ГОСТ 34104-2017. Межгосударственный стандарт. Корма и кормовые добавки. Метод идентификации генетически модифицированных линий сои, кукурузы и рапса с использованием ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2017 № 593-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов государств — членов Евразийского экономического союза, а также методик исследований (испытаний) и измерений, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности зерна» (ТР ТС 015/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2024 № 134). Документ введен в действие с 1 июля 2018 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2017 г. № 593-ст
МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИНИЙ СОИ, КУКУРУЗЫ И РАПСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
Feed and feed additives. Method of identification of genetically modified events of soybean, maize and rapeseed using PCR with hybridization-fluorescence detection in real time
Дата введения 1 июля 2018 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 июня 2017 г. № 51)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2017 г. № 593-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34104-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на корма: фуражное зерно, продукты его переработки; растительные корма; комбикорма для продуктивных и непродуктивных животных и сырье для их производства; кормовые добавки и устанавливает метод идентификации генно-модифицированной сои (далее — ГМ сои), генно-модифицированной кукурузы (далее — ГМ кукурузы) и генно-модифицированного рапса (далее — ГМ рапса) методом полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты <*>
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды, размещение и обслуживание
ГОСТ ISO 6497-2014 Корма. Отбор проб
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 24760-81 Халаты медицинские женские. Технические условия
ГОСТ 25194-82 Халаты медицинские мужские. Технические условия
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 31719-2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 амплификация: Процесс, многократно увеличивающий число копий фрагмента генома какого-либо организма.
3.2 генно-модифицированные (генно-инженерные, трансгенные) организмы; ГМО: Организм или несколько организмов, любое неклеточное, одноклеточное или многоклеточное образование, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и/или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинации генов.
3.3 линия генно-модифицированного растения (генетически модифицированная линия, ГМ линия): Потомство от одного определенного генно-инженерно-модифицированного организма.
3.4 нуклеиновые кислоты; НК: Макромолекулы, являющиеся носителями генетической информации или выступающие в качестве посредника при синтезе полипептидной цепи.
3.5 нуклеотидная последовательность: Порядок чередования нуклеотидных остатков в НК.
3.6 отрицательный контроль ПЦР; К-: Реакционная смесь для проведения ПЦР, заведомо не содержащая целевой нуклеиновый материал.
3.7 отрицательный контроль выделения (контроль чистоты выделения); КВ: Контроль, прошедший все этапы выделения ДНК, но в отсутствие анализируемой пробы.
3.8 отрицательный контрольный образец; ОКО: Реакционная смесь, используемая вместо анализируемой пробы для контроля чистоты выделения ДНК.
3.9 полимеразная цепная реакция; ПЦР: Циклический ферментативный процесс, результатом которого является получение многочисленных копий определенного участка молекулы ДНК.
3.10 положительный контроль ПЦР; К+: Реакционная смесь для проведения ПЦР, заведомо содержащая целевой нуклеиновый материал.
3.11 полимеразная цепная реакция в режиме реального времени: Полимеразная цепная реакция, проводимая по специальной технологии, которая позволяет регистрировать накопление ПЦР-продуктов в процессе амплификации.
3.12 ПЦР-продукт: Фрагмент ДНК, амплифицированный в ПЦР.
3.13 праймер: Искусственно синтезируемая короткая последовательность нуклеотидов, комплементарная определенному участку целевой ДНК, используемая в полимеразной цепной реакции.
3.14 промотор: Последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за начало транскрипции.
3.15 пороговый цикл Ct: Цикл амплификации, в котором кривая флуоресценции исследуемого образца пересекает линию порога (Threshold).
3.16 терминатор: Последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за прекращение транскрипции.
3.17 целевая ДНК: Выбранная для амплификации последовательность ДНК.
3.18 экстракция ДНК: Обработка анализируемой пробы, высвобождающая ДНК.
3.19 элюция: Извлечение вещества из твердого носителя вымыванием подходящим растворителем.
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025, ГОСТ 31719 (приложение А).
4.1.2 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218 и ГОСТ ИСО/МЭК 17025.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 В лаборатории должно быть организовано обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.2 При работе с химическими реактивами необходимо соблюдать общие требования безопасности обращения с вредными веществами, установленные ГОСТ 12.1.007.
4.2.3 Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 При работе с электроустановками следует соблюдать требования электробезопасности, установленные в ГОСТ Р 12.1.019.
4.2.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, должно быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
5 Оборудование, материалы, реагенты
5.1 Общие требования к оборудованию — по ИСО/МЭК 17025.
5.2 При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719, с дополнением:
- бокс ламинарный, класс биологической безопасности II тип А2;
- термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 100 °C;
- отсасыватель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
- центрифуга для микропробирок вместимостью 1,5 см3, со скоростью вращения не менее 12000 об/мин;
- миницентрифуги-встряхиватели с роторами для микропробирок вместимостью 0,2; 0,6 и 1,5 см3, со скоростью вращения не менее 2400 об/мин;
- микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1,5 см3;
- микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0,2 см3;
- одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером объемом 10 мм3, 100 мм3, 200 мм3, 1000 мм3;
- ПЦР-бокс;
- прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени <*>;
<*> Прибор для проведения ПЦР «Rotor-Gene» 2000/3000/6000 («Corbett Research», Австралия), «Rotor Gene Q» («Qiagen», Германия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
- халаты медицинские по ГОСТ 24760 и ГОСТ 25194;
- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678, обеспечивающий поддержание температуры от 2 °C до 8 °C, с морозильной камерой, обеспечивающей поддержание температуры не выше минус 16 °C.
Допускается использование другого оборудования, материалов с техническими характеристиками не ниже указанных.
Допускается использование роботизированных станций для пробоподготовки, выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и раскапывания готовой многокомпонентной смеси для ПЦР.
5.3 При проведении испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК, реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации. Для экстракции ДНК допускается использовать готовые наборы <**>.
<**> Примером могут служить наборы «ДНК-СОРБ-С» (ФГБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, форма 1 ref K1-6-50/ver. 05/08/16), «Сорб-ГМО-А» и «Сорб-ГМО-Б» (ЗАО «Синтол», каталожный номер GM-503). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
5.3.1 Реагенты:
а) набор реагентов для экстракции ДНК, включающий:
-
буфер для лизирующего реагента, содержащий хаотропный агент гуанидин хлорид;
-
раствор для отмывки № 1 для очистки от клеточных белков, содержащий хаотропный агент гуанидин тиоцианат;
-
раствор для отмывки № 2 для очистки от солей, содержащий водный раствор изопропилового спирта;
-
сорбент (25%-ная взвесь частиц силикагеля SiO2 размером от 20 до 50 мкм в растворе Трис-HCl молярной концентрации 5 ммоль/дм3);
-
буфер для элюции ДНК (TE-буфер) — Трис-HCl молярной концентрации 10 ммоль/дм3; натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты молярной концентрации 1 ммоль/дм3;
б) вода деионизированная, класса чистоты I, свободная от рибонуклеаз, дезоксирибонуклеаз, неорганических и органических примесей с удельным сопротивлением не менее 18 Мом·см;
г) смесь олигонуклеотидов (праймеры) по 5.3.2 или 5.3.3;
д) смесь олигонуклеотидов (зонды, меченные флуоресцентными красителями FAM и R6G) по 5.3.2 или 5.3.3;
е) раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), содержащий натриевые соли дНТФ со степенью очистки более 98% и концентрацией каждой 2 моль/дм3;
ж) термостабильная Taq-полимераза;
и) сертифицированные стандартные образцы ГМ линий сои, ГМ линий кукурузы или ГМ линий рапса <*>.
<*> Сертифицированные стандартные образцы производства IRMM, Бельгия; AOCS, США (материалы, состоящие из высушенной гомогенизированной муки соевых бобов, рапса или кукурузы, включающих смеси ГМ и не ГМ растений соответствующих видов, содержащие от 0,1% до 100% генетически модифицированных материалов). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Допускается использование других реагентов с техническими характеристиками не хуже указанных.
5.3.2 Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК растений допускается использование наборов реагентов (готовых тест-систем), содержащих праймеры, специфичные к ДНК определенного вида растений.
5.3.3 Допускается использование синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий сои, кукурузы и рапса. Список последовательностей всех используемых олигонуклеотидов приведен в таблицах 1 - 3, где указаны последовательности:
- для прямых и обратных праймеров и зондов <**>, специфичных конкретной ГМ линии;
<**> Маркировки в наименовании: «F» — прямой праймер, «R» — обратный праймер, «P» — зонд.
- прямых и обратных праймеров и зондов, специфичных фрагменту генома растения (ген лектина для сои, ген зеина для кукурузы, ген круциферина A для рапса).
Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий сои
Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий кукурузы
Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий рапса
6 Сущность метода
6.1 Сущность метода идентификации ГМ линий сои, кукурузы и рапса методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка видоспецифичной ДНК растений (сои, кукурузы или рапса) и части генно-инженерной конструкции, специфичной для генома тестируемой генетически модифицированной линии.
6.2 Метод состоит из следующих этапов:
- экстракция и очистка ДНК: на данном этапе осуществляется лизис клеток с последующей очисткой ДНК от балластных веществ (белков, полисахаридов и других соединений);
- ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов, меченных флуоресцентным красителем. На данном этапе осуществляется накопление копий целевого участка ДНК и детекция ПЦР-продуктов в режиме «реального времени»;
- анализ и интерпретация результатов происходит на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флюоресценции от количества циклов, что соответствует значениям порогового цикла Ct.
7 Отбор проб
Общие правила отбора проб для испытаний должны соблюдаться в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 6497.
8 Экстракция ДНК
8.1 Экстракцию ДНК из анализируемой пробы осуществляют с использованием набора реагентов для экстракции ДНК сорбционным методом по 5.3 или иным методом, позволяющим получить достаточный объем ДНК для последующих исследований. Объем ДНК, необходимый для проведения исследований, вычисляют по формулам:
где Vи — объем ДНК, необходимый для проведения идентификации линий;
N — количество идентифицируемых линий;
где Vк — объем ДНК, необходимый для проведения количественного анализа.
8.2 Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки № 1 (если они хранились при температуре от 2 °C до 8 °C) прогревают на поверхности твердотельного термостата при температуре от 60 °C до 64 °C до полного растворения кристаллов.
8.3 Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 см3 (включая отрицательный контроль выделения). В пробирки вносят анализируемые пробы. В пробирку отрицательного контроля выделения ДНК вносят 100 мм3 ОКО.
8.4 Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером вносят в каждую пробирку по 400 мм3 буфера для лизирующего реагента и по 17 мм3 лизирующего реагента. Тщательно перемешивают содержимое пробирок на встряхивателе в течение 10 с.
8.5 Пробирки инкубируют в термостате при температуре 64 °C в течение 1 ч, периодически встряхивая на встряхивателе (пять раз через каждые 10 — 12 мин).
8.6 Нерастворенные частицы анализируемой пробы осаждают центрифугированием при 12 — 14 тыс. об/мин в течение 5 мин.
8.7 Надосадочную жидкость в объеме 200 — 350 мм3 очень аккуратно (так, чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отбирают отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и переносят в новые пробирки.
8.8 Пробирки с надосадочной жидкостью прогревают в течение 5 мин в термостате при температуре 64 °C, перемешивают содержимое пробирок и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об/мин для сброса капель с крышки пробирки.
8.9 В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 25 мм3 сорбента, предварительно помещенного во встряхиватель для получения однородной суспензии. Содержимое пробирок перемешивают на встряхивателе и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 — 15 мин, перемешивая через каждые 2 мин. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
8.10 В пробирки добавляют по 300 мм3 раствора для отмывки № 1. Перемешивают на встряхивателе до полного ресуспендирования сорбента. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
8.11 Процедуру отмывки повторяют дважды, используя по 500 мм3 раствора для отмывки № 2, и центрифугируют в течение 30 с при 7 тыс. об/мин, удаляют надосадочную жидкость полностью.
8.12 Пробирки с отмытым сорбентом помещают в термостат при температуре 64 °C на 10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
8.13 В пробирки добавляют по 50 мм3 буфера для элюции ДНК и перемешивают на встряхивателе. Помещают в термостат при температуре 64 °C на 5 мин и периодически (один раз в минуту) встряхивают на встряхивателе. Пробирки центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин.
8.14 Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК, которую затем используют для постановки ПЦР и проведения амплификации. Очищенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 °C до 8 °C и в течение года при температуре не выше минус 16 °C. Для этого рекомендуется перенести надосадочную жидкость в чистую микропробирку.
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)
9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси
Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения генетически модифицированной линии сои, кукурузы или рапса берут 1 мм3 деионизированной воды, по 1 мм3 каждого соответствующего праймера с маркировкой «F» по 5.3.2 концентрацией 5·10-6 моль/дм3, по 1 мм3 каждого праймера с маркировкой «R» по 5.3.2 концентрацией 5·10-6 моль/дм3, по 1 мм3 каждого зонда с маркировкой «P» по 5.3.2 концентрацией 3·10-6 моль/дм3, 3 мм3 раствора дНТФ и смешивают в пробирке вместимостью 1,5 см3. Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 °C — не более 12 мес.
9.2 Постановка ПЦР
9.2.1 ДНК, экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее чем в двух повторностях.
9.2.2 Для проведения ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм3 ПЦР-смеси по 9.1, к которой добавляют 5 мм3 ПЦР-буфера и 0,5 мм3 термостабильной Taq полимеразы. Смесь перемешивают на встряхивателе, осаждая кратковременным центрифугированием.
9.2.3 Вносят по 15 мм3 смеси, полученной по 9.2.2, в микропробирку вместимостью 0,2 см3, затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм3 ДНК, полученной из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакционной смеси — 25 мм3.
Примечание - Необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
9.3 Контрольные реакции амплификации:
- отрицательный контроль ПЦР (К-) — вместо ДНК-пробы в микропробирку с 15 мм3 смеси по 9.2.2 вносят 10 мм3 TE-буфера;
- положительный контроль ПЦР (К+) — вместо ДНК-пробы в микропробирку с 15 мм3 смеси по 9.2.2 вносят 10 мм3 1%-ного стандартного образца состава ГМ сои, ГМ кукурузы или ГМ рапса.
9.4 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Программируют прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Программы амплификации для идентификации линий ГМ сои, кукурузы и рапса различаются для разных ГМ линий и приведены в таблицах 4 - 11.
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий 40-3-2, A5547-127, A2704-12 приведена в таблице 4.
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий 40-3-2, A5547-127, A2704-12
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Удерживание | 95 °C | 15 мин | 1 | - |
| Циклирование | 95 °C | 15 с | 45 | - |
| 60 °C | 30 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow | ||
| 72 °C | 30 с | - | - |
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий MON87701, BPS-CV127-9, FG72 приведена в таблице 5.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий сои MON87701, BPS-CV127-9, FG72
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий MON89788, SYHTOH2, DP-305423, DP-356043, MON87705, MON87708, MON87769 приведена в таблице 6.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий сои MON89788, SYHTOH2, DP-305423, DP-356043, MON87705, MON87708, MON87769
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 15 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 45 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линии DAS-44406, DAS-81419 приведена в таблице 7.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий сои DAS-44406, DAS-81419
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 10 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 40 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линии DAS-68416 приведена в таблице 8.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий сои DAS-68416
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 10 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 45 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Программа амплификации для идентификации ГМ кукурузы линий MON98140, MIR162, 5307, Bt176, MIR604, 3272 приведена в таблице 9.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий кукурузы MON98140, MIR162, 5307, Bt176, MIR604, 3272
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 10 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 40 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Программа амплификации для идентификации ГМ кукурузы линий TC1507, MON87460, LY038, DAS40278-9, MON89034, MON810, NK603, T25, GA21, MON863, MON88017 приведена в таблице 10.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий кукурузы TC1507, MON87460, LY038, DAS40278-9, MON89034, MON810, NK603, T25, GA21, MON863, MON88017
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 10 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 45 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Программа амплификации для идентификации ГМ кукурузы линий 59122, Bt11. приведена в таблице 11.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий кукурузы 59122, Bt11
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 10 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 50 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Программа амплификации для идентификации ГМ рапса линий GT73, MON88302, RF2, MS1, MS8, T45, RF1, RF3, Topas19/2 приведена в таблице 12.
Программа амплификации для идентификации ГМ линий рапса линий GT73, MON88302, RF2, MS1, MS8, T45, RF1, RF3, Topas19/2
| Стадия | Температура | Время | Количество циклов | Детекция |
| Hold/Удержание температуры | 95 °C | 15 мин | 1 | - |
| Cycling/Циклирование | 95 °C | 15 с | 40 | - |
| 60 °C | 60 с | По каналам FAM/Green, JOE/Yellow |
Детекцию флуоресцентного сигнала проводят на каналах FAM и JOE. По каналу FAM регистрируют уровень флуоресценции участка части генно-инженерной конструкции, специфичной для генома тестируемой генетически модифицированной линии, по каналу JOE — для эндогенной ДНК ГМ сои, ГМ кукурузы, ГМ рапса. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с использованием программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR).
9.5 Учет и интерпретация результатов
9.5.1 Полученные в ходе испытания данные (кривые накопления флуоресцентного сигнала) анализируют по нескольким каналам детекции с использованием программного обеспечения прибора.
9.5.2 Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует значению порогового цикла Ct.
9.5.3 Учет результатов испытания следует начинать с результатов амплификации ДНК контрольных образцов в соответствии с таблицами оценки результатов контрольных реакций (таблицы 8 - 11). Для положительного контроля ПЦР в таблицах результатов по каналам FAM/Green и JOE/Yellow должны присутствовать значения порогового цикла Ct соответствующих значений в зависимости от программы амплификации. Для отрицательного контроля экстракции и отрицательного контроля ПЦР значения порогового цикла Ct по всем каналам должны отсутствовать. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР (К+) или превышение граничного значения Ct, указанного в таблице, может свидетельствовать об ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести этап ПЦР повторно.
Оценка результатов контролей для таблиц 4, 6, 8, 10
| Контроли | Контролируемый этап испытаний | Значение Ct по каналу | |
| FAM/Green | JOE/Yellow | ||
| В- | Экстракция ДНК | Нет значений | Нет значений |
| К- | ПЦР | Нет значений | Нет значений |
| К+ | ПЦР | <= 31 | <= 31 |
| Проба | <= 37 | <= 35 | |
В образце обнаружена ДНК сои/кукурузы, если для данной пробы в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла Ct <= 35 (таблица 13). При получении значения Ct > 35 по каналу JOE/Yellow для анализируемой пробы требуется повторное испытание данной пробы, начиная с первого этапа испытаний (экстракция ДНК). При повторном получении аналогичного результата образец считают не подлежащим испытанию из-за низкого содержания в нем ДНК кукурузы/сои.
ДНК ГМ линии считают обнаруженной, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green определено значение порогового цикла Ct <= 37.
Оценка результатов контролей для таблиц 5, 7, 9
| Контроли | Контролируемый этап испытаний | Значение Ct по каналу | |
| FAM/Green | JOE/Yellow | ||
| В- | Экстракция ДНК | Нет значений | Нет значений |
| К- | ПЦР | Нет значений | Нет значений |
| К+ | ПЦР | <= 21 | <= 21 |
| Проба | <= 27 | <= 25 | |
В образце обнаружена ДНК сои/кукурузы, если для данной пробы в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла Ct <= 25 (таблица 14). При получении значения Ct > 25 по каналу JOE/Yellow для анализируемой пробы требуется повторное испытание данной пробы, начиная с первого этапа испытаний (экстракция ДНК). При повторном получении аналогичного результата образец считают не подлежащим анализу из-за низкого содержания в нем ДНК кукурузы/сои.
ДНК ГМ линии обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green определено значение порогового цикла Ct <= 27.
Оценка результатов контролей для таблицы 11
| Контроли | Контролируемый этап испытаний | Значение Ct по каналу | |
| FAM/Green | JOE/Yellow | ||
| В- | Экстракция ДНК | Нет значений | Нет значений |
| К- | ПЦР | Нет значений | Нет значений |
| К+ | ПЦР | <= 35 | <= 35 |
| Проба | <= 40 | <= 37 | |
В образце обнаружена ДНК кукурузы, если для данной пробы в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла Ct <= 37 (таблица 15). При получении значения Ct > 37 по каналу JOE/Yellow для анализируемой пробы требуется повторное испытание данной пробы, начиная с первого этапа испытаний (экстракция ДНК). При повторном получении аналогичного результата образец считают не подлежащим анализу из-за низкого содержания в нем ДНК кукурузы.
ДНК ГМ линии обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green определено значение порогового цикла Ct <= 40.
Оценка результатов контролей для таблицы 12
| Контроли | Контролируемый этап испытаний | Значение Ct по каналу | |
| FAM/Green | JOE/Yellow | ||
| B- | Экстракция ДНК | Нет значений | Нет значений |
| K- | ПЦР | Нет значений | Нет значений |
| K+ | ПЦР | <= 31 | <= 31 |
| Проба | <= 37 | <= 37 | |
В образце обнаружена ДНК рапса, если для данной пробы в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла Ct <= 37 (таблица 16). При получении значения Ct > 37 по каналу JOE/Yellow для анализируемой пробы требуется повторное испытание данной пробы, начиная с первого этапа испытаний (экстракция ДНК). При повторном получении аналогичного результата образец считают не подлежащим анализу из-за низкого содержания в нем ДНК рапса.
ДНК ГМ линии обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу FAM/Green определено значение порогового цикла Ct <= 37.
9.5.4 Проверка условий достоверности испытаний
9.5.4.1 Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР (К+) или превышение граничных значений Ct, указанных в таблицах 13 - 16, может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести этап ПЦР повторно.
9.5.4.2 Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля экстракции (на любом из каналов) и для отрицательного контроля ПЦР (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
9.5.4.3 При получении значения Ct в таблице результатов по каналам Yellow и/или Green для анализируемой пробы более указанных пороговых значений Ct требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК. При повторном получении аналогичного результата образец считают не подлежащим анализу из-за низкого содержания в нем растительной ДНК и/или ДНК ГМ линии.
А.1 ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (отдельные комнаты или помещения) для каждой из стадий ПЦР-диагностики.
А.2 Рабочая зона ПЦР-лаборатории в соответствии с этапами ПЦР-исследования должна включать следующий минимальный набор изолированных помещений:
- приема и регистрации лабораторной пробы;
- первичной обработки лабораторной пробы, подготовки анализируемой пробы (I зона, отдельный ламинар);
- выделения НК из анализируемой пробы (I зона, отдельный ламинар).
Примечание - Помещения, где проводят работы по выделению и амплификации НК, располагают как можно дальше от помещения для детекции и учета результатов ПЦР с целью исключения движения воздушного потока и предотвращения контаминации продуктами амплификации (ампликонов), поскольку в процессе ПЦР фрагменты ДНК накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации;
- приготовления реакционных смесей, постановки ПЦР (II зона);
- гибридизационно-флюоресцентной детекции и учета результатов испытания методом Real Time PCR (III зона).
Рисунок А.1 — Схема ПЦР-лаборатории
А.3 Работа в ПЦР-лаборатории должна быть организована в одном направлении: от зон выделения и амплификации НК к зоне детекции и учета результатов ПЦР. В разных зонах лаборатории должны работать разные сотрудники.
А.4 Не допускается выполнение ПЦР-исследований в помещениях для проведения работ другими лабораторными и генно-инженерными методами (клонирование, секвенирование, рестрикционный анализ).
Все работы по подготовке испытуемых проб и выделению НК проводят в ламинарном боксе II, III классов защиты.
А.5 Каждая рабочая зона должна иметь свой набор лабораторной мебели, оборудования, реагентов, автоматических пипеток, расходных материалов, лабораторной посуды, защитной одежды, обуви, уборочного инвентаря и др. Имущество должно иметь маркировку, использование его в других помещениях или для проведения других работ запрещено.
А.6 Для проведения ПЦР-исследований необходимо использовать только одноразовые микропробирки и наконечники. Для предотвращения аэрозольного загрязнения автоматических пипеток используют наконечники с антиаэрозольным фильтром. Пробирки и наконечники для автоматических пипеток используют однократно. При переходе от одной пробы к другой обязательно меняют наконечники с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК, РНК или при раскапывании реакционной смеси.
А.7 Работы по подготовке реакционной смеси для ПЦР, внесению выделенных НК в ПЦР-смесь проводят в ПЦР-боксах, оснащенных ультрафиолетовыми лампами.
Регулярно следует проводить мониторинг помещений, оборудования, рабочих поверхностей, дверных ручек на наличие продуктов амплификации.