---
title: "\"ГОСТ 33526-2015. Межгосударственный стандарт. Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии\""
number: "ГОСТ 33526-2015"
issuer: "Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/standart-gost-33526-2015"
---

## "ГОСТ 33526-2015. Межгосударственный стандарт. Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"

# "ГОСТ 33526-2015. Межгосударственный стандарт. Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"

(введен в действие Приказом Росстандарта от 30.11.2015 N 2085-ст)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов (п. п. 61(52), 533), а в случае их отсутствия - национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 N 236).
> Документ включен в Перечень стандартов (п. п. 83, 381), содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции" (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 N 80).
> Текст данного документа приведен с учетом [поправки](https://bukva.ai/docs/popravka-popravki-gost-33526-2015), опубликованной в "ИУС", N 7, 2019.
> Документ [введен](#p100008) в действие с 01.07.2016.


<a id="p100001"></a>Введен в действие
Приказом Федерального агентства
по техническому регулированию
и метрологии
от 30 ноября 2015 г. N 2085-ст

<a id="p100002"></a>**МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ**

<a id="p100003"></a>**МОЛОКО И ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АНТИБИОТИКОВ**
**МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**

<a id="p100005"></a>Milk and dairy products. Method for determination
of the antibiotic by high performance liquid chromatography

<a id="p100006"></a>**ГОСТ 33526-2015**

<a id="p100007"></a>МКС 67.100.10

<a id="p100008"></a>Дата введения
1 июля 2016 года


## <a id="p100009"></a>Предисловие


<a id="p100010"></a>Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"


## <a id="p100011"></a>Сведения о стандарте


<a id="p100012"></a>1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности" (ФГБНУ "ВНИМИ")
<a id="p100013"></a>2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
<a id="p100014"></a>3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)
<a id="p100015"></a>За принятие проголосовали:


| <a id="p100016"></a>Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | <a id="p100017"></a>Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | <a id="p100018"></a>Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
| --- | --- | --- |
| <a id="p100019"></a>Армения | <a id="p100020"></a>AM | <a id="p100021"></a>Минэкономики Республики Армения |
| <a id="p100280"></a>Казахстан | <a id="p100281"></a>KZ | <a id="p100282"></a>Госстандарт Республики Казахстан |
| <a id="p100022"></a>Киргизия | <a id="p100023"></a>KG | <a id="p100024"></a>Кыргызстандарт |
| <a id="p100025"></a>Россия | <a id="p100026"></a>RU | <a id="p100027"></a>Росстандарт |


<a id="p100028"></a>4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. N 2085-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33526-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.
<a id="p100029"></a>**5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ**

<a id="p100030"></a>Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет


## 1. <a id="p100031"></a>Область применения


<a id="p100032"></a>Настоящий стандарт распространяется на молоко и продукты переработки молока (молоко (сырое, питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.
<a id="p100033"></a>Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина (хлорамфеникола) от 0,0001 млн-1 (мг/кг) до 1,0 млн-1 (мг/кг), для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп от 0,001 млн-1 (мг/кг) до 1,0 млн-1 (мг/кг), для стрептомицина от 0,005 млн-1 (мг/кг) до 1,0 млн-1 (мг/кг).


## 2. <a id="p100034"></a>Нормативные ссылки


<a id="p100035"></a>В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
<a id="p100036"></a>ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения <1>

<a id="p100037"></a>

---

<a id="p100038"></a><1> На территории Российской Федерации действует [ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-1-2002).

<a id="p100039"></a>ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике <2>

<a id="p100040"></a>

---

<a id="p100041"></a><2> На территории Российской Федерации действует [ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002).

<a id="p100042"></a>[ГОСТ OIML R 76-1-2011](https://bukva.ai/docs/gost-oiml-r-76-1-2011) Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
<a id="p100043"></a>ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
<a id="p100044"></a>ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
<a id="p100045"></a>ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
<a id="p100046"></a>ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты <3>

<a id="p100047"></a>

---

<a id="p100048"></a><3> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

<a id="p100049"></a>ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
<a id="p100050"></a>ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
<a id="p100051"></a>[ГОСТ 245-76](https://bukva.ai/docs/gost-245-76) Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия
<a id="p100052"></a>[ГОСТ 908-2004](https://bukva.ai/docs/standart-gost-908-2004) Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия
<a id="p100053"></a>[ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
<a id="p100054"></a>ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
<a id="p100055"></a>[ГОСТ 5848-73](https://bukva.ai/docs/gost-5848-73) Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия
<a id="p100056"></a>ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия
<a id="p100057"></a>ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
<a id="p100058"></a>ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
<a id="p100059"></a>[ГОСТ 10652-73](https://bukva.ai/docs/gost-10652-73) Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б). Технические условия
<a id="p100060"></a>ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
<a id="p100061"></a>ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
<a id="p100062"></a>[ГОСТ 26809.1-2014](https://bukva.ai/docs/gost-26809-1-2014) Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты
<a id="p100063"></a>[ГОСТ 26809.2-2014](https://bukva.ai/docs/gost-26809-2-2014) Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты
<a id="p100064"></a>[ГОСТ 29227-91](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
<a id="p100065"></a>*Примечание* - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.


## 3. <a id="p100066"></a>Сущность метода


<a id="p100067"></a>Метод основан на экстракции антибиотиков из пробы продукта, очистке экстракта и определении антибиотиков в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.


## 4. <a id="p100068"></a>Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы


<a id="p100069"></a>Хроматограф для проведения ВЭЖХ, включающий следующие элементы:
- <a id="p100070"></a>колонка хроматографическая обращенно-фазная (250·4,6) мм, заполненная силикагелем с диаметром частиц сорбента 3 мкм;
- <a id="p100071"></a>детектор спектрофотометрический или диодно-матричный с длиной волны детектирования 265 нм и 280 нм с погрешностью задания длины волны +/- 1 нм;
- <a id="p100072"></a>петлевое устройство для ввода пробы с рабочим объемом петли 0,020 см3;
- <a id="p100073"></a>насос высокого давления;
- <a id="p100074"></a>регистрирующее устройство, позволяющее проводить измерения площади (или высоты) пика с погрешностью +/- 1%;
- <a id="p100075"></a>программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений.
<a id="p100076"></a>Устройство вакуумное для твердофазной экстракции.
<a id="p100077"></a>Картридж для твердофазной экстракции объемом не более 6 см3, заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм.
<a id="p100078"></a>Весы неавтоматического действия по [ГОСТ OIML R 76-1](https://bukva.ai/docs/gost-oiml-r-76-1-2011) или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,5 мг и +/- 1,0 мг.
<a id="p100079"></a>Анализатор потенциометрический (pH-метр) с диапазоном измерения 1 - 14 ед. pH, с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,01 ед. pH.
<a id="p100080"></a>Центрифуга лабораторная с охлаждением, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин и диапазон температур охлаждения от 4 °C до 20 °C, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см3.
<a id="p100081"></a>Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40 °C.
<a id="p100082"></a>Баня водяная термостатируемая.
<a id="p100083"></a>Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм3.
<a id="p100084"></a>Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, с угловой скоростью вращения ножей (1000 - 10000) мин-1, включающий емкость вместимостью 1,0 дм3.
<a id="p100085"></a>Встряхиватель лабораторный (вортекс) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой вращения гнезда 3 мм и скоростью вращения гнезда (150 - 2500) мин-1.
<a id="p100086"></a>Дозаторы механические переменного объема (0,1 - 3 мм3, 0,5 - 10 мм3, 20 - 200) мм3, 100 - 1000 мм3, 1 - 5 см3) с наконечниками.
<a id="p100087"></a>Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2 по [ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74).
<a id="p100088"></a>Пипетки 1-1-1-5, 1-1-1-10 по [ГОСТ 29227](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91).
<a id="p100089"></a>Пробирки мерные стеклянные П-1-10-0,1 ХС по [ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74).
<a id="p100090"></a>Цилиндр 1-25-1, 1-100-1, 1-250-2 по [ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74).
<a id="p100091"></a>Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 см3 и 50 см3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками.
<a id="p100092"></a>Колба Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-24/29 ТС по ГОСТ 25336.
<a id="p100093"></a>Стакан В-1-100, В-1-500, В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.
<a id="p100094"></a>Воронка В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.
<a id="p100095"></a>Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.
<a id="p100096"></a>Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
<a id="p100097"></a>Фильтр нейлоновый с размером пор 0,45 мкм.
<a id="p100098"></a>Ацетон по ГОСТ 2603, ч.д.а.
<a id="p100099"></a>Ацетонитрил, ч.д.а.
<a id="p100100"></a>Бензилпенициллин, массовой долей основного вещества не менее 99%.
<a id="p100101"></a>Демеклоциклин, массовой долей основного вещества не менее 90%.
<a id="p100102"></a>Доксициклин, массовой долей основного вещества не менее 90%.
<a id="p100103"></a>Кислота лимонная моногидрат пищевая по [ГОСТ 908](https://bukva.ai/docs/standart-gost-908-2004).
<a id="p100104"></a>Кислота муравьиная по [ГОСТ 5848](https://bukva.ai/docs/gost-5848-73), ч.д.а.
<a id="p100105"></a>Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, х.ч.
<a id="p100106"></a>Метанол для хроматографии (метиловый спирт), х.ч.
<a id="p100107"></a>Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по [ГОСТ 245](https://bukva.ai/docs/gost-245-76), ч.д.а.
<a id="p100108"></a>Окситетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.
<a id="p100109"></a>Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по [ГОСТ 10652](https://bukva.ai/docs/gost-10652-73), х.ч.
<a id="p100110"></a>Стрептомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 96%.
<a id="p100111"></a>Тетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.
<a id="p100112"></a>Хлорамфеникол (левомицетин), массовой долей основного вещества не менее 99%.
<a id="p100113"></a>Хлортетрациклин гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.
<a id="p100114"></a>Феноксиметилпенициллин, массовой долей основного вещества не менее 99%.
<a id="p100115"></a>Вода для лабораторного анализа деионизированная, с удельным сопротивлением 28 Ом, степень чистоты 2 по ISO 3696.
<a id="p100116"></a>Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
<a id="p100117"></a>Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.


## 5. <a id="p100118"></a>Отбор проб


<a id="p100119"></a>Отбор проб - по [ГОСТ 26809.1](https://bukva.ai/docs/gost-26809-1-2014), [ГОСТ 26809.2](https://bukva.ai/docs/gost-26809-2-2014), а также другим нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
<a id="p100120"></a>Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 48 ч.


## 6. <a id="p100121"></a>Подготовка к проведению измерений



#### <a id="p100122"></a>6.1 Приготовление растворов

<a id="p100123"></a>6.1.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации c(C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>·H<sub>2</sub>O) = 0,1 моль/дм3
<a id="p100124"></a>В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают (21,000 +/- 0,001) г лимонной кислоты, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.
<a id="p100125"></a>Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.
<a id="p100126"></a>6.1.2 Приготовление раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации c(NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O) = 0,2 моль/дм3
<a id="p100127"></a>В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят (35,600 +/- 0,001) г натрия фосфорнокислого, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.
<a id="p100128"></a>Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

##### <a id="p100129"></a>6.1.3 Приготовление буферного раствора

<a id="p100130"></a>В конической колбе вместимостью 250 см3 смешивают 60 см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3 [(6.1.1)](#p100123) и 40 см3 раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации 0,2 моль/дм3 [(6.1.2)](#p100126), добавляют (37,200 +/- 0,001) г трилона Б, аккуратно перемешивают и измеряют значение pH полученного раствора. Значение pH должно составлять 4,0. При необходимости значение pH доводят до 4,0 ед. pH ортофосфорной кислотой.
<a id="p100131"></a>Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

##### <a id="p100132"></a>6.1.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

<a id="p100133"></a>6.1.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 200 см3 деионизированной воды, добавляют 5 см3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.
<a id="p100134"></a>Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.
<a id="p100135"></a>6.1.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 200 см3 метанола, добавляют 5 см3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.
<a id="p100136"></a>Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

##### <a id="p100137"></a>6.1.5 Приготовление 50%-ного раствора метанола

<a id="p100138"></a>В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 25,0 см3 метанола, добавляют небольшое количество деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки. Колбу помещают на ультразвуковую баню на 5 мин.
<a id="p100139"></a>Срок хранения раствора в темной посуде при температуре (4 +/- 2) °C - не более 1 мес.

##### <a id="p100140"></a>6.1.6 Приготовление градуировочных растворов


###### <a id="p100141"></a>6.1.6.1 Приготовление основных градуировочных растворов

<a id="p100142"></a>6.1.6.1.1 В мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают по 10 мг доксициклина, окситетрациклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида и хлортетрациклина гидрохлорида, взвешенных с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.
<a id="p100143"></a>6.1.6.1.2 В мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают 10 мг стрептомицина сульфата, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.
<a id="p100144"></a>6.1.6.1.3 В мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают 10 мг хлорамфеникола (левомицетина), взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.
<a id="p100145"></a>6.1.6.1.4 В мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают по 10 мг феноксиметилпенициллина, бензилпенициллина, взвешенных с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.
<a id="p100146"></a>6.1.6.1.5 Массовая концентрация каждого антибиотика в растворах по [6.1.6.1.1](#p100142) - [6.1.6.1.4](#p100145) составляет 1 мг/см3 (или 1000 мг/дм3).
<a id="p100147"></a>Уточненное значение концентрации антибиотика рассчитывается с учетом содержания основного вещества.
<a id="p100148"></a>6.1.6.1.6 Раствор антибиотика массовой концентрации 0,1 мг/см3 (или 100 мг/дм3) готовят из раствора антибиотика массовой концентрации 1 мг/см3 [(6.1.6.1.5)](#p100146) путем его разведения метанолом в 10 раз.
<a id="p100149"></a>Растворы хранят при температуре минус (20 +/- 2) °C не более 3 мес.
<a id="p100150"></a>Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин, но не более 2 ч.

###### <a id="p100151"></a>6.1.6.2 Приготовление градуировочных образцов

<a id="p100152"></a>Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных образцов в количестве не менее пяти с массовыми концентрациями антибиотиков в диапазоне от 0,001 мг/дм3 до 1 мг/дм3 (для левомицетина в диапазоне от 0,00015 мг/дм3 до 0,1 мг/дм3) путем разбавления метанолом основных градуировочных растворов антибиотиков, приготовленных по [6.1.6.1](#p100141).

###### <a id="p100153"></a>6.1.6.3 Приготовление раствора внутреннего стандарта демеклоциклина

<a id="p100154"></a>В мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают 10 мг демеклоциклина, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.
<a id="p100155"></a>Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта демеклоциклина в растворе составляет 1 мг/см3 (уточненное значение концентрации внутреннего стандарта рассчитывается с учетом содержания основного вещества).
<a id="p100156"></a>Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта демеклоциклина до значения 1 мкг/см3. Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.
<a id="p100157"></a>Раствор хранят при температуре минус (20 +/- 2) °C не более 3 мес.
<a id="p100158"></a>Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин.

#### <a id="p100159"></a>6.2 Подготовка хроматографической системы

<a id="p100160"></a>6.2.1 Включают хроматограф. Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с Руководством по эксплуатации прибора.

##### <a id="p100161"></a>6.2.2 Устанавливают следующие условия хроматографирования:

- <a id="p100162"></a>скорость потока элюента - 0,1 см3/мин;
- <a id="p100163"></a>объем вводимой пробы - 20 мм3;
- <a id="p100164"></a>температура хроматографирования - (30 +/- 1) °C;
- <a id="p100165"></a>длина волны детектирования 280 нм.
<a id="p100166"></a>Разделение проводят в режиме градиентного элюирования: с 0% до 55% мобильной фазы Б [(6.1.4.2)](#p100135) за 25 мин.
<a id="p100167"></a>6.2.3 Перед каждым измерением для оценки работы хроматографа проводят контрольное измерение, вводя в хроматограф образец с известным значением содержания антибиотика. В качестве такого образца может служить раствор антибиотика, приготовленный из реактива антибиотика с известным содержанием антибиотика.

#### <a id="p100168"></a>6.3 Построение градуировочной характеристики

<a id="p100169"></a>6.3.1 Для построения градуировочной зависимости анализируют серию градуировочных образцов, приготовленных по [6.1.6.2](#p100151), в условиях, описанных в [6.2](#p100159) и [7](#p100194).
<a id="p100170"></a>6.3.2 Используя программное обеспечение, прилагаемое к хроматографу, строят график зависимости массовой концентрации антибиотика от отношения площади хроматографического пика антибиотика к площади пика внутреннего стандарта.
<a id="p100171"></a>Градуировочная характеристика считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной характеристики каждого антибиотика составит не менее 0,98.
<a id="p100172"></a>6.3.3 Градуировку проводят не реже одного раза в месяц, а также при изменении условий хроматографического анализа, при смене колонки, при замене реактивов или несоответствии результатов метрологическим требованиям.

#### <a id="p100173"></a>6.4 Подготовка проб продуктов

<a id="p100174"></a>6.4.1 Пробы молока и жидкой молочной продукции перемешивают путем перевертывания емкости с пробами не менее трех раз.
<a id="p100175"></a>Пробы продуктов освобождают от упаковки, нагревают до температуры (20 +/- 2) °C, аккуратно перемешивают и сразу же проводят измерение.
<a id="p100176"></a>6.4.2 Пробы продуктов, содержащие ароматизаторы, пищевкусовые добавки (кофе, какао, фруктово-ягодный или овощной наполнитель и т.д.), образующие с продуктом однородную структуру, а также неотделяемые пищевкусовые компоненты (например, кокосовую стружку), полностью освобождают от упаковки (при наличии), помещают в лабораторный стакан вместимостью 500 - 1000 см3 и нагревают на водяной бане до температуры (32 +/- 2) °C, после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 2000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.
<a id="p100177"></a>6.4.3 Пробы творога, творожных продуктов и творожных полуфабрикатов нагревают до температуры (20 +/- 2) °C, растирают в фарфоровой ступке до получения однородной консистенции и переносят в колбу вместимостью 500 см3 с притертой пробкой.
<a id="p100178"></a>6.4.4 Пробы сухих молочных продуктов растирают в ступке, тщательно перемешивая.
<a id="p100179"></a>6.4.5 Пробы мороженого освобождают от глазури и вафель, оставляют при комнатной температуре для отепления. Затем отделяют фрукты, орехи, изюм и другие отделяемые компоненты. При подготовке мороженого с наполнителями, обладающими текучестью (мягкая карамель, сироп, крем-брюле и т.д.), полностью растаявшее мороженое переносят в стакан гомогенизатора вместимостью от 500 см3 до 1000 см3 и гомогенизируют в течение 1 - 3 мин при частоте вращения ножей от 1000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.
<a id="p100180"></a>6.4.6 Пробу сыра и сырного продукта измельчают на металлической терке с мелкой перфорацией и аккуратно перемешивают в ступке.
<a id="p100181"></a>6.4.7 Пробу масла, масляной пасты помещают в стакан вместимостью 100 см3, расплавляют на водяной бане при температуре (60 +/- 2) °C и перемешивают до получения однородной эмульсии.

##### <a id="p100182"></a>6.4.8 Подготовка проб продуктов для хроматографирования

<a id="p100183"></a>6.4.8.1 В стакан вместимостью 100 см3 помещают (5,000 +/- 0,001) г продукта, подготовленного по [6.4.2](#p100176) - [6.4.6](#p100180). Добавляют 20 см3 раствора элюента мобильной фазы А [(6.1.4.1)](#p100133) и аккуратно перемешивают. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, ополаскивая стакан раствором элюента мобильной фазы А [(6.1.4.1)](#p100133). Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А [(6.1.4.1)](#p100133) до метки.
<a id="p100184"></a>Затем колбы с раствором помещают в ультразвуковую баню на 15 мин, охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. В случае получения непрозрачного раствора допускается его центрифугирование при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин.
<a id="p100185"></a>6.4.8.2 В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают (5,000 +/- 0,001) г масла, пасты масляной, подготовленных по [6.4.7](#p100181), и добавляют 35 см3 раствора элюента мобильной фазы А [(6.1.4.1)](#p100133). Колбу помещают в ультразвуковую баню на 15 мин, охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А [(6.1.4.1)](#p100133) до метки. Полученную смесь центрифугируют при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин. Для анализа используем водную фракцию.

#### <a id="p100186"></a>6.5 Подготовка проб для определения антибиотиков тетрациклиновой группы

<a id="p100187"></a>В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см3 помещают (1,000 +/- 0,001) г пробы продукта, подготовленной по [6.4.1](#p100174), или 10,0 см3 пробы продукта, подготовленной по [6.4.8](#p100182), добавляют 0,1 см3 раствора внутреннего стандарта [(6.1.6.3)](#p100153). Затем добавляют 3 см3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °C, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.
<a id="p100188"></a>Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3 и упаривают до 1 см3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 +/- 1) °C. К полученному остатку добавляют 3 - 5 см3 буферного раствора [(6.1.3)](#p100129), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором [(6.1.3)](#p100129) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

#### <a id="p100189"></a>6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы

<a id="p100190"></a>В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см3 помещают (1,000 +/- 0,001) г пробы продукта, подготовленной по [6.4.1](#p100174), или 10,0 см3 пробы продукта, подготовленной по [6.4.8](#p100182). Затем добавляют 3 см3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °C, и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.
<a id="p100191"></a>Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3 и упаривают до 1 см3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 +/- 1) °C. К полученному остатку добавляют 3 - 5 см3 буферного раствора [(6.1.3)](#p100129), аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором [(6.1.3)](#p100129) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

#### <a id="p100192"></a>6.7 Проведение твердофазной экстракции

<a id="p100193"></a>Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ предварительно кондиционируют 6 см3 50%-ного раствора метанола и уравновешивают 6 см3 деионизированной воды. Затем вносят пробу продукта, подготовленную по [6.5](#p100186) или [6.6](#p100189), и вновь промывают 6 см3 деионизированной воды. Антибиотики элюируют с сорбента при помощи 6 см3 раствора элюента мобильной фазы Б [(6.1.4.2)](#p100135). Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле досуха в токе азота под вакуумом при температуре (40 +/- 1) °C, затем растворяют раствором элюента мобильной фазы Б [(6.1.4.2)](#p100135) до 0,5 см3, после чего используют для хроматографирования.


## 7. <a id="p100194"></a>Условия проведения измерений


<a id="p100195"></a>При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:


| <a id="p100196"></a>- температура окружающего воздуха ....................................... | <a id="p100197"></a>(20 +/- 5) °C; |
| --- | --- |
| <a id="p100198"></a>- относительная влажность воздуха ....................................... | <a id="p100199"></a>(55 +/- 25) %; |
| <a id="p100200"></a>- атмосферное давление .......................................................... | <a id="p100201"></a>(96 +/- 10) кПа; |
| <a id="p100202"></a>- частота переменного тока .................................................... | <a id="p100203"></a>(50 +/- 5) Гц; |
| <a id="p100204"></a>- напряжение в сети ................................................................ | <a id="p100205"></a>(220 +/- 10) В. |



## 8. <a id="p100206"></a>Проведение измерений


<a id="p100207"></a>8.1 Хроматографирование градуировочных растворов и анализируемой пробы продукта проводят в идентичных условиях.
<a id="p100208"></a>8.2 Проводят два последовательных измерения. Подготовленную по [6.7](#p100192) пробу вводят в колонку хроматографа и проводят хроматографический анализ в условиях, указанных в [6.2.2](#p100161).
<a id="p100209"></a>Если содержание антибиотиков в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализируемую пробу разводят в 10 или более раз мобильной фазой А и проводят повторные измерения.


## 9. <a id="p100210"></a>Обработка результатов измерений


<a id="p100211"></a>9.1 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков тетрациклиновой группы, полученных с применением внутреннего стандарта
<a id="p100212"></a>Определение содержания антибиотиков тетрациклиновой группы выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. С помощью программы обработки спектров вычисляют отношение площади пика определяемого антибиотика к площади пика внутреннего стандарта. Затем, используя программу обработки данных, рассчитывают содержание соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.
<a id="p100213"></a>9.2 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков пенициллиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина
<a id="p100214"></a>Определение содержания антибиотиков выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Используя градуировочный график, рассчитывают значение массовой концентрации соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

#### <a id="p100215"></a>9.3 Массу пробы продукта, взятую для разведения, m, г, вычисляют по формуле


<a id="p100216"></a> $m = \frac{m_{1} \cdot V_{2}}{V_{1}}$ , (1)

<a id="p100217"></a>где m1 - масса пробы продукта, подготовленная по [6.4.2](#p100176) - [6.4.7](#p100181), взятая для анализа и отобранная по 6.4.9, г;
<a id="p100218"></a>V2 - объем пробы, подготовленный по [6.4.8](#p100182) и взятый для анализа ([6.5](#p100186) - [6.6](#p100189)), см3, (V2 = 10 см3);
<a id="p100219"></a>V1 - общий объем раствора, полученный при разведении пробы продукта согласно [6.4.8](#p100182), см3, (V1 = 50 см3).

#### <a id="p100220"></a>9.4 Массовую долю антибиотика в продукте X, млн-1 (мг/кг), вычисляют по формуле


<a id="p100221"></a> $X = \frac{C \cdot V_{3}}{m}$ , (2)

<a id="p100222"></a>где C - массовая концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, мг/дм3;
<a id="p100223"></a>V3 - объем элюата после выпаривания по [6.7](#p100192), см3;
<a id="p100224"></a>m - масса пробы продукта, подготовленная по [6.4.1](#p100174) и отобранная для анализа ([6.5](#p100186) - [6.6](#p100189)) или определенная по [формуле (1)](#p100216), г.
<a id="p100225"></a>За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух последовательных измерений, выполненных в условиях повторяемости (ГОСТ ИСО 5725-1, пункт 3.14), если соблюдается условие приемлемости по [10.1](#p100250).

#### <a id="p100226"></a>9.5 Контроль точности результатов измерений

<a id="p100227"></a>Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока при P = 0,95 приведены в таблице 1.

<a id="p100228"></a>Таблица 1


| <a id="p100229"></a>Диапазон измерений массовой доли антибиотиков, млн-1 (мг/кг) | <a id="p100230"></a>Предел повторяемости rотн, % | <a id="p100231"></a>Предел воспроизводимости Rотн, % | <a id="p100232"></a>Границы относительной погрешности, $\pm \delta$ , % |
| --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100233"></a>От 0,0001 до 0,001 включ. | <a id="p100234"></a>70 | <a id="p100235"></a>85 | <a id="p100236"></a>60 |
| <a id="p100237"></a>Св. 0,001 до 0,010 включ. | <a id="p100238"></a>50 | <a id="p100239"></a>57 | <a id="p100240"></a>40 |
| <a id="p100241"></a>Св. 0,010 до 0,100 включ. | <a id="p100242"></a>25 | <a id="p100243"></a>37 | <a id="p100244"></a>26 |
| <a id="p100245"></a>Св. 0,100 до 1,000 включ. | <a id="p100246"></a>20 | <a id="p100247"></a>28 | <a id="p100248"></a>20 |



## 10. <a id="p100249"></a>Проверка приемлемости результатов измерений



#### <a id="p100250"></a>10.1 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

<a id="p100251"></a>Проверку приемлемости результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях повторяемости (два последовательных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).
<a id="p100252"></a>Результаты измерений считаются приемлемыми при условии:

<a id="p100253"></a>|X1 - X2| <= rотн·0,01·Xср, (3)

<a id="p100254"></a>где X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - значения результатов двух последовательных измерений содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях повторяемости, млн-1 (мг/кг);
<a id="p100255"></a>Xср - среднеарифметическое значение двух последовательных измерений содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, млн-1 (мг/кг);
<a id="p100256"></a>rотн - предел повторяемости (сходимости), значение которого приведено в [таблице 1](#p100228), %.
<a id="p100257"></a>Если данное условие не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

#### <a id="p100258"></a>10.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

<a id="p100259"></a>Проверку приемлемости результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (подпункт 5.3.2.1).
<a id="p100260"></a>Результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии:

<a id="p100261"></a>|X'1 - X'2| <= Rотн·0,01·Xср, (4)

<a id="p100262"></a>где X'<sub>1</sub>, X'<sub>2</sub> - значения двух результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, млн-1 (мг/кг);
<a id="p100263"></a>Rотн - предел воспроизводимости, значение которого приведено в [таблице 1](#p100228), %;
<a id="p100264"></a>Xср - среднеарифметическое значение результатов определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока, полученных в условиях воспроизводимости, млн-1 (мг/кг).
<a id="p100265"></a>Если данное условие не выполняется, то выполняют процедуры в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).


## 11. <a id="p100266"></a>Оформление результатов


<a id="p100267"></a>Результат определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока представляют в документах, предусматривающих его использование в виде:

<a id="p100268"></a> $X_{\text{ср}} \pm \delta \cdot 0,01 \cdot X_{\text{ср}}$ , млн-1 (мг/кг), при P = 0,95, (5)

<a id="p100269"></a>где Xср - среднеарифметическое значение результатов двух последовательных определений, млн-1 (мг/кг);
<a id="p100270"></a> $\delta$ - границы относительной погрешности измерений, % [(таблица 1)](#p100228).


## 12. <a id="p100271"></a>Требования безопасности


<a id="p100272"></a>При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:
- <a id="p100273"></a>помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;
- <a id="p100274"></a>требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;
- <a id="p100275"></a>требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019.
<a id="p100276"></a>Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.


## 13. <a id="p100277"></a>Требования к оператору


<a id="p100278"></a>Выполнение измерений может проводить специалист, имеющий специальное образование, освоивший метод и уложившийся в норматив проверки приемлемости результатов измерений при выполнении процедуры проверки приемлемости результатов измерений.



<a id="p100279"></a>

---