ГОСТ 34209-2017. Межгосударственный стандарт. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Иммуноферментный метод определения плевромутилинов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2017 № 1355-ст)
Примечание
Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 2, 2020. Документ введен в действие с 1 января 2019 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 октября 2017 г. № 1355-ст
КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛЕВРОМУТИЛИНОВ
Feeds, mixed feeds, raw material. Immunoenzymatic method for determination of pleuromutilins
Дата введения 1 января 2019 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 июля 2017 г. № 101-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 октября 2017 г. N 1355-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34209-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма, комбикормовое сырье и устанавливает иммуноферментный метод определения суммарного содержания плевромутилинов (тиамулина и вальнемулина).
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 <1> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 334-73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2652-78 Калия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-2016 Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.
3.1.2 вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.
3.1.3 рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ИФА — иммуноферментный анализ;
ТМБ — 3,3',5,5'-тетраметилбензидин;
4. Сущность метода
4.1 Иммуноферментный метод основан на измерении массовой концентрации ПМ в растворах экстрактов проб с помощью непрямого твердофазного конкурентного ИФА.
4.2 Непрямой твердофазный конкурентный ИФА основан на способности ПМ взаимодействовать со специфичными АТ, полученными против ВАЛ, в условиях конкуренции с белковым конъюгатом ВАЛ, нанесенным на поверхность лунок планшета — твердофазным АГ.
4.3 Связавшиеся с твердой фазой АТ выявляют путем измерения интенсивности окрашивания конечного продукта реакции: вторичных антивидовых АТ, меченных пероксидазой хрена, с субстрат-хромогенной смесью.
Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП), характеризующий степень взаимодействия АТ с АГ, обратно пропорционален массовой концентрации ПМ в растворе.
5. Предел обнаружения суммарного содержания плевромутилинов
5.1 Предел обнаружения суммарного содержания плевромутилинов представлен в таблице 1.
Пределы обнаружения суммарного содержания плевромутилинов
| Определяемый компонент | Предел обнаружения, мкг/кг |
|---|---|
| Суммарное содержание ВАЛ и ТИАЛ | 100 |
5.2 Специфичность АТ, применяемых для определения содержания плевромутилинов, выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования, представлена в таблице 2.
Специфичность АТ, применяемых для определения суммарного содержания плевромутилинов
| Определяемый компонент | Коэффициент перекрестного реагирования, % |
|---|---|
| ВАЛ | 100 |
| ТИАЛ | 30 |
6. Требования безопасности и условия выполнения измерений
6.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
6.2 Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.
6.3 К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой ИФА и изучившие инструкцию по применению тест-системы и инструкции по эксплуатации используемых приборов.
6.4 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- <a id="p100096"></a>температура окружающего воздуха .................. от 15 °C до 30 °C;
- <a id="p100097"></a>относительная влажность воздуха ...................... от 20% до 80%.
7. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, посуда и реактивы
7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и посуду:
- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,01 г;
- компьютер с установленным программным обеспечением для управления и обработки результатов измерений;
- фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционными светофильтрами для длин волн 450 нм;
- мельницу лабораторную;
- калькулятор любого типа с логарифмической функцией;
- систему получения деионизированной воды высокой чистоты;
- термостат любого типа, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;
- холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 2 °C до 8 °C;
- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 4750 об/мин и диапазоном температур от 4 °C до 25 °C, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см3;
- шейкер вертикального вращения 360° в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;
- шейкер вортексного типа, с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;
- шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры (95 +/- 5) °C;
- бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334, марки Н-1;
- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;
- колбы конические Кн-1-100(250)-24/29 ТС по ГОСТ 25336;
- пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03 — 0,3 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1,0%;
- пипетки одноканальные переменной вместимости 0,005 — 0,05; 0,1 — 1,0; 0,5 — 5,0 см3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по карбинолу и ацетонитрилу не более +/- 1%;
- пробирку стеклянную типа П 1-14-120 ХС по ГОСТ 25336;
- пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см3 с завинчивающимися крышками;
- пробирки микроцентрифужные вместимостью 1,5 см3;
- цилиндр 1-100-1 по ГОСТ 1770.
7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:
- ацетонитрил для ВЭЖХ-МС с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
- воду деионизированную для ВЭЖХ, полученную с использованием системы производства ультрачистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709;
- калия бихромат по ГОСТ 2652;
- кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную;
- тест-систему для непрямого твердофазного конкурентного ИФА в комплектации (см. приложение А), предназначенную для определения ПМ.
7.3 Допускается применение других средств измерений и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также вспомогательных устройств, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
8. Подготовка к выполнению измерений
8.1 Подготовка лабораторной посуды и оборудования
8.1.1 При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.
8.1.2 Подготовку и проверку фотометра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.
8.2 Приготовление растворов
8.2.1 Приготовление хромовой смеси
В колбе вместимостью 250 см3 взвешивают 5,0 г бихромата калия, растворяют в 50 см3 деионизированной воды, затем добавляют 100 см3 концентрированной серной кислоты.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес. Если раствор приобретает зеленый оттенок, его готовят заново.
8.2.2 Приготовление рабочего раствора реакционного буфера для промывки
В колбу вместимостью 100 см3 вносят 95 см3 деионизированной воды, добавляют 5 см3 реактива № 2 (см. приложение А), перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C — не более 1 мес.
8.2.3 Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата (ФК)
В стеклянную пробирку вносят 2,25 см3 реактива № 10 (см. приложение А) и 0,25 см3 реактива № 9 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 10 с.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.3 Отбор проб
8.3.1 Отбор проб кормов, комбикормов, комбикормового сырья производят в соответствии с ГОСТ 13496.0.
8.3.2 Пробы хранят согласно условиям хранения, установленным нормативной документацией на конкретную продукцию.
8.4 Подготовка проб
Пробу измельчают на лабораторной мельнице и проводят ее обработку в соответствии с рисунком 1.
| Взвешивают 1,0 г гомогенизированной пробы в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 |
v
| Добавляют 5 см3 ацетонитрила, интенсивно встряхивают и помещают на шейкер на 30 мин для экстракции |
v
| Помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин и температуре 20 °C |
v
| Отбирают аликвоту 0,2 см3, переносят в микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3 с 0,8 см3 реактива № 10 (см. приложение А) |
v
| Перемешивают на шейкере 10 с и используют для проведения ИФА в соответствии с разделом 9 |
|---|
Рисунок 1 — Подготовка проб кормов, комбикормов, комбикормового сырья
9. Проведение иммуноферментного анализа
9.1 Общие положения
9.1.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.
9.1.2 Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в пределах срока хранения.
9.1.3 Окрашивание раствора субстрата (приложение А) является признаком его порчи и делает невозможным его применение для анализа.
9.2 Подготовка тест-системы к проведению анализа
9.2.1 Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при температуре (23 +/- 5) °C не менее 30 мин, затем аккуратно встряхивают каждый флакон. Реактив № 2 (см. приложение А) необходимо прогреть в термостате при температуре 37 °C до полного растворения кристаллов солей и тщательно перемешать.
9.2.2 После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.
9.2.3 На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.
9.2.4 Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники пипеток переменной вместимости. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.
9.2.5 Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб (см. 8.4) и градуировочных растворов K0 — K5 (см. приложение А) анализируют в двух повторностях.
Примечание - Далее приведены расходы реактивов на два стрипа <1>, что достаточно для анализа двух проб. Для другого числа проб количество используемых стрипов и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством анализируемых проб.
<1> Стрип — полоска из восьми лунок.
9.3 Проведение анализа
9.3.1 Из планшета извлекают необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с зип-локом <2> при температуре от 2 °C до 8 °C в течение всего срока годности тест-системы.
<2> Зип-лок — замок, обеспечивающий герметизацию пакета.
9.3.2 Анализ проб и рабочих градуировочных растворов проводят в соответствии с рисунком 2.
| В лунки планшета вносят по 0,05 см3 рабочих градуировочных растворов K — K (см. приложение А) и экстрактов испытуемых проб (см. 8.4), 0 5 согласно схеме (см. приложение Б), начиная с минимальной концентрации. Каждый раствор вносят в двойной повторности |
v
| Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 раствора № 1-АТ (см. приложение А). Процедура внесения экстрактов испытуемых проб, градуировочных растворов, раствора № 1-АТ не должна превышать 15 мин |
v
| Растворы в лунках перемешивают аккуратным постукиванием по ребру рамки планшета |
v
| Заклеивают планшет пленкой для заклеивания планшетов либо закрывают крышкой, помещают его в полиэтиленовый пакет и плотно укупоривают. Выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 1 ч, избегая попадания прямого солнечного света |
v
| Содержимое лунок сливают и промывают планшет. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 см3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2) и сразу удаляют ее содержимое. Процедуру повторяют еще дважды. После этого тщательно стряхивают остатки раствора из лунок на фильтровальную бумагу |
v
| Во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 рабочего раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.3). Заклеивают планшет пленкой для заклеивания планшетов либо закрывают крышкой, помещают его в полиэтиленовый пакет и плотно укупоривают. Выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 1 ч, избегая попадания прямого солнечного света |
v
| Содержимое лунок сливают и промывают планшет. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 см3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2) и сразу удаляют ее содержимое. Процедуру повторяют еще дважды. После этого тщательно стряхивают остатки раствора из лунок на фильтровальную бумагу |
v
| Во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 реагента № 11 (см. приложение А). Выдерживают планшет в термостате при температуре 37 °C в течение 10 мин |
v
| Вносят во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности по 0,1 см3 стоп-реагента № 12 (см. приложение А) |
v
┌──────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
<pre class="legal-pre">│ Планшет устанавливают в держатель планшета спектрофотометра │
│ и измеряют ОП при длине волны 450 нм. Время измерения │
│ оптической плотности не должно превышать 10 - 15 мин │
│ после добавления стоп-реагента N 12 (см. приложение Б) │</pre>
└──────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
Рисунок 2 — Проведение анализа
10. Обработка результатов измерения
10.1 По показателям ОП в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений ОП для них в процентах от среднего не должна превышать 10.
Связывание АТ (или относительное поглощение) П, %, рассчитывают по формуле
\text{П } = \frac{\text{ОП}_{\text{к}}}{\text{ОП}_{0}} \cdot 100, (1)
где ОПк — среднее значение ОП, измеренной в лунках с градуировочными растворами ВАЛ K5 — K1, или экстрактами испытуемых проб;
ОП0 — среднее значение ОП, измеренной в лунках с градуировочным раствором K0 (приложение А).
По значениям процентов связывания, вычисленным для градуировочных растворов и соответствующим известным значением массовой концентрации ВАЛ (нг/см3), строят градуировочный график в полулогарифмической системе координат.
10.2 Для построения градуировочного графика используют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций ВАЛ в рабочих разведениях градуировочных растворов K5 — K1 (см. приложение А). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рассчитанные для массовых концентраций по формуле (1) и строят градуировочный график с использованием линейной зависимости.
10.3 С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного для растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифм массовой концентрации ПМ. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации определяемого ПМ в растворе экстракта.
10.4 Содержание ПМ в испытуемой пробе C, мкг/кг, рассчитывают по формуле
где c — массовая концентрация ПМ в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;
K — коэффициент пересчета мкг/дм3 в экстракте испытуемой пробы в мкг/кг, учитывающий как разведение, так и степень извлечения ПМ и равный 20.
Результаты измерений содержания ПМ, мкг/кг, округляют до целого числа.
Образец записи результатов измерений приведен в приложении В.
10.5 Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять массовую концентрацию (содержание) ПМ в анализируемой пробе по средним значением ОП, измеренным в лунках с градуировочными растворами и экстрактами испытуемых проб.
С помощью компьютерной системы обработки данных строят градуировочную зависимость оптической плотности раствора от массовой концентрации ВАЛ и аппроксимируют линейной функцией.
Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции R2 не менее 0,98.
Положительными считают пробы, показавшие значения содержания ПМ выше предела обнаружения (мкг/кг).
КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «ПЛЕВРОМУТИЛИНЫ — ИФА»
В комплектацию тест-системы входят:
Планшет 96-луночный полистироловый стрипованный, сенсибилизированный антигеном, готовый для использования
№ 1 — АТ — антитела кроличьи к плевромутилинам, прозрачная опалесцирующая жидкость кремового цвета, готовая для использования, 6,0 см3;
№ 2 — БУФЕР-ОТ — раствор фосфатного буфера с добавлением твина-20 (20-кратный концентрат), значение pH (7,2 +/- 0,5) ед. pH, прозрачная бесцветная жидкость, 20,0 см3;
№ 3 — 8 - Градуировочные растворы вальнемулина K0 - K5 с концентрациями 0; 0,5; 2; 4; 16; 48 нг/см3, 1 см3;
№ 9 — Конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена (10-кратный концентрат), прозрачная бесцветная жидкость, 2,0 см3;
№ 10 — Реакционный буферный раствор с добавлением твина-20 и бычьего сывороточного альбумина, значение pH 7,0 — 7,4 ед. pH, стерильный, прозрачная бесцветная жидкость, 2 флакона по 20,0 см3;
№ 11 — Раствор субстрата на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина с добавлением перекиси водорода, прозрачная бесцветная жидкость, готовая для использования, 11,0 см3;
№ 12 — Стоп-реагент — раствор серной кислоты с молярной концентрацией 0,5 моль/дм3, прозрачная бесцветная жидкость, готовая для использования, 11,0 см3.
СХЕМА ЗАПОЛНЕНИЯ ЛУНОК ПЛАНШЕТА
Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме:
ТАБЛИЦА ДЛЯ ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ