ГОСТ 34284-2017. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье, объекты биологические животного происхождения. Метод обнаружения анаболических стимуляторов роста с помощью иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией с использованием технологии биочипов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 14.11.2017 № 1738-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 1, 2020. Документ введен в действие с 01.01.2019.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 ноября 2017 г. № 1738-ст
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, КОРМА, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ, ОБЪЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ АНАБОЛИЧЕСКИХ СТИМУЛЯТОРОВ РОСТА С ПОМОЩЬЮ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ БИОЧИПОВ
Food products, feed, food raw materials, biological objects of animal origin. Method for the detection of anabolic growth promoters by the hemiluminescence immunoenzymatic assay with the use of biochip technology
67.050
67.120
Дата введения 1 января 2019 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 сентября 2017 г. № 103-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 ноября 2017 г. № 1738-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34284-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты в части мяса всех видов животных (включая бескостное, парное, охлажденное, замороженное, и размороженное), мясокостный и кусковой полуфабрикаты, корма, а также биологические объекты животного происхождения (мочу) и устанавливает иммуноферментный метод с хемилюминесцентной детекцией обнаружения с использованием биочипов \beta - \text{агонистов} (кленбутерол, карбутерол, бромбутерол, салбутамол, метилкленбутерол, тербуталин, мабутерол, пирбутерол, мапентерол, кимбутерол), болденона, кортикостероидов (дексаметазон, флюметазон, бетаметазон), нандролона, рактопамина, станозолола, стильбенов (диэтилстилбестрол, гексэстрол), тренболона, зеранола.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты <*>
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2652-78 Калия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ ISO 6497-2014 Корма. Отбор проб
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 7269-2015 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-2016 Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.
3.2 вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.
3.3 рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.
3.4 коэффициент перекрестного реагирования: Коэффициент, характеризующий степень взаимодействия антител с близкородственными к определяемому компоненту соединениями.
3.5 биологические объекты животного происхождения: Все формы тканей животных (кожа, костная и хрящевая ткань, кровь и т.п.), все производные формы эпидермиса, продукты жизнедеятельности животных, в том числе их биологические выделения.
4. Сущность метода
4.1 Для обнаружения анаболических стимуляторов роста используют метод прямого твердофазного иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией.
4.2 Сущность метода основана на конкуренции анаболических симуляторов роста, адсорбированных на дискретных участках биочипов, и свободных анаболических симуляторов роста, присутствующих в градуировочных растворах или растворах проб, за активные центры связывания антител (АТ) меченных пероксидазой хрена. В ходе иммуноспецифической реакции образуются комплексы АТ-анаболические стимуляторы роста. Комплекс антиген — антитела (АГ — АТ), который не связан с поверхностью биочипа, удаляют на стадии промывки. После добавления раствора субстрата регистрируют значение интенсивности люминесценции характеризующее степень взаимодействия АТ с АГ.
Измеренная величина обратно пропорциональна массовой концентрации определяемых веществ в растворе.
5. Пределы обнаружения анаболических стимуляторов роста и специфичность АТ выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования
5.1 Пределы обнаружения анаболических стимуляторов роста представлены в таблице 1.
5.2 Специфичность АТ, применяемых для обнаружения анаболических стимуляторов роста, выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования, представлена в таблице 2.
6. Требования безопасности и условия выполнения измерений
6.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
6.2 Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.
6.3 К выполнению измерений допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, владеющие техникой ИФА-Х и изучившие инструкции по применению тест-системы и инструкции по эксплуатации используемых приборов.
6.4 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
| - температура окружающего воздуха.................................... | от 15 °C до 27 °C; |
|---|---|
| - относительная влажность воздуха.................................... | от 20% до 80%. |
7. Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы
7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуду:
- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,01 г;
- весы утвержденного типа поверенные в установленном порядке с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,5 мг;
- анализатор полуавтоматический иммунохимический, включающий в себя:
а) компьютер с установленным программным обеспечением для управления и обработки результатов измерений;
б) камеру с зарядовой связью для регистрации хемилюминесценции;
- pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. pH с погрешностью +/- 0,05 ед. pH;
- баню водяную с терморегулятором, позволяющим поддерживать температуру от 30 °C до 100 °C, с отклонением от заданной температуры не более +/- 5 °C;
- мельницу лабораторную для кормов;
- измельчитель-гомогенизатор лабораторный;
- иммуноаффинные колонки, заполненные сорбентом с иммобилизованными на нем АТ против \beta - \text{агонистов} , болденона, кортикостероидов, нандролона, рактопамина, станозолола, стильбенов, тренболона, зеранола, с максимальной сорбируемой концентрацией по определяемым соединениям 25 нг;
- испаритель роторный любого типа или устройство для испарения экстрактов, с термостатируемым нагревательным модулем, поддерживающим температуру от 25 °C до 200 °C, с системой отдувки растворителей инертным газом;
- систему получения деионизированной воды высокой чистоты;
- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;
- камеру лабораторную морозильную с рабочим диапазоном температур от минус 15 °C до минус 25 °C;
- холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур от 2 °C до 8 °C;
- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 4750 об/мин и диапазоном температур от 4 °C до 25 °C, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 и 50 см3;
- шейкер вертикального вращения 360° в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;
- шейкер вортексного типа, с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;
- термошейкер орбитального вращения с диапазоном скорости от 250 до 1200 об/мин и обеспечивающий режим термостатирования от 25 °C до 60 °C;
- шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры (95 +/- 5) °C;
- бумагу индикаторную универсальную, pH 0 — 12 ед. pH;
- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;
- мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм;
- посуду из полимерного материала с навинчиваемой крышкой;
- колбы мерные 2-50(100,500,1000)-2 по ГОСТ 1770;
- колбы со шлифом Кн-1-250(1000)-29/32 ТС по ГОСТ 25336;
- пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03 — 0,3 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1,0%;
- пипетки одноканальные переменной вместимости 0,005 — 0,05; 0,1 — 1,0; 0,5 — 5,0 см3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1%;
- пробирки стеклянные типа П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;
- пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см3 с завинчивающимися крышками;
- пробирки микроцентрифужные вместимостью 1,5 см3;
- стакан В-1-150 ТС по ГОСТ 25336;
- цилиндры 1-10(100,250,500)-1 по ГОСТ 1770.
7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:
- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
- калия бихромат по ГОСТ 2652;
- кислоту серную по ГОСТ 4204;
- кислоту соляную по ГОСТ 3118 х.ч.;
- натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.;
- оксид алюминия нейтральный;
- спирт этиловый (этанол) по ГОСТ 5962;
- кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;
- бета-глюкуронидазу;
- метанол для ВЭЖХ-МС с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- воду деионизированную для ВЭЖХ с удельным сопротивлением 18 МОм·см при температуре 25 °C, полученную с использованием системы производства ультрачистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709;
- тест-систему в комплектации (см. приложение А), предназначенной для определения анаболических стимуляторов роста;
- набор реагентов для подготовки проб кормов в комплектации, указанной в приложении В;
- набор реагентов для подготовки проб мочи и мяса в комплектации, указанной в приложении В.
8. Подготовка к выполнению анализа
8.1 Подготовка оборудования
8.1.1 При подготовке к проведению анализа лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.
8.1.2 Подготовку и проверку полуавтоматического иммунохимического анализатора и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.
8.2 Приготовление растворов
8.2.1 Приготовление хромовой смеси
В колбе со шлифом вместимостью 250 см3 растворяют 5,0 г бихромата калия в 50 см3 дистиллированной воды, затем добавляют 100 см3 концентрированной серной кислоты.
Раствор хранят в колбе со шлифом в вытяжном шкафу при комнатной температуре не более 1 мес. Если раствор приобретает зеленый оттенок, его готовят заново.
8.2.2 Приготовление рабочего раствора буфера для промывки чипов
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 32 см3 реактива № 8 (см. приложение А), доводят объем раствора деионизированной водой до метки на колбе, перемешивают.
Раствор хранят в колбе со шлифом при температуре от 2 °C до 8 °C — не более 1 мес.
8.2.3 Приготовление промежуточного раствора ферментного конъюгата (ФК)
В стеклянную пробирку вносят 1,98 см3 реактива № 3 (см. приложение А) и 0,02 см3 реактива № 2 (см. приложение А), закрывают пробкой и перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 10 с.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.4 Приготовление рабочего раствора ФК
В стеклянную пробирку вносят 6 см3 реактива № 3 (см. приложение А) и 0,4 см3 промежуточного раствора ФК (см. 8.2.3).
Используют свежеприготовленный раствор.
Расчет реагентов тест-системы приведен для 54 определений, включая анализ градуировочных растворов.
8.2.5 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3, содержащую 500 см3 дистиллированной воды, вносят 85 см3 концентрированной соляной кислоты, доводят дистиллированной водой объем в колбе до метки, закрывают пробкой и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес.
8.2.6 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,4 г гидроокиси натрия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.
Срок хранения раствора в плотно закрытой посуде из полимерных материалов в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес.
8.2.7 Приготовление 5%-ного раствора этанола
В колбу вместимостью 250 см3 вносят последовательно 5 см3 этанола и 95 см3 дистиллированной воды, перемешивают.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 3 сут.
8.2.8 Приготовление 10%-ного раствора этанола
В колбу вместимостью 250 см3 вносят последовательно 10 см3 этанола и 95 см3 дистиллированной воды, перемешивают.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 3 сут.
8.2.9 Приготовление 70%-ного раствора этанола
В колбу вместимостью 250 см3 вносят последовательно 70 см3 этанола и 95 см3 дистиллированной воды, перемешивают.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 3 сут.
8.2.10 Приготовление градуировочных растворов анаболических стимуляторов роста К1 - К9
В девять флаконов с лиофилизированными градуировочными растворами (см. приложение А) вносят по 5 см3 раствора № 1 (см. приложение А), и перемешивают на термошейкере при температуре 25 °C в течение 30 мин, избегая образования пены.
Срок хранения растворов при температуре от 2 °C до 8 °C — не более 7 сут.
8.2.11 Приготовление раствора субстрата
В стеклянную пробирку вносят 7 см3 раствора № 7 (см. приложение А), затем добавляют 7 см3 раствора № 6 (см. приложение А). Тщательно перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 10 с.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 4 ч.
Расчет реагента приведен для 54 определений, включая анализ градуировочных растворов.
8.2.12 Приготовление раствора бета-глюкуронидазы концентрацией 5000 ед./см3
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 250 мг бета-глюкуронидазы и доводят объем раствора до метки на колбе деионизированной водой.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.13 Приготовление раствора этанола с pH 4,0 ед. pH
В стакан вместимостью 150 см3 вносят 100 см3 этанола, измеряют pH и доводят его значение ледяной уксусной кислотой до 4,0 ед. pH.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.14 Приготовление раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок
В мерную колбу вместимостью 500 см3 вносят 25 см3 концентрата буфера для промывки колонок (см. приложение В) и доводят объем раствора до метки на колбе деионизированной водой.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.15 Приготовление раствора для хранения иммуноаффинных колонок
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 20 см3 концентрата буфера для хранения колонок (см. приложение В) и доводят объем раствора до метки на колбе деионизированной водой.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.16 Приготовление раствора метанол-гидроокись натрия в соотношении 99:1
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1 см3 раствора гидроокиси натрия (см. 8.2.6) и доводят объем раствора метанолом до метки на колбе.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.17 Приготовление 70%-го раствора метанола
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 70 см3 метанола и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки на колбе.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 3 сут.
8.3 Отбор проб
8.3.1 Отбор проб кормов для животных — по ГОСТ ISO 6497, комбикормов и сырья, используемого при их производстве — по ГОСТ 13496.0.
8.3.2 Отбор проб мяса — по ГОСТ 7269.
8.3.3 Пробу мочи берут в середине процесса естественного мочеиспускания животного.
8.3.4 До начала анализа пробы, отобранные по 8.3.2, хранят при температуре от 2 °C до 8 °C. При отсутствии возможности анализа проб в течение 2 сут, их замораживают и хранят при температуре минус 24 °C до проведения анализа, но не более 2 мес.
8.4 Подготовка проб
8.4.1 Подготовка проб мочи
Обработку проб мочи проводят в соответствии с рисунком 1.
| 10 см3 мочи помещают в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин |
|---|
 |
| Супернатант фильтруют через мембранный фильтр в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 |
 |
| Отбирают 5 см3 фильтрата в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 1 см3 раствора бета-глюкуронидазы (см. 8.2.12), перемешивают. Измеряют pH с помощью индикаторной бумаги и доводят его значение до 5 ед. pH раствором соляной кислоты (см. 8.2.5) |
 |
| Пробу выдерживают на водяной бане при 37 °C в течение 2 ч, после чего охлаждают до комнатной температуры |
 |
| Измеряют pH с помощью индикаторной бумаги и доводят его значение до 7 — 8 ед. pH раствором гидроокиси натрия (см. 8.2.6) |
 |
| Объем пробы доводят до 20 см3 деионизированной водой, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин и наносят на иммуноаффинную колонку |
 |
| Перед проведением иммуноаффинной очистки пробы, колонку устанавливают на вакуумное устройство для твердофазной экстракции и уравновешивают путем пропускания через нее 20 см3 раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14), 4 см3 раствора этанола (см. 8.2.13) и 5 см3 деионизированной воды |
 |
| Затем на колонку наносят 4 см3 подготовленной пробы. После этого колонку промывают дважды, добавляя при этом каждый раз по 4 см3 раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14), один раз 5 см3 деионизированной воды и 5 см3 10%-го раствора этанола (см. 8.2.8) |
 |
| Пробу элюируют с колонки в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 4 см3 раствора бета-глюкуронидазы (см. 8.2.12). Колонку затем промывают 15 см3 10%-ного раствора этанола (см. 8.2.8) и 20 см3 раствора для хранения иммуноаффинных колонок (см. 8.2.15). Если необходимо провести очистку еще одной пробы на колонке, то необходимо повторить процедуру уравновешивания 20 см3 раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14), 4 см3 раствора этанола (см. 8.2.13) и 5 см3 деионизированной воды. На одной колонке можно провести очистку 10 проб |
 |
| Очищенную пробу упаривают досуха при 60 °C в токе азота |
 |
| К сухому остатку приливают 0,5 см3 раствора № 1 (см. приложение А). Перемешивают на шейкере вортексного типа 2 мин. В пробирку вместимостью 1,5 см3 переносят 100 мм3 полученного раствора и добавляют 300 мм3 раствора № 1 (см. приложение А). Разведенную пробу анализируют методом ИФА-Х с использованием биочипов |
Рисунок 1 — Подготовка проб мочи
8.4.2 Подготовка проб мяса, мясокостных и кусковых полуфабрикатов
Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани, измельчают в гомогенизаторе и проводят обработку проб в соответствии с рисунком 2.
| 1,00 г гомогенизированной пробы и 1 г оксида алюминия помещают в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 5 см3 раствора метанол-гидроокись натрия (см. 8.2.16) |
|---|
 |
| Перемешивают 2 мин на шейкере вортексного типа и 15 мин на вертикальном шейкере. Затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант переносят в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 |
 |
| К осадку снова добавляют 5 см3 раствора метанол-гидроокись натрия (см. 8.2.16), перемешивают 2 мин на шейкере вортексного типа и 15 мин на вертикальном шейкере. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин |
 |
| Супернатанты соединяют и помещают в морозильную камеру на 2 ч при температуре не выше минус 20 °C |
 |
| Затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин |
| Отбирают 2 см3 супернатанта в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 и доводят объем до 20 см3 раствором для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14). Перемешивают на вертикальном шейкере в течение 5 мин и наносят на иммуноаффинную колонку |
 |
| Перед проведением иммуноаффинной очистки пробы, колонку устанавливают на вакуумное устройство для твердофазной экстракции и уравновешивают путем пропускания через нее 20 см3 раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14), 4 см3 раствора этанола (см. 8.2.13) и 5 см3 деионизированной воды |
 |
| Затем на колонку наносят 20 см3 подготовленной пробы. После этого колонку промывают дважды, добавляя при этом каждый раз по 4 см3 раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14), один раз 5 см3 деионизированной воды и 15 см3 10%-ного раствора этанола (см. 8.2.8) |
 |
| Пробу элюируют с колонки в стеклянную пробирку вместимостью 15 см3 4 см3 раствора этанола (см. 8.2.13). Колонку затем промывают 15 см3 10%-ного раствора этанола (см. 8.2.8) и 20 см3 раствора для хранения иммуноаффинных колонок (см. 8.2.15). Если необходимо провести очистку еще одной пробы на колонке, то необходимо повторить процедуру уравновешивания 20 см3 раствора для кондиционирования иммуноаффинных колонок (см. 8.2.14), 4 см3 раствора этанола (см. 8.2.13) и 5 см3 деионизированной воды. На одной колонке можно провести очистку 10 проб |
 |
| Очищенную пробу упаривают досуха при 60 °C в токе азота |
 |
| К сухому остатку приливают 0,5 см3 раствора № 1 (приложение А). Перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 2 мин и анализируют методом ИФА-Х с использованием биочипов |
Рисунок 2 — Подготовка проб мяса, мясокостных и кусковых полуфабрикатов
8.4.3 Подготовка проб кормов
Пробу корма предварительно измельчают и гомогенизируют. Отбирают 1,00 г пробы в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 5 см3 70%-го раствора метанола (см. 8.2.17). Перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 1 мин и центрифугируют при 2880 об/мин в течение 10 мин. Супернатант переносят в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 и затем отбирают 125 мм3 в пробирку вместимостью 1,5 см3. К осадку добавляют 5 см3 буфера для экстракции кормов (см. приложение В). Перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 1 мин и центрифугируют при 2880 об/мин в течение 10 мин. Отбирают 125 мм3 супернатанта и добавляют его к уже отобранному количеству в пробирку вместимостью 1,5 см3. К объединенным супернатантам добавляют 0,75 см3 рабочего раствора буфера для промывки чипов (см. 8.2.2). Перемешивают 1 мин на шейкере вортексного типа и анализируют с помощью ИФА-Х с использованием технологии биочипов.
9. Проведение иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией (ИФА-Х) с использованием технологии биочипов
9.1 Общие положения
9.1.1 При проведении анализа следует использовать реагенты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.
9.1.2 Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в пределах срока хранения.
9.2 Подготовка тест-системы к проведению анализа
9.2.1 Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при температуре (23 +/- 5) °C не менее 30 мин, после чего аккуратно встряхивают каждый флакон.
9.2.2 После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.
9.2.3 На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.
9.2.4 Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники пипеток переменной вместимости. Внесение растворов на биочипы проводят осторожно, не касаясь наконечниками поверхности биочипа.
Примечание - Далее приведены расходы реактивов на шесть кассет с биочипами (по девять в каждой), чего достаточно для анализа 45 анализируемых проб. Используемые биочипы и объем реагентов рассчитывают на основании количества анализируемых проб.
9.3 Проведение анализа
9.3.1 В держатель вставляют необходимое количество биочипов, кратное трем. Неиспользованные биочипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с зип-локом <*> при температуре от 2 °C до 8 °C в течение всего срока годности тест-системы.
<*> Зип-лок — замок, обеспечивающий герметизацию пакета.
9.3.2 Анализ проб и рабочих градуировочных растворов проводят в соответствии с рисунком 3.
| На биочипы наносят по 0,1 см3 раствора № 1 (см. приложение А) |
|---|
 |
| Добавляют по 0,1 см3 градуировочных растворов К1 - К9 (см. 8.2.10) и экстракты анализируемых проб (см. 8.4.1, 8.4.2 или 8.4.3), согласно схеме (см. приложение Б), начиная с минимальной концентрации. Процедура внесения экстрактов анализируемых проб и градуировочных растворов не должна превышать 15 мин |
 |
| Растворы в биочипах перемешивают аккуратным постукиванием по ребру рамки держателя биочипов |
 |
| Перемешивают в термошейкере при 370 об/мин и температуре 25 °C в течение 30 мин |
 |
| Добавляют 0,1 см3 рабочего раствора ФК (см. 8.2.4) и перемешивают в термошейкере при 370 об/мин и температуре 25 °C в течение 60 мин |
 |
| Содержимое сливают, затем каждый биочип двукратно промывают, добавляя при этом каждый раз в биочипы по 300 мм3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2) и затем выливая его. После чего в каждый биочип вносят по 300 мм3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2), выдерживают 2 мин и удаляют раствор. Процедуру повторяют 4 раза. После последнего промывания в каждый биочип вносят по 300 мм3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2) и оставляют до добавления раствора субстрата (см. 8.2.11) в темном месте при температуре (25 +/- 2) °C |
 |
| Кассету с девятью биочипами удаляют из держателя. Промывочный буфер выливают резким переворачиванием кассеты и аккуратно удаляют остатки раствора легким постукиванием ее по поверхности стола, накрытого сухим листом фильтровальной бумаги. Затем вносят в каждый биочип по 0,25 см3 рабочего раствора субстрата (см. 8.2.11). Выдерживают в темноте при температуре (25 +/- 2) °C в течение 2 мин. Затем измеряют интенсивность люминесценции биочипов с помощью иммунохимического анализатора |
Рисунок 3 — Проведение анализа
10. Обработка результатов измерения
10.1 Обработку проводят с помощью программного обеспечения, позволяющего обнаруживать анаболические стимуляторы роста, указанные в разделе 1, в анализируемой пробе по средним значениям интенсивности люминесценции, измеренным в биочипах с градуировочными растворами и экстрактами анализируемых проб.
10.2 С помощью компьютерной системы обработки данных строят градуировочную зависимость интенсивности люминесценции раствора от массовой концентрации каждого из определяемых соединений.
10.3 Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции R2 не менее 0,98.
10.4 Результат обнаружения \beta - \text{агонистов} (кленбутерол, карбутерол, бромбутерол, салбутамол, метилкленбутерол, тербуталин, мабутерол, пирбутерол, мапентерол, кимбутерол); болденона; кортикостероидов (дексаметазон, флюметазон, бетаметазон); нандролона, рактопамина, станозолола, стильбенов (диэтилстилбестрол, гексэстрол), тренболона, зеранола принимают за положительный в пробах, где полученное значение массовой концентрации превышает предел обнаружения по 5.1, а в остальных пробах результат обнаружения принимают за отрицательный.
КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «GROWTH PROMOTER MULTIPLE MATRIX SCREEN (GPMMS)»
В комплектацию тест-системы входят:
№ 1 — раствор для разведения образцов (8,0 +/- 0,5) ед. pH, содержащий белок, ПАВ, блокирующие агенты и консерванты, три флакона по 30 см3;
№ 2 — концентрат ФК (1600-кратный концентрат), (7,2 +/- 0,5) ед. pH, один флакон по 750,0 мм3;
№ 3 — буфер для разведения ФК (8,0 +/- 0,5) ед. pH, два флакона по 8 см3;
№ 4 — шесть кассет по девять биочипов в каждой с нанесенными на дискретные участки антителами против \beta - \text{агонистов} (кленбутерол, карбутерол, бромбутерол, салбутамол, метилкленбутерол, тербуталин, мабутерол, пирбутерол, мапентерол, кимбутерол), болденона, кортикостероидов (дексаметазон, флюметазон, бетаметазон), нандролона, рактопамина, станозолола, стильбенов (диэтилстилбестрол, гексэстрол), тренболона, зеранола;
№ 5 — лиофилизированные градуировочные растворы, девять флаконов;
Концентрации градуировочных растворов указаны в таблице А1.
№ 6 — раствор люминола, один флакон по 10,0 см3;
№ 7 — раствор перекиси водорода, один флакон — 10,0 см3;
№ 8 — концентрат промывочного буфера (20 мМ Трис 7,4 ед. pH, содержащий ПАВ и консерванты), один флакон по 32,0 см3;
№ 9 — лиофилизированные контрольные растворы, содержащие \beta - \text{агонисты} , болденон, кортикостероиды, нандролон, рактопамин, станозолол, стильбены, тренболон, зеранол, девять флаконов.
СХЕМА ЗАПОЛНЕНИЯ КАССЕТ С БИОЧИПАМИ, ВСТАВЛЕННЫМИ В ДЕРЖАТЕЛЬ
Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме:
Набор для подготовки проб мочи и мяса:
-
Концентрат буфера для промывки колонок (20-кратный), два флакона по 100 см3.
-
Концентрат буфера для хранения колонок (5-кратный), два флакона по 100 см3.
Набор для подготовки проб кормов:
Буфер для экстракции, два флакона по 250 см3.