ГОСТ 33600-2015. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочные продукты. Методика определения лактоферрина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 30.11.2015 № 2086-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 7, 2019. Документ введен в действие с 1 июля 2016 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. № 2086-ст
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Milk and dairy products. Method for determination of the lactoferrin by high performance liquid chromatography
Дата введения 1 июля 2016 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГБНУ «ВНИМИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. № 82-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. № 2086-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33600-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты (молоко сырое, молоко питьевое, сливки сырые, сливки питьевые, кисломолочные продукты, творог, сыры, сухие молочные продукты) и устанавливает методику определения лактоферрина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Диапазон измерений массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина от 0,01 до 10,00 мг/см3 (мг/г) включительно.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<*> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты
ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <**> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<**> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Сущность метода
Метод основан на удалении из пробы жира и казеиновой фракции белка и определении в полученном фильтрате содержания лактоферрина высокоэффективной жидкостной хроматографией по обращенно-фазовому механизму при помощи спектрометрического детектора при длине волны 205 нм.
4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы
Хроматограф, включающий следующие элементы:
- колонку С18 с размером пор 300Е длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм;
- устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 см3;
- спектрофотометрический детектор с переменной длиной волны, позволяющий проводить измерения оптической плотности при длине волны 205 нм, снабженный проточной кварцевой кюветой объемом 1 см3;
- программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений.
Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,1 см3.
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,001 г.
Анализатор потенциометрический диапазоном измерения от 1 до 12 ед. pH с погрешностью +/- 0,02 ед. pH.
Центрифуга лабораторная со скоростью вращения не менее 5000 мин-1.
Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,020 — 5,000 см3 с относительной погрешностью дозирования +/- 1%.
Часы 2-го класса точности по ГОСТ 27752.
Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм3.
Колбы 1-25-2, 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.
Пробирки П-1-10-0,1 ХС по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.
Колба К-1-1000-29/32 по ГОСТ 25336.
Стаканы В-1-25, В-1-150 по ГОСТ 25336.
Фильтры мембранные с диаметром пор не более 0,5 мкм.
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, с содержанием основного вещества не менее 99,98%.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч. раствор молярной концентрации 1 моль/дм3.
Кислота трифторуксусная (ТФУ), с содержанием основного вещества не менее 99,0%.
Лактоферрин, с содержанием основного вещества не менее 99,9%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
5. Отбор проб и подготовка их к анализу
Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 26809.1 и другим нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
В случае если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 48 ч.
6. Подготовка к проведению измерений
6.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 1 моль/дм3
Раствор готовят в соответствии с требованиями ГОСТ 25794.1 (раздел 2).
Срок хранения раствора при температуре (20 +/- 5) °C — не более 1 мес.
6.2 Подготовка пробы исследуемого продукта
6.2.1 Пробы жидких продуктов массой (20,000 +/- 0,001) г помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости вращения 5000 мин-1 в течение (15 — 30) мин. При этом она разделяется на два слоя: верхний — жировой и нижний — белковый.
Для осаждения казеина полученную белковую фракцию переливают в мерный цилиндр вместимостью 50 см3, помещают в него электроды pH-метра и по каплям добавляют раствор HCl молярной концентрацией 1 моль/дм3 до pH 4,6 ед. pH. Переливают полученный раствор в градуированные центрифужные пробирки и центрифугируют 15 мин при скорости вращения 5000 мин-1, фиксируют конечный объем раствора.
Проводят два параллельных определения.
6.2.2 Пробы пастообразных, сухих продуктов массой (5,000 +/- 0,001) г растворяют в 50 см3 дистиллированной воды, помещают туда электроды и по каплям добавляют раствор HCl молярной концентрации 1 моль/дм3 до pH 4,6 ед. pH. После достижения указанного значения раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой. Дают отстояться в течение 30 мин. Затем фильтруют через складчатый фильтр. В случае недостаточного осаждения казеина проводят центрифугирование фильтрата: переливают полученный фильтрат в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при скорости вращения 5000 мин-1.
Полученный экстракт используют для измерений.
6.3 Приготовление подвижной фазы для жидкостной хроматографии (элюенты A, B)
Для приготовления элюента A к ацетонитрилу добавляют 0,1% ТФУ по объему.
Для приготовления элюента B к бидистиллированной воде добавляют 0,1% ТФУ по объему.
Полученные элюенты рекомендуется профильтровать через мембранный фильтр. Перед использованием подвижную фазу дегазируют в круглодонной колбе под вакуумом на ультразвуковой бане.
Срок хранения элюента A в плотно укупоренной темной посуде при температуре (4 +/- 2) °C — не более 3 мес.
Элюент B используется свежеприготовленным.
6.4 Приготовление раствора лактоферрина массовой концентрации 1 мг/см3
Взвешивают (0,025 +/- 0,001) г лактоферрина, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, доводят до метки бидистиллированной водой и аккуратно перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре (4 +/- 2) °C — не более 1 мес.
6.5 Приготовление раствора лактоферрина массовой концентрации 0,5 мг/см3
В стакан вместимостью 25 см3 отмеряют 1 см3 раствора лактоферрина массовой концентрации 1 мг/см3, приливают 1 см3 бидистиллированной воды и аккуратно перемешивают.
6.6 Приготовление раствора лактоферрина массовой концентрации 0,25 мг/см3
В стакан вместимостью 25 см3 отмеряют 1 см3 раствора лактоферрина массовой концентрации 0,5 мг/см3, приливают 1 см3 бидистиллированной воды и аккуратно перемешивают.
6.7 Приготовление раствора лактоферрина массовой концентрации 0,1 мг/см3
В стакан вместимостью 25 см3 отмеряют 0,1 см3 раствора лактоферрина массовой концентрации 1 мг/см3, приливают 0,9 см3 бидистиллированной воды и аккуратно перемешивают.
6.8 Построение градуировочной зависимости
Построение градуировочной зависимости и проверку приемлемости градуировки проводят в соответствии с руководством пользователя программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу, с использованием растворов лактоферрина по 6.4 - 6.7.
Градуировку проводят при изменении условий хроматографического анализа, при несоответствии результатов метрологическим требованиям.
Проверку градуировки проводят непосредственно после выполнения градуировки, а в дальнейшем — периодически, перед каждой серией измерений.
6.9 Подготовка хроматографа к работе
Подготовку хроматографа к работе проводят в соответствии с прилагаемой к хроматографу инструкцией.
6.9.1 Условия хроматографирования
подвижная фаза: элюент A — элюент B.
Элюент A: с 35% до 60% за 30 мин,
- длина волны детектора — 205 нм;
- чувствительность детектора — 0,08 единицы оптической плотности по шкале (ориентировочное значение);
- скорость потока подвижной фазы — 1,2 см3/мин;
- температура (20 +/- 2) °C.
7. Условия проведения измерений
При выполнении измерений в лаборатории необходимо соблюдать следующие условия: - температура окружающего воздуха .................. от 20 °C до 25 °C; - относительная влажность воздуха .................. от 40% до 80%; - атмосферное давление ............................. от 84 до 106 кПа; - напряжение в электросети ......................... (220 +/- 10) В; - частота тока в электросети ....................... от 49 до 51 Гц.
8. Проведение измерений
После выхода системы в режим равновесия в хроматограф вводят 20 мкл экстракта (6.2) и детектируют с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 205 нм. Приблизительное время удерживания лактоферрина 18 — 20 мин.
9. Обработка результатов измерений
9.1 Массовую концентрацию лактоферрина X, мг/см3, в жидких продуктах определяют по градуировочному графику.
9.2 Массовую долю лактоферрина X1, мг/г, в пастообразных и сухих продуктах определяют по формуле
X_{1} = \frac{C \cdot V}{m} , (1)
где C — массовая концентрация лактоферрина, определенная по градуировочному графику, мг/см3;
V — объем раствора, полученный после разведения пробы продукта, см3;
9.3 За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух последовательных определений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака.
10. Контроль точности результатов измерений
10.1 Метрологические характеристики метода
Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах при P = 0,95 приведены в таблице 1.
| Диапазон определения лактоферрина, мг/см3 (мг/г) | Предел повторяемости rотн, % | Предел воспроизводимости Rотн, % | Границы, относительной погрешности \pm \delta , % |
|---|---|---|---|
| 0,01 — 10,00 | 20 | 28 | 20 |
10.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости
Проверку приемлемости результатов определения лактоферрина в молоке и молочных продуктах, полученных в условиях повторяемости (два последовательных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).
Результаты измерений считаются приемлемыми при условии
|X1 — X2| <= rотн·0,01·Xср, (2)
где X1, X2 - значения результатов двух последовательных измерений массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина в молоке и молочных продуктах, полученных в условиях повторяемости, мг/см3 (мг/г);
Xср — среднеарифметическое значение двух последовательных измерений массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина в молоке и молочных продуктах, мг/см3 (мг/г);
rотн — предел повторяемости (сходимости), значение которого приведено в таблице 1, %.
Если данное условие не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).
10.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
Проверку приемлемости результатов определения массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина в молоке и молочных продуктах, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.2.1).
Результаты измерений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии
|X_{1}\prime - X_{2}\prime| \leq R_{\text{отн}} \cdot 0,01 \cdot X_{\text{ср}}, (3)
где X_{1}\prime , X_{2}\prime — значения двух результатов определения массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина в молоке и молочных продуктах, полученных в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, мг/см3 (мг/г);
Xср — среднеарифметическое значение результатов определения массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина в молоке и молочных продуктах, выполненных в условиях воспроизводимости, мг/см3 (мг/г);
Rотн — предел воспроизводимости, значение которого приведено в таблице 1, %.
Если данное условие не выполняется, то выполняют процедуры в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).
11. Оформление результатов
Результат определения массовой концентрации (массовой доли) лактоферрина в молоке и молочных продуктах представляют в документах, предусматривающих его использование, в виде
\text{Х}_{c\text{р}} \pm \delta \cdot 0,01 \cdot \text{Х}_{\text{ср}},\text{при Р } = 0,95, (4)
где Xср — среднеарифметическое значение результатов двух последовательных определений, мг/см3 (мг/г);
\delta — границы относительной погрешности измерений, % (таблица 1).
12. Требования, обеспечивающие безопасность
При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:
- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;
- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами — в соответствии с ГОСТ 12.1.007;
- требования техники безопасности при работе с электроустановками — в соответствии с ГОСТ 12.1.019.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.
13. Требования к оператору
Выполнение измерений может проводить специалист, имеющий специальное образование, освоивший метод и уложившийся в норматив контроля точности при выполнении процедур контроля точности.
ПРИМЕР ХРОМАТОГРАММЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛАКТОФЕРРИНА В МОЛОЧНОМ ПРОДУКТЕ
А.1 Пример хроматограммы определения массовой концентрации лактоферрина в молоке приведен на рисунке А.1.
2 — \alpha - \text{Лактоальбумин}
4 — \beta - \text{Лактоглобулин А}
5 — \beta - \text{Лактоглобулин В}