герметизируют обе камеры специальными пробками, входящими в комплект держателя.

g) Образцы роговицы инкубируют в вертикальном положении при температуре (32 +/- 1) °C в течение не менее 60 мин для достижения теплового равновесия с используемой эссенциальной средой, что будет способствовать обеспечению их нормальной метаболической активности.

h) По окончании первого 1-часового периода инкубации все образцы снова проверяют на наличие дефектов, под которыми понимаются образовавшиеся после последней проверки разрывы или складки. Образцы с дефектами отбраковывают.

Г.6.3 Контроль выбора роговицы и показатели ее непрозрачности

Окончательный этап, необходимый для одобрения образцов роговицы к дальнейшим исследованиям, предусматривает получение объективной оценки степени непрозрачности роговицы; а именно в процессе исследования могут быть использованы только такие образцы роговицы, исходные значения непрозрачности которых составляют <= 7 применяемых единиц непрозрачности (в соответствии с показаниями калиброванного специального денситометра).

a) Для этого по истечении 1-часового периода инкубации эссенциальную среду из обеих камер каждого держателя (начиная с передней камеры) удаляют и заменяют аналогичным количеством свежей MEM.

b) Выполняют первичные измерения непрозрачности каждого образа роговицы, используя рекомендованный денситометр или подобный ему прибор, прошедший надлежащую калибровку в соответствии с указаниями изготовителя, и записывают полученные показания. Установленные таким образом исходные значения непрозрачности в дальнейшем используют при вычислении конечных значений непрозрачности соответствующих образцов роговицы. Лаборатория должна обеспечивать надлежащее функционирование денситометра каждый раз при его эксплуатации.

c) Все образцы роговицы, имеющие макроскопические повреждения тканей либо значения непрозрачности > 7 единиц, подлежат отбраковке.

d) Рассчитывают общее среднее значение непрозрачности для всех образцов роговицы.

e) Отбирают не менее трех образцов со значениями непрозрачности, близкими к среднему значению для всех роговиц, для проведения отрицательного контроля (или контроля растворителя/вещества-носителя). Оставшиеся образцы роговицы распределяют по сериям, обрабатываемым исследуемой химической продукцией и предназначенным для проведения положительного контроля. Порядок утилизации неиспользуемых образцов роговицы должен быть определен заранее.

Г.6.4 Серии обрабатываемых образцов

Для обработки раствором или суспензией каждой исследуемой химической продукции используют не менее трех отобранных образцов роговицы. Кроме того, не менее трех образцов роговицы из расчета на каждый эксперимент обрабатывают положительной контрольной пробой и не менее трех других образцов — отрицательной контрольной пробой. Если в день проведения исследования используется эталонная химическая продукция, ее воздействию также следует подвергнуть не менее трех отобранных образцов роговицы.

Используемые способы нанесения исследуемой химической продукции могут различаться в зависимости от физического состояния и химической природы этой продукции (жидкая продукция или сурфактант по сравнению с твердой продукцией, не содержащей сурфактант). Способ закрытой камеры, как правило, применяется для исследований жидкостей, которые не обладают или обладают лишь незначительной вязкостью, тогда как способ открытой камеры обычно предназначен для исследований полувязких и вязких жидкостей, а также неразведенной твердой продукции. Способ открытой камеры предусматривает свободный доступ к наружной стороне роговицы для нанесения исследуемой продукции, трудно поддающейся дозированию с помощью пипетки и ее последующему удалению.

Г.6.5 Обработка роговицы и измерения прозрачности

Г.6.5.1 Способ закрытой камеры для использования невязкой и слабовязкой жидкой исследуемой химической продукции и продукции, содержащей сурфактанты

a) Записывают исходные значения непрозрачности и наносят на каждую камеру соответствующую маркировку для обозначения используемой контрольной пробы или исследуемой химической продукции. Непосредственно перед обработкой удаляют эссенциальную среду из передней камеры через отверстия для заполнения, используя для этой цели подходящее аспирационное оборудование (например, шприц большой вместимости с толстой иглой или вакуумный насос).

b) Добавляют контрольную пробу или исследуемую химическую продукцию в количестве 0,75 мл (либо, если этого недостаточно, в ином количестве, позволяющем полностью покрыть образец роговицы) в переднюю камеру через отверстия при помощи микропипетки. Снова закрывают отверстия пробками.

c) Поворачивают держатели таким образом, чтобы образцы роговицы располагались горизонтально. При выполнении этой операции держатели осторожно покачивают в разные стороны для обеспечения равномерного распределения контрольной пробы или исследуемой химической продукции по всей поверхности роговицы.

d) Оставляют держатели с образцами для инкубирования в горизонтальном положении при температуре (32 +/- 1) °C на (10 +/- 1) мин. Выбор другого времени экспозиции допускается при наличии соответствующего обоснования.

e) Удаляют из передней камеры держателя контрольную пробу или исследуемую химическую продукцию через отверстия и промывают эпителий роговицы не менее трех раз (по крайней мере до исчезновения видимых остатков исследуемой продукции), порциями приблизительно по 2 — 3 мл свежей готовой MEM (с добавлением красителя фенолового красного в качестве индикатора эффективности смывания кислотных или щелочных материалов). На завершающем этапе эпителий роговицы промывают свежей готовой MEM (без красителя фенолового красного, чтобы гарантировать его отсутствие на образцах при выполнении измерений непрозрачности). Если полностью удалить видимые остатки исследуемой химической продукции не удается, этот факт следует надлежащим образом документировать. Снова заполняют переднюю камеру свежей готовой MEM (без добавления красителя фенолового красного).

f) Измеряют значения непрозрачности всех образцов роговицы после обработки исследуемой химической продукцией и записывают полученные результаты. Подвергают каждый образец внешнему осмотру, записывая соответствующие результаты наблюдений (например, сведения о неравномерном помутнении образца, отслаивании тканей, присутствии остатков исследуемой химической продукции).

g) Оставляют держатели с образцами для инкубирования в вертикальном положении (передней камерой вперед) при температуре (32 +/- 1) °C на (120 +/- 10) мин. Выбор другого времени, в течение которого образцы выдерживаются после экспозиции, допускается при наличии соответствующего обоснования.

h) Записывают результаты измерений непрозрачности всех образцов роговицы после инкубирования с целью последующего использования при вычислении конечных значений непрозрачности этих образцов. Подвергают каждый образец внешнему осмотру и записывают соответствующие наблюдения. Особое внимание при этом обращают на неравномерное помутнение образцов, отслаивание тканей, присутствие остатков исследуемой химической продукции и т.п.

Г.6.5.2 Способ открытой камеры для использования полувязкой и вязкой жидкой исследуемой химической продукции и продукции, содержащей сурфактанты

a) Записывают исходные значения непрозрачности и наносят на каждую камеру соответствующую маркировку для обозначения используемой контрольной пробы или исследуемой продукции. Непосредственно перед обработкой удаляют эссенциальную среду из передней камеры через дозировочные отверстия.

b) Снимают с передних камер всех держателей с образцами стеклянные окошки с уплотнительным кольцом и располагают держатели в горизонтальном положении (передней камерой вверх).

c) Последовательно добавляют в передние камеры держателей исследуемую химическую продукцию, выдерживая постоянный временной интервал величиной от 15 до 30 с перед добавлением продукции в следующую камеру. Наносят контрольную пробу или исследуемую химическую продукцию в количестве приблизительно 0,75 мл (либо, если этого недостаточно, в ином количестве, позволяющем полностью покрыть образец роговицы) непосредственно на поверхность эпителия роговицы при помощи микропипетки или используя иное подходящее приспособление, например лопатку. Располагают держатели с образцами в горизонтальном положении (передней камерой вверх).

d) Если наполнение микропипетки вязким веществом вызывает трудности, ее можно наполнить, предварительно набрав исследуемое вещество в шприц. После этого кончик пипетки прямого вытеснения с регулируемым объемом вставляют в дозирующий наконечник шприца, при этом продукция для испытаний нагнетается под давлением. По мере нажатия на шток шприца поршень пипетки поднимается. Если в кончике пипетки образуются пузырьки, исследуемую продукцию выдавливают наружу и повторяют процесс сначала до тех пор, пока наконечник не удастся наполнить без пузырьков. Описанный подход следует применять для всей продукции, которую сложно втягивать пипеткой (например, такой как гели, зубные пасты или кремы для лица).

e) В случае необходимости сразу после нанесения исследуемой продукции держатели с образцами слегка покачивают, наклоняя их в ту или иную сторону, для более равномерного растекания продукции по всей поверхности роговицы.

f) По завершении обработки всех образцов стеклянные окошки камер возвращают на прежнее место и уплотняют кольцами.

g) Оставляют держатели с образцами для инкубирования в горизонтальном положении при температуре (32 +/- 1) °C на (10 +/- 1) мин. Выбор другого времени экспозиции допускается при наличии соответствующего обоснования.

h) Непосредственно перед истечением заданного периода с передних камер держателей удаляют стеклянные окошки с уплотнительными кольцами.

i) По окончании экспозиции последовательно промывают каждый образец роговицы не менее трех раз (по крайней мере до исчезновения видимых остатков исследуемой химической продукции), с соблюдением тех же временных интервалов между отдельными образцами, которые выдерживались при нанесении продукции. С этой целью при помощи шприца впрыскивают у задней стенки передней камеры достаточное количество свежей готовой MEM с добавлением фенолового красного, создавая при этом эффект вихря или водоворота, благодаря которому исследуемая продукция постепенно смывается с поверхности роговицы. Ни в коем случае не следует направлять поток жидкости непосредственно на роговицу. От остатков исследуемой продукции, которую не удалось смыть с роговицы вихревым» методом, избавляются, наполняя камеру эссенциальной средой, при этом уровень жидкости в ней должен быть выше поверхности роговицы (в процессе наполнения жидкость, как и в начале промывки, должна подаваться у задней стенки камеры). Смывают остатки продукции слабой струей, пропуская ее через образовавшийся слой жидкости и направляя на те участки роговицы, где сохранились данные остатки. На завершающем этапе эпителий роговицы промывают свежеприготовленной MEM (без красителя фенолового красного). Если спустя несколько попыток остатки исследуемой продукции все еще присутствуют на образце, этот факт документируют и переходят к следующему этапу.

j) После окончательного удаления остатков исследуемой продукции и промывания всех образцов на передние камеры держателей снова устанавливают стеклянные окошки с уплотнительными кольцами. Продолжают промывку образцов в порядке, предусмотренном для метода закрытой камеры, как было указано выше (см. Г.6.5.1, перечисление e)).

k) Измеряют значения непрозрачности всех образцов роговицы после обработки исследуемой химической продукцией и записывают полученные результаты. Подвергают каждый образец внешнему осмотру, записывая соответствующие результаты наблюдений (например, сведения о неравномерном помутнении образца, отслаивании тканей, присутствии остатков исследуемой химической продукции).

l) Оставляют держатели с образцами для инкубирования в вертикальном положении (передней камерой вперед) при температуре (32 +/- 1) °C на (120 +/- 10) мин. Выбор другого времени экспозиции допускается при наличии соответствующего обоснования.

m) Записывают результаты измерений непрозрачности всех образцов роговицы с целью последующего использования при вычислении конечных значений непрозрачности этих образцов. Подвергают каждый образец внешнему осмотру и записывают соответствующие наблюдения. Особое внимание при этом обращают на неравномерное помутнение образцов, отслаивание тканей, присутствие остатков исследуемой химической продукции и т.п.

Г.6.5.3 Твердая исследуемая химическая продукция, не содержащая сурфактанты

Твердую исследуемую химическую продукцию, не содержащую сурфактанты, наносят на образцы роговицы в порядке, описанном выше, с некоторыми отличиями, а именно:

• твердую продукцию наносят на роговицу в виде 20%-ного (масса/объем) раствора или суспензии, приготовленных с использованием соответствующего растворителя/вещества носителя (например, стерильной деионизированной воды);
• образцы с твердой исследуемой продукцией инкубируют при температуре (32 +/- 1) °C в течение (240 +/- 10) мин;
• дополнительный период инкубирования после воздействия исследуемой химической продукцией не предусматривается. Соответственно, сразу по окончании процесса промывки в обе камеры держателя (начиная с задней) снова заливают свежую готовую MEM и выполняют заключительные измерения непрозрачности образцов. В процессе выполнения этих измерений осуществляют также внешний осмотр каждого образца роговицы и при необходимости записывают соответствующие наблюдения. Особое внимание обращают на неравномерное помутнение образцов, отслаивание тканей, присутствие остатков исследуемой химической продукции и т.п. Сразу после получения результатов измерений непрозрачности проводят определение проницаемости роговицы.

Г.6.6 Нанесение флуоресцеина натрия

После выполнения заключительных измерений непрозрачности образцов проводят определение их проницаемости путем окрашивания роговицы раствором флуоресцеина натрия. Раствор флуоресцеина натрия наносят на поверхность роговицы одним из двух описанных ниже способов, в зависимости от свойств исследуемой химической продукции:

Жидкая исследуемая химическая продукция и сурфактанты, продукция, содержащая сурфактанты:

a) удаляют эссенциальную среду из обеих камер держателя (начиная с передней камеры);

b) наполняют заднюю камеру свежей готовой MEM и помещают в переднюю камеру 1 мл раствора флуоресцеина натрия с концентрацией 4 мг/мл;

c) снова закрывают отверстия в верхней части обеих камер пробками.

Твердая исследуемая химическая продукция, не содержащая сурфактанты:

a) удаляют эссенциальную среду только из передней камеры держателя, заменяя ее 1 мл раствора флуоресцеина натрия с концентрацией 5 мг/мл.

b) снова закрывают отверстия в верхней части обеих камер специальными пробками.

Г.6.7 Определение проницаемости

a) После добавления флуоресцеина натрия в переднюю камеру и герметизации обеих камер держатели с образцами переворачивают в горизонтальное положение, передней камерой вверх. При необходимости держатели слегка покачивают, наклоняя их в ту или иную сторону, для более равномерного распределения раствора флуоресцеина натрия по всей поверхности роговицы. Оставляют держатели с образцами для инкубирования в горизонтальном положении при температуре (90 +/- 5) °C на (32 +/- 1) мин.

b) По истечении 90-минутного периода инкубирования удаляют эссенциальную среду из задней камеры каждого держателя, помещая ее в пробирки, предварительно промаркированные в соответствии с нумерацией держателей. Важно, чтобы из задней камеры была слита как можно большая часть жидкости и чтобы она затем была тщательно перемешана в пробирке с целью получения репрезентативной пробы, пригодной для измерений ОП490.

c) По завершении операций, связанных с определением проницаемости роговицы для флуоресцеина натрия, использованные образцы могут быть помещены в раствор подходящего фиксирующего реактива (например, в 10%-ном НБФ) при комнатной температуре на срок не менее 24 ч, чтобы в дальнейшем при необходимости или при наличии соответствующих указаний обеспечить возможность их гистологического исследования. Необходимо следить за тем, чтобы образцы роговицы оставались влажными в период времени между извлечением их из держателей и началом процедуры фиксации (погружением в фиксирующий раствор) (см. 3.4.2).

d) Если для измерений оптической плотности служит микропланшетный ридер, то в соответствующие лунки 96-луночного планшета помещают по 360 мкл отработанной среды из каждой пробирки. Стандартная компоновка планшета позволяет задействовать по две лунки из расчета на каждый образец роговицы. В первую лунку, таким образом, помещают неразбавленную пробу от каждого исследуемого образца. После переноса на планшет всех имеющихся проб эссенциальной среды выполняют измерения значений их оптической плотности ОП490 и записывают полученные результаты. Если полученные значения ОП490 для любого из образцов роговицы (обработанного контрольной пробой или исследуемой химической продукцией) выходят за пределы линейного диапазона используемого оборудования, пробы эссенциальной среды в обязательном порядке разбавляют так, чтобы эти значения находились внутри допустимого диапазона.

Примечание - Линейный диапазон измерений поглощения у различных микропланшетных ридеров может отличаться. В этой связи каждая лаборатория должна самостоятельно установить верхний измеряемый предел поглощения (в линейном диапазоне), обеспечиваемый микропланшетным ридером, который она использует в своей работе. Так, например, специалисты IIVS выяснили, что значения ОП490, превышающие 1,500, могут не попадать в линейный диапазон эксплуатируемой институтом модели ридера, поэтому было принято решение о соответствующем разбавлении проб, чтобы избежать выпадения значений ОП490 за пределы этого диапазона.

Для большинства случаев разбавление пробы в соотношении 1:5 является достаточным, однако на практике может потребоваться использование разбавления в большем соотношении. Разбавление приготавливают из исходной пробы среды и помещают 360 мкл этого разбавления во вторую лунку планшета, предназначенную для соответствующего образца роговицы. Проводят повторное считывание значений ОП490 для лунок с разбавленными и неразбавленными пробами и записывают полученные данные. Эти значения, полученные путем повторного считывания, в дальнейшем используют при выполнении всех последующих вычислений. Если их величины составляют менее 1,500, они считаются пригодными для вычисления значений показателя проницаемости образцов.

e) В случае измерений оптической плотности при помощи спектрофотометра, его соответствующим образом настраивают для определения значений ОП490, используя в качестве исходного образца для установки нуля готовую MEM. Перед началом анализа проницаемости образцов роговицы по методу BCOP приготавливают и анализируют две пробы для контроля качества, которыми является раствор флуоресцеина натрия, чтобы убедиться, что ранее построенная кривая градуировки спектрофотометра (см. примечание ниже) остается приемлемой для данной продукции. Если средние значения полученных показаний для таких контрольных проб выходят за пределы допустимого диапазона кривой градуировки для флуоресцеина натрия, то до начала анализа образцов по методу BCOP для него строят новую градуировочную кривую. Если же средние значения показаний находятся в пределах допустимого диапазона градуировочной кривой, то переходят непосредственно к определению проницаемости образцов в соответствии с методом BCOP. Для этого переносят одну аликвоту образовавшейся смеси на основе эссенциальной среды из задней камеры держателя роговицы в фотометрическую кювету, выполняют измерения поглощения, используя спектрофотометр, и записывают полученные результаты. Все растворы, значения оптической плотности ОП490 которых выходят за пределы линейного диапазона спектрофотометра, подлежат разбавлению готовой MEM, с последующим повторным считыванием показаний. Эти шаги повторяют до тех пор, пока определяемые значения ОП490 не будут находиться в необходимом диапазоне. Описанную последовательность операций выполняют для каждого образца при исследованиях по методу BCOP, тщательно ополаскивая кювету(ы) перед помещением в нее новой пробы, до тех пор пока соответствующие значения оптической плотности не будут установлены и документированы для всех испытуемых образцов роговицы.

Примечание - Если испытания проводятся впервые, то предварительно должна быть построена соответствующая кривая градуировки спектрофотометра на основе результатов анализа последовательных разбавлений раствора натрия флуоресцеина в MEM. Кривую градуировки строят и используют для определения линейного диапазона спетрофотометра и уточнения таким образом верхнего допустимого предела линейного диапазона поглощения.

Г.6.8 Проведение гистологического исследования

Гистологический анализ роговицы может быть полезен для выявления повреждений в слоях клеток, которые не приводят к их заметному помутнению или к существенному изменению их проницаемости, а также может применяться в случаях, когда значения показателей, определяемых при проведении исследований по методу BCOP, носят пограничный характер. Кроме того, результаты гистологических исследований могут способствовать определению глубины и тяжести повреждения различных слоев роговицы, что в свою очередь помогает оценить вероятность ее последующего восстановления. Джетер [79], Маурер [85], [38] и др. убедительно доказали, что для ряда химической продукции различных классов глубина повреждений, наблюдаемых в первые часы после ее контакта с роговицей, позволяет подготовить достаточно достоверный прогноз относительно степени выраженности и длительности сохранения патологических изменений, обусловленных ее воздействием. Так, например, если повреждения охватывают только эпителий роговицы кролика, то это свидетельствует о возможности ее эффективного восстановления, при условии что слой базальных клеток был полностью сохранен. Более глубокие повреждения, достигающие стромы, влекут за собой более существенные последствия, и если при этом они носят сквозной характер и сопряжены с нарушением целостности или утратой эндотелия, то такие последствия можно предварительно охарактеризовать как тяжелые. Аналогичного рода наблюдения в отношении глубины гистологических изменений были сделаны при обработке роговицы рядом антимикробных препаратов, предлагаемых для использования в составе моющих и чистящих средств (их классификация была предварительно проведена методом in vivo), и ее последующем исследовании по методу BCOP [86]. В публикации [92] отмечается, что проведение гистологического анализа образцов роговицы после применения метода BCOP с учетом упомянутой концепции зависимости от глубины повреждений обеспечивает повышение чувствительности метода при определении различных видов агрохимической продукции, способных вызывать серьезное раздражение глаз, на основе одного только показателя IVIS, хотя и с оговоркой о том, что в отношении данной продукции с сильным раздражающим действием эта чувствительность все же остается недостаточной. В ходе исследования должна применяться стандартная схема оценки с использованием формализованной совокупности терминов, принятых в области патологии, для обозначения наблюдаемых явлений.

a) Срезы роговицы проверяют на наличие изменений в тканях эпителия, стромы и эндотелия. Особое внимание уделяют оценке глубины и степени повреждений стромальных элементов. Состояние тканей образцов, которые контактировали с исследуемой химической продукцией, сравнивают с состоянием тканей образцов, обработанных отрицательными контрольными пробами.

b) Образцы роговицы, использовавшиеся для целей отрицательного и положительного контроля в рамках применения метода BCOP, при проведении гистологического анализа обрабатывают вместе с образцами, подвергавшимися воздействию исследуемой химической продукции, в одной серии, что позволяет использовать результаты гистологического анализа образцов роговицы, обработанных отрицательной контрольной пробой для оценки качества/приемлемости всех подготовленных срезов. Перед подготовкой результатов гистологического анализа образцов, взаимодействовавших с исследуемой продукцией, необходимо провести оценку общего качества окрашенных срезов, чтобы получить представление о характере и масштабе артефактов, которые могли возникнуть в образцах как в процессе проведения исследования по методу BCOP, так и при подготовке к гистологическим исследованиям. С этой целью срезы, обработанные отрицательной контрольной пробой, проверяют на наличие артефактов, которые могут иметь место на уровне всей серии. Дополнительно они являются примером «нормального» уровня окрашивания (насыщения каждого слоя/типа клеток гематоксилином эозином), ненарушенной структуры и типичной толщины тканей.

c) Исследуемые срезы тщательно изучают с использованием микроскопа. Каждый поперечный срез каждой роговицы в составе обрабатываемой группы изучают вначале при слабом увеличении для оценки состояния тканей в целом до проведения более тщательного анализа. Осмотр срезов роговицы проводят по всей площади сечения между обеими областями деформации (под областью деформации следует понимать наружный периметр роговицы, вдоль которого она прижимается уплотнительным кольцом внутри камеры держателя при проведении эксперимента по методу BCOP; эти области отчетливо выделяются на срезах во время гистологического наблюдения). Ввиду присутствия случайных артефактов, возникших в процессе подготовки, отдельные срезы тканей могут оказаться непригодными для получения гистопатологических данных.

d) Срезы образцов, на которые воздействовали исследуемой химической продукцией или положительной контрольной пробой, проверяют на наличие изменений в клеточной морфологии и структуре тканей. Поскольку при проведении исследований по методу BCOP продукция наносится местно на наружную поверхность эпителия роговицы, обнаружение каких-либо изменений или следов токсического воздействия наиболее вероятно в тканях эпителия, а при более глубоком проникновении продукции в толщу роговицы также в нижележащих слоях тканей. Таким образом, наблюдение за изменениями в тканях образцов роговицы после испытаний должно начинаться с поверхностных слоев, представленных чешуйчатым эпителием, в месте, где произошло химическое воздействие, и последовательно продолжаться в более глубоких слоях вплоть до эндотелия. Если существенные изменения в тканях роговицы или нарушения ее структуры заметны сразу, то распознавание иного рода последствий, таких как окрашивание клеток или клеточных ядер, может потребовать дополнительного внимания. Основная информация, которую требуется получить при анализе, это наблюдаемая глубина изменений, которые появляются в образцах роговицы крупного рогатого скота. Вместе с тем масштаб многих видимых изменений не всегда удается достоверно оценить, поэтому в числе результатов исследования может указываться частота подобных изменений по сравнению с образцами роговицы, обработанными отрицательной контрольной пробой. При интерпретации результатов исследования следует обеспечивать возможность сопоставления всех выявленных изменений для подготовки окончательного заключения.

e) Соответствующие участки срезов могут быть зафиксированы на фотографиях и приобщены к отчету исключительно в качестве свидетельства, иллюстрирующего описанные в отчете изменения.

Г.6.9 Уход за держателями роговицы

По завершении исследования все держатели разбирают и производят очистку их частей в следующем порядке:

a) обильно увлажняют поверхности задней и передней камер не оставляющим следов очищающим раствором с использованием моющего средства для ухода за медицинскими и лабораторными инструментами (например, Alconox Liquinox® );

b) замачивают пробки камер, уплотнительные кольца и крепежные винты в 70%-ном этаноле. Тщательно промывают пробки, уплотнительные кольца и крепежные винты горячей водой из-под крана и оставляют для просушки на воздухе перед повторной сборкой камер;

c) очищают наружные и внутренние поверхности всех предварительно увлажненных задних и передних камер при помощи жесткой губки. Тщательно промывают передние и задние камеры теплой водой перед последующей сборкой;

d) компонуют по номерам задние камеры с соответствующими им передними камерами, устанавливают на место уплотнительное кольцо; устанавливают крепежные винты и вкручивают их в переднюю камеру.

Г.7 Оценка результатов исследования

Результаты определения показателей непрозрачности и проницаемости флуоресцеина объединяют при помощи полученной эмпирическим путем формулы с целью вычисления общего показателя раздражающей способности для каждой исследуемой химической продукции.

Г.7.1 Непрозрачность

a) Вычисляют изменение показателя непрозрачности роговицы для каждого отдельного образца (включая образец, обработанный отрицательной контрольной пробой) путем вычитания исходного значения непрозрачности из конечного значения непрозрачности после проведенной обработки. Вычисляют усредненное значение изменения непрозрачности для образцов роговицы, обработанных отрицательной контрольной пробой.

b) Вычисляют скорректированные значения непрозрачности для всех обработанных продукцией образцов роговицы, образцов с положительной контрольной пробой и образцов с пробой растворителя/вещества-носителя (если используется) путем вычитания усредненного значения изменения непрозрачности для образцов с отрицательной контрольной пробой из значения изменения непрозрачности для каждого обработанного образца, образца с положительной контрольной пробой или образца с пробой растворителя/вещества-носителя.

c) Вычисляют среднее значение непрозрачности для каждой обработанной группы образцов путем усреднения скорректированных значений непрозрачности для образцов, обработанных химической продукцией.

Г.7.2 Проницаемость

При использовании микропланшетного ридера

a) Вычисляют среднее значение ОП490 для холостых (пустых) лунок планшета. Вычитают среднее значение ОП490 для холостых лунок из неисправленного значения ОП490 (поправка на холостой опыт).

b) Если проводилось разбавление, поправку на холостой опыт в значение ОП490 вносят до применения к показаниям прибора коэффициента разбавления. Умножают скорректированное значение ОП490 на коэффициент разбавления (например, на 5 при разбавлении в соотношении 1:5).

c) Вычисляют конечное скорректированное значение ОП490 для каждого образца роговицы путем вычитания среднего значения ОП490 образцов, обработанных отрицательной контрольной пробой, из значения ОП490 каждого обработанного образца.

d) Конечное скорректированное значение ОП490 = (неисправленное значение ОП490 — среднее значение ОП490 для холостого опыта) — среднее значение ОП490 для отрицательной контрольной пробы с поправкой на холостой опыт.

e) Вычисляют среднее значение ОП490 для каждой обработанной серии путем усреднения конечных скорректированных значений ОП490 для обработанных образцов роговицы в соответствующей серии.

При использовании спектрофотометра

a) Вычисляют скорректированное значения ОП490 для всех обработанных образцов роговицы, образцов с положительной контрольной пробой или пробой растворителя/вещества-носителя путем вычитания усредненного значения для образцов с отрицательной контрольной пробой из первоначального значения ОП490 для каждого образца.

b) Конечное скорректированное значение ОП490 = неисправленное значение ОП490 — среднее значение ОП490 для отрицательной контрольной пробы с поправкой на холостой опыт.

c) Вычисляют среднее значение ОП490 для каждой обработанной серии путем усреднения конечных скорректированных значений ОП490 для обработанных образцов роговицы в соответствующей серии.

Г.7.3 Показатель раздражающей способности

a) Используют средние значения непрозрачности и проницаемости роговицы (ОП490) для каждой обработанной серии образцов для вычисления значения показателя раздражающей способности в соответствующей группе.

b) Показатель раздражающей способности (IVIS) = среднее значение непрозрачности + (15 x среднее значение ОП490).

Г.8 Критерии приемлемости испытаний

Результаты испытания считают приемлемыми, если показатель раздражающей способности in vitro, полученный для положительной контрольной пробы, находится в пределах удвоенного стандартного отклонения от ее текущего среднего значения за истекший период, которое должно обновляться не реже чем один раз в три месяца либо при каждом успешном проведении подобного испытания, если испытания такого рода проводятся в лаборатории нерегулярно (т.е. реже одного раза в месяц). При исследовании по методу BCOP 20%-ный (масса/объем) раствор имидазола дает отчетливо выраженный положительный результат (показатель in vitro = 69,7 — 136,2 по данным IIVS [n = 125]; среднее значение = 103, CO = 16). Значения непрозрачности или проницаемости при нанесении отрицательных контрольных проб или контрольных проб растворителя/вещества-носителя должны быть ниже установленного верхнего предела для соответствующих фоновых значений непрозрачности или проницаемости образцов, обрабатываемых такими отрицательными контрольными пробами или контрольными пробами растворителя/вещества-носителя.

Приложение ДА (справочное)

СОПОСТАВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ НАСТОЯЩЕГО СТАНДАРТА СО СТРУКТУРОЙ ПРИМЕНЕННОГО В НЕМ МЕЖДУНАРОДНОГО ДОКУМЕНТА

Таблица ДА.1

Структура настоящего стандарта			Структура международного документа
Разделы	Пункты	Перечисления	Пункты	Перечисления
Введение			1, 2, 3, 4, 5	-
1 1.1
-	4	-	2	-
-		-		2.1
-	6, приложение 1	-		2.2
-	6, приложение 1	-		2.3
-	6, приложение 1	-		2.4
-	6, приложение 1	-		2.5
-	6, приложение 1	-		2.6
-	6, приложение 1	-		2.7
-	6, приложение 1	-		2.8
-	6, приложение 1	-		2.9
-	6, приложение 1	-		2.10
-	6, приложение 1	-		2.11
-	6, приложение 1	-		2.12
-	6, приложение 1	-		2.13
-	6, приложение 1	-		2.14
-	6, приложение 1	-		2.15
-	6, приложение 1	-		2.16
-	6, приложение 1	-		2.17
-	6, приложение 1	-		2.18
-	6, приложение 1	-		2.19
-	6, приложение 1	-		2.20
-	6, приложение 1	-		2.21
-	6, приложение 1	-		2.22
-	6, приложение 1	-		2.23
-	6, приложение 1	-		2.24
-	6, приложение 1	-		2.25
-	6, приложение 1	-		2.26
-	6, приложение 1	-		2.27
-	6, приложение 1	-		2.28
-	6, приложение 1	-		2.29
-	6, приложение 1	-		2.30
-	6, приложение 1	-		2.31
-	6, приложение 1			2.32
-	6, приложение 1	-		2.33
-	6, приложение 1	-		2.34
-	6, приложение 1	-		2.35
-	6, приложение 1	-		2.36
-	6, приложение 1	-		2.37
-	6, приложение 1	-		2.38
-	6, приложение 1	-		2.39
-	6, приложение 1	-		2.40
-	6, приложение 1	-		2.41
-	6, приложение 1	-		2.42
-	6, приложение 1	-		2.43
-	6, приложение 1	-		2.44
-	6, приложение 1	-		2.45
-	6, приложение 1	-		2.46
-	6, приложение 1	-		2.47
-	6, приложение 1	-		2.48
-	6, приложение 1	-		2.49
-	6, приложение 1	-		2.50
-	6, приложение 1	-		2.51
-	6, приложение 1	-		2.52
-	6, приложение 1	-		2.53
-	6, приложение 1	-		2.54
-	6, приложение 1	-		2.55
-	6, приложение 1	-		2.56
-	6, приложение 1	-		2.57
-	6, приложение 1	-		2.58
-	6, приложение 1	-		2.59
-	6, приложение 1	-		2.60
-	6, приложение 1	-		2.61
-	6, приложение 1	-		2.62
-	6, приложение 1	-		2.63
-	6, приложение 1	-		2.64
-	6, приложение 1	-		2.65
-	6, приложение 1	-		2.66
-	6, приложение 1	-		2.67
-	6, приложение 1	-		2.68
-	6, приложение 1	-		2.69
-	6, приложение 1	-		2.70
-	6, приложение 1	-		2.71
-	6, приложение 1	-		2.72
-	6, приложение 1	-		3.1.1
-	7	-		3.1.2
-	8	-		3.2.1
-	9	-		3.2.2
-	10	-		3.3
-	11	-		3.4.1
-	12	-		3.4.2
-	13	-		3.4.3
-	14	-		3.5.1
-	15	-		3.5.2
-	16	-		3.5.3
-	17	-		3.5.4
-	18	-		3.5.5
-	19	-		3.6
-	20	-		3.7.1
-	21	-		3.7.2
-	22	-		3.7.3
-	23	-		3.7.4
-	24	-		3.7.5
-	25	-		3.7.6
-	26	-		3.7.7
-	27	-		3.8.1
-	28	-		3.8.2
-	29	-		3.8.3
-	30	-		3.8.4
-	31	-		3.9.1
-	32	-		3.9.2
-	33	-		3.10.1
-	34	-		3.10.2
-	35	-		4.1.1
-	36	-		4.1.2
-	37	-		4.1.3
-	38	-		4.2.1
-	39	-		4.2.2
-	40	-		4.2.3
-	41	-		4.2.4
-	42	-		4.3
-	43	-		4.4.1
-	44	-		4.4.2
-	45	-		4.5.1
-	46	-		4.5.2
-	47	-		4.5.3
-	48	-		4.5.4
-	49	-		4.5.5
-	50	-		4.6.1
-	51	-		4.6.2
-	52	-		4.6.3
-	53	-		4.6.4
-	54	-		4.6.5
-	55	-		4.6.6
-	56	-		4.6.7
-	57	-		4.6.8
-	58	-		4.6.9
-	59	-		4.6.10
-	60	-		4.6.11
-	61	-		4.6.12
-	62	-		4.6.13
-	63	-		4.6.14
-	64	-		4.7
-	65	-		4.8
-	66	-	Приложение А
-	Приложение 2	-	Приложение Б
-	Приложение 3	-	Приложение В
-	Приложение 4	-	Приложение Г
-	Приложение 5	-	Библиография	Литература

БИБЛИОГРАФИЯ

[1]	Adriaens E., Barroso J., Eskes C., Hoffmann S., McNamee P., Alépée N., Bessou-Touya S., De Smedt A, de Wever B., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Zuang V. (2014). Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of the endpoints evaluated with regard to UN GHS/EU CLP classification. Archives of Toxicology 88, 701 — 723 (Тест Дрейза для оценки серьезного повреждения/раздражения глаз. Значимость определяемых показателей с точки зрения применяемой классификации СГС ООН/EU CLP)
[2]	Balls M., Botham P.A., Bruner L.H., Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicology In Vitro 9, 871 — 929 (Международные валидационные исследования EC/HO по определению альтернатив тесту Дрейза на раздражение глаз)
[3]	Bancroft J.D., Cook H.C. (1994). Manual of Histological Techniques and Their Diagnostic Application. New York: Churchill Livingstone (Руководство по проведению гистологических исследований и их применению в диагностике)
[4]	Bancroft J.D., Gamble M. (2008). Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. (Bancroft & Gamble, eds.) Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier (Теория и практика проведения гистологических исследований)
[5]	Banks W.J. (1993). Applied Veterinary Histology. St. Louis, MO: Mosby-Year Book (Прикладная ветеринарная гистология)
[6]	Barequet I.S., Zohar H.-W., Lavinsky F., Ziv H., Belkin M., Rosner M. (2007). Effect of fourth- generation fluoroquinolones on the healing rate of corneal erosions in an animal model. Cornea 26, 606 — 609 (Влияние фторхинолонов четвертого поколения на скорость заживления эрозий роговицы у животных)
[7]	Billings P.E., Grizzle W.E. (2008). The gross room/surgical cutup. In: Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. (Bancroft & Gamble, eds.). Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier, 75 — 82 (Предварительное/хирургическое препарирование образцов)
[8]	Cazelle E., Eskes C., Hermann M., Jones P., McNamee P., Prinsen M., Taylor H., Wijnands M.V.W. (2014). Suitability of histopathology as an additional endpoint to the isolated chicken eye test for classification of non-extreme pH detergent and cleaning products. Toxicology In Vitro 28, 657 — 666 (Применимость данных гистологического анализа как дополнительного источника информации при проведении исследований с использованием извлеченных образцов глаза курицы с целью классификации моющих и чистящих средств с неэкстремальными значениями pH по степени их опасности для глаз)
[9]	Carrier P., Deschambeault A., Audet C., Talbot M., Gauvin R., Giasson C.J., Auger F.A., Guerin S., Germain L. (2009). Impact of cell source on human cornea reconstructed by tissue engineering, Inves Ophthal. Vis. Sci. 50, 2645 — 2652 (Влияние исходного клеточного материала на характеристики роговицы человеческого глаза, реконструируемой методами тканевой инженерии)
[10]	Cerven D.R., Arp, L.H., Shah, P.V., Moreno, O.M. (1996), A histopathological and cytological evaluation of bovine corneas exposed to anionic or cationic surfactants in a bovine corneal opacity and permeability assay. Poster presented at 35th Society of Toxicology Meeting in Anaheim, CA (Гистопатологическая и цитологическая оценка состояния образцов роговицы глаза при проведении анализа помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота после воздействия анионных или катионных сурфактантов)
[11]	Chamberlain M., Gad S.C., Gautheron P., Prinsen M.K. (1997). Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35, 23 — 27 (Органотипические модели для оценки/прогнозирования раздражающего воздействия на глаза)
[12]	Chen C.-C., Yeh L.-K., Liu C.-Y., Kao W.W.-Y., Samples J.R., Lin S.-J., Hu F.-R., Wang I.-J. (2008). Morphological differences between the trabecular meshworks of zebrafish and mammals. Current Eye Res. 33, 59 — 72 (Морфологические различия трабекулярных сетей рыб рода данио и млекопитающих)
[13]	Cuellar N., Lloyd P.H., Swanson J.E., Merrill J.C., Clear M.L., Mun G., Harbell J.H., Bonnette K.L. (2003). Evaluating the eye irritancy of solvents in a simple fragrance mixture with the bovine corneal opacity and permeability (BCOP) assay. The Toxicologist 72, 312 (Оценка способности растворителей в составе простых ароматических смесей вызывать раздражение глаз по результатам анализа помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота (BCOP))
[14]	DB-ALM Protocol No. 80 (1994). Chicken enucleated eye test (CEET). Available at: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols (Исследования с использованием извлеченного глаза курицы (CEET))
[15]	DB-ALM Protocol No. 124 (1999). Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay — SOP of Microbiological Associates Ltd. Available at: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols (Анализ помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота. СОП компании Microbiological Associates Ltd.)
[16]	Doughty M.J., Petrou S., Macmillan H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73, 2159 — 2165 (Анатомия и морфология образцов роговицы глаз крупного рогатого скота, отбираемых на скотобойне)
[17]	EPA (2003a). Label Review Manual. 3rd ed. EPA 735-B-003-001. Washington, DC, U.S. Environmental Protection Agency (Аналитическое руководство по маркировке)
[18]	EPA (2003b). Good Laboratory Practice Standards. 40 CFR 792. Washington, DC U.S. Environmental Protection Agency (Стандарты надлежащей лабораторной практики)
[19]	EPA (2003c). Good Laboratory Practice Standards. 40 CFR 160. Washington, DC U.S. Environmental Protection Agency (Стандарты надлежащей лабораторной практики)
[20]	EU (2008). Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. Official Journal of the European Union L353, 1 — 1355 (Регламент (ЕС) № 1272/2008 Европейского парламента и Совета от 16 декабря 2008 г. по классификации, маркировке и упаковке веществ и смесей, вносящий изменения и отменяющий Директивы 67/548/ЕЕС и 1999/45/ЕС и вносящий изменения в Регламент (ЕС) № 1907/2006)
[21]	FDA (2003). Good laboratory practice for nonclinical laboratory studies. 21CFR58. Washington, DC, U.S. Food and Drug Administration (Надлежащая лабораторная практика неклинических лабораторных исследований)
[22]	Fischer A.H., Jacobson K.A., Rose J., Zeller R. (2008). Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. CSH Protocols: doi: 10.1101/pdb.prot4989 (Заливка образцов тканей парафином для последующего микротомирования)
[23]	Bancroft J.D., Gamble M. (2008). Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. (Bancroft & Gamble, eds.) Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier ? 121 — 134 (Теория и практика гистологических исследований)
[24]	Gautheron P., Giroux J., Cottin M., Audegond L., Morilla A., Mayordomo-Blanco L., Tortajada A., Haynes G., Vericat J.A., Pirovano R., Tos E.G. Hagemann C., Vanparys P., Deknudt G., Jacobs G., Prinsen M., Kalweit S., Spielmann H. (1994). Interlaboratory assessment of the bovine corneal opacity and permeability (BCOP) assay. Toxicol. In Vitro 8, 381 — 392 (Межлабораторная оценка результатов анализа помутнения и проницаемости образцов роговицы глаз крупного рогатого скота (BCOP))
[25]	Grizzle W.E., Fredenburgh J.L., Myers R.B. (2008). Fixation of tissues. In: Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. (Bancroft & Gamble, eds.). Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier, 53 — 74 (Фиксация образцов тканей)
[26]	Harbell J.W., Mun G., Curren R.D. (2006). Application of histological evaluation to enhance the bovine opacity and permeability (BCOP) assay. Toxicologist 90, 326. Available at: http://www.iivs.org/pages/publication_view.phpdoc_id=135 (Применение методов гистологической оценки для повышения результативности анализа помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота (BCOP))
[27]	ICCVAM (2006a). Background Review Document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Rabbit Eye Test Method. NIH Publication No. 06-4514. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, A5 — A14. Available: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm (Обобщающий вспомогательный документ. Текущий статус методов исследований in vitro для определения веществ, вызывающих разъедание и серьезное раздражение глаз. Метод исследования с использованием извлеченного глаза кролика)
[28]	ICCVAM (2006b). ICCVAM Test Method Evaluation Report: In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Severe Irritants and Corrosives. NIH Publication No.: 07-4517. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/ocutox_docs/OTeval/OTevalrpt.pdf (Отчет об оценке методов исследований. Методы анализа офтальмологической токсичности in vitro для определения веществ, вызывающих серьезное раздражение и разъедание глаз)
[29]	ICCVAM (2010a). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No. 10-7553. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: https://ntp.niehs.nih.gov/pub-health/evalatm/test-method-evaluations/ocular/in-vitro-test-methods/tmer/index.html#Correction-to-the-Report-October-2011- (Отчет об оценке методов исследований. Текущее состояние валидации предлагаемых методов исследований in vitro для определения потенциальной опасности повреждения глаз при воздействии химических веществ и продукции на их основе)
[30]	ICCVAM (2010b). Guidelines for Histopathological Evaluation of Bovine Corneas as an Endpoint of the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Assay (provided by the Institute for In Vitro Sciences, Gaithersburg, MD), In: ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of a Proposed In Vitro Testing Strategy for U.S. Environmental Protection Agency Ocular Hazard Classification and Labeling of Antimicrobial Cleaning Products. NIH Publication No. 10-7513. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at (see Annex G): https://ntp.niehs.nih.gov/pubhealth/evalatm/test-method-evaluations/ocular/amcp/index.html (Руководящие указания по гистологической оценке образцов роговицы глаз в рамках проведения анализа помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота (BCOP))
[31]	Kadar T., Turetz J., Fishbine E., Sahar R., Chapman S., Amir A. (2001). Characterization of acute and delayed ocular lesions induced by sulfur mustard in rabbits. Current Eye Research 22, 42 — 53 (Описание острых и отдаленных деструктивных последствий для глаз при контакте с сернистым ипритом у кроликов)
[32]	Kiernan J.A. (1990). Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice (ED. Kiernan). New York: Pergamon Press (Гистологические и гистохимические методы. Теория и практика)
[33]	Kimura H., Sakamoto T., Hinton D.R., Spee C., Ogura Y., Tabata Y., Ikada Y., Ryan S.J. (1995). A new model of subretinal neovascularization in the rabbit. Inv. Ophthalmol. & Vis. Sci. 36, 2110 — 2119 (Новая модель субретинальной неоваскуляризации у кроликов)
[34]	Kjellström , S., Bruun A., Isaksson B., Eriksson T., Andréasson S., Ponjavic V. (2006). Retinal function and histopathology in rabbits treated with Topiramate. Doc. Ophthalmol. 113, 179 — 186 (Функции сетчатки и гистологические исследования у кроликов)
[35]	Latendresse J.R., Warbrittion, A.R., Jonassen, H., Creasy D.M. (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's Fluid: Comparison with Bouin's Fluid and Conventional Davidson's Fluid. Toxicologic. Pathol. 30, 524 — 533 (Фиксация тест-материалов и образцов глаз при помощи модифицированной жидкости Дэвидсона. Сравнение с жидкостью Буэна и стандартной жидкостью Дэвидсона)
[36]	Lee W.R. (2002). Ophthalmic Histopathology. 2nd ed. London: Springer-Verlag (Офтальмологическая гистопатология)
[37]	Maaijwee K.J.M., van Meurs J.C., Kirchhof B., Mooij C.M., Fischer J.H., Mackiewicz J., Kobuch K., Joussen A.M. (2006). Histological evidence for revascularization of an autologous retinal pigment epithelium-choroid graft in the pig. Br. J. Ophthalmol. 91, 546 — 550 (Гистологические свидетельства реваскуляризации собственных сосудистых трансплантатов пигментного эпителия сетчатки у свиней)
[38]	Maurer J.K., Parker R.D., Jester J.V. (2002). Extent of initial corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36, 106 — 117 (Степень повреждения роговицы как механистическая основа раздражения глаз. Ключевые наблюдения и рекомендации для разработки альтернативных методов анализа)
[39]	Morton D., Sellers R.S., Barale-Thomas E., Bolon B., George C., Hardisty J.F., Irizarry A., McKay J.S., Odin M., Teranishi M. (2010). Recommendations for Pathology Peer Review. Toxicol. Pathol. 38, 1118 — 1127 (Рекомендации по подготовке сторонней экспертной оценки в патологии)
[40]	OECD (1998). OECD principles on Good Laboratory Practice. OECD Series on Principles of Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring Number 1, ENV/MC/CHEM(98)17, OECD, Paris. Available at: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdseriesonprinciplesofgoodlaboratorypracticeglpandcompliancemonitoring.htm (Принципы надлежащей лабораторной практики. Серия документов ОЭСР по принципам надлежащей лабораторной практики и контролю соответствия. № 1)
[41]	OECD (2005). Series on Testing and Assessment No. 34: Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines (Серия по испытаниям и оценке № 34. Руководящий документ по валидации и международному признанию новых или актуализированных методов испытаний для оценки опасностей)
[42]	OECD (2014). Advisory document n. 16. Guidance on the good laboratory practice (GLP) Requirements for Peer Review of Histopathology. OECD Series on principles of good laboratory practice and compliance monitoring. Advisory document of the working group on GLP. ENV/JM/MONO(2014)30. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris Available at: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdseriesonprinciplesofgoodlaboratorypracticeglpandcompliancemonitoring.htm (Рекомендательный документ № 16. Руководство по надлежащей лабораторной практике (GLP). Требования к экспертной оценке в гистопатологии. Серия документов ОЭСР по принципам надлежащей лабораторной практики и контролю соответствия)
[43]	OECD (2017a). Guidelines for Testing of Chemicals No. 437. Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines (Руководство по проведению испытаний химических веществ № 437. Метод исследования помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота для определения i) химических веществ, вызывающих серьезное повреждение глаз) <1>
[44]	OECD (2017b). Guidance Document on an Integrated Approach on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 263). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (Руководящий документ по интегрированным подходам к испытаниям и оценке серьезного повреждения глаз и раздражения глаз. Публикации по охране труда, окружающей среды и технике безопасности. Серия по испытаниям и оценке № 263)
[45]	OECD (2017c). Guideline for Testing of Chemicals No. 405. Acute Eye Irritation/Corrosion. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines (Руководство по проведению испытаний химической продукции № 405. Острое раздражение/разъедание глаз)
[46]	OECD (2018a). Guideline for Testing of Chemicals No. 438. Isolated Chicken Eye Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines (Руководство по проведению испытаний химической продукции № 438. Метод исследования с использованием извлеченного глаза курицы для определения i) химической продукции, вызывающей серьезное повреждение глаз, и ii) химической продукции, не требующей классификации) <2>
[47]	OECD (2018b). Guideline for the Testing of Chemicals No. 492. Reconstructed human Cornealike Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines (Руководство по проведению испытаний химической продукции № 492. Метод испытаний на раздражение кожи на основе реконструированной модели эпителия роговицы человеческого глаза (RhCE) для определения химической продукции, не требующей классификации как вызывающая раздражение или серьезное повреждение глаз) <3>
[48]	OECD (2018c). Series on Testing and Assessment No. 188: Streamlined summary document supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for eye irritation/corrosion. Second Edition. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/testguidelines (Серия по испытаниям и оценке № 188. Оптимизированный обобщающий вспомогательный документ к Руководству по проведению испытаний № 438 с использованием извлеченного глаза курицы для определения раздражающего/разъедающего воздействия на глаза)
[49]	Pantcheva M.B., Kahook M.Y., Schuman J.S., Noecker R.J. (2007). Comparison of acute structural and histopathological changes in human autopsy eyes after endoscopic cyclophotocoagulation and trans-scleral cyclophotocoagulation. Br. J. Ophthalmol. 91, 248 — 252 (Сравнение острых структурных и гистопатологических изменений образцов человеческих глаз при патолого-анатомическом исследовании после эндоскопической циклофотокоагуляции и транссклеральной циклофотокоагуляции)
[50]	Prinsen M.K., Koeter H.B.W.M. (1993). Justification of the Enucleated Eye Test With Eyes of Slaughterhouse Animals as an Alternative to the Draize Eye Irritation Test With Rabbits. Fd. Chem. Toxic. 31, 69 — 76 (Обоснование применимости метода исследования на извлеченных из тела образцах глаз, полученных от убойных животных, в качестве альтернативы тесту Дрейза на раздражение глаз, проводимого на глазу кролика)
[51]	Prinsen M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34, 291 — 296 (Испытания на образцах глаз, извлеченных из тела курицы (CEET). Практический (пред)скрининговый анализ для оценки раздражающей/разъедающей способности исследуемых материалов)
[52]	Prinsen M.K., Wijnands M., Schipper M.E.I. (2009). Histopathology in the isolated chicken eye test; comparison of different stainings of the cornea. ALTEX 26(Special Issue), 278 (Гистологические исследования извлеченного глаза курицы. Сравнение различных способов окрашивания роговицы)
[53]	Prinsen M.K., Schipper M.E.I., Wijnands M.V.W. (2011). Histopathology in the Isolated Chicken Eye Test and Comparison of different Stainings of the Cornea. Toxicology In Vitro 25, 1475 — 1479 (Гистологические исследования извлеченного глаза курицы и сравнение различных способов окрашивания роговицы)
[54]	Prophet E.B., Mills B., Arrington J.B., Sobin L.H. (1992). Laboratory Methods in Histotechnology. Armed Forces Institute of Pathology, Washington, USA, 279 pp. (Лабораторные методы в гистотехнике)
[55]	Rosa Jr. R.H., Green, W.R. (2008). Eye. In: Surgical Pathology Dissection, 2nd ed. (Westra, Phelps, Hruban & Isacson, eds.). New York: Springer, 194 — 201 (Глаз. Хирургическое патологоанатомическое вскрытие)
[56]	Samuelson D.A. (2007). Textbook of Veterinary Histology. St. Louis, USA, Saunders-Elsevier (Пособие по ветеринарной гистологии)
[57]	Scott L., Eskes C., Hoffmann S., Adriaens E., Alépée N., Bufo M., Clothier R., Facchini D., Faller C., Guest R., Harbell J., Hartung T., Kamp H., Le Varlet B., Meloni M., McNamee P., Osborne R., Pape W., Pfannenbecker U., Prinsen M., Seaman C., Spielman H., Stokes W., Trouba K., Van den Berghe C., Van Goethem F., Vassallo M., Vinardell P., Zuang V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicology In Vitro 24, 1 — 9 (Предлагаемая программа проведения испытаний на раздражение глаз, позволяющая ограничить или исключить необходимость исследований in vivo и предусматривающая реализацию восходящего и нисходящего подходов)
[58]	Siegel J.D., Rhinehart E., Jackson M., Chiarello L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf (Руководство по мерам предосторожности при изоляции образцов. Предотвращение переноса возбудителей инфекционных заболеваний в медицинских учреждениях)
[59]	Sina J.F., Gautheron P.D. (1998). Report from the bovine corneal opacity and permeability technical workshop November 3 — 4, 1997): An historical perspective. In Vitro Mol. Toxicol. 11, 316 — 326 (Отчет по итогам технического семинара, посвященного оценке помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота)
[60]	Spencer L.T., Bancroft J.D. (2008). Tissue processing and microtomy: paraffin and frozen. In: Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. (Bancroft & Gamble, eds.). Philadelphia, USA, Churchill Livingstone/Elsevier, 83 — 104 (Обработка тканей и микротомия. Пропитывание парафином и заморозка)
[61]	Ubels J.L., Paauw J.D., Casterton P.L., Kool D.J. (2002). A redesigned corneal holder for the bovine cornea opacity and permeability assay that maintains normal corneal morphology. Toxicol. In Vitro 16, 621 — 628 (Усовершенствованная конструкция держателя роговицы для проведения исследований помутнения и проницаемости образцов роговицы глаз крупного рогатого скота, позволяющая сохранить их нормальную морфологию)
[62]	UN (2015). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). ST/SG/AC.10/30/Rev.6, Sixth Revised Edition, New York and Geneva: United Nations. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/06files_e.html (Согласованная на глобальном уровне система классификации и маркировки химической продукции (СГС) Организации Объединенных Наций. 6-е, пересмотр. изд.)
[63]	Van den Berghe C., Guillet M.C., Compan D. (2005). Performance of porcine corneal opacity and permeability assay to predict eye irritation for water-soluble cosmetic ingredients. Toxicol. In Vitro 19, 823 — 830 (Проведение исследования помутнения и проницаемости роговицы глаз свиней для прогнозирования степени раздражения глаз человека водорастворимыми компонентами косметической продукции)
[64]	Zhang M., Rao P.V. (2005). Blebbistatin, a novel inhibitor of myosin II ATPase activity, increases aqueous humor outflow facility in perfused enucleated eyes. Inv. Ophthalmol. & Vis. Sci. 46, 4130 — 4138 (Блеббистатин, новый ингибитор активности аденозинтрифосфатазы миозина II, усиливающий отток внутриглазной жидкости при перфузии изолированных образцов глаз)
[65]	Araki K., Y. Ohahsi, S. Knoshita, K. Hayahsi, Y. Kuwayama and Y. Tano (1994). «Epithelial Wound Healing in the Denervated Cornea.» Current Eye Research 13: 203 — 211 (Заживление ран эпителия денервированной роговицы)
[66]	Baldwin H.A., T.O. McDonald and C. H. Beasley (1973). «Slit examination of experimental animals eyes. II Grading scales and photographic evaluation of induced pathological conditions.» J Society of Cosmetic Chemistry 24: 181 — 195 (Исследование глаз подопытных животных с использованием щелевой лампы. Двойная шкала оценки и порядок оценивания последствий индуцированных патологических процессов по фотоматериалам)
[67]	Butler J. M. and B. R. Hammond (1980). «The Effects of Sensory Denervation on the Response of the Rabbit Eye to prostaglandin E1, bradykinin and substance P.» British Journal of Pharmacology 69: 495 — 502 (Последствия сенсорной денервации для реакции глаза кролика на простагландин E1, брадикинин и субстанцию P)
[68]	Chan P. K. and A. W. Hayes (1994). «Acute Toxicity and Eye Irritancy.» In Principles and Methods of Toxicology, 3rd Edition (ed Hayes A.W.): 579 — 647 (Острая токсичность и раздражение глаз)
[69]	Cuellar, N., J. Merrill, M. Clear, G. Mun and J. W. Harbell (2002). «The Application of Benchmarks for the Evaluation of the Potential Ocular Irritancy of Aerosol Fragrances.» The Toxicologist 66(1): 243 — 244 (Применение образцовых материалов для оценки потенциальной способности аэрозольных ароматических веществ вызывать раздражение глаз)
[70]	Curren D. R., M. G. Evans, H. Raabe, R. R. Ruppalt and J. Harbell (2000). «Correlation of Histopathology, Opacity, and Permeability of Bovine corneas Exposed In Vitro to Known Ocular Irritants.» Veterinary Pathology 37(5): 557 (Корреляция гистопатологических параметров, помутнения и проницаемости образцов роговицы глаз крупного рогатого скота при воздействии на них in vitro веществ, заведомо способных вызывать раздражение глаз)
[71]	Dearman R. J., M. Cumberbatch and I. Kimber (2003). «Cutaneous Cytokine Expression: Induction by Chemical Allergen and Paracrine Regulation.» Journal of Toxicology-Cutaneous and Ocular Toxicology 22: 69 — 86 (Кожная экспрессия цитокинов. Результат воздействия химических аллергенов и паракринной регуляции)
[72]	Dua H. S., J. A. P. Gomes and A. Singh (1994). «Corneal Epithelium Wound Healing.» British Journal of Ophthalmology 78: 401 — 408 (Заживление ран эпителия роговицы)
[73]	Eurell T. E., J. M. Sinn, P. A. Gerding and C. L. Alden (1991). «In Vitro Evaluation of Ocular Irritants Using Corneal Protein Profiles.» Toxicology and Applied Pharmacology 108: 374 — 378. (Оценка воздействия веществ, вызывающих раздражение глаз, в условиях in vitro на основе профилей белков роговицы)
[74]	Farquhar M. G. and G. E. Palade (1963). «Junctional complexes in Various Epithelia.» J Cell Biology 17: 375 — 412 (Комплексы межклеточных контактов в различных типах эпителиальной ткани)
[75]	Gautheron P., M. Dukic, D. Alix and J. F. Sina (1992). «Bovine Corneal Opacity and Permeability Test: An In Vitro Assay of Ocular Irritancy.» Fundam Appl Toxicol 18: 442 — 449 (Исследование помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота. Анализ способности вызывать раздражение глаз in vitro)
[76]	Hackett R. B. and T. O. McDonald (1994). «Mechanisms of Ocular Response to Irritants.» Dermatotoxicology, 5th Editions, (ed Marzulli F.N, Maibach H.I.): 299 — 306 (Механизмы отклика глазной системы на раздражающие вещества)
[77]	Hogan M. J. and L. E. Zimmerman (1962). «Ophthalmic Pathology: An Atlas and Textbook, 2nd edition.» Philadelphia: W.B. Saunders (Офтальмологическая патология. Пособие и атлас)
[78]	Hubert F. (1992). «The Eye (Rabbit/Human): Parameters to be Measured in the Field of Ocular Irritation.» ATLA 20: 476 — 479 (Измеряемые параметры в области изучения раздражения глаз)
[79]	Jester J.V., Li H.F., Petroll W.M., Parker R.D., Cavanaugh H.D., Carr G.J., Smith B., and Maurer J.K. (1998) Area and depth of surfactant-induced corneal injury correlates with cell death. Investigative Ophthalmology & Visual Science 39(6): 922 — 936 (Площадь и глубина повреждений роговицы под воздействием сурфактантов коррелируют с показателем гибели клеток)
[80]	Jacobs G. A. and M. A. Martens (1990). «Quantification of Eye Irritation Based Upon In Vitro Changes of Corneal Thickness.» ATLA 17: 255 — 262 (Количественное оценка раздражающего действия на глаза in vitro в соответствии с наблюдаемыми изменениями толщины роговицы)
[81]	Katahira J. H., H. Sugiyama, N. Inoue, Y. Horiguchi, M. Matsuda and N. Sugimoto (1997). «Clostridium Perfringens Enterotoxin Utilizes Two Structurally Related Membrane (Токсин энтеритной клостридии использует два структурно связанных мембранных белка как функциональные рецепторы в условиях in vivo)»
[82]	Proteins as Functional Receptors in Vivo.» J Biological Chemistry 272: 26652 — 26658. Klyce, S. D. and R. W. Beuerman (1988). «Structure and Function of the Cornea.» The Cornea: 3 — 23 (Структура и функции роговицы)
[83]	Mamalis N., H. F. Edelhauser D. G. Dawson, J. Chew, R. M. LeBoyer and L. Werner (2006). «Toxic Anterior Segment Syndrome.» J Cataract Refract Surg 32(2): 324 — 332 (Токсический синдром переднего сегмента)
[84]	Maurer J. K., A. Molai, R. D. Parker, L. Li, G. J. Carr, W. M. Petroll, et al. (2001). «Pathology of Ocular Irritation with Bleaching Agents in the Rabbit Low-volume Eye Test.» Toxicol Pathol 29(3): 308 — 319 (Патология раздражения глаз, вызываемого отбеливателями, при проведении тестов на глазу кролика по методу с использованием малых объемов исследуемого вещества)
[85]	Maurer J. K. and R. D. Parker (1996). «Light Microscope Comparison of Surfactant Induced Eye Irritation in Rabbits and Rats at Three Hours and Recovery/day 35.» Toxicologic Pathology 24(4): 403 — 411 (Сравнительное исследование последствий раздражения глаз поверхностно-активными веществами у кроликов и крыс спустя три часа после воздействия и после восстановления повреждений/на 35 день, выполняемое средствами оптической микроскопии)
[86]	Redden J., Perry M.J., Leighton T., Chen J., and McMahon T., (2009). Voluntary Pilot Program to Evaluate Use of a Non-Animal Testing Approach to EPA Labeling For Eye Irritation For Certain Antimicrobial Products With Cleaning Claims (Добровольная экспериментальная программа для оценки эффективности применения подхода, исключающего проведение исследований на живых животных, в целях маркировки определенных видов антимикробных препаратов, предлагаемых для использования в составе моющих и чистящих средств, в соответствии с их способностью вызывать раздражение глаз)
[87]	Sina J. F., D. M. Galer, R. G. Sussman, P. D. Gautheron, E. V. Sargent, B. Leong, et al. (1995). «A Collaborative Evaluation of Seven Alternatives to the Draize Eye Irritation Test Using Pharmaceutical Intermediates.» Fundamental and Applied Toxicology 26: 20 — 31 (Совместная оценка семи методов исследований, альтернативных тесту Дрейза на раздражение глаз, с использованием промежуточных фармацевтических материалов)
[88]	Swanson J. E., B. T. White, B. P. Gran, J. Merrill and J. Harbell (2003). «Evaluating Oxidizing/reactive Cleaning Products in the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Assay.» The Toxicologist 72: 220 — 221 (Оценка воздействия чистящих и моющих средств с окислительной способностью/высокой химической активностью по методу исследования помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота)
[89]	Van Meer G., W. van Hof and I. and Genderen (1992). «Tight Junctions and Polarity of Lipids» Tight Junctions (ed Cereijido M.): 187 — 201 (Плотные контакты и полярность липидов)
[90]	Wilhelmus K. R. (2001). «The Draize Eye Test.» Surveys in Ophthalmology 45: 493 — 515 (Офтальмологический тест Дрейза)
[91]	Gautheron P., Dukic M., Alix D. and Sina J.,F. (1992), Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol., 18, 442 — 449 (Исследование помутнения и проницаемости роговицы глаз крупного рогатого скота. Анализ способности вызывать раздражение глаз in vitro)
[92]	Kolle S.N., Moreno M.C.R., Mayer W., van Cott A., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2015). The EpiOcularTM Eye Irritation Test is the Method of Choice for In vitro Eye Irritation Testing of Agrochemical Formulations: Correlation Analysis of EpiOcularTM Eye Irritation Test and BCOP Test Data to UN GHS, US EPA and Brazil ANIVSA Classifications. ATLA 43, 181 — 198 (Метод тестирования EpiOcularTM как предпочтительный метод исследования агрохимической продукции на способность оказывать раздражающее действие на глаза. Корреляционный анализ данных, полученных с применением метода EpiOcularTM и метода BCOP, при проведении классификации в соответствии с требованиями СГС ООН, US EPA и Brazil ANIVSA)
[93]	Cazelle E., Eskes C., Hermann M., Jones P., McNamee P., Prinsen M., Taylor H., Wijnands M.V.W. (2015). Suitability of the Isolated Chicken Eye Test for Classification of Extreme pH Detergents and Cleaning Products. Toxicology In Vitro 29, 609 — 616 (Применимость данных гистологического анализа как дополнительного источника информации при проведении исследований с использованием извлеченных образцов глаза курицы с целью классификации моющих и чистящих средств с неэкстремальными значениями pH по степени их опасности для глаз)

---

<1> Принят ГОСТ 34722-2021.

<2> Принят ГОСТ 34736-2021.

<3> Принят ГОСТ 34735-2021.

УДК 661:615,099:006.354	МКС 71.040.10; 13.020.01	MOD
Ключевые слова: химическая продукция, роговица глаза курицы, роговица глаз крупного рогатого скота, гистологические исследования, атлас патологических изменений, метод BCOP, метод ICE

---