ГОСТ 33482-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, сырье продовольственное, комбикорма. Метод определения содержания анаболических стероидов и производных стильбена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
(введен в действие Приказом Росстандарта от 13.11.2015 № 1808-ст)
(ред. от 05.10.2018)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» (ТР ЕАЭС 051/2021) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.11.2022 № 188). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности рыбы и рыбной продукции» (ТР ЕАЭС 040/2016) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.08.2017 № 106). Текст данного документа приведен с учетом поправок, опубликованных в «ИУС», № 7, 2017; № 4, 2020; поправки, введенной в действие с 15.02.2024, опубликованной в «ИУС», № 5, 2024. Изменение № 1 введено в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст с 01.02.2019.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 ноября 2015 г. № 1808-ст
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, СЫРЬЕ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ, КОМБИКОРМА
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АНАБОЛИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ И ПРОИЗВОДНЫХ СТИЛЬБЕНА С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
Food products, food raw materials, mixed feeds. Method for determination of anabolic steroids and stilbene derivatives by high performance liquid chromatography — mass spectrometry
67.050
67.120
67.120.30
(код введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
Дата введения 1 января 2017 года
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. № 81-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 ноября 2015 г. № 1808-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33482-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и непереработанную пищевую продукцию животного происхождения в части мяса, в том числе из мяса птицы, субпродуктов (печень), рыбу, комбикорма и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее — ВЭЖХ-МС/МС) для определения содержания анаболических стероидов и производных стильбена в диапазоне измерений:
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
- меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} в мясе, рыбе — от 0,2 до 5,0 мкг/кг;
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
- \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} в печени — от 0,5 до 30,0 мкг/кг;
- \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} в печени — от 2,0 до 30,0 мкг/кг;
- гексэстрола, диэтилстильбестрола, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, метилтестостерона, \beta - \text{тестостерона} , преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона в мясе, печени, рыбе и комбикорме — от 0,5 до 30,0 мкг/кг, диенэстрола — от 2,0 до 30,0 мкг/кг.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <1> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
Ссылка исключена с 1 февраля 2019 года. - Изменение № 1, введенное в действие Постановлением Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст.
Сноска исключена с 1 февраля 2019 года. - Изменение № 1, введенное в действие Постановлением Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст.
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия
ГОСТ 7269-2015 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
ГОСТ 13496.0-2016 Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб
(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия
ГОСТ 24104-2001 <2> Весы лабораторные. Общие технические требования
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.»
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб
(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
Количественное определение содержания анаболических стероидов и производных стильбена (аналитов) проводят методом внутреннего стандарта по площадям пиков идентифицированных соединений с помощью градуировочной характеристики высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в режиме мониторинга выбранных реакций (MRM).
4 Требования безопасности и условия выполнения измерений
4.1 Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го класса опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.
4.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.
4.3 Приготовление градуировочных растворов проводят под тягой в вытяжном шкафу.
4.4 К выполнению измерений методом ВЭЖХ-МС/МС допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемой аппаратуры.
4.5 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- <a id="p100076"></a>температура окружающего воздуха............ от 15 °C до 30 °C;
- <a id="p100077"></a>атмосферное давление....................... от 84 до 106 кПа;
- <a id="p100078"></a>относительная влажность воздуха............ от 20% до 80%.
5 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы
5.1 Для определения содержания аналитов применяют следующие средства измерений, аппаратуру, материалы и посуду:
- весы специального или высокого класса точности с действительной ценой деления 0,1 мг по ГОСТ OIMLR 76-1 или весы лабораторные по ГОСТ 24104 специального или высокого класса точности с ценой поверочного деления 1,0 мг;;
- масс-спектрометр с гибридным квадрупольным анализатором с диапазоном измерений от 5 до 1200 атомных единиц массы (а. е. м.), массовым разрешением не менее 1200, точностью измерения массы не менее 0,2 а. е. м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);
- pH-метр или универсальный иономер диапазоном измерения от 4 до 9 ед. pH с погрешностью измерения +/- 0,05 ед. pH;
- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм3;
- баню водяную лабораторную;
- встряхиватель (шейкер) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2000 об/мин;
- измельчитель-гомогенизатор погружной лабораторный со скоростью измельчающей насадки от 200 до 5000 об/мин;
- камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 30 °C до минус 40 °C;
- колонку хроматографическую длиной 150 мм и диаметром 2 мм с сорбентом на основе силикагеля с привитыми октадецильными группами, диаметром частиц сорбента не более 3 мкм;
- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений;
- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 250 °C;
- систему высокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем, системы фильтрования и дегазации подвижных фаз, термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до (50 +/- 1) °C;
- систему получения деионизованной воды высокой чистоты с удельным сопротивлением 18 МОм·см;
- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;
- холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °C до 5 °C;
- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 6000 об/мин и диапазоном температур от 4 °C до 20 °C с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см3;
- шкаф сушильный лабораторный с рабочим диапазоном температур от 50 °C до 200 °C;
- картриджи для твердофазной экстракции вместимостью не менее 15 см3, заполненные 0,5 г немодифицированного силикагеля с диаметром частиц сорбента от 63 до 100 мкм;
- пробы контрольные с установленным значением содержания определяемого анаболического стероида или производного стильбена;
- пробы, не содержащие анаболических стероидов и производных стильбена, подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 7 и 8, в зависимости от типа исследуемой матрицы («чистые» пробы);
Примечание - Срок хранения «чистых» проб при температуре от минус 20 °C до минус 40 °C — не более трех мес.
- фильтры нейлоновые мембранные с размером диаметра пор не более 0,2 мкм;
- виалы (флаконы) стеклянные вместимостью 2 см3 с завинчивающимися крышками;
- виалы (флаконы) полипропиленовые или пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см3 с завинчивающимися крышками;
- колбы 1-25(1000)-2 по ГОСТ 1770;
- колбы конические Кн-1-250-29/32 ТС по ГОСТ 25336;
- пипетки 2-2-1-5(10, 25) по ГОСТ 29227;
- пипетки одноканальные переменной вместимости 5 — 25, 20 — 100, 200 — 1000 мм3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1%;
- пробирки П-2-10-14/23ХС по ГОСТ 1770;
- цилиндры 1-25(50, 1000)-1 по ГОСТ 1770.
5.2 При определении содержания аналитов применяют следующие реактивы:
- ацетон по ГОСТ 2603;
- натрий уксуснокислый (натрия ацетат) по ГОСТ 199, ч.д.а.;
- кислоту уксусную по ГОСТ 61;
- метанол, по ГОСТ 6995, х.ч.;
- н-гексан, х.ч.;
- эфир этиловый уксусной кислоты (этилацетат) по ГОСТ 22300, ч.д.а.;
- азот газообразный марки 60 по ГОСТ 9293, ос.ч.;
- сок пищеварительный виноградной улитки Helix pomatia, ч.д.а.;
- эфир метил-третбутиловый для хроматографии;
- воду деионизованную для ВЭЖХ, полученную с использованием системы производства ультрачистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709.
5.3 При определении содержания аналитов в качестве стандартных веществ применяют следующие анаболические стероиды и производные стильбена:
5.3.1 Для приготовления исходных растворов с массовой долей основного вещества не менее 98,0%:
- меленгестрола ацетат;
- мегестрола ацетат;
- медроксипрогестерон;
- \alpha - \text{нортестостерон} ;
- \beta - \text{нортестостерон} ;
- \alpha - \text{тренболон} ;
- \beta - \text{тренболон} ;
- \beta - \text{тестостерон} ;
- метилтестостерон;
- метилболденон;
- триамцинолона ацетонид;
- преднизолон;
- метилпреднизолон;
- дексаметазон;
- диэтилстильбэстрол;
- диенэстрол;
- гексэстрол;
- \alpha - \text{зеараланол} ;
- \beta - \text{зеараланол} ;
- \alpha - \text{зеараленол} .
5.3.2 Для приготовления исходных растворов внутренних стандартов с массовой долей основного вещества не менее 98,0%:
- меленгестрола-D3 ацетат;
- медроксипрогестерон-D3;
- мегестрола-D3 ацетат;
- \beta - \text{тренболон} - D3 ;
- болденон-D3;
- \beta - \text{тестостерон} - D2 ;
- \beta - \text{нортестостерон} - D3 ;
- триамцинолона ацетонид-D6;
- диэтилстильбэстрол-D6;
- \beta - \text{зеараланол} - D4 .
5.4 Допускается применение других средств измерений и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также аппаратуры, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6 Подготовка к проведению измерений
6.1 Подготовка лабораторной посуды и реактивов
6.1.1 Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.
6.1.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).
6.1.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °C до 110 °C.
6.1.4 Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения холостого опыта в соответствии с процедурой анализа.
6.2 Приготовление растворов
6.2.1 Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,2 моль/дм3 и pH 5,2
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 16,4 г ацетата натрия, приливают 900 см3 деионизованной воды, перемешивают. Измеряют pH и устанавливают его значение до (5,2 +/- 0,1) концентрированной уксусной кислотой и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.
Срок хранения раствора при температуре 4 °C — не более 1 мес.
6.2.2 Приготовление раствора ацетона в гексане в объемном соотношении 1:9
В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят 20 см3 ацетона и 180 см3 гексана, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 3 мес.
6.2.3 Приготовление раствора ацетона в гексане в объемном соотношении 1:4
В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят 40 см3 ацетона и 160 см3 гексана, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 3 мес.
6.2.4 Приготовление раствора метанола в деионизированной воде в объемном соотношении 4:1
В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят 200 см3 метанола и 50 см3 деионизированной воды, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 3 мес.
6.3 Приготовление градуировочных растворов
6.3.1 Приготовление градуировочных растворов меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола}
6.3.1.1 Приготовление исходных растворов C0 и исходных растворов внутренних стандартов D0
Для приготовления исходных растворов C0 концентрацией 200 мкг/см3 взвешивают по 5,0 мг \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} , меленгестрола ацетата; для приготовления исходных растворов внутренних стандартов D0 концентрацией 200 мкг/см3 взвешивают по 5,0 мг \beta - \text{нортестостерона} - D3 , \beta - \text{зеараланола} - D4 , меленгестрола-D3 ацетата, \beta - \text{тренболона} - D3 и переносят каждое вещество по отдельности в мерные колбы вместимостью 25 см3. Доводят до метки раствором метанола (см. 6.2.4), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.
Срок хранения растворов при температуре от минус 30 °C до минус 40 °C — не более одного года.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
Внутренние стандарты для анаболических стероидов и производных стильбена выбирают в соответствии с таблицей 1.
Соответствие между аналитами и внутренними стандартами
6.3.1.2 Приготовление рабочих растворов C1, D1, C2
Рабочие растворы C1, D1, C2 готовят в мерных пробирках вместимостью 10 см3 в соответствии рисунком 1.
| Рабочий раствор C1 с массовой концентрацией каждого аналита 1 мкг/см3 | Рабочий раствор внутренних стандартов D1 с массовой концентрацией каждого аналита 0,5 мкг/см3 | Рабочий раствор C2 с массовой концентрацией каждого аналита 0,025 мкг/см3 | ||
| Берут по 0,050 см3 каждого раствора C0 по 6.3.1.1 | Берут по 0,025 см3 каждого раствора D0 по 6.3.1.1 | Берут 0,250 см3 раствора C1 | ||
 |  |  | ||
| Доводят до метки раствором метанола (см. 6.2.4), перемешивают | ||||
 | ||||
| Помещают в ультразвуковую баню на 1 мин | ||||
Рисунок 1 — Приготовление рабочих растворов C1, D1, C2
Растворы C1, D1 хранят при температуре от минус 20 °C до минус 40 °C. Срок хранения раствора C1 — не более одного года, D1 — не более 6 мес.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
Срок хранения раствора C2 в холодильнике при температуре от 2 °C до 4 °C — не более 1 мес.
6.3.1.3 Приготовление матричных градуировочных растворов G1м — G4м меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} для проб мяса, рыбы
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
Матричные градуировочные растворы G1м — G4м готовят в виалах или пропиленовых пробирках вместимостью 50 см3 путем обработки «чистых» проб мяса, рыбы массой 10,0 г согласно разделу 7, в которые одновременно с добавлением рабочего раствора внутренних стандартов D1 вносят рабочие растворы определяемых аналитов C1 и C2 в соответствии с таблицей 2.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
Приготовление матричных градуировочных растворов G1м — G4м
Виалы (пробирки) встряхивают в шейкере в течение 1 мин и проводят обработку пробы согласно разделу 7.
Раствор G1м используют свежеприготовленным.
Срок хранения растворов G2м — G4м при температуре от 2 °C до 4 °C — не более 1 сут.
6.3.1.4 Приготовление матричных градуировочных растворов G1п — G4п меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} для проб печени
Матричные градуировочные растворы G1п — G4п готовят в виалах или пропиленовых пробирках вместимостью 50 см3 путем обработки «чистых» проб печени массой 5,0 г согласно разделу 7, в которые одновременно с добавлением рабочего раствора внутренних стандартов D1 вносят рабочие растворы определяемых аналитов C1 и C2 в соответствии с таблицей 3.
Приготовление матричных градуировочных растворов G1п — G4п
Виалы (пробирки) встряхивают в шейкере в течение 1 мин и проводят обработку пробы согласно разделу 7.
Срок хранения растворов G1п — G4п при температуре от 2 °C до 4 °C — не более 1 сут.
6.3.2 Приготовление градуировочных растворов триамцинолона ацетонида, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона
6.3.2.1 Приготовление исходных растворов C_{0}\prime и исходных растворов внутренних стандартов D_{0}\prime
Для приготовления исходных растворов C_{0}\prime с концентрацией 200 мкг/см3 взвешивают по 5,0 мг триамцинолона ацетонида, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона; для приготовления исходных растворов внутренних стандартов D_{0}\prime с концентрацией 200 мкг/см3 взвешивают по 5,0 мг медроксипрогестерона-D3, мегестрола-D3 ацетата, \beta - \text{тестостерона} - D2 , триамцинолона ацетонида-D6, диэтилстильбэстрола-D6 и переносят каждое вещество по отдельности в мерные колбы вместимостью 25 см3. Доводят до метки раствором метанола (см. 6.2.4), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.
Срок хранения растворов при температуре от минус 30 °C до минус 40 °C — не более одного года.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре, в темном месте, не менее 30 мин.
Внутренние стандарты для анаболических стероидов и производных стильбена выбирают в соответствии с таблицей 4.
Соответствие между аналитами и внутренними стандартами
6.3.2.2 Приготовление рабочих растворов C_{1}\prime , D_{1}\prime , C_{2}\prime
Рабочие растворы C_{1}\prime , D_{1}\prime , C_{2}\prime готовят в мерных пробирках вместимостью 10 см3 в соответствии рисунком 2.
| Рабочий раствор C_{1}\prime с массовой концентрацией каждого аналита 1 мкг/см3 | Рабочий раствор внутренних стандартов D_{1}\prime с массовой концентрацией каждого аналита 0,5 мкг/см3 | Рабочий раствор C_{2}\prime с массовой концентрацией каждого аналита 0,025 мкг/см3 | ||
| Берут по 0,050 см3 каждого раствора C_{0}\prime по 6.3.2.1 | Берут по 0,025 см3 каждого раствора D_{0}\prime по 6.3.2.1 | Берут 0,250 см3 раствора C_{1}\prime | ||
 |  |  | ||
| Доводят до метки раствором метанола (см. 6.2.4), перемешивают | ||||
 | ||||
| Помещают в ультразвуковую баню на 1 мин | ||||
Рисунок 2 — Приготовление рабочих растворов C_{1}\prime , D_{1}\prime , C_{2}\prime
Растворы C_{1}\prime , D_{1}\prime хранят при температуре от минус 30 °C до минус 40 °C. Срок хранения раствора C_{1}\prime — не более одного года, D_{1}\prime — не более 6 мес.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
Срок хранения раствора C_{2}\prime при температуре от 2 °C до 4 °C — не более 1 мес.
6.3.2.3 Приготовление матричных градуировочных растворов G_{1}\prime - G_{4}\prime триамцинолона ацетонида, мегестрол ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона для проб мяса, печени, рыбы и комбикорма
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
Матричные градуировочные растворы G_{1}\prime - G_{4}\prime готовят в виалах или пропиленовых пробирках вместимостью 50 см3 путем обработки «чистых» проб массой 5,0 г согласно разделу 7, в которые одновременно с добавлением рабочего раствора внутренних стандартов D_{1}\prime вносят рабочие растворы определяемых аналитов C_{1}\prime и C_{2}\prime в соответствии с таблицей 5.
Приготовление матричных градуировочных растворов G_{1}\prime - G_{4}\prime
Виалы (пробирки) встряхивают в шейкере в течение 1 мин и проводят обработку пробы согласно разделу 7.
Раствор G_{1}\prime используют свежеприготовленным.
Срок хранения растворов G_{2}\prime - G_{4}\prime при температуре от 2 °C до 4 °C — не более 1 сут.
7.1 Отбор проб
7.1.1 Отбор проб мяса, печени — по ГОСТ 7269. Отбор проб рыбы — по ГОСТ 31339.
(п. 7.1.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
7.1.2 Отбор проб мяса и печени птицы — по ГОСТ 31467.
7.1.3 Отбор проб комбикормов — по ГОСТ 13496.0.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
7.1.4 Пробы, отобранные по 7.1.1, 7.1.2, при отсутствии возможности анализа в день отбора замораживают и хранят при температуре минус 25 °C до проведения анализа, но не более 90 сут.
7.2 Подготовка проб
7.2.1 Подготовка проб мяса, включая мясо птицы, рыбы при определении меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола}
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
7.2.1.1 Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани, рыбу предварительно очищают от крупных костей, кожи, других нецелевых составляющих и измельчают на гомогенизаторе. Далее обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 3.
(п. 7.2.1.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
| Взвешивают 10,00 г (результат взвешивания записывают с точностью до второго десятичного знака) гомогенизированной мышечной ткани и помещают анализируемую пробу в виалу или полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 |
|---|
 |
| Вносят 50 мм3 рабочего раствора внутренних стандартов D1 (см. 6.3.1.2) и перемешивают в шейкере в течение 1 мин |
 |
| Приливают 15 см3 ацетатного буферного раствора (см. 6.2.1) и гомогенизируют в гомогенизаторе в течение 30 с |
 |
| Приливают 20 см3 трет-бутилметилового эфира, закрывают крышкой и перемешивают в шейкере в течение 20 мин |
 |
| Центрифугируют при 2800 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 °C |
 |
| Пипеточным дозатором переносят верхний (эфирный) слой в новую виалу (пробирку) вместимостью 50 см3 и упаривают досуха в токе азота при температуре 40 °C |
 |
| К полученному остатку приливают 3 см3 раствора ацетона (см. 6.2.2) |
 |
| Помещают на 1 мин в ультразвуковую баню, затем на 1 мин в шейкер |
 |
| Полученный экстракт очищают методом твердофазной экстракции (ТФЭ) по 7.2.1.2 |
Рисунок 3 — Подготовка проб мяса, включая мясо птицы, рыбы
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
7.2.1.2 Картриджи для твердофазной экстракции кондиционируют на вакуумном устройстве для ТФЭ, пропуская 8 см3 раствора ацетона (см. 6.2.2). Затем пропускают через картридж пробу, полученную в соответствии с 7.2.1.1, промывают картридж 10 см3 раствора ацетона (см. 6.2.2) и сушат в вакууме водоструйного насоса в течение 10 мин. Элюируют определяемые вещества 10 см3 раствора ацетона (см. 6.2.3) в новую виалу. Упаривают элюат досуха в токе азота при температуре не более 40 °C. Остаток перерастворяют в 1 см3 раствора метанола (см. 6.2.4), помещают в ультразвуковую баню при комнатной температуре на 1 мин, затем фильтруют через мембранный фильтр в виалу вместимостью 2 см3 и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.
7.2.2 Подготовка проб печени, включая печень птицы, при определении меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола}
Обработку пробы печени проводят в соответствии с рисунком 4.
| Взвешивают 5,00 г печени (результат взвешивания записывают с точностью до второго десятичного знака) и помещают анализируемую пробу в виалу или полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 |
|---|
 |
| Вносят 50 мм3 рабочего раствора внутренних стандартов D1 (см. 6.3.1.2) и перемешивают в шейкере в течение 1 мин |
 |
| Приливают 6 см3 ацетатного буферного раствора (см. 6.2.1) и гомогенизируют в гомогенизаторе в течение 30 с |
 |
| Добавляют 40 мм3 пищеварительного сока виноградной улитки Helix pomatia, закрывают крышкой и помещают на нагревательный модуль при температуре 52 °C на 4 ч для гидролиза |
 |
| Охлаждают до комнатной температуры |
 |
| Добавляют 15 см3 трет-бутилметилового эфира, закрывают крышкой и перемешивают в шейкере в течение 20 мин |
 |
| Центрифугируют при 2800 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 °C |
 |
| Пипеточным дозатором переносят верхний (эфирный) слой в новую виалу вместимостью 15 см3 и упаривают досуха в токе азота при температуре 40 °C |
 |
| К полученному остатку приливают 3 см3 раствора ацетона (см. 6.2.2) |
 |
| Помещают на 1 мин в ультразвуковую баню, затем на 1 мин в шейкер |
 |
| Полученный экстракт очищают методом ТФЭ по 7.2.1.2 |
Рисунок 4 — Подготовка проб печени, включая печень птицы
7.2.3 Подготовка проб мяса, включая мясо птицы, рыбы и комбикормов при определении триамцинолона ацетонида, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани, рыбу предварительно очищают от крупных костей, кожи, других нецелевых составляющих и измельчают на гомогенизаторе. Далее обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 5.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
| Взвешивают 5,00 г (результат взвешивания записывают с точностью до второго десятичного знака) гомогенизированной мышечной ткани или комбикорма и помещают анализируемую пробу в виалу или полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 |
|---|
 |
| Вносят 50 мм3 рабочего раствора внутренних стандартов D_{1}\prime (см. 6.3.2.2) и перемешивают в шейкере в течение 1 мин |
 |
| Приливают 10 см3 ацетатного буферного раствора (см. 6.2.1) и гомогенизируют в гомогенизаторе в течение 30 с |
 |
| Добавляют 15 см3 трет-бутилметилового эфира, закрывают крышкой и перемешивают в шейкере в течение 20 мин |
 |
| Центрифугируют при 2800 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 °C |
 |
| Пипеточным дозатором переносят верхний (эфирный) слой в новую виалу (пробирку) вместимостью 15 см3 и упаривают досуха в токе азота при температуре 40 °C |
 |
| К полученному остатку приливают 1 см3 раствора метанола (см. 6.2.4) |
 |
| Помещают на 1 мин в ультразвуковую баню, затем на 1 мин в шейкер |
 |
| Пипеточным дозатором удаляют гексановый слой и центрифугируют пробу при 5200 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 °C |
 |
| Переносят центрифугат в виалу и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа |
Рисунок 5 — Подготовка проб мяса, включая
мясо птицы, рыбы и комбикормов
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
7.2.4 Подготовка проб печени, включая печень птицы, при определении триамцинолона ацетонида, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона
Обработку пробы печени проводят в соответствии с рисунком 6.
| Взвешивают 5,00 г печени (результат взвешивания записывают с точностью до второго десятичного знака) и помещают анализируемую пробу в виалу или полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 |
|---|
 |
| Вносят 50 мм3 рабочего раствора внутренних стандартов D_{1}\prime (см. 6.3.2.2) и перемешивают в шейкере в течение 1 мин |
 |
| Приливают 6 см3 ацетатного буферного раствора (6.2.1) и гомогенизируют в гомогенизаторе в течение 30 с |
 |
| Добавляют 40 мм3 пищеварительного сока виноградной улитки Helix pomatia, закрывают крышкой и помещают на нагревательный модуль на 4 ч при температуре 52 °C для гидролиза |
 |
| Охлаждают до комнатной температуры |
 |
| Добавляют 15 см3 трет-бутилметилового эфира, закрывают крышкой и перемешивают в шейкере в течение 20 мин |
 |
| Центрифугируют при 2800 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 °C |
 |
| Пипеточным дозатором переносят верхний (эфирный) слой в новую виалу вместимостью 15 см3 и упаривают досуха в токе азота при температуре 40 °C |
 |
| К полученному остатку приливают 1 см3 раствора метанола (см. 6.2.4) и помещают на 1 мин в ультразвуковую баню |
 |
| Добавляют 3 см3 гексана и перемешивают в шейкере в течение 1 мин |
 |
| Пипеточным дозатором удаляют гексановый слой и центрифугируют пробу при 5200 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 °C |
 |
| Переносят центрифугат в виалу и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа |
Рисунок 6 — Подготовка проб печени, включая печень птицы
7.2.5 Приготовление «холостой пробы»
Приготовление «холостой» пробы проводят в условиях подготовки проб, где вместо матрицы используют 1,0 см3 деионизованной воды.
8.1 Условия хроматографических измерений
8.1.1 Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем хроматографических колонок. Например, для колонки диаметром 2 мм, длиной 150 мм, с обращенно-фазным сорбентом C18, с размером частиц 3,0 мкм, применяют следующие хроматографические условия:
- температура колонки — 40 °C;
- скорость потока подвижной фазы — 0,2 см3/мин;
- объем вводимой пробы — 20 мм3.
8.1.2 Разделение проводят в режиме градиентного элюирования. В качестве подвижной фазы А используют деионизованную воду, подвижной фазы Б — метанол) в соответствии с таблицами 6 и 7.
Условия хроматографического разделения при регистрации положительных ионов
| Время, мин | Подвижная фаза А, % | Подвижная фаза Б, % |
|---|---|---|
| 0,0 | 100 | - |
| 25,0 | 20 | 80 |
| 30,0 | 20 | 80 |
| 30,1 | 100 | - |
| 40,0 | 100 | - |
Условия хроматографического разделения при регистрации отрицательных ионов
| Время, мин | Подвижная фаза А, % | Подвижная фаза Б, % |
|---|---|---|
| 0,0 | 60 | 40 |
| 4,0 | 30 | 70 |
| 4,1 | 25 | 75 |
| 13,1 | 60 | 40 |
| 23,0 | 60 | 40 |
8.1.3 Параметры воздействия на ионы в режиме мониторинга нескольких реакций (MRM) при определении меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} приведены в таблице 8.
Параметры воздействия на ионы в режиме MRM и условиях электрораспыления с регистрацией положительных или отрицательных ионов
| Аналит | Ион-предшественник, m/z | Ион-продукт, m/z | Потенциал декластеризации, В | Энергия соударений, эВ | Ускоряющее напряжение на выходе из ячейки столкновений, В | ||
| Меленгестрол ацетат | 397,1 | 279,1 | 337,1 | 100 | 27 | 21 | 14 |
| \alpha - \text{нортестостерон} , \beta - \text{нортестостерон} | 275,2 | 109,2 | 145,2 | 100 | 35 | 30 | 14 |
| \alpha - \text{тренболон} , \beta - \text{тренболон} | 271,0 | 165,1 | 199,1 | 100 | 27 | 27 | 14 |
| \beta - \text{нортестостерон} - D3 <*> | 278,2 | 242,1 | - | 100 | 24 | - | 15 |
| Меленгестрол-D3 ацетат <*> | 400,2 | 282,1 | - | 100 | 28 | - | 15 |
| \beta - \text{тренболон} - D3 <*> | 274,1 | 199,1 | - | 100 | 27 | - | 15 |
| \alpha - \text{зеараланол} \beta - \text{зеараланол} | 321,2 | 277,2 | 303,2 | -110 | -30 | -30 | -20 |
| \alpha - \text{зеараленол} | 319,1 | 160,1 | 130,1 | -165 | -40 | -40 | -20 |
| \beta - \text{зеараланол} - D4 <*> | 325,1 | 281,1 | 307,1 | -100 | -35 | -32 | -20 |
| <*> Внутренний стандарт. | |||||||
8.1.4 Параметры метода воздействия на ионы в режиме мониторинга нескольких реакций (MRM) при определении триамцинолона ацетонида, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона приведены в таблице 9.
Параметры воздействия на ионы в режиме MRM и условиях электрораспыления с регистрацией положительных или отрицательных ионов
| Аналит | Ион-предшественник, m/z | Ион-продукт, m/z | Потенциал декластеризации, В | Энергия соударений, эВ | Ускоряющее напряжение на выходе из ячейки столкновений, В | ||
| Триамцинолона ацетонид | 435,2 | 213,2 | 171,0 | 100 | 37 | 37 | 18 |
| Мегестрола ацетат | 385,1 | 267,1 | 325,1 | 100 | 25 | 25 | 12 |
| Медроксипрогестерон | 345,2 | 97,3 | 123,1 | 100 | 31 | 31 | 8 |
| Метилболденон | 301,2 | 149,1 | 121,1 | 100 | 21 | 21 | 14 |
| \beta - \text{тестостерон} | 289,2 | 97,1 | 109,1 | 100 | 29 | 29 | 16 |
| Метилтестостерон | 303,2 | 97,1 | 109,1 | 100 | 37 | 38 | 13 |
| Дексаметазон | 373,1 | 147,1 | 171,1 | 100 | 32 | 35 | 15 |
| Медроксипрогестерон-D3 <*> | 348,2 | 126,1 | - | 100 | 30 | - | 15 |
| Мегестрола-D3 ацетат <*> | 388,3 | 270,1 | - | 100 | 24 | - | 15 |
| \beta - \text{тестостерон} - D2 <*> | 291,2 | 99,1 | 111,0 | 100 | 27 | 30 | 15 |
| Триамцинолона ацетонид-D6 <*> | 441,2 | 213,1 | - | 100 | 34 | - | 15 |
| Диенэстрол | 265,0 | 234,8 | 92,9 | -115 | -31 | -30 | -20 |
| Гексэстрол | 269,2 | 118,9 | 133,9 | -100 | -50 | -21 | -20 |
| Диэтилстильбэстрол | 267,2 | 221,9 | 236,9 | -115 | -47 | -35 | -20 |
| Преднизолон | 405,2 | 295,1 | 280,1 | -10 | -45 | -50 | -20 |
| Метилпреднизолон | 419,2 | 343,3 | 309,2 | -40 | -23 | -43 | -20 |
| Дексаметазон | 437,1 | 361.2 | 345,3 | -50 | -24 | -34 | -20 |
| Диэтилстильбэстрол-D6 <*> | 273,2 | 240,9 | 223,0 | -100 | -32 | -35 | -20 |
| <*> Внутренний стандарт. | |||||||
Примечание - Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемой аппаратуры.
8.1.5 Параметры источника ионизации и квадрупольного анализатора:
- напряжение на распыляющем капилляре (IS) 5500 В при регистрации положительных ионов и минус 4500 В при регистрации отрицательных ионов;
- разрешение квадруполей Q1/Q3 единичное;
- давление газа для фрагментации (CAD) 41 кПа.
8.1.6 Контроль чувствительности хромато-масс-спектрометра осуществляют введением 20 мм3 градуировочного раствора G4м, G4п или G_{4}\prime (см. 6.3.1.3, 6.3.1.4, 6.3.2.3) в зависимости от типа анализируемой матрицы в инжектор хроматографа. Полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 20.
8.2 Построение градуировочной характеристики
Построение и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения хромато-масс-спектрометра.
8.2.1 Проводят измерения не менее трех градуировочных растворов, приготовленных по 6.3.1.3, 6.3.1.4 или 6.3.2.3, в порядке возрастания их концентраций. Каждый градуировочный раствор измеряют два раза.
8.2.2 Вычисление площади пика проводят для каждого иона-продукта анализируемых анаболических стероидов и производных стильбена и их внутренних стандартов. Допускается проведение количественных измерений по одному, наиболее интенсивному, иону-продукту. Для подтверждения наличия анаболических стероидов и производных стильбена рассчитывают отношения площади пика двух ионов-продуктов для каждого аналита в градуировочном растворе.
8.2.3 При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида y = ax, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98.
8.2.4 Построение линейного градуировочного графика и расчет концентрации анаболических стероидов и производных стильбена в анализируемых пробах выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.
8.3 ВЭЖХ-МС/МС измерение
8.3.1 Для определения содержания аналитов проводят ВЭЖХ-МС/МС анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования.
8.3.2 ВЭЖХ-МС/МС анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:
- подвижную фазу А;
- «холостую» пробу (см. 7.2.5);
- «чистую» пробу;
- градуировочные растворы (см. 6.3.1.3, 6.3.1.4, 6.3.2.3);
- экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.
8.3.3 В инжектор хроматографа вводят 20 мм3 пробы, подготовленной в соответствии с разделом 7, и проводят измерения.
8.3.4 Определяют и регистрируют на хроматограмме время удерживания пиков двух ионов-продуктов каждого аналита, соответствующее времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов по 8.1.1.
8.3.5 Отклонения относительных ионных интенсивностей в анализируемой пробе от относительных ионных интенсивностей, полученных при анализе градуировочных растворов, не должны превышать значений, указанных в таблице 10.
Допустимые отклонения относительных ионных интенсивностей
9 Обработка результатов измерений
9.1 В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения концентрации аналитов в анализируемой пробе.
9.2 Содержание i-го аналита Xi, мкг/кг, вычисляют по формуле
X_{i} = \frac{C_{i} \cdot V_{i}}{m_{i}} , (1)
где Ci — концентрация аналита в анализируемой пробе, найденная по градуировочному графику, нг/см3;
Vi — объем, до которого разбавлена проба, см3;
mi — масса анализируемой пробы, г.
9.3 За окончательный результат содержания анаболических стероидов и производных стильбена принимают среднеарифметическое значение результатов вычислений двух параллельных измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака и выраженное в микрограммах на килограмм (мкг/кг).
10 Метрологические характеристики
Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение определения содержания анаболических стероидов и производных стильбена с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата k = 2, указанной в таблицах 11 — 13.
Показатели точности метода при определении содержания меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} в пробах печени
Показатели точности метода при проведении измерений содержания меленгестрола ацетата, \alpha - \text{нортестостерона} , \beta - \text{нортестостерона} , \alpha - \text{тренболона} , \beta - \text{тренболона} , \alpha - \text{зеараланола} , \beta - \text{зеараланола} , \alpha - \text{зеараленола} в пробах мяса, рыбы
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
Показатели точности метода при определении содержания триамцинолона ацетонида, мегестрола ацетата, медроксипрогестерона, метилболденона, \beta - \text{тестостерона} , диэтилстильбэстрола, диенэстрола, гексэстрола, преднизолона, метилпреднизолона, дексаметазона, метилтестостерона в пробах мяса, печени, рыбы и комбикормов
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 05.10.2018 № 716-ст)
11 Оформление результатов измерений
Содержание i-го анаболического стероида и производных стильбена, мкг/кг, представляют в виде
\overline{X_{i}} \pm 0,01 \cdot U_{i} \cdot \overline{X_{i}} , (2)
Где \overline{X_{i}} — среднеарифметическое значение вычислений двух параллельных измерений содержания i-го аналита в анализируемой пробе по 9.2, мкг/кг;
Ui — значение относительной расширенной неопределенности содержания i-го аналита для соответствующего диапазона измерений, % (в соответствии с таблицами 11 - 13).
12 Контроль правильности результатов измерений
12.1 Для соблюдения требований настоящего стандарта рекомендуется в ходе анализа каждой серии проб проводить анализ контрольных проб с установленным значением содержания i-го определяемого аналита с использованием стандартной процедуры подготовки проб (см. раздел 7).
12.2 Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении следующего неравенства
|\overline{X_{i}} - X_{a}| \leq \overline{X_{i}} \cdot U_{i} \cdot 0,01 , (3)
где \overline{X_{i}} — среднеарифметическое значение содержания i-го определяемого аналита в анализируемой пробе, мкг/кг
Xa — установленное значение содержания определяемого аналита в контрольной пробе, мкг/кг
Ui — значение относительной расширенной неопределенности содержания определяемого аналита для соответствующего диапазона измерений, % (в соответствии с таблицами 11 - 13).
12.3 Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6, используя контроль стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности рутинного анализа с изменяющимися факторами «время» и «оператор» с использованием контрольных карт Шухарта.