ГОСТ 34623-2019. Межгосударственный стандарт. Продукция пищевая специализированная, биологически активные добавки к пище. Метод определения проантоцианидинов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.11.2019 № 1320-ст)
Примечание
Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 1, 2021. Документ введен в действие с 01.06.2020.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2019 г. № 1320-ст
ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ К ПИЩЕ
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВ
Foods for special dietary uses, food biologically active additives. Method for determination of proanthocyanidins
Дата введения 1 июня 2020 года
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи» (ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 «Продукция специализированная пищевая»
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 28 ноября 2019 г. № 124-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2019 г. № 1320-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34623-2019 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2020 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на специализированную пищевую продукцию (СПП) и биологически активные добавки к пище (БАД к пище) и устанавливает метод определения суммарного содержания проантоцианидинов в пересчете на проантоцианидин B2 спектрофотометрическим методом.
Диапазон измерений массовой доли проантоцианидинов в пересчете на процианидин B2 составляет от 0,1 до 500 мг/г.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4517 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9293 Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 14261 Кислота соляная особой чистоты. Технические условия
ГОСТ 15113.0 «Концентраты пищевые. Правила приемки, отбор и подготовка проб»
ГОСТ 27025 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний
ГОСТ 28311 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ ISO 3696 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний <*>
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
ГОСТ ISO/IEC 17025-2019 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемых в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:
3.1 проантоцианидины: Конденсированные танины, структурными единицами которых являются флаван-3-олы (катехины).
Примечание — Структура основных флаван-3-олов приведена на рисунке А.1 в приложении А. В зависимости от степени полимеризации различают олигомерные (n = 2 — 5) и полимерные проантоцианидины (n > 6). Наиболее полно характеризованы димеры B-типа, субъединицы которых могут быть соединены связями C4-C8 и C4-C6. Структура проантоцианидинов B-типа приведена на рисунке А.2 в приложении А. В проантоцианидинах A-типа структурные единицы соединены дополнительной связью C2-O7 или C2-O5. Структура проантоцианидинов A-типа на примере процианидина A2 приведена на рисунке А.3 в приложении А.
4 Спектрофотометрический метод определения суммарного содержания проантоцианидинов
4.1 Сущность метода
Методика основана на реакции кислотного гидролиза проантоцианидинов, в результате которой одна концевая группа молекулы процианидина дает эпикатехин, а остальные — антоцианидины. Реакция является характеристической для проантоцианидинов и позволяет спектрофотометрически определять их содержание (в пересчете на процианидин B2) в сложной многокомпонентной матрице СПП и БАД к пище.
4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения оптической плотности при длине волны 550 нм, или аналогичные приборы с основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.
Кюветы кварцевые для спектрофотометрии с длиной оптического пути 10 мм.
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,0005 г.
Баня ультразвуковая лабораторная рабочая вместимостью не менее 0,5 дм3.
Центрифуга настольная с относительным центробежным ускорением ротора не менее 1000 g, снабженная адаптерами для пробирок полимерных вместимостью 50 см3.
Колбы мерные 2-50(100, 250, 500, 1000)-2 с одной меткой по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1-50(100, 250)-1(2) по ГОСТ 1770.
Пробирки полимерные центрифужные с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см3.
Пробирки полимерные центрифужные вместимостью 1,5 — 2 см3.
Дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 20 до 5000 мм3 с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1% с соответствующими наконечниками по ГОСТ 28311.
Азот газообразный по ГОСТ 9293.
н-Бутиловый спирт для УФ-ИК-ВЭЖХ.
Кислота соляная ос. ч. по ГОСТ 14261.
Квасцы железоаммонийные [Fe(NH4)(SO4)2·12H2O], ч.д.а.
н-Гексан с массовой долей основного вещества не менее 99%.
Вода по ГОСТ ISO 3696 2-й степени чистоты или по ГОСТ 6709.
Виалы с завинчивающимися крышками вместимостью 4 — 6 см3.
Металлическая подставка для виал (помещается в водяную баню).
Процианидин B2 (CAS 29106-49-8) с содержанием основного вещества >= 90%.
Примечание - Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками, не уступающих вышеуказанным, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.
5 Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб — по ГОСТ 15113.0.
Отбор проб проводят в соответствии с нормативными документами, регламентирующими отбор проб конкретных видов БАД к пище и СПП, в состав которых введены растительное сырье или экстракты, содержащие проантоцианидины. Масса средней пробы не менее 1 г.
6 Условия проведения измерений
При подготовке к проведению измерений соблюдают следующие условия:
При приготовлении и хранении растворов должны выполняться требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.
7 Требования безопасности
При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
8 Подготовка к проведению измерений
8.1 Приготовление смеси бутанол — соляная кислота 95:5 по объему
В коническую колбу с притертой пробкой объемом 100 см3 с помощью мерного цилиндра объемом 100 см3 переносят 95 см3 н-бутанола, затем с помощью мерного цилиндра объемом 5 — 10 см3 добавляют 5 см3 соляной кислоты, тщательно перемешивают. Смесь хранят вдали от прямых солнечных лучей при комнатной температуре в течение 6 мес.
8.2 Приготовление 2%-ного раствора железоаммонийных квасцов в 2М соляной кислоте
2М раствор получают разведением соляной кислоты с молярностью 12М водой в 6 раз: в коническую колбу с притертой пробкой объемом 200 см3 с помощью мерного цилиндра объемом 100 см3 переносят 100 см3 воды, затем с помощью мерного цилиндра объемом 25 см3 добавляют 20 см3 соляной кислоты, тщательно перемешивают. Навеску железоаммонийных квасцов [Fe(NH4)(SO4)·12H2O] массой 2 г переносят в мерную колбу объемом 100 см3, добавляют приблизительно 70 см3 2М соляной кислоты, помещают в ультразвуковую баню комнатной температуры на 5 минут, доводят 2М соляной кислотой до метки, перемешивают. Раствор хранят в темном месте при комнатной температуре в течение 6 мес.
Примечание - Железо Fe(III) в составе железоаммонийных квасцов выполняет роль катализатора окисления карбокатионов в антоцианидины.
8.3 Приготовление рабочего раствора процианидина B2
Навеску 4,0 мг процианидина B2 (с точностью до четвертого знака) помещают в мерную колбу объемом 10 см3, добавляют примерно 7 см3 метанола, тщательно перемешивают, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, доводят метанолом до метки, перемешивают. Концентрация проантоцианидина B2 в полученном рабочем растворе составляет 0,4 мг/см3. Приготовленный рабочий раствор хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в течение не более 3 мес.
Для получения разбавленных калибровочных растворов проантоцианидина B2 с концентрацией 0,04; 0,12; 0,20 мг в 1 см3 в ряд пробирок помещают 1,0; 3,0; 5,0 см3 свежеприготовленного рабочего раствора проантоцианидина B2 и доводят объем раствора до 10 см3 метанолом.
Далее калибровочные растворы и рабочий раствор гидролизуют согласно 9.1.
8.4 Подготовка проб для анализа 2
Навеску пробы растворяют в 60%-ном водном метаноле так, чтобы концентрация проантоцианидинов составляла 0,04 — 0,40 мг/см3. Если содержание проантоцианидинов в пробе неизвестно, навеску 1 г СПП или 0,5 г БАД к пище помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют примерно 30 см3 60%-ного водного метанола, тщательно перемешивают. В случае СПП и БАД к пище на основе экстрактов мерную колбу помещают в ультразвуковую баню комнатной температуры на 5 мин, доводят 60%-ным водным метанолом до метки, перемешивают. В случае СПП и БАД к пище на основе растительного сырья мерную колбу помещают в ультразвуковую баню, нагретую до 40 °C, на 30 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят 60%-ным водным метанолом до метки, перемешивают. Аликвоту жидких образцов СПП и БАД к пище при необходимости разводят 60%-ным водным метанолом в мерной колбе, помещают в ультразвуковую баню комнатной температуры на 5 мин, перемешивают.
При определении проантоцианидинов в образцах с высоким содержанием жира (> 10%) пробу предварительно обезжиривают гексаном. Соответствующую навеску пробы помещают в полимерную центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют приблизительно 50 см3 гексана, предварительно нагретого до 50 °C, тщательно перемешивают, помещают в ультразвуковую баню комнатной температуры на 5 мин, центрифугируют, надосадочную жидкость сливают. Процедуру повторяют трижды. Обезжиренную пробу высушивают в токе азота или естественным путем, добавляют приблизительно 30 см3 60%-ного водного метанола, тщательно перемешивают. Экстракцию проводят, как указано выше, в зависимости от источника проантоцианидинов в составе исследуемой пробы (растительное сырье или экстракт). Полученное извлечение количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, промывая пробирку небольшими порциями растворителя, доводят до метки.
Перед анализом пробу центрифугируют (раствор пробы 1). Далее пробу анализируют согласно 9.1.
9 Проведение измерений
9.1 Измерение оптической плотности рабочего и калибровочных растворов проантоцианидина B2
В виалы с завинчивающимися крышками объемом 4 — 6 см3 помещают по 3 см3 смеси бутанол-соляная кислота, 0,1 см3 раствора Fe(III) и 0,5 см3 рабочего или калибровочного раствора проантоцианидина B2, азотом вытесняют из виалы воздух, герметически закрывают и встряхивают. Все виалы одновременно (можно поместить на металлическую подставку для пробирок) нагревают на водяной бане при 95 °C в течение 45 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 550 нм в кюветах с толщиной слоя раствора 1,0 см. В кювету сравнения помещают 3 см3 смеси бутанол-соляная кислота, 0,1 см3 раствора Fe(III) и 0,5 см3 растворителя.
9.2 Построение градуировочного графика
Строят график зависимости оптической плотности (A) калибровочных растворов от концентрации проантоцианидина B2 (мг/см3) A = f(C). По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют суммарное содержание проантоцианидинов в пересчете на проантоцианидин B2 в пробе.
9.3 Измерение оптической плотности в пробе
Аликвоту (0,5 см3) раствора пробы 1 (8.4) обрабатывают согласно 9.1.
Оптическая плотность образца должна находиться в пределах 0,2 — 1,2. При необходимости раствор разбавляют смесью бутанол-соляная кислота/раствор Fe(III) (3 см3/0,1 см3). Если оптическая плотность образца менее 0,2, то образец готовят вновь, соответственно увеличив массу навески (аликвоту).
10 Обработка и оформление результатов
10.1 Формула расчета массовой доли проантоцианидинов в твердых и вязких СПП и БАД к пище
Массовую долю проантоцианидинов в пересчете на процианидин B2 в твердых и вязких СПП и БАД к пище X, мг/г, вычисляют по формуле
X = \frac{C \cdot V_{1} \cdot V_{2}}{m} , (1)
где C — массовая концентрация проантоцианидина B2, найденная по градуировочному графику, мг/см3;
10.2 Формула расчета массовой доли проантоцианидинов в жидких СПП и БАД к пище
Массовую долю проантоцианидинов в пересчете на процианидин B2 в жидких СПП и БАД к пище X, мг/см3, вычисляют по формуле
X = \frac{C \cdot V_{1} \cdot V_{2}}{V_{3}} , (2)
где C — массовая концентрация проантоцианидина B2, найденная по градуировочному графику, мг/см3;
10.3 Обработка результатов
При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения.
Расхождение между результатами двух параллельных измерений X1, X2 (в процентах от среднего значения Xср), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать r (предел повторяемости приведен в таблице 1) с доверительной вероятностью P = 95%.
При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение Xср, округленное до второго десятичного знака.
Границы относительной погрешности определения массовой доли проантоцианидинов (±\delta) , в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 1.
10.4 Оформление результатов
Результат определения массовой доли проантоцианидинов представляют в следующем виде:
X_{\text{ср}} \pm \Delta , мг/г, при P = 95%, (3)
где Xср — среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/г (мг/см3);
\Delta — значение границы абсолютной погрешности определений, мг/г (мг/см3), рассчитанное по формуле
\Delta = \frac{\delta \cdot X_{\text{ср}}}{100} . (4)
Результаты испытаний заносят в протокол, в котором указывают:
- обозначение настоящего стандарта;
- результаты исследования;
- причины отклонений в процедуре определения от установленных условий.
11 Метрологические характеристики
11.1 Повторяемость
Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений (X1, X2), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени считают удовлетворительным, если |X1 — X2| <= 0,01r·Xср, где Xср — величина среднего арифметического, r — предел повторяемости (расхождение между двумя параллельными определениями, выполненными в условиях повторяемости). Значение r приведено в таблице 1.
При превышении предела повторяемости (сходимости) испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
11.2 Воспроизводимость
Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений (X1, X2), выполненными разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если |X1 — X2| <= 0,01R·X, где X — величина среднего арифметического, R — предел воспроизводимости (расхождение между двумя определениями, выполненными в условиях воспроизводимости). Значение R приведено в таблице 1.
Основные метрологические характеристики методики
При превышении предела воспроизводимости испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
11.3 Контроль погрешности результатов испытаний
Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют проантоцианидин B2 в количестве, составляющем 50% — 150% исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.
Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли проантоцианидинов в добавке не превышает норматива контроля погрешности Kдоб мг/г (мг/см3):
|Xдоб — Xср — Cдоб| <= Kдоб, (5)
где Xдоб — среднее арифметическое результатов двух испытаний пробы с добавкой, мг/г;
Xср — среднее арифметическое результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, мг/г (мг/см3);
Cдоб — величина добавки, мг/г (мг/см3).
При проведении внутрилабораторного контроля значение Kдоб рассчитывают (при доверительной вероятности 90%) по формуле:
K_{\text{доб}} = 0,84 \cdot \frac{\delta}{100} \cdot \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} , (6)
где \delta — значение границы относительной погрешности определения массовой доли проантоцианидинов, указанное в таблице 1.
При проведении внешнего контроля значение Kдоб рассчитывают (при доверительной вероятности 95%) по формуле:
K_{\text{доб}} = \frac{\delta}{100} \cdot \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} . (7)
11.4 Контроль стабильности результатов измерений при реализации методики в лаборатории
Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6, используя методы контроля стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 6.2.3) и показателя правильности по ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 6.2.4). Проверку стабильности проводят с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов выполнения измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ISO/IEC 17025-2019 (подраздел 4.2).
СТРУКТУРА ПРОАНТОЦИАНИДИНОВ B И A ТИПА
А.1 Структура основных флаван-3-олов, входящих в молекулы проантоцианидинов, приведена на рис. А.1
Рисунок А.1 — Структура основных флаван-3-олов
Примечание - Процианидины — конденсированные афзелехин катехины, если в молекулу проантоцианидина входят афзелехин (эпиафзелехин) или галлокатехин (эпигаллокатехин), то это соответственно — пропеларгонидин или продельфинидин.
А.2 Структуры проантоцианидинов B-типа на примере процианидина B2 и процианидина B5 приведены на рисунке А.2
Рисунок А.2 — Структуры проантоцианидинов B-типа
Примечание - Проантоцианидины B-типа наиболее широко распространены и присутствуют в таких продуктах, как какао, виноград, яблоки, красная фасоль, орехи, сорго.
А.3 Структура проантоцианидинов A типа на примере процианидина A2
Рисунок А.3 — Структура проантоцианидинов A-типа
Примечание - Проантоцианидины A-типа с 2\beta \rightarrow O7 связью характерны для плодов семейства Вересковые Ericaceae (клюква, черника, брусника, голубика), корицы, карри, с 2\beta \rightarrow O5 связью — для какао.