ГОСТ 33780-2016. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, корма, комбикорма. Определение содержания афлатоксина B1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением очистки на оксиде алюминия
(введен в действие Приказом Росстандарта от 23.05.2016 № 374-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов государств — членов Евразийского экономического союза, а также методик исследований (испытаний) и измерений, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности зерна» (ТР ТС 015/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.11.2024 № 134). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности алкогольной продукции» (ТР ЕАЭС 047/2018) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 17.05.2022 № 80). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ введен в действие с 01.07.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 мая 2016 г. № 374-ст
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, КОРМА, КОМБИКОРМА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АФЛАТОКСИНА B1 МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ОЧИСТКИ НА ОКСИДЕ АЛЮМИНИЯ
Foodstuffs, feeds, compound feeds. Determination of aflatoxin B1 content by method of high performance liquid chromatography using aluminum oxide clean-up
65.120
Дата введения 1 июля 2017 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Обществом с ограниченной ответственностью «Люмэкс-маркетинг» (ООО «Люмэкс-маркетинг»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 20 апреля 2016 г. № 87-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 мая 2016 г. № 374-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33780-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, корма, комбикорма и сырье для их производства и устанавливает метод определения массовой доли афлатоксина B1 с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) после очистки экстракта на колонке с оксидом алюминия. Настоящий стандарт не распространяется на кофе, кофепродукты, а также продукты питания для детей, беременных и кормящих женщин.
Диапазон измерений массовой доли афлатоксина B1 составляет от 0,0002 до 0,05 млн-1.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 <1> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 84-76 Реактивы. Натрий углекислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <2> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры
ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 33303-2015 Продукты пищевые. Методы отбора проб для определения микотоксинов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Отбор и подготовка лабораторных проб
Отбор и подготовка лабораторных проб — по ГОСТ 33303.
4 Требования безопасности
При проведении испытаний следует соблюдать требования:
- электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и технической документацией на хроматограф;
- взрывобезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.010;
- пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004;
- безопасности при работе с вредными веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Афлатоксин B1 - высокотоксичное вещество, которое вызывает поражение печени и является канцерогеном. При работе с ним, его растворами, а также при работе с пробами, которые содержат или могут содержать афлатоксин B1, следует соблюдать правила безопасности, изложенные в приложении А.
5 Сущность метода
Метод основан на экстракции афлатоксина B1 из пробы смесью ацетонитрил — вода, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия, переводе афлатоксина B1 в интенсивно флуоресцирующее соединение обработкой трифторуксусной кислотой (далее — ТФУ), определении массовой доли афлатоксина B1 в форме ТФУ-производного методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы, посуда и материалы
6.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим или спектрофлуориметрическим детектором, обеспечивающим возбуждение флуоресценции в спектральной области (365 +/- 20) нм и регистрацию интенсивности флуоресценции в спектральной области (440 +/- 20) нм. Применяемый детектор должен обеспечивать предел обнаружения афлатоксина B1 не более 0,3 нг/см3.
6.2 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,01 г.
6.3 Колонка хроматографическая аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм, например колонка внутренним диаметром 2,1 мм длиной 150 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом Кромасил С-18, Alltima C18, снабженная предколонкой длиной 10 мм <1>.
<1> Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.
6.4 Предколонка того же внутреннего диаметра и заполненная тем же обращенно-фазовым сорбентом, что и аналитическая колонка.
6.5 Испаритель ротационный, снабженный водяной баней с регулятором температуры в диапазоне от 20 °C до 50 °C.
6.6 Насос лабораторный вакуумный, мембранный или водоструйный по ГОСТ 25336, обеспечивающий разрежение от 2,5 до 10 кПа.
6.7 Устройство для перемешивания проб (шейкер), обеспечивающее частоту встряхивания до 120 мин-1, по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.8 Шкаф сушильный, обеспечивающий температуру до 200 °C.
6.9 Измельчитель проб, обеспечивающий измельчение до частиц размером менее 1 мм, например лабораторная мельница по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.10 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
6.11 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 мин-1.
6.12 Стандартный образец, принятый в соответствии с нормативными документами, действующими на территории государства, принявшего стандарт, состава раствора афлатоксина B1 в ацетонитриле массовой концентрации 10 мкг/см3 с погрешностью аттестованного значения не более +/- 0,5 мкг/см3. Допускается применение стандартных образцов состава раствора афлатоксина B1 в других растворителях с тем же или иным значением массовой концентрацией афлатоксина B1, а также кристаллического афлатоксина B1 с массовой долей основного вещества не менее 98%, что должно быть учтено при приготовлении исходного раствора по 8.3.2.
6.13 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
6.14 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, оптическая плотность относительно дистиллированной воды при 200 нм не более 0,025, массовая доля воды не более 0,03%.
6.15 Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч. или ч.д.а.
6.16 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.
6.17 Кислота трифторуксусная с массовой долей основного вещества не менее 98% по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.18 Гексан, х.ч., по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.19 Алюминия оксид для хроматографии нейтральный или щелочной, фракция от 50 до 150 мкм по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.20 Натрий углекислый 10-водный по ГОСТ 84, х.ч. или ч.д.а.
6.21 Пипетки градуированные 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5, 1-2-2-10 или других типов и исполнений по ГОСТ 29227.
6.22 Цилиндры мерные 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-250-2 или других исполнений по ГОСТ 1770.
6.23 Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.
6.24 Пробирки одноразовые (типа Эппендорф) вместимостью 1,5 см3.
6.25 Дозаторы переменного объема от 100 до 1000 мм3 с метрологическими характеристиками, соответствующими ГОСТ 28311.
6.26 Колбы остродонные О-10-14/23, О-25-14/23 и О-50-14/23 по ГОСТ 25336.
6.27 Колбы плоскодонные П-1-50-29/32, П-1-100-29/32, П-1-250-29/32, П-1-500-29/32, П-1-1000-29/32 или Кн-1-50-29/32, Кн-1-100-29/32, Кн-1-250-29/32, Кн-1-500-29/32, Кн-1-1000-29/32 по ГОСТ 25336.
6.28 Воронки делительные типа ВД исполнений 1 или 3 вместимостью 50 см3 по ГОСТ 25336 (применяются при испытаниях масложировой продукции).
6.29 Воронки лабораторные типа B по ГОСТ 25336.
6.30 Колонка хроматографическая стеклянная с пришлифованной пробкой (длина 20 см, внутренний диаметр 10 мм)
6.31 Фильтры бумажные «красная лента» по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.32 Стеклянные емкости вместимостью 250, 1000 см3 с пришлифованными стеклянными, фторопластовыми или полиэтиленовыми пробками по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.33 Часы песочные или таймер по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6.34 Вата медицинская по ГОСТ 5556.
6.35 Спектрофотометр, обеспечивающий измерения оптической плотности в диапазоне от 340 до 400 нм с погрешностью не более +/- 1% (требуется только при приготовлении исходного раствора афлатоксина B1 из кристаллического препарата согласно 8.3.2).
6.36 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не хуже вышеуказанных, вспомогательного оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже вышеуказанных, а также химических реактивов аналогичной или более высокой квалификации.
7 Условия проведения испытаний
При подготовке к проведению испытаний и проведении испытаний в лаборатории соблюдают следующие условия:
В лабораторных помещениях не должно быть загрязненности воздуха рабочей зоны пылью и агрессивными веществами, должны отсутствовать вибрация или другие факторы, влияющие на результаты испытаний.
8 Подготовка к проведению испытаний
8.1 Подготовка стеклянной посуды
Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы моют только серной кислотой по 6.15 без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой.
Остальную стеклянную посуду моют горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °C.
8.2 Приготовление вспомогательных растворов
8.2.1 Приготовление подвижной фазы ацетонитрил — дистиллированная вода в объемном соотношении 23:77
В коническую или плоскодонную колбу вместимостью 500 см3 помещают 115 см3 ацетонитрила и 385 см3 дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают.
При хранении подвижной фазы недопустимо использование резиновых и корковых пробок.
Срок хранения подвижной фазы при комнатной температуре в стеклянной емкости с пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой — не более 3 мес.
Перед использованием подвижную фазу дегазируют и фильтруют в соответствии с указаниями изготовителя хроматографа и (или) колонки.
1 В зависимости от типа сорбента и типоразмера применяемых колонок допускается варьирование состава подвижной фазы в диапазоне объемной доли ацетонитрила от 20% до 25% с целью оптимизации отделения пика афлатоксина B1 от пиков компонентов матрицы пробы. Рекомендации по оптимизации состава подвижной фазы приведены в приложении Б.
2 При наличии технической возможности допускается использование градиентной техники элюирования. Состав подвижных фаз и программу элюирования оптимизируют в соответствии с рекомендациями изготовителя колонок. Например, для колонок по 6.3 рекомендуется следующий режим: объемная доля ацетонитрила, % (время, мин) — 15 (0) — 15 (2) — 40 (19) — 40 (24).
8.2.2 Приготовление смеси ацетонитрила и дистиллированной воды в объемном соотношении 9:1
В плоскодонную или коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 180 см3 ацетонитрила и 20 см3 дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения смеси при комнатной температуре в стеклянной емкости с пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой — 3 мес.
8.2.3 Приготовление раствора хлорида натрия с массовой концентрацией 40 г/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 4,0 г хлорида натрия, добавляют 30 — 50 см3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят объем дистиллированной водой до метки и снова перемешивают.
Срок хранения при комнатной температуре — 3 мес.
8.3 Приготовление растворов афлатоксина B1
8.3.1 Общие положения
Растворы афлатоксина B1 должны храниться в темноте при температуре не выше 6 °C в стеклянных сосудах с фторопластовыми или пришлифованными стеклянными пробками.
8.3.2 Приготовление исходного раствора афлатоксина B1 с номинальным значением массовой концентрации 50 нг/см3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают пипеткой или дозатором 0,5 см3 стандартного образца состава раствора афлатоксина B1 номинального значения массовой концентрации 10 мкг/см3 (6.12) и доводят до метки ацетонитрилом (6.14).
Срок хранения исходного раствора в холодильнике при температуре от 2 °C до 6 °C — не более 6 мес. Рекомендуется использовать сосуды из темного стекла, а сосуды из бесцветного стекла заворачивать в материалы, не пропускающие свет (например, алюминиевую фольгу).
Фактическое значение массовой концентрации афлатоксина B1 в исходном растворе (Cисх, нг/см3) вычисляют по формуле
C_{\text{исх}} = \frac{C_{\text{СО}} \cdot V_{\text{СО}}}{V_{\text{исх}}} \cdot 1000 , (1)
где CСО — значение массовой концентрации афлатоксина B1 в стандартном образце, мкг/см3;
VСО — объем стандартного образца состава раствора афлатоксина B1, отобранный для приготовления исходного раствора, см3 (0,5 см3);
Vисх — объем приготовленного исходного раствора, см3 (100 см3);
1000 — коэффициент согласования размерности единиц массы.
1 При использовании стандартного образца состава раствора афлатоксина B1 в других растворителях аликвоту (0,5 см3) упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 °C до 45 °C. Сухой остаток растворяют в ацетонитриле и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и разбавляют до метки ацетонитрилом.
2 При использовании стандартных образцов с иным номинальным значением массовой концентрации афлатоксина B1 изменяют объем аликвоты и (или) мерной колбы таким образом, чтобы номинальное значение массовой концентрации афлатоксина B1 в приготовленном исходном растворе составляло 50 нг/см3.
При использовании кристаллического препарата афлатоксина B1 приготовление раствора и расчет значения массовой концентрации афлатоксина B1 в растворе проводят в соответствии с приложением В.
8.3.3 Приготовление градуировочных растворов афлатоксина B1
В колбу для упаривания помещают пипеткой или дозатором указанный в таблице 1 объем раствора афлатоксина B1 номинального значения массовой концентрации 50 нг/см3 (8.3.2), удаляют растворитель упариванием в вакууме при температуре водяной бани от 40 до 45 °C.
| Номер градуировочного раствора | Номинальное значение массовой концентрации афлатоксина B1, нг/см3 | Объем раствора афлатоксина B1 (8.3.2), Vисх, см3 | Объем подвижной фазы, добавляемый к сухому остатку, Vгр,i, см3 |
|---|---|---|---|
| 1 | 50 | 1 | 1 |
| 2 | 10 | 0,2 | 1 |
| 3 | 1 | 0,2 | 10 |
К сухому остатку добавляют 50 мм3 трифторуксусной кислоты, тщательно перемешивают, выдерживают 10 мин в колбе, закрытой стеклянной пришлифованной пробкой. Затем остаток ТФУ отгоняют в вакууме досуха до исчезновения ее запаха, растворяют сухой остаток в соответствующем объеме (см. таблицу 1) подвижной фазы по 8.2.1, перемешивают и выдерживают перед измерениями не менее 10 мин в закрытом сосуде.
Растворы готовят в день проведения градуировки хроматографа.
Фактические значения массовой концентрации афлатоксина B1 в приготовленных градуировочных растворах (Cгр,i, нг/см3) вычисляют по формуле
C_{\text{гр},i} = \frac{C_{\text{исх}} \cdot V_{\text{исх}}}{V_{\text{гр},i}} , (2)
где Cисх — фактическое значение массовой концентрации афлатоксина B1 в растворе по 8.3.2, нг/см3;
Vисх — объем раствора по 8.3.2, взятый для приготовления раствора, см3;
Vгр,i — объем подвижной фазы (таблица 1), см3;
i — номер градуировочного раствора по таблице 1.
Примечание - Допускается использование иных градуировочных растворов в диапазоне значений массовой концентрации афлатоксина B1 от 1 до 50 нг/см3.
8.3.4 Приготовление контрольного раствора афлатоксина B1
Контрольный раствор афлатоксина B1 в подвижной фазе готовят согласно 8.3.3, используя аликвоту 0,4 см3 раствора афлатоксина B1 в ацетонитриле номинального значения массовой концентрации 50 нг/см3 (8.3.2) и растворяя остаток после упаривания в 1 см3 подвижной фазы по 8.2.1.
Номинальное значение массовой концентрации афлатоксина B1 в контрольном растворе составляет 20 нг/см3, фактическое значение вычисляют по формуле (2).
Используют только свежеприготовленный раствор.
8.4 Подготовка хроматографа
Подготовку хроматографа к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации.
Устанавливают рабочие длины волн возбуждения и регистрации флуоресценции (6.1), а также скорость подачи подвижной фазы (8.5). При наличии термостата колонок устанавливают температуру (25 +/- 1) °C.
При использовании градиентного элюирования задают соответствующую программу.
8.5 Условия хроматографического анализа
Если используют хроматографическую колонку по 6.3 и подвижную фазу по 8.2.1, то хроматографический анализ проводят в следующих условиях:
При использовании колонок других типоразмеров скорость потока подвижной фазы и объем дозирования выбирают в соответствии с указаниями изготовителей хроматографа и колонки.
8.6 Градуировка хроматографа
Диапазон линейности градуировочной характеристики составляет от 1 до 50 нг/см3. В качестве образцов для градуировки хроматографа используют градуировочные растворы афлатоксина B1 по 8.3.3.
Регистрируют по две хроматограммы каждого градуировочного раствора и, используя программное обеспечение к хроматографу, проводят градуировку хроматографа, устанавливая параметры градуировочной характеристики и время удерживания афлатоксина B1.
Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации афлатоксина B1 в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (8.3.3).
Градуировку считают приемлемой, если:
- коэффициент корреляции не менее 0,998;
- относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации афлатоксина B1 от фактического значения в каждой градуировочной точке не более 10%.
8.7 Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работы.
В качестве контрольного раствора используют свежеприготовленный контрольный раствор (8.3.4).
Регистрируют не менее двух хроматограмм контрольного раствора и идентифицируют пик афлатоксина B1 по времени удерживания при ширине окна идентификации 5%, внося при необходимости программную коррекцию времени удерживания пика, и при помощи градуировочной характеристики рассчитывают массовую концентрацию афлатоксина B1 для каждой хроматограммы.
Сходимость значений времени удерживания и значений массовой концентрации афлатоксина B1 проверяют по формулам
\frac{|t_{1} - t_{2}|}{\overline{t}} \leq 0,05 , (3)
где t1 и t2 — время удерживания пика афлатоксина B1 на первой и второй хроматограммах соответственно, мин;
\overline{t} — среднеарифметическое значений t1 и t2, мин.
\frac{|C_{\text{к}1} - C_{\text{к}2}|}{\overline{C_{\text{к}}}} \leq 0,07 , (4)
где Cк1 и Cк2 — массовые концентрации афлатоксина B1 в контрольном растворе по первой и второй хроматограммам соответственно, нг/см3;
\overline{C_{\text{к}}} — среднеарифметическое значений Cк1 и Cк2, нг/см3.
Градуировочная зависимость признается стабильной, если выполняется условие
\frac{|\overline{C_{\text{к}}} - C_{\text{к},0}|}{C_{\text{к},0}} \leq 0,12 , (5)
где Cк,0 — фактическое значение массовой концентрации афлатоксина B1 в контрольном растворе, нг/см3.
Если условие (5) не выполняется, то процедуру контроля повторяют, заново приготавливая контрольный раствор по 8.3.4. Результаты повторного контроля считают окончательными и градуировку хроматографа по 8.6 проводят заново.
8.8 Контроль холостой реактивной пробы
Контроль холостой реактивной пробы проводят для каждой партии реактивов перед испытанием проб.
Холостую реактивную пробу готовят по 9.1 - 9.3 (в зависимости от типа проб), не добавляя анализируемую пробу.
Проводят хроматографический анализ полученного концентрата холостой реактивной пробы по 9.5. Если на хроматограмме присутствуют пики, по параметрам удерживания близкие к пику афлатоксина B1, то находят и устраняют причины загрязнения холостой пробы (посуда или реактивы) и контроль повторяют.
8.9 Подготовка хроматографической колонки
В носик колонки помещают небольшое количество ваты (6.34). Взвешивают 2 г оксида алюминия (6.19) и переносят в колонку, затем сверху насыпают 1 г натрия углекислого 10-водного (6.20). Колонку используют однократно.
8.10 Учет потерь афлатоксина B1 при подготовке проб
Для учета потерь афлатоксина B1 при подготовке проб проводят анализ проб продукции с введенной добавкой афлатоксина B1. Пробы, в которые вносят добавки, не должны содержать афлатоксин B1.
К пробе массой от 4,5 до 5,5 г добавляют 0,5 см3 (0,25 см3 в случае анализа проб масложировой продукции) раствора афлатоксина B1 номинального значения массовой концентрации 50 нг/см3 по 8.3.2 и проводят все операции согласно 9.1 - 9.3 (в зависимости от типа проб), получая таким образом концентрат пробы, который анализируют согласно 9.5.
Находят массовую концентрацию афлатоксина B1 в концентрате пробы и вычисляют коэффициент извлечения афлатоксина B1 (\eta) по формуле
\eta = \frac{V_{1} \cdot V_{3} \cdot C_{\text{изм}}}{V_{2} \cdot C_{\text{ст}} \cdot V_{\text{ст}}} , (6)
где V1 - объем смеси ацетонитрил — вода, использованной для извлечения афлатоксина B1, см3 (25 см3 при подготовке пробы по 9.1 и 21 см3 при подготовке пробы по 9.2);
V3 — объем концентрата пробы по 9.4, см3 (1 см3);
Cизм — измеренное значение массовой концентрации афлатоксина B1 в концентрате пробы с добавкой, нг/см3;
V2 — объем аликвоты фильтрата пробы, отобранной для проведения очистки по 9.3, см3 (10 см3);
Cст — массовая концентрация раствора афлатоксина B1, взятого для внесения добавки, нг/см3;
Vст — объем раствора афлатоксина B1, взятого для внесения добавки, см3 (по 9.1 - 0,5 см3, по 9.2 - 0,25 см3).
Коэффициент извлечения афлатоксина B1 определяют не менее двух раз на стадии освоения методики и затем при смене партий реактивов. Полученные значения должны соответствовать следующим требованиям:
- каждое из полученных значений находится в интервале от 0,5 до 1,0;
- относительное значение размаха полученных значений соответствует условию
\frac{|\eta_{max} - \eta_{min}|}{\overline{\eta}} \leq 0,10 , (7)
где \eta_{max} и \eta_{min} — наибольшее и наименьшее из полученных значений коэффициента извлечения афлатоксина B1;
\overline{\eta} — среднеарифметическое полученных значений коэффициента извлечения афлатоксина B1.
Если оба этих условия выполняются, то среднеарифметическое значений коэффициента извлечения афлатоксина B1 (\overline{\eta}) используют при расчете результатов испытаний по формуле (9). В противном случае находят причины потерь афлатоксина B1 и повторяют определение коэффициента извлечения.
1 Коэффициент извлечения афлатоксина B1 зависит от матрицы пробы.
2 В случае низкого коэффициента извлечения (менее 0,5) рекомендуется провести операции, изложенные в настоящем пункте, без добавления пробы продукции. Коэффициент извлечения афлатоксина B1 в этом случае должен составлять от 0,8 до 1,0. При более низких значениях находят и устраняют причины недопустимых потерь афлатоксина B1, наиболее вероятной причиной которых может быть неудовлетворительное качество карбоната натрия.
9 Проведение испытаний
9.1 Экстракция афлатоксина B1 из проб зерна и продуктов его переработки, кормов и сырья для их производства, а также орехов, чая, шоколада, какао
В коническую или плоскодонную колбу вместимостью 100 см3 помещают от 4,5 до 5,5 г измельченной пробы, 1 г хлористого натрия и 25 см3 (V1, см3) смеси ацетонитрил — вода по 8.2.2. После перемешивания в течение 30 мин полученную смесь оставляют на 1 — 2 мин в покое, затем пропускают через бумажный фильтр «красная лента» и отбирают 10 см3 (V2, см3) фильтрата. Подготовленную аликвотную порцию экстракта пробы очищают по 9.3.
9.2 Экстракция афлатоксина B1 из проб масложировой продукции
В коническую колбу вместимостью 100 см3 помещают от 2,2 до 2,8 г пробы, добавляют 5 см3 гексана, 1 см3 раствора хлорида натрия массовой концентрации 40 г/дм3 и 20 см3 ацетонитрила (общий объем водно-ацетонитрильного раствора V1, см3, равен 21 см3). Перемешивают 30 мин. Смесь переносят в делительную воронку вместимостью 50 — 100 см3, добавляют 5 см3 гексана и проводят экстракцию жиров в течение 1 мин. Нижний водно-ацетонитрильный слой пропускают через бумажный фильтр «красная лента» и отбирают 10 см3 (V2, см3) фильтрата. Подготовленную аликвотную порцию экстракта пробы очищают по 9.3.
9.3 Очистка фильтрата
Аликвоту фильтрата пробы (см. 9.1 и 9.2) пропускают через колонку с оксидом алюминия, подготовленную по 8.9, и собирают в остродонную колбу вместимостью 25 см3. Промывают колонку 5 см3 ацетонитрила, собирая его в ту же колбу. Содержимое колбы упаривают в вакууме досуха.
9.4 Подготовка концентрата пробы
К сухому остатку, полученному по 9.3, добавляют 50 мм3 ТФУ, тщательно омывают дно колбы, закрывают стеклянной пришлифованной пробкой и выдерживают 10 мин. Остаток ТФУ отгоняют в вакууме досуха до исчезновения ее характерного запаха, сухой остаток растворяют в 1 см3 (V3, см3) подвижной фазы, перемешивают, закрывают стеклянной пришлифованной пробкой и выдерживают не менее 10 мин. Допускается растворять сухой остаток в ином объеме подвижной фазы (от 0,4 до 5,0 см3) в зависимости от ожидаемой концентрации афлатоксина B1.
Затем к полученному концентрату добавляют 2 см3 гексана, добиваясь перехода маслообразного остатка в гексан. Выдерживают 5 мин и аккуратно отбирают нижний слой, используя для этого пипетку или дозатор, в подходящий сосуд, например в одноразовую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см3 (6.24). Полученный концентрат подвергают хроматографическому анализу до конца рабочего дня согласно 9.5.
9.5 Проведение хроматографических измерений
Регистрируют две хроматограммы концентрата пробы (по 9.4) в тех же условиях, при которых была проведена градуировка хроматографа (по 8.6). Идентификацию афлатоксина B1 проводят по совпадению времени удерживания афлатоксина B1 в экстракте пробы с его временем удерживания, полученным при контроле стабильности градуировочной характеристики, установив ширину окна идентификации 5%.
Пример хроматограммы приведен на рисунке Б.1 (приложение Б).
Примечание — При необходимости подтверждения правильности идентификации пика афлатоксина B1 рекомендуется выполнить добавку раствора афлатоксина B1 по 8.3.3 к концентрату пробы. О достоверности идентификации можно судить по увеличению высоты предполагаемого пика афлатоксина B1. Количество добавляемого раствора афлатоксина B1 определяют исходя из того, что массовая концентрация афлатоксина B1 в пробе должна увеличиться на 50% — 150% по сравнению с исходным значением.
При наличии на хроматограмме концентрата пробы пика, идентифицированного как пик афлатоксина B1, вычисляют значение массовой концентрации афлатоксина B1 в концентрате пробы для каждой зарегистрированной хроматограммы с использованием градуировочной характеристики, установленной по 8.6, и проверяют приемлемость полученных значений, используя условие (4).
Если условие (4) выполняется, то в качестве результата измерений массовой концентрации афлатоксина B1 в концентрате испытуемой пробы (Cкон, нг/см3) принимают среднеарифметическое полученных значений. Если условие (4) не выполняется, то находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод концентрата пробы повторяют.
Если массовая концентрация афлатоксина B1 в концентрате превышает 50 нг/см3, то концентрат разбавляют подвижной фазой (8.2.1). Коэффициент разбавления (Q) вычисляют по формуле
Q = \frac{V_{\text{р}}}{V_{\text{а}}} , (8)
где Vр — объем концентрата пробы, полученного в результате разбавления, см3;
Vа — объем аликвотной порции исходного концентрата пробы, взятый для разбавления, см3.
10 Обработка результатов испытаний
Массовую долю афлатоксина B1 в пробе X, млн-1, вычисляют по формуле
X = \frac{V_{1} \cdot V_{3} \cdot C_{\text{кон}}}{1000 \cdot V_{2} \cdot m \cdot \eta} \cdot Q , (9)
где V1 - объем смеси ацетонитрил — вода, использованной для извлечения афлатоксина B1 по 9.1 или 9.2, см3 (25 см3 при подготовке пробы по 9.1 и 21 см3 при подготовке пробы по 9.2);
V3 — объем концентрата пробы по 9.4, см3;
Cкон — массовая концентрация афлатоксина B1 в концентрате пробы (см. 9.5), нг/см3;
1000 — коэффициент согласования размерности единиц массы;
V2 — объем аликвоты фильтрата пробы, отобранной для проведения очистки по 9.3, см3 (10 см3);
\eta — коэффициент извлечения афлатоксина B1 по 8.10;
Q — коэффициент разбавления концентрата пробы по 9.5. Если концентрат пробы не разбавляли, то Q = 1.
11 Метрологические характеристики
Метод обеспечивает получение результатов измерений с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, приведенных в таблице 2.
Расхождение между двумя результатами измерений (X1 и X2, млн-1), полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости, должно соответствовать условию
\frac{|X_{1} - X_{2}|}{\overline{X}} \cdot 100 \leq r_{\text{отн}} , (10)
где \overline{X} — среднеарифметическое значений X1 и X2, млн-1;
rотн — предел повторяемости (таблица 2), %.
При выполнении условия (10) за результат измерений принимают среднеарифметическое полученных результатов измерений, млн-1.
Расхождение между двумя результатами измерений, полученными в двух лабораториях ( \overline{X_{1\text{лаб}}} и \overline{X_{2\text{лаб}}} , млн-1) на идентичных пробах, должно соответствовать условию
\frac{|\overline{X_{1\text{лаб}}} - \overline{X_{2\text{лаб}}}|}{\overline{X_{\text{лаб}}}} \cdot 100 \leq CD_{0,95,\text{отн}} , (11)
где \overline{X_{\text{лаб}}} — среднеарифметическое значение \overline{X_{1\text{лаб}}} и \overline{X_{2\text{лаб}}} , млн-1;
CD0,95,отн — критическая разность (таблица 2), %.
12 Контроль качества результатов измерений
Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (раздел 6).
13 Оформление результатов испытаний
Результаты испытаний регистрируют в протоколе испытаний, который оформляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом протокол испытаний должен содержать ссылку на настоящий стандарт.
Результаты измерений массовой доли афлатоксина B1 (при подтвержденном в лаборатории соответствии аналитической процедуры требованиям настоящего стандарта) представляют в виде
X \pm \Delta либо \overline{X} \pm U , (12)
где \overline{X} — результат измерений, полученный в соответствии с разделом 10, млн-1;
\Delta — границы абсолютной погрешности измерений массовой доли афлатоксина B1 (P = 0,95), млн-1, которые вычисляют по формуле
\Delta = 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{X} ; (13)
U — расширенная неопределенность при коэффициенте охвата k = 2, млн-1, которую вычисляют по формуле
U = 0,01 \cdot U_{\text{отн}} \cdot \overline{X} . (14)
Значения \delta(U_{\text{отн}}) приведены в таблице 2.
Числовые значения границ абсолютной погрешности (неопределенности) выражают числом, содержащим не более двух значащих цифр, при этом наименьший разряд числового значения окончательного результата измерений принимают таким же, как и наименьший разряд числового значения границ абсолютной погрешности (неопределенности).
Результат испытаний при содержании афлатоксина B1 менее нижней границы диапазона измерений (см. таблицу 2) представляют в виде «менее 0,0002 млн-1». Результат испытаний при содержании афлатоксина B1 выше верхней границы диапазона измерений (см. таблицу 2) представляют в виде «более 0,05 млн-1».
ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С АФЛАТОКСИНАМИ
Работу с афлатоксинами проводят в отдельной комнате или в общем помещении химической лаборатории при наличии боксового отделения или настольного бокса.
В лабораторных помещениях, где ведутся работы с афлатоксинами, запрещается курить и принимать пищу.
Стандартные образцы и растворы афлатоксинов следует хранить в местах, недоступных для посторонних. Сосуды с растворами афлатоксинов должны быть снабжены этикетками с надписью «ЯД» и находиться в стаканах на поддонах. Рабочее место должно быть покрыто листом фильтровальной бумаги, которую после работы следует поместить в герметичный мешок или контейнер для последующего сжигания.
Химическую посуду, находившуюся в контакте с афлатоксинами, обрабатывают путем ее заполнения на 2 — 3 час деконтаминационным раствором следующего состава: 250 г гидроксида натрия, 100 г хлорамина Б, 10 г стирального порошка, 5 дм3 воды. После этого посуду моют общепринятым способом.
Работать с афлатоксинами следует в резиновых перчатках, которые после завершения работы должны быть обработаны раствором хлорамина Б и затем тщательно промыты проточной водой.
В случае попадания афлатоксинов на лабораторное оборудование и предметы их деконтаминацию следует производить тщательной обработкой 5 — 10%-ным водным раствором хлорамина Б, а затем 1%-ным водным раствором углекислого кислого натрия.
При попадании афлатоксинов на открытые участки тела, в глаза, на слизистую рта и носа необходимо немедленно промыть пораженные участки 1%-ным водным раствором борной кислоты, а затем большим количеством проточной воды.
ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ
В зависимости от типа сорбента и типоразмера используемых колонок допускается варьирование объемной доли ацетонитрила в подвижной фазе в диапазоне от 20 до 25%. В качестве пробы рекомендуется использовать нерафинированное растительное масло, в котором влияние матричных компонентов наиболее значимо. Критерием оптимизации состава подвижной фазы является отделение пика афлатоксина B1 от пиков матричных компонентов пробы.
Пробы масла и масла с добавкой (см. 8.10) анализируют по 9.2 - 9.5, используя выбранный состав подвижной фазы, и убеждаются, что пик афлатоксина B1 отделяется от пиков матричных компонентов пробы (разрешение >= 1).
Профиль хроматограммы растительного масла с добавкой афлатоксина B1 представлен на рисунке Б.1.
Рисунок Б.1 — Хроматограмма нерафинированного растительного масла с добавкой афлатоксина B1
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРА АФЛАТОКСИНА B1 ИЗ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
1 мг кристаллического афлатоксина B1 количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят ацетонитрилом до метки.
Измеряют оптическую плотность приготовленного раствора в области длин волн от 345 до 365 нм с шагом 1 нм на спектрофотометре (6.35) в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см относительно ацетонитрила и находят ее максимальное значение в указанном диапазоне длин волн.
Рассчитывают значение массовой концентрации исходного раствора C0, мкг/см3, по формуле
C_{0} = \frac{A \cdot M \cdot 1000}{\epsilon \cdot l} , (В.1)
где A — оптическая плотность раствора, ед. оптической плотности;
M — молярная масса афлатоксина B1, г/моль (M = 312,3 г/моль);
1000 — коэффициент согласования размерности единиц массы;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения раствора афлатоксина B1, дм3·моль-1·см-1 (\epsilon = 2,07 \cdot 10^{4}\text{дм}^{3} \cdot \text{моль}^{- 1} \cdot \text{см}^{- 1}) ;
l — толщина поглощающего слоя, см (l = 1 см).
Номинальное значение массовой концентрации афлатоксина B1 в приготовленном растворе составляет 10 мкг/см3. Этот раствор используется для приготовления исходного раствора афлатоксина B1 по 8.3.2. При вычислении фактического значения массовой концентрации приготовленного раствора по формуле (1) вместо CСО используют значение C0, рассчитанное по формуле (В.1).