ГОСТ 33410-2015. Межгосударственный стандарт. Продукция безалкогольная, слабоалкогольная, винодельческая и соковая. Определение содержания органических кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 19.08.2016 № 923-ст)
(ред. от 19.11.2025)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов (п. п. 271, 303, 338, 403, 494), а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности алкогольной продукции» (ТР ЕАЭС 047/2018) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 17.05.2022 № 80). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» (ТР ТС 023/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 28.01.2020 № 19). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Изменение № 1 вводится в действие на территории Российской Федерации Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст с 01.11.2026 с правом досрочного применения.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2016 г. № 923-ст
ПРОДУКЦИЯ БЕЗАЛКОГОЛЬНАЯ, СЛАБОАЛКОГОЛЬНАЯ, ВИНОДЕЛЬЧЕСКАЯ И СОКОВАЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Non-alcoholic, low-alcoholic, wine and juice products. Determination of organic acids content by high performance liquid chromatography
67.160.20
Дата введения 1 июля 2017 года
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ)
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 22 июля 2015 г. № 78-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2016 г. № 923-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33410-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.
5 Настоящий стандарт разработан на основе методики выполнения измерений МВИ.МН 2990-2008 «Определение содержания органических кислот в винах, виноматериалах, безалкогольных напитках, соках, продуктах переработки плодов и овощей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», аттестованной БелГИМ. Свидетельство об аттестации № 48/2008 от 02.02.2009
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Настоящий стандарт распространяется на напитки безалкогольные, слабоалкогольные, винодельческую продукцию, соки, нектары, сокосодержащие напитки, продукты переработки фруктов, ягод и овощей, и устанавливает метод определения массовой концентрации щавелевой, винной, яблочной, шикимовой, аскорбиновой, молочной, уксусной, малеиновой, лимонной, янтарной, фумаровой кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с применением диодно-матричного или спектрофотометрического детектора.
Диапазоны измерений для каждой кислоты приведены в таблице 1.
(раздел 2 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.2.003 Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения средств измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 841 Реактивы. Кислота метафосфорная. Технические условия
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 6552 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия <*>
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 58144-2018.
(сноска введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29169 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 предел измерения (LOQ): Наименьшее значение массовой концентрации определяемой кислоты, которое может быть измерено с установленной точностью в соответствии с настоящим стандартом.
3.2 диапазон измерений: Область значений массовой концентрации кислоты в пробе, определяемая по настоящему стандарту с установленной точностью.
Метод основан на применении обращенно-фазовой ВЭЖХ для разделения смеси органических кислот на колонке в режиме изократического элюирования. Идентификацию и количественное определение кислот осуществляют с помощью диодно-матричного или спектрофотометрического детектора в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 220 нм.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
5 Требования безопасности и требования к квалификации операторов
5.1 Требования безопасности
При проведении работ персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:
- электробезопасности — по ГОСТ 12.1.019 и 12.2.003;
- пожарной безопасности — по ГОСТ 12.1.004;
- техники безопасности при работе с химическими реагентами — по ГОСТ 12.1.007;
- техники безопасности при работе в химической лаборатории;
- техники безопасности, изложенные в эксплуатационных документах на средства измерений и оборудование, применяемые при проведении измерений.
5.2 Требования к квалификации операторов
К проведению измерений и обработке результатов хроматографического анализа могут быть допущены лица, имеющие специальное образование, опыт работы в области жидкостной хроматографии, изучившие руководство по эксплуатации жидкостного хроматографа, инструкцию по использованию системы обработки хроматографических данных и настоящий стандарт. Первое применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории следует проводить под руководством специалиста, владеющего теорией метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.
6 Условия проведения измерений
При проведении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
Помещения для проведения измерений должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией и подводкой воды.
7 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, материалы, реактивы
Хроматограф высокоэффективный жидкостной включающий:
- насос с вакуумным дегазатором;
- термостат колонок;
- детектор диодно-матричный или спектрофотометрический (диапазон длин волн от 190 нм);
- автосамплер;
- система управления и обработки данных;
- колонка аналитическая хроматографическая <*>.
<*> Примером подходящего продукта является хроматографическая колонка LichroCART 250-4 Superspher 100 RP-18. Данная информация приведена для удобства и не означает признания названного продукта пользователями настоящего стандарта.
Весы лабораторные электронные по ГОСТ OIML R 76-1, специального класса точности, с максимальной нагрузкой 220 г, действительной ценой деления 0,0001 г.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Весы лабораторные электронные по ГОСТ OIML R 76-1, специального класса точности, с максимальной нагрузкой 510 г, действительной ценой деления 0,0001 г.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.
Колба коническая КН-1-250-29/32 по ГОСТ 25336.
Пипетка с одной меткой 2-2-5 по ГОСТ 29169.
Пипетки градуированные 1-2-1-1, 1-2-1-5 по ГОСТ 29227.
Стакан В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.
Цилиндр 1-1000-1 по ГОСТ 1770.
Баня ультразвуковая с частотой ультразвука 35 кГц.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Виалы для автосамплера вместимостью 2 см3.
Термостат водяной с точностью поддержания температуры +/- 0,1 °C, в диапазоне температур от 10 °C до 40 °C.
Гомогенизатор для работы с объемом до 200 см3 или бытовой измельчитель.
Картриджи для твердофазной экстракции вместимостью 3 см3 с привитой фазой C18 или C18-CN.
Шейкер лабораторный с орбитальным или горизонтальным движением и регулируемой скоростью до 500 оборотов в минуту.
Устройство для твердофазной экстракции.
Устройство для фильтрования элюентов.
Фильтры мембранные из регенерированной целлюлозы d = 25 мм, dпор = 0,25 мкм.
Фильтры мембранные из регенерированной целлюлозы d = 47 мм, dпор = 0,45 мкм.
Кислота фумаровая, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Центрифуга, обеспечивающая скорость вращения 8000 оборотов в минуту с объемом стаканов для центрифугирования не менее V = 30 см3.
Шприцы инъекционные однократного применения вместимостью 2; 10 см3.
pH-метр с диапазоном измерений от 0 до 14 ед. pH и погрешностью 0,01 ед. pH в комплекте с электродами.
Кислота аскорбиновая, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Кислота винная, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Калий однозамещенный фосфорнокислый, содержание основного вещества не менее 99,7%.
Кислота метафосфорная по ГОСТ 841, х.ч.
Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, х.ч.
Кислота лимонная, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Кислота малеиновая, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Кислота молочная, массовая доля основного вещества не менее 88,0%.
Спирт этиловый из пищевого сырья высшей степени очистки.
Кислота уксусная, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Кислота шикимовая, массовая доля основного вещества не менее 98,0%.
Кислота щавелевая, массовая доля основного вещества не менее 96,0%.
Кислота яблочная, массовая доля основного вещества не менее 98,0%.
Кислота янтарная, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Примечание - Погрешность массовой доли основного вещества в органических кислотах должна быть не более 1,0%.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также посуды, материалов и реактивов по качеству не ниже указанных.
8 Подготовка к проведению измерений
8.1 Отбор проб
Отбор проб продукции для определения органических кислот проводят в соответствии с действующими нормативными документами на продукцию.
Отбор проб продукции для определения содержания органических кислот должен обеспечивать однородность и репрезентативность представленной пробы, а также предусматривать отбор проб на случай разногласий в оценке качества продукции.
Проба, доставленная в лабораторию на анализ, не должна быть повреждена или изменена во время транспортирования и хранения.
8.1.1 Подготовка проб для определения органических кислот
Для выполнения анализа кислот по 8.1.1 - 8.1.6 готовят две параллельные пробы. Подготовку каждой параллельной пробы проводят в соответствии с рисунком А.1 (приложение А).
Примечание - Предлагаемое разбавление пробы в 2 и 50 раз выбрано на основе анализа данных по диапазону массовых концентраций органических кислот в винодельческой продукции, напитках и другой продукции. Такое разбавление позволяет измерить массовую концентрацию всех, определяемых органических кислот, присутствующих в пробе. Допускается применение других коэффициентов разбавления пробы при измерении массовой концентрации кислот, выходящих за границы диапазона измерений.
8.1.2 Подготовка проб винодельческой продукции, безалкогольных и слабоалкогольных напитков, сока, нектара и сокосодержащих напитков осветленных
Каждую параллельную пробу перед измерением разбавляют в 2 и 50 раз для выполнения измерений массовых концентраций кислот в диапазоне градуировочного графика.
От каждой параллельной пробы пипеткой отбирают 1 и 25 см3, переносят в две мерные колбы вместимостью 50 см3. Каждую колбу доводят до метки элюирующим раствором, приготовленным по 8.2 при температуре (20 +/- 2) °C и хорошо перемешивают. Аликвоту объемом 5 см3 из каждой колбы подготавливают далее в соответствии с требованиями 8.1.6.1.
8.1.3 Подготовка проб сока, нектара и сокосодержащих напитков неосветленных
Каждую параллельную пробу перед измерением разбавляют в 2 и 50 раз для выполнения измерения массовых концентраций кислот в диапазоне градуировочного графика.
От каждой параллельной пробы пипеткой отбирают 1 и 25 см3, переносят в отдельные мерные колбы вместимостью 50 см3, доводят до метки элюирующим раствором, приготовленным по 8.2 при температуре (20 +/- 2) °C и хорошо перемешивают. Содержимое мерной колбы переносят в коническую колбу, которую помещают в ультразвуковую баню на 15 мин или встряхивают в течение 25 — 30 мин на лабораторном шейкере.
25 — 30 см3 раствора из конических колб помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют в течение 5 мин при 7000 об/мин. Супернатант объемом 5 см3 подготавливают далее в соответствии с требованиями 8.1.6.1.
8.1.4 Подготовка проб пюреобразных продуктов (продуктов переработки фруктов, ягод и овощей, находящихся или переведенных в пюреобразное состояние) проб сока, нектара и сокосодержащего напитка с мякотью
Фрукты, овощи предварительно измельчают до пюреобразного состояния с помощью гомогенизатора или бытового измельчителя, кухонного комбайна. Далее пробоподготовку проводят так же как и для пюреобразных продуктов.
Каждую параллельную пробу перед измерением разбавляют в 2 и 50 раз для выполнения измерения массовых концентраций кислот в диапазоне градуировочного графика.
Навеску пробы массой 1 г взятую с точностью до 0,01 г и навеску 25 г взятую с точностью до 0,1 г вносят в две отдельные мерные колбы вместимостью 50 см3. Каждую колбу доводят до метки элюирующим раствором, приготовленным по 8.2 и перемешивают при температуре (20 +/- 2) °C. Содержимое мерной колбы переносят в коническую колбу, которую помещают в ультразвуковую баню на 15 мин или встряхивают в течение 25 — 30 мин на лабораторном шейкере.
25 — 30 см3 раствора из конических колб помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют в течение 5 мин при 7000 об/мин. Супернатант объемом 5 см3 подготавливают далее в соответствии с требованиями 8.1.6.1.
8.1.5 Подготовка проб для определения аскорбиновой кислоты и других органических кислот
При необходимости определения содержания аскорбиновой и других органических кислот в соках, напитках, продуктах переработки фруктов, ягод и овощей в качестве экстрагирующего раствора применяют 3%-ный раствор метафосфорной кислоты, приготовленный по 8.3 для предотвращения разложения аскорбиновой кислоты во время подготовки проб и проведения анализа.
Все этапы подготовки проб по определению содержания аскорбиновой и других органических кислот аналогичны 8.1.1 - 8.1.4 и проводятся в соответствии с рисунком А.2 (приложение А).
8.1.6 Подготовка к работе картриджа для твердофазной экстракции (ТФЭ)
Картридж устанавливают в устройство для ТФЭ и промывают последовательно 3 см3 этилового спирта и 4 см3 дистиллированной воды, не допуская осушения его рабочей поверхности.
8.1.6.1 Экстракция кислот из пробы с применением картриджа
Из пробы, подготовленной по 8.1.1 - 8.1.5, отбирают аликвоту или супернатант объемом 5 см3 и пропускают через активированный картридж для ТФЭ при скорости фильтрования одна-две капли в секунду. Первую порцию фильтрата объемом 2 см3 отбрасывают. Последующую порцию фильтрата объемом около 3 см3 собирают и фильтруют в виалу для автосамплера через фильтр из регенерированной целлюлозы с диаметром пор 0,25 мкм. Подготовленная для измерения проба должна быть прозрачной.
8.2 Приготовление элюирующего раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) молярной концентрации 0,02 моль/дм3
Навеску однозамещенного фосфорнокислого калия массой 2,72 г, взятую с точностью 0,01 г, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, заполненную 850 — 900 см3 дистиллированной водой, хорошо перемешивают. Значение pH приготовленного элюирующего раствора должно находиться в диапазоне 2,0 — 2,1 ед. pH. Значение pH регулируют с помощью 50%-ного раствора ортофосфорной кислоты. Раствор доводят до метки дистиллированной водой при температуре (20 +/- 2) °C. Перед применением элюирующий раствор фильтруют через фильтр из регенерированной целлюлозы с диаметром 47 мм, диаметром пор 0,45 мкм.
8.3 Приготовление экстрагирующего 3%-ного раствора метафосфорной кислоты
3%-ный раствор метафосфорной кислоты применяют в качестве экстрагирующего раствора для проб, где необходимо определить содержание аскорбиновой и других органических кислот. Данный раствор готовят в день проведения анализа и применяют для предотвращения разложения аскорбиновой кислоты во время подготовки проб и проведения анализа.
Навеску метафосфорной кислоты массой 30,0 г, взятую с точностью до 0,1 г, переносят в стакан вместимостью 1000 см3 и добавляют 970 см3 дистиллированной воды, отмеренной цилиндром вместимостью 1000 см3 при температуре (20 +/- 2) °C. Раствор хорошо перемешивают до полного растворения кислоты.
8.4 Приготовление градуировочных растворов
8.4.1 Приготовление основного градуировочного раствора фумаровой и малеиновой кислот
Навески фумаровой и малеиновой кислот, взятые в соответствии с таблицей 2 с точностью до 0,001 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, добавляют 450 — 460 см3 элюирующего раствора, приготовленного по 8.2, хорошо перемешивают до полного растворения и доводят до метки элюирующим раствором, приготовленным по 8.2 при температуре (20 +/- 2) °C.
| Наименование кислот | Навеска, г | Вместимость колбы, см3 | Массовая концентрация кислот, мг/дм3 |
| Фумаровая | 0,125 | 500 | 250 |
| Малеиновая |
8.4.2 Приготовление основного градуировочного раствора аскорбиновой кислоты
Навеску аскорбиновой кислоты массой 0,125 г, взятую с точностью до 0,001 г взвешивают в мерной колбе вместимостью 100 см3. Добавляют 50 — 60 см3 3%-ного раствора метафосфорной кислоты, приготовленного по 8.3. Хорошо перемешивают до полного растворения и доводят до метки 3%-ным раствором метафосфорной кислоты, приготовленным по 8.3 при температуре (20 +/- 2) °C.
Примечание - Раствор аскорбиновой кислоты готовят в день проведения анализа.
8.4.3 Приготовление основного градуировочного раствора смеси кислот
Навески индивидуальных органических кислот (примерные массы навесок приведены в таблице 3) взвешивают с точностью до 0,001 г в мерной колбе вместимостью 250 см3, предварительно заполненной 40 — 50 см3 элюирующего раствора, приготовленного по 8.2. Добавляют 150 см3 элюирующего раствора, приготовленного по 8.2. Раствор хорошо перемешивают до полного растворения кислот. Затем в колбу добавляют 25 см3 основного градуировочного раствора фумаровой и малеиновой кислот, приготовленного по 8.4.1 и доводят до метки элюирующим раствором, приготовленным по 8.2 при температуре (20 +/- 2) °C.
Точную массовую концентрацию каждой кислоты в основном градуировочном растворе вычисляют с учетом массовой доли основного вещества по формуле
C_{A_{i}} = \frac{m_{i} \cdot P_{i}}{V_{A}} \cdot 10^{4}, (1)
где C_{A_{i}} — массовая концентрация i-ой кислоты в растворе, мг/дм3;
mi — масса навески i-ой кислоты, г;
Pi — массовая доля основного вещества i-ой кислоты, %;
VA — вместимость мерной колбы, см3;
104 — коэффициент пересчета из г/100 см3 на мг/дм3.
| Наименование кислот | Навеска, г | Вместимость колбы, см3 | Массовая концентрация кислот, мг/дм3 |
| Винная, яблочная | 0,250 | 250 | 1000 |
| Щавелевая | 0,312 | 1250 | |
| Молочная | 1,875 <*> | 7500 | |
| Уксусная, янтарная | 1,250 | 5000 | |
| Лимонная | 0,625 | 2500 | |
| Шикимовая | 0,125 | 500 | |
| Фумаровая, малеиновая | 25,0 см3 раствора по 8.4.1 | 25 | |
| <*> В пересчете на 100%-ное содержание. | |||
Основной градуировочный раствор смеси кислот (см. 8.4.3) и основной градуировочный раствор фумаровой и малеиновой кислот (см. 8.4.1) хранят при температуре от 3 °C до 8 °C в течение 3 мес.
8.4.4 Приготовление рабочих градуировочных растворов
Рабочие градуировочные растворы готовят путем разбавления основного градуировочного раствора смеси органических кислот по схеме, представленной в таблице 4.
| Наименование кислот | Концентрация в основном градуировочном растворе по 8.4.3, мг/дм3 | Массовая концентрация кислот в градуировочных растворах, мг/дм3 <*> | ||||||||||||
| № 1 | № 2 <**> | № 3 | № 4 | № 5 | № 6 | № 7 | ||||||||
| Элюирующий раствор по 8.2 | Объем раствора № 7, см3 | Вместимость колбы, см3 | Объем раствора по 8.4.3, см3 | Вместимость колбы, см3 | Объем раствора по 8.4.3, см3 | Вместимость колбы, см3 | Объем раствора по 8.4.3, см3 | Вместимость колбы, см3 | Объем раствора по 8.4.3, см3 | Вместимость колбы, см3 | Объем раствора по 8.4.3, см3 | Вместимость колбы, см3 | ||
| 5 | 100 | 1 | 100 | 2,5 | 100 | 2,5 | 50 | 4 | 50 | 5 | 50 | |||
| Винная, яблочная | 1000,0 | 0,0 | 5,0 | 10,0 | 25,0 | 50,0 | 80,0 | 100,0 | ||||||
| Щавелевая | 1250,0 | 0,0 | 6,2 | 12,0 | 31,25 | 62,5 | 100,0 | 125,0 | ||||||
| Молочная | 7500,0 | 0,0 | 37,5 | 75,0 | 187,5 | 375,0 | 600,0 | 750,0 | ||||||
| Уксусная, янтарная | 5000,00 | 0,0 | 25,0 | 50,0 | 125,0 | 250,0 | 400,0 | 500,0 | ||||||
| Лимонная | 2500,0 | 0,0 | 12,5 | 25,0 | 62,5 | 125,0 | 200,0 | 250,0 | ||||||
| Шикимовая | 500,0 | 0,0 | 25,0 | 5,00 | 12,50 | 25,00 | 40,0 | 50,0 | ||||||
| Фумаровая, малеиновая | 25,0 | 0,0 | 0,12 | 0,25 | 0,62 | 1,25 | 2,00 | 2,50 | ||||||
| Аскорбиновая | 1250,0 | 0,0 | 6,2 | 12,5 | 31,2 | 62,5 | 100,0 | 125,0 | ||||||
| <*> Точное значение массовой концентрации каждой кислоты в рабочих градуировочных растворах вычисляют с учетом содержания основного вещества в навеске кислоты, взятой для приготовления основного градуировочного раствора смеси кислот. <**> Раствор № 2 готовят из градуировочного раствора № 7. | ||||||||||||||
Для проведения градуировки используют свежеприготовленные растворы.
Для аскорбиновой кислоты готовят отдельные рабочие градуировочные растворы в день проведения измерений. Рабочие градуировочные растворы смеси кислот хранят при температуре от 3 °C до 8 °C в течение 10 сут и могут применяться для оперативного контроля стабильности градуировочной характеристики, проводимого по 9.1, 9.2.
8.5 Подготовка хроматографа к работе
Подготовку жидкостного хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией фирмы — производителя оборудования.
8.5.1 Условия хроматографического анализа
Колонка аналитическая, обращенно-фазовая: длина 250 мм, внутренний диаметр 4,6 мм, заполненная сорбентом, с размером частиц 5 мкм.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Элюент: KH2PO4 молярной концентрации 0,02 моль/дм3, pH раствора 2,0 — 2,1 ед. pH.
Режим элюирования: изократический.
Температура колонки: (25,0 +/- 0,1) °C.
Скорость подачи элюента: 0,4 см3/мин.
Детектор: спектрофотометрический или диодная матрица.
Длина волны поглощения: 220 нм.
Время стабилизации хроматографической системы перед следующим анализом — 20 мин для красных вин, винодельческой продукции.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Объем вводимой пробы: 20 — 50 мм3.
Ориентировочное время удерживания органических кислот приведено в таблице 5.
Ориентировочное время удерживания органических кислот
Примечание - Точное время выхода кислот определяют по градуировочным растворам.
Типичная хроматограмма смеси кислот приведена на рисунке Б.1 (приложение Б).
Допускается проведение анализа в других условиях хроматографирования, обеспечивающих разделение многокомпонентной смеси определяемых соединений. Величина степени разделения пиков Rs должна быть не менее 0,8.
(абзац введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
8.6 Проведение градуировки
Для определения рабочего диапазона массовых концентраций и линейности функции градуировки выполняют градуировку хроматографа по семи рабочим градуировочным растворам с массовыми концентрациями, представленными в таблице 4.
Градуировку для аскорбиновой кислоты проводят отдельно от всех кислот по градуировочным растворам, приготовленным в день проведения измерений. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее двух раз при условиях по 8.5.1.
Градуировочная зависимость должна иметь вид y = bx + a. Параметры градуировочной зависимости вычисляют путем анализа линейной регрессии скорректированных площадей пиков, учитывая нулевую точку (см. раствор № 1, таблица 4).
9 Порядок проведения измерений
9.1 Оперативный контроль стабильности градуировки
Перед началом измерений выполняют оперативный контроль стабильности градуировочного графика. Для этого анализируют любой рабочий градуировочный раствор, хроматографируя его два раза. Для аскорбиновой кислоты оперативный контроль стабильности градуировочного графика проводят отдельно от всех кислот по градуировочным растворам, приготовленным в день проведения анализа. Первое измерение выбранного градуировочного раствора проводят перед началом выполнения анализа серии проб.
Если абсолютное значение разности между измеренной массовой концентрацией каждой кислоты в выбранном градуировочном растворе и его фактической массовой концентрацией не превышает норматива стабильности градуировки
где Cфакт — фактическая концентрация i-ой кислоты в пробе, мг/дм3 (мг/кг);
Cизм — измеренная концентрация i-ой кислоты в пробе, мг/дм3 (мг/кг);
Kгр — норматив стабильности градуировочной зависимости, то градуировку считают достоверной и можно переходить к анализу серии проб по 9.3.
Если требование (2) не выполняется, то проводят повторную градуировку прибора.
Норматив стабильности градуировки Kгр, мг/дм3 (мг/кг), вычисляют по формуле
Kгр = 0,04Cфакт + 0,01Cмакс, (3)
где Cмакс — максимальная массовая концентрация i-ой кислоты в рабочем градуировочном растворе № 7, мг/дм3 (мг/кг) (см. таблицу 4).
После завершения анализа серии проб проводят повторный контроль стабильности градуировки путем измерения выбранного градуировочного раствора, сравнивая результат измерений с нормативом стабильности градуировки так, как это описано выше. В случае невыполнения условия (2) проводят повторное измерение выбранного градуировочного раствора. Если при этом полученное значение результата измерений повторно не удовлетворяет вышеприведенным требованиям, выявляют и устраняют причины несоответствия, а затем вновь проводят повторное измерение данной серии проб.
При проведении измерений серия состоит не более чем из 15 проб.
9.2 Проведение измерений
Проводят измерение пробы, подготовленной по 8.1.1 - 8.1.6 в соответствии с условиями 8.5.
Пробу хроматографируют 2 раза. Пики кислот в пробе должны быть правильно проинтегрированы, при необходимости результаты интегрирования площади пика корректируют вручную. Если измеренная массовая концентрация кислоты в анализируемом растворе превышает верхнюю границу диапазона градуировки, повторяют подготовку пробы по 8.1.1 с коэффициентом разбавления большим, чем 50.
9.3 Идентификация индивидуальных соединений
При отсутствии пика анализируемой кислоты с характеристическим временем удерживания, соответствующем времени, полученному на хроматограмме градуировочного раствора, делают вывод, что данная кислота в пробе отсутствует.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Если время удерживания определяемой кислоты на хроматограмме анализируемой пробы совпадает со временем удерживания анализируемой кислоты на хроматограмме градуировочного раствора, то считают, что данная кислота в пробе присутствует.
10 Обработка результатов измерений
10.1 Вычисление массовой концентрации анализируемой кислоты в пробе
Конечный результат измерений массовой концентрации выражают в следующих единицах измерения:
Массовую концентрацию i-ой кислоты Ci1 в параллельной пробе вычисляют по формуле
где Cxi — массовая концентрация i-ой кислоты в анализируемом растворе, вычисленная по градуировочному графику, мг/дм3 <*>;
K, K1 — коэффициенты разбавления, вычисляемые по формулам:
где Vp — объем разбавленного раствора пробы, см3 (50 см3);
Va — объем исходной пробы, см3 (1 см3 или 25 см3);
m — навеска пробы для анализа, г (1 г или 25 г).
Результаты измерений Cxi вычисляют в каждой параллельной пробе до второго десятичного знака.
Полученные значения массовой концентрации кислоты Cxi используют для расчетов при выполнении условия
где Ci град.мин — нижняя граница диапазона градуировки i-ой кислоты, значения которой представлены в таблице 6.
<*> Согласно алгоритму выполнения измерений величина Cxi характеризует параллельные пробы с учетом разбавления (в 2 и 50 раз) и Cxi может иметь четыре значения (C(2/1)i; C(2/2)i; C(50/1)i; C(50/2)i).
Нижняя граница диапазона градуировки
| Наименование кислот | Массовая концентрация Cград.мин, мг/дм3 |
|---|---|
| Молочная | 30 |
| Уксусная, янтарная | 25 |
| Винная, яблочная, щавелевая, аскорбиновая | 5 |
| Лимонная | 10 |
| Шикимовая | 1,25 |
| Фумаровая, малеиновая | 0,1 |
10.2 Вычисление результата измерений
Вычисление результата измерений выполняют отдельно для каждого разбавления. Вычисляют среднеарифметическое значение \overline{C_{i}} результатов измерений двух параллельных проб по формуле
\overline{C_{i}} = \frac{C_{i1} + C_{i2}}{2} , (9)
где C_{i1} + C_{i2} — среднеарифметические значения результатов единичных измерений массовой концентрации i-ой кислоты параллельных проб, мг/дм3 (мг/кг).
C_{i1} = \frac{C_{1i}^{I} + C_{2i}^{I}}{2} и C_{i2} = \frac{C_{2i}^{I} + C_{2i}^{II}}{2} , (10)
где C_{1i}^{I} + C_{2i}^{I} и C_{2i}^{I} + C_{2i}^{II} — значения результатов единичных измерений (двух вводов пробы) массовой концентрации i-ой кислоты параллельных проб, мг/дм3 (мг/кг).
Полученное согласно формуле (9) значение принимают за окончательный результат измерения массовой концентрации i-ой кислоты в пробе при выполнении условия повторяемости по 12.1.
Окончательный результат измерений при полученном значении массовой концентрации i-ой кислоты до 1000 мг/дм3 (мг/кг) выражают в единицах размерности миллиграмм на кубический дециметр (мг/дм3) или миллиграмм на килограмм (мг/кг) с округлением до целых чисел. При получении результата измерений более 1000 мг/дм3 (мг/кг) окончательный результат выражают в единицах размерности грамм на кубический дециметр (г/дм3) или грамм на килограмм (г/кг) с точностью до двух десятичных знаков.
Окончательный результат измерений массовой концентрации фумаровой, малеиновой и шикимовой кислот выражают в единицах размерности миллиграмм на кубический дециметр (мг/дм3) или миллиграмм на килограмм (мг/кг) с точностью до одного десятичного знака.
11 Оформление результатов измерений
Если величина массовой концентрации i-ой кислоты \overline{C_{i}} при разбавлении пробы в 2 раза оказывается меньше предела измерения (LOG), то дают одностороннюю оценку массовой концентрации органических кислот в пробе в виде
\overline{C_{i}} \leq (C_{LOG}),
где CLOG — предел измерения (см. таблицу 7).
| Наименование кислот | CLOG, мг/дм3 (мг/кг) |
|---|---|
| Молочная | 60 |
| Уксусная, янтарная | 50 |
| Винная, яблочная, щавелевая, аскорбиновая | 10 |
| Лимонная | 20 |
| Шикимовая | 2,5 |
| Фумаровая, малеиновая | 0,2 |
Результат измерений при доверительной вероятности P = 0,95 представляют в следующем виде
(формула в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
где \overline{\text{С}} — результат измерений, мг/дм3 (мг/кг), г/дм3, полученный в соответствии с настоящим стандартом и вычисленный по формуле (9);
\pm \Delta — абсолютное значение показателя точности, вычисленное в соответствии с настоящим стандартом, (мг/кг), г/дм3.
Абсолютное значение показателя точности \Delta (мг/кг), г/дм3, вычисляют, используя относительное значение показателя точности настоящего стандарта \delta , %, указанное в таблице 10, по формуле
\Delta = 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{\text{С}}, (11)
где 0,01 — коэффициент для пересчета процентов;
\overline{\text{С}} — среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений, (мг/кг), г/дм3.
12.1 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости
Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости проводят для каждой кислоты.
При каждом измерении получают два параллельных результата единичных измерений анализируемой пробы в условиях повторяемости. За результат принимают среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений, расхождение между которыми не превышает установленного предела повторяемости.
Проверку приемлемости проводят следующим образом.
Вычисляют расхождение между результатами единичных измерений |C1 - C2|, значение которого сравнивают со значением предела повторяемости rабс.
r_{\text{абс}} = 0,01 \cdot r_{\text{отн}} \cdot \overline{C}, (12)
где rотн — относительное значение предела повторяемости, %, указанное в таблице 8;
\overline{\text{С}} — среднеарифметическое значение результатов измерений двух параллельных проб, мг/дм3 (мг/кг).
Если для значения абсолютного расхождения между двумя результатами единичных измерений выполняется условие
то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднеарифметическое значение \overline{C_{i}} , вычисленное по формуле (9).
При невыполнении условия (13) проводят повторные измерения по 9.2.
При повторном невыполнении условия (13) готовят новые градуировочные растворы по 8.4, выполняют новую градуировку по 8.6 и проводят повторное измерение в соответствии с требованиями 9.2, 9.3 и раздела 10.
Относительные значения пределов повторяемости
12.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят следующим образом. Каждая из двух лабораторий проводит измерения в соответствии с разделом 10.2 и получает результат измерений, обеспечивая контроль повторяемости по формуле (13).
Вычисляют среднеарифметическое значение \overline{\text{С}} , мг/дм3 (мг/кг), двух результатов измерений \overline{\text{С}_{1}} и \overline{\text{С}_{2}} соответственно
\overline{C} = \frac{\overline{C_{1}} + \overline{C_{2}}}{2} . (14)
Вычисляют абсолютное расхождение между результатами измерений |\overline{C_{1}} - \overline{C_{2}}| , полученными в двух лабораториях, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости Rабс. Абсолютное значение предела повторяемости Rабс, мг/дм3 (мг/кг), вычисляют по формуле
R_{\text{абс}} = 0,01 \cdot R_{\text{отн}} \cdot \overline{C}, (15)
где 0,01 — коэффициент для пересчета процентов;
Rотн — относительное значение предела воспроизводимости, %, указанное в таблице 9;
\overline{C} — среднеарифметическое значение результатов измерений двух лабораторий, мг/дм3 (мг/кг).
Если для абсолютного расхождения между двумя средними значениями \overline{C_{1}} , \overline{C_{2}} , вычисленными (см. 10.2) на основании двух пар единичных результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости, соблюдается условие
|\overline{C_{1}} - \overline{C_{2}}| \leq R_{\text{абс}}, (16)
то оба результата \overline{C_{1}} , \overline{C_{2}} считают приемлемыми и общее среднее значение \overline{C} , вычисленное по формуле (14), может быть использовано в качестве результата измерений.
Относительные значения пределов воспроизводимости
13 Контроль правильности результатов измерений
Контроль правильности определения массовой концентрации органической кислоты проводят путем анализа проб для контроля (ОК) с заранее известным значением массовой концентрации органической кислоты (референсный стандартный образец, референсный материал, рабочая проба с добавкой).
Контроль процедуры измерений выполняют с периодичностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:
- при внедрении настоящего стандарта;
- при появлении факторов, влияющих на стабильность процесса по результатам анализа контрольных карт;
- при значимых изменениях в условиях измерений (другая партия реагентов, новые средства измерений, ремонт оборудования и т.д.);
- при любых выявленных несоответствиях в работе лаборатории, применительно к настоящему стандарту.
13.1 Требование к ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавкой
ОК представляют собой специально приготовленную пробу, в которой значение массовой концентрации органических кислот Cат вычислено по процедуре приготовления. ОК с добавкой хранят при температуре от 5 °C до 10 °C и выбирают таким образом, чтобы с течением времени при хранении в данных условиях он оставался стабильным по массовой концентрации органических кислот. Таким ОК является проба анализируемого материала с известной добавкой.
Для проведения контрольной процедуры рабочую пробу делят на две части. Одну часть оставляют без изменений, во вторую делают добавку одного или нескольких компонентов. Величину добавки выбирают в зависимости от массовой концентрации компонента в пробе без добавки, установленной по результатам предварительного анализа пробы, в размере от 50% до 150%. При этом содержание компонента в пробе с добавкой не должно превышать верхней границы диапазона измерений. Проводят анализ пробы без добавки и пробы с введенной добавкой в условиях повторяемости. В качестве результатов контрольных измерений в пробе (\overline{C_{n}}) и в пробе с добавкой (\overline{C_{n + d}}) используют среднеарифметические значения двух результатов единичных измерений, расхождения между которыми не превышают предела повторяемости [см. формулу (13)].
13.2 Проведение контрольной процедуры
Получают результаты измерений ОК в соответствии с требованиями раздела 10.
За результат контрольного измерения принимают результат измерения массовой концентрации кислоты \overline{C_{i}} в ОК, мг/дм3 (мг/кг), вычисленный по формуле (9) при выполнении условия повторяемости по формуле (13).
13.3 Вычисление результата контрольной процедуры Kk
Результат контрольной процедуры Kk, мг/дм3 (мг/кг), вычисляют по формуле
K_{k} = \overline{C_{i}} - C_{\text{ат}}, (17)
где \overline{C_{i}} — результат контрольного измерения массовой концентрации анализируемой органической кислоты в ОК, мг/дм3 (мг/кг);
Cат — установленное значение массовой концентрации определяемой органической кислоты в ОК, мг/дм3 (мг/кг).
При проведении контрольной процедуры с использованием метода добавок результат контрольной процедуры Kk вычисляют по формуле
K_{k} = \overline{C_{n + d}} - (\overline{C_{n}} + C_{d}), (18)
где \overline{C_{n + d}} — среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации анализируемой кислоты в пробе с добавкой, мг/дм3 (мг/кг);
\overline{C_{n}} — среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации анализируемой кислоты в пробе без добавки, мг/дм3 (мг/кг);
Cd — вычисленная величина добавки анализируемой кислоты, мг/дм3 (мг/кг).
13.4 Вычисление норматива контроля K
Норматив контроля K, мг/дм3 (мг/кг), вычисляют по формуле
K = \sqrt{(\Delta_{C_{n + d}})^{2} + (\Delta_{C_{n}})^{2}} , (19)
где \pm \Delta_{C_{n}} — характеристика погрешности результатов контрольного измерения, мг/дм3 (мг/кг), соответствующая содержанию компонента в пробе без добавки;
\pm \Delta_{C_{n + d}} — характеристика погрешности результатов контрольного измерения, мг/дм3 (мг/кг), соответствующая содержанию компонента в пробе с добавкой, вычисленная по формуле
\pm \Delta_{C_{n + d}} = 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{C_{n + d}}, (20)
где 0,01 — коэффициент для пересчета процентов;
\pm \delta — относительное значение характеристики погрешности результатов измерений, %, указанное в таблице 10;
\overline{C_{n + d}} — среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений — массовой концентрации компонента в пробе с добавкой, мг/дм3 (мг/кг).
Характеристику погрешности результатов контрольного измерения \pm \Delta_{C_{n}} , мг/дм3 (мг/кг), соответствующую содержанию компонента в пробе без добавки, вычисляют по формуле
\Delta_{C_{n}} = 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{C_{n}}, (21)
где 0,01 — коэффициент для пересчета процентов;
\pm \delta — относительное значение характеристики погрешности результатов измерений, %, указанное в таблице 10;
\overline{C_{n}} — среднеарифметическое значение двух результатов единичных измерений массовой концентрации анализируемого компонента в пробе без добавки, мг/дм3 (мг/кг).
Относительные значения характеристики погрешности результатов измерений
Если установлено лабораторное смещение, то норматив контроля K, мг/дм3 (мг/кг), вычисляют по формуле
K = \frac{\Delta_{m}}{2} , (22)
где \Delta_{m} — установленное лабораторное смещение, мг/дм3 (мг/кг).
13.5 Реализация решающего правила контроля
Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:
При невыполнении данного условия контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (23) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
Схема подготовки проб для анализа органических кислот
ПМ — соки, нектары и сокосодержащие напитки с мякотью, ПН — соки, нектары и сокосодержащие напитки неосветленные, ПО — соки, нектары и сокосодержащие напитки осветленные, ПВН — винодельческая продукция, безалкогольные и слабоалкогольные напитки, ПП — пюреобразные продукты (продукты переработки фруктов, ягод и овощей, находящиеся или переведенные в пюреобразное состояние), ТФЭ — твердофазная экстракция, ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, УЗБ — ультразвуковая баня
Схема подготовки проб для анализа органических кислот, включая аскорбиновую кислоту
ПМ — соки, нектары и сокосодержащие напитки с мякотью, ПН — соки, нектары и сокосодержащие напитки неосветленные, ПО — соки, нектары и сокосодержащие напитки осветленные, ПВН — винодельческая продукция, безалкогольные и слабоалкогольные напитки, ПП — пюреобразные продукты (продукты переработки фруктов, ягод и овощей, находящиеся или переведенные в пюреобразное состояние), ТФЭ — твердофазная экстракция, ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, УЗБ — ультразвуковая баня
(приложение Б в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 19.11.2025 № 1416-ст)
Рисунок Б.1 — Хроматограмма градуировочного раствора смеси органических кислот