ГОСТ 33277-2015. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение массовой концентрации каротиноидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 27.07.2015 № 994-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» (ТР ТС 023/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 28.01.2020 № 19). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Документ введен в действие с 01.01.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июля 2015 г. № 994-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАРОТИНОИДОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Juice products. Determination of carotenoids by high performance liquid chromatography
67.080
Дата введения 1 января 2017 года
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
1 РАЗРАБОТАН Некоммерческой организацией «Российский союз производителей соков» (РСПС) при участии Закрытого акционерного общества «Мултон» (ЗАО «Мултон»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 18 июня 2015 г. № 47)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июля 2015 г. № 994-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33277-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары, сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы (далее — соковая продукция), в том числе обогащенные и предназначенные для детского питания, и устанавливает метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения (измерения) массовой концентрации \beta - \text{каротина} , лютеина и ликопина (далее — каротиноидов).
Диапазоны измерений массовой концентрации \beta - \text{каротина} — от 1 до 250 мг/дм3, лютеина и ликопина — от 1 до 200 мг/дм3.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 <1> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<1> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 <2> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний
<2> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
ГОСТ ISO 5725-2-2003 <3> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
<3> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
ГОСТ ISO 5725-6-2003 <1> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<1> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы. Основные параметры и размеры.
ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб.
ГОСТ 26671-2014 Продукты переработки фруктов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов
ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
Метод основан на количественном измерении каротиноидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по обращенно-фазовому механизму. Разделение каротиноидов осуществляется на твердом носителе C8 в изократическом режиме с использованием в качестве подвижной фазы смеси тетрагидрофурана и воды в объемном соотношении 70:30.
Детектирование разделенных каротиноидов \beta - \text{каротина} , лютеина и ликопина осуществляется с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 450 нм или диодноматричного детектора в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм.
Идентификацию и количественный расчет пиков разделенных каротиноидов проводят при максимуме поглощения, указанном в таблице 1, что повышает избирательность хроматографического измерения. При необходимости, для повышения точности хроматографического измерения, идентификация \beta - \text{каротина} , лютеина и ликопина в соковой продукции может проводиться в сравнении времени удерживания и спектра поглощения стандартного раствора.
Параметры идентификации каротиноидов
| Наименование каротиноида | Ориентировочное время удерживания, мин | Максимум светопоглощения, нм |
|---|---|---|
| \beta - \text{каротина} | 13,8 +/- 0,2 | |
| Лютеин | 4,6 +/- 0,1 | 450 +/- 5 |
| Ликопин | 13,0 +/- 0,1 |
4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
Хроматограф жидкостный, с насосом высокого давления, спектрофотометрическим детектором, позволяющим проводить измерения оптической плотности с программируемой длиной волны от 190 до 600 нм или диодноматричным детектором, позволяющим проводить измерения оптической плотности на нескольких длинах волн от 190 до 800 нм, инжектором для ручного или автоматического ввода проб и программным обеспечением для сбора и обработки хроматографических данных.
Колонка хроматографическая <1> длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, сорбент — силикагель с привитыми группами C8.
<1> Колонка типа Hypersil GOLD C8 Thermo. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования хроматографических колонок других фирм, обеспечивающих аналогичный порядок выхода компонентов и требуемую степень разделения.
Колонка защитная (предколонка) для колонки C8 (10,0 x 4,0 мм).
Весы неавтоматического действия по ГОСТ R OIML 76-1 специального класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,0005 г.
Фильтры с диаметром пор 0,20 мкм и 0,45 мкм. <2>
<2> Фильтры марки SUPOR (PES) фирмы Waters. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования фильтров других марок и фирм, имеющих аналогичные свойства.
Емкости для жидких проб (виалы) с завинчивающимися крышками вместимостью 2 см3.
Вставки для микрообъемов вместимостью 250 мм3.
Микрошприцы вместимостью 250 мм3 с ценой деления 10 мм3 и погрешностью измерения +/- 2%.
Шприц медицинский номинальной вместимостью 5 см3 по ГОСТ ISO 7886-1.
Фильтры мембранные диаметром 47 мм с насадкой для шприца.
Микродозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 20 до 1000 мм3 с относительной погрешностью дозирования +/- 1% с соответствующими наконечниками по ГОСТ 28311.
pH-метр с погрешностью измерения +/- 0,05 ед. pH, в диапазоне измерений от 4 до 9 ед. pH.
Центрифуга настольная с относительным центробежным ускорением ротора не менее 1000 g, снабженная адаптерами для пробирок полимерных конических вместимостью 15 см3.
Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3.
Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм3.
Пипетки градуированные лабораторные стеклянные 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5, 1-1-2-10, 1-1-2-25 по ГОСТ 29227.
Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.
Цилиндр 2-1000-1 по ГОСТ 1770.
Стаканы лабораторные В-1-50, В-1-100, и В-1-1000 по ГОСТ 25336.
Воронки лабораторные В-56-80 ХС, В-75-80 ХС, В-75-110 ХС, В-100-150 ХС по ГОСТ 25336.
Пробирки центрифужные градуированные, конические, полимерные с завинчивающейся крышкой, вместимостью 15 см3.
Вещества стандартные каротиноидов (натурального или синтетического происхождения):
\beta - \text{каротина} (C40H56), с массовой долей основного вещества не менее 95%;
Лютеин (C40H56O2), с массовой долей основного вещества не менее 95%;
Ликопин (C40H56), с массовой долей основного вещества не менее 90%.
Тетрагидрофуран (ТГФ) для хроматографии, с массовой долей основного вещества не менее 99,9% и показателем преломления nD в пределах от 1,3439 до 1,3443.
Эфир этиловый уксусной кислоты (этилацетат) для хроматографии, с массовой долей основного вещества не менее 99,8% и коэффициентом пропускания при длине волны 280 нм.
Вода по ГОСТ ISO 3696, 2-й степени чистоты или по ГОСТ 6709.
Азот газообразный по ГОСТ 9293, о.ч.
Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками, не уступающих вышеуказанным, а также реактивов, материалов и посуды с характеристиками, не хуже вышеуказанных.
5.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 26313, подготовку лабораторных проб — по ГОСТ 26671.
5.2 Подготовка проб для измерений
5.2.1 Подготовка проб соков продукции без мякоти
В мерную колбу вместимостью V2 = 50 см3 помещают V1 = 25 см3 пробы, доводят до метки тетрагидрофураном и тщательно перемешивают. Далее проводят экстракцию этилацетатом. Для этого в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3 отбирают 10 см3 приготовленного раствора, добавляют 5 см3 этилацетата, завинчивают крышкой, встряхивают в течение 1 мин и центрифугируют при 9000 об/мин (фактор разделения не менее 990 g) в течение 10 мин. Затем через иглу отбирают в медицинский шприц, окрашенный верхний слой. Экстракцию с последующим центрифугированием повторяют еще два раза, приливая каждый раз по 5 см3 этилацетата. Экстракты объединяют в мерной колбе вместимостью 25 см3 и доводят до метки этилацетатом. Отбирают 5 см3 полученного раствора в стакан вместимостью 50 см3, отдувают растворитель досуха в токе азота (без нагревания). Для этого в стакан с 5 см3 полученного раствора помещают отводящую трубку от редуктора баллона с азотом по ГОСТ 9293 с наконечником по ГОСТ 28311 и отдувают растворитель.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 тетрагидрофурана, переносят в виалу и проводят хроматографическое измерение (см. 8.4).
5.2.2 Подготовка проб соковой продукции с мякотью
В мерную колбу вместимостью V2 = 50 см3 помещают V1 = 25 см3 пробы, доводят до метки тетрагидрофураном и тщательно перемешивают. Далее проводят экстракцию этилацетатом. Для этого в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3 отбирают 10 см3 приготовленного раствора, добавляют 5 см3 этилацетата, завинчивают крышкой, встряхивают в течение 1 мин и центрифугируют при 9000 об/мин (фактор разделения не менее 990 g) в течение 10 мин. Затем через иглу отбирают в медицинский шприц, окрашенный верхний слой, не затрагивая мякоть на границе разделения слоев. Далее повторяют все операции согласно 5.2.1.
5.2.3 Подготовка проб концентрированной соковой продукции
Концентрированные соки и пюре различных фруктов, ягод и овощей разбавляют водой в пять раз весовым методом. Далее проводят все операции, описанные в 5.2.2.
5.2.4 Подготовка проб соковой продукции с высоким содержанием каротиноидов
В случае визуального обнаружения нерастворившихся каротиноидов (маслообразные капли оранжевого цвета на поверхности раствора) при разбавлении пробы тетрагидрофураном, начальную пробу разбавляют следующим образом:
- пробу соковой продукции разбавляют водой в два раза;
- пробу концентрированной соковой продукции разбавляют водой в десять раз весовым методом.
После этого операции, описанные в 5.2.1 - 5.2.3, повторяют. Данные разбавления учитывают при вычислении конечного результата.
5.3 Срок хранения подготовленных проб в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C — не более 2 ч.
6 Условия проведения измерений
При подготовке к проведению измерений и проведении измерений соблюдают следующие условия: - температура окружающего воздуха ...................... (20 +/- 5) °C; - атмосферное давление ............................... (97 +/- 10) кПа; - относительная влажность ............................... не более 80%; - напряжение в питающей сети .......................... (220 +/- 20) В; - частота тока в питающей сети ......................... (50 +/- 1) Гц.
При проведении измерения принимают во внимание, что каротиноиды чувствительны к световому и тепловому воздействиям. Измерения проводят в месте, защищенном от действия прямого солнечного или ультрафиолетового излучения.
7 Подготовка к проведению измерений
7.1 Подготовка хроматографа к работе
Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации.
7.2 Приготовление подвижной фазы для жидкостной хроматографии
В мерный цилиндр вместимостью 1000 см3 приливают 300 см3 воды и 700 см3 тетрагидрофурана, перемешивают. Полученный раствор дегазируют под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Допускается приготовление меньшего объема подвижной фазы, исходя из потребности в ней.
Раствор хранят в стеклянной бутылке с плотно закрытой крышкой в течение двух рабочих дней.
Перед использованием подвижную фазу дегазируют в круглодонной колбе под вакуумом на ультразвуковой бане или другим способом.
7.3 Приготовление градуировочных растворов
7.3.1 Приготовление основного градуировочного раствора A каротиноидов с массовой концентрацией \beta - \text{каротина} , лютеина и ликопина по 50,4 мг/дм3
Взвешивают по (0,0053 +/- 0,0002) г \beta - \text{каротина} , лютеина и (0,0056 +/- 0,0002) г ликопина в стакане вместимостью 100 см3, растворяют в 30 см3 ТГФ (см. раздел 4), затем переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем раствора до метки ТГФ и перемешивают.
7.3.2 Приготовление рабочих градуировочных растворов
Из основного раствора готовят не менее пяти рабочих градуировочных растворов каротиноидов путем точного разбавления (разведения) в соответствии с таблицей 2. Аликвоты основного раствора дозируют с использованием пипеток 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-1-2-10, 1-1-2-25 по ГОСТ 29227.
Приготовление градуировочных растворов
| № градуировочного раствора (i = 1...5) | Компоненты | Объем мерной колбы, см3 | Способ приготовления | Массовая концентрация в полученном растворе Cгр,i, мг/дм3 |
| 1 | \beta - \text{каротин} | 50 | В мерную колбу приливают 20,0 см3 раствора A, приготовленного по 7.3.1, доводят до метки тетрагидрофураном и перемешивают | 20,2 |
| Лютеин | 20,2 | |||
| Ликопин | 20,2 | |||
| 2 | \beta - \text{каротин} | 50 | В мерную колбу приливают 10,0 см3 раствора A, приготовленного по 7.3.1, доводят до метки тетрагидрофураном и перемешивают | 10,1 |
| Лютеин | 10,1 | |||
| Ликопин | 10,1 | |||
| 3 | \beta - \text{каротин} | 50 | В мерную колбу приливают 5,0 см3 раствора A, приготовленного по 7.3.1, доводят до метки тетрагидрофураном и перемешивают | 5,0 |
| Лютеин | 5,0 | |||
| Ликопин | 5,0 | |||
| 4 | \beta - \text{каротин} | 50 | В мерную колбу приливают 2,5 см3 раствора A, приготовленного по 7.3.1, доводят до метки тетрагидрофураном и перемешивают | 2,5 |
| Лютеин | 2,5 | |||
| Ликопин | 2,5 | |||
| 5 | \beta - \text{каротин} | 50 | В мерную колбу приливают 1,0 см3 раствора A, приготовленного по 7.3.1, доводят до метки тетрагидрофураном и перемешивают | 1,0 |
| Лютеин | 1,0 | |||
| Ликопин | 1,0 |
Приготовленные рабочие растворы рекомендуется профильтровать через мембранный фильтр.
Градуировочные растворы готовят непосредственно перед градуировкой хроматографа.
8.1 Условия хроматографических измерений
Измерения проводят при следующих условиях:
- температура термостата колонки: (20 +/- 5) °C (при отсутствии термостата допускается проведение измерений при температуре окружающего воздуха, приведенной в разделе 6);
- рабочая длина волны светопоглощения: 450 нм (для спектрофотометра) или диапазон волн светопоглощения 190 — 600 нм (для фотодиодной матрицы);
- объем вводимой пробы: 5 — 20 мм3;
- режим элюирования: изократический;
- скорость потока: 1,0 см3/мин.
Проверку эффективности хроматографического разделения каротиноидов в данных условиях осуществляют путем измерения раствора с массовой концентрацией каротиноидов 5 мг/дм3 (см. таблицу 2, раствор № 3). В случае ручного ввода пробы петлю инжектора полностью заполняют подготовленным раствором № 3. Эффективность хроматографического разделения признают удовлетворительной, если коэффициент разделения пиков лютеина и бета-каротина составляет не менее 1,3, а число эффективных теоретических тарелок, вычисленное по пику бета-каротина составляет не менее 4000. Если данное условие не соблюдается, то для достижения требуемой эффективности проводят замену хроматографической колонки на аналогичную новую. Контроль эффективности хроматографического разделения проводят не реже одного раза в две недели.
В зависимости от типа применяемого хроматографа и хроматографической колонки допускается изменение условий измерений, обеспечивающих требуемое разделение компонентов пробы в порядке, указанном в настоящем разделе.
8.2 Градуировка хроматографа
Для установления градуировочной характеристики в инжектор хроматографа дозируют рабочие градуировочные растворы, приготовленные в соответствии с таблицей 2, и регистрируют их хроматограммы в условиях, приведенных в 8.1.
Для каждого градуировочного раствора выполняют два параллельных измерения в условиях повторяемости. Компоненты идентифицируют по абсолютным значениям времени удерживания.
Вычисляют с помощью компьютерной программы обработки данных или вручную методом наименьших квадратов градуировочные коэффициенты и устанавливают градуировочную характеристику для площади пика каждого каротиноида в градуировочном растворе
\overline{S_{i}} = kC_{i} + b , (1)
где \overline{S_{i}} — площадь пика каротиноида (среднеарифметическое значение из результатов двух измерений) при измерении i-го градуировочного раствора, AU·с;
Ci — массовая концентрация каротиноида в i-ом градуировочном растворе, мг/дм3;
b, k — градуировочные коэффициенты в уравнении прямой, вычисленные методом наименьших квадратов.
Градуировочную характеристику, вычисленную методом наименьших квадратов, считают приемлемой, если значение квадрата коэффициента корреляции R2 для каждого каротиноида составляет не менее 0,990.
Градуировочную характеристику строят заново в случае замены оборудования, колонок, партий реактивов или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов контроля стабильности, но не реже одного раза в месяц.
8.3 Контроль стабильности градуировочной характеристики
Проверку градуировочной зависимости проводят перед каждой новой серией измерений. Допускается проводить контроль только по одному из каротиноидов, чередуя их.
Измеряют два градуировочных раствора, приготовленных по 7.3.2, с массовой концентрацией каротиноидов близкой к началу и концу диапазона измерений в тех же условиях, в которых была установлена градуировочная характеристика.
Регистрируют хроматограммы каждого градуировочного раствора в тех же условиях, в которых была установлена градуировочная характеристика.
Измеренное таким образом значение массовой концентрации каротиноидов сравнивают с реальным содержанием каротиноидов в градуировочных растворах по условию (2).
Градуировочную характеристику считают стабильной в случае, если для каждого градуировочного раствора выполняется условие
\frac{|C_{\text{изм},i} - C_{\text{гр},i}|}{C_{\text{гр},i}} \cdot 100 \leq K_{\text{гр},i} , (2)
где Cизм,i — массовая концентрация каротиноида в i-том градуировочном растворе, измеренная по градуировочной характеристики, мг/дм3;
Cгр,i — массовая концентрация каротиноида в i-том градуировочном растворе, мг/дм3;
Kгр,i — норматив контроля, K_{\text{гр},i} = 0,5 \cdot \delta_{i\text{отн}} ,
где \delta_{i\text{отн}} — границы относительной погрешности для \beta - \text{каротина} , лютеина или ликопина (см. таблицу 3), %;
i — номер градуировочного раствора (см. таблицу 2).
Если условие стабильности (2) не выполняется только для одного градуировочного раствора, то выполняют повторное измерение этого раствора с целью исключения результата, содержащего ошибку.
Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других растворов для градуировки (см. 7.3.2). При повторном не выполнении условия (2) градуировку строят заново во всем диапазоне измерений.
8.4 Измерение проб
В инжектор хроматографа вводят подготовленную по 5.5.1 - 5.5.3 пробу и проводят измерения в условиях, указанных в 8.1.
Регистрируют на хроматограммах пики, соответствующие временам удерживания каротиноидов, найденных при измерении градуировочных растворов по 8.2.
Относительное расхождение времени удерживания идентифицированных каротиноидов в пробе не должно отличаться от времени удерживания каротиноидов в градуировочном растворе более чем на 5%. Если данное условие не соблюдается, то измерения повторяют.
Примеры хроматограмм и условия измерения конкретных каротиноидов приведены в приложении А.
Значения площади пика каротиноида на хроматограммах используют для вычисления массовой концентрации по разделу 8.5 при условии, что они не выходят за верхнюю границу диапазона градуировки хроматографа. Если данное условие не соблюдается, то уменьшают вводимый объем пробы в два раза и проводят ее повторное измерение.
При вычислении площадь пика в этом случае умножают в два раза.
8.5 Обработка и оформление результатов измерений
8.5.1 В соответствии с данными, полученными при измерении градуировочных растворов, оформляют таблицу пиков с использованием программного обеспечения хроматографа. Обработку хроматограмм проводят методом абсолютной градуировки.
8.5.2 Массовую концентрации \beta - \text{каротина} , лютеина или ликопина Ci, мг/дм3, в соковой продукции вычисляют по формуле
C_{i} = \frac{(S_{i} - b)}{k_{i}} \cdot \frac{V_{2}}{V_{1}} , (3)
где Si — площадь пика \beta - \text{каротина} , лютеина или ликопина в пробе соковой продукции, AU·с; AU — «absorbance units», единицы абсорбции;
b — коэффициент в уравнении градуировочной зависимости, AU·с;
ki — градуировочный коэффициент для \beta - \text{каротина} , лютеина или ликопина, AU·с·(мг/дм3)-1;
V2 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления (см. 5.2.1, 5.2.2), см3;
V1 — объем пробы соковой продукции, взятой для измерения (см. 5.2.1, 5.2.2), см3.
Все вычисления проводят до первого десятичного знака.
8.5.3 За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, если относительное расхождение между ними при соблюдении условий согласно ГОСТ ИСО 5725-6 (подпункт 5.2.2.1) не превышает предела повторяемости (сходимости) rотн, указанного в таблице 3 при доверительной вероятности P = 0,95
\frac{2 \cdot |C_{i1} - C_{i2}| \cdot 100}{(C_{i1} + C_{i2})} \leq r_{\text{отн}} , (4)
где Ci1, Ci2 — результаты параллельных измерений массовой концентрации каротиноидов, мг/дм3;
rотн — значение предела повторяемости, % (см. таблицу 3).
8.5.4 В случае превышения предела повторяемости rотн выполняют условия ГОСТ ИСО 5725-6 (подпункт 5.2.2.1).
8.5.5 Результаты измерений в документах, предусматривающих их использование, представляют согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием метода и настоящего стандарта в виде
\overline{C} \pm 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{C},\text{при }P = 0,95 ,
где \overline{C} — среднеарифметическое значение результатов n измерений каротиноидов, признанных приемлемыми по 8.5.3, 8.5.4, мг/дм3;
\delta — границы относительной погрешности измерений каротиноидов (см. таблицу 3), %.
Если массовая концентрация каротиноидов выходит за пределы границы диапазона измерений, проводят следующую запись в журнале: «массовая концентрация \beta - \text{каротина} , лютеина или ликопина менее 1 мг/дм3».
Числовое значение результата измерения должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение границ абсолютной погрешности. Значение границ абсолютной погрешности приводят с одной значащей цифрой после запятой.
9 Метрологические характеристики
При соблюдении всех условий и проведении измерений в точном соответствии с настоящим стандартом значение погрешности измерений (и ее составляющих) не превышает значений, представленных в таблице 3.
Основные метрологические характеристики метода
10 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
10.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:
- при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;
- проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях.
10.2 Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.
Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD0,95 по формуле
\frac{2 \cdot |C_{\text{ср}1} - C_{\text{ср}2}| \cdot 100}{(C_{\text{ср}1} + C_{\text{ср}2})} \leq CD_{0,95} , (5)
где Cср1, Cср2 — средние значения массовой концентрации каротиноидов, полученные в первой и второй лабораториях, мг/дм3;
CD0,95 — значение критической разности, вычисляемое по формуле
CD_{0,95} = 2,77 \cdot 0,01 \cdot \overline{C_{1,2}} \sqrt{\sigma_{R,\text{отн}}^{2} - \sigma_{r,\text{отн}}^{2}(1 - \frac{1}{2n_{1}} - \frac{1}{2n_{2}})} , (6)
где 2,77 — коэффициент Q (0,95; 2) критического диапазона для двух измерений, полученных в условиях воспроизводимости по ГОСТ ИСО 5725-6;
0,01 — множитель для перехода от процентов к абсолютным значениям;
\overline{C_{1,2}} — среднеарифметическое значение результатов измерений; полученных в первой и второй лабораториях, мг/дм3;
\sigma_{R,\text{отн}} — показатель воспроизводимости, % (см. таблицу 3);
\sigma_{r,\text{отн}} — показатель повторяемости, % (см. таблицу 3);
Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).
При разногласиях руководствуются ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).
11 Контроль результатов измерений при реализации метода
Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории при реализации метода выполняют по ГОСТ ИСО 5725-6, используя методы контроля стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) и показателя правильности по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 6.2.4). Проверку стабильности проводят с применением контрольных карт Шухарта.
Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.
При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
12.1 Условия безопасного проведения работ
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности — по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018.
Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005.
Остатки проб соковой продукции утилизируют в порядке, установленном в руководстве по качеству в лаборатории.
12.2 Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются инженеры-химики, лаборанты, имеющие высшее или средне-специальное образование, опыт работы с данным оборудованием и знакомые с настоящим методом.
Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.
ПРИМЕРЫ ТИПОВЫХ ХРОМАТОГРАММ КАРОТИНОИДОВ В СОКОВОЙ ПРОДУКЦИИ
А.1 Примеры типовых хроматограмм каротиноидов в соковой продукции приведены на рисунках А.1 - А.3.
Рисунок А.1 — Хроматограмма образца мультифруктового сока с концентрацией каротиноидов (лютеина, ликопина, бета-каротина) — 4 мг/дм3
Рисунок А.2 — Хроматограмма образца томатного сока с концентрацией ликопина — 6 мг/дм3
Рисунок А.3 — Хроматограмма образца обогащенного мультифруктового нектара с концентрацией лютеина — 1 мг/дм3, ликопина — 3 мг/дм3 и бета-каротина — 2,5 мг/дм3