ГОСТ 33163-2026. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение спорообразующих термоацидофильных бактерий Alicyclobacillus spp., вызывающих порчу

(введен в действие Приказом Росстандарта от 15.07.2026 № 798-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ 33163-2014"]:::doc
  n1["ГОСТ 33163-2026"]:::notEnt
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-33163-2026" "ГОСТ 33163-2026. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение спорообразующих термоацидофильных бактерий Alicyclobacillus spp., вызывающих порчу (введен в действие П"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 июля 2026 г. № 798-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ALICYCLOBACILLUS SPP., ВЫЗЫВАЮЩИХ ПОРЧУ

Juice products. Determination of spore-forming thermoacidophilic bacteria causing spoilage of bacteria Alicyclobacillus spp.

ГОСТ 33163-2026

МКС 67.050

67.080

Дата введения 1 января 2027 года

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом технологии консервирования — филиалом Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН (ВНИИТеК — филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН), при участии Союза производителей соков, воды и напитков (СОЮЗНАПИТКИ)

2 ВНЕСЕН Межгосударственным техническим комитетом МТК 093 «Продукты переработки фруктов, овощей и грибов. Пищевые концентраты»

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2026 г. № 198-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 июля 2026 г. № 798-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33163-2026 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2027 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 33163-2014

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары, сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы (далее — соковая продукция), в том числе предназначенные для детского питания.

В настоящем стандарте, в зависимости от вида продукции и цели, установлены следующие методы обнаружения (выявления) и количественного подсчета спорообразующих термоацидофильных бактерий (Alicyclobacillus spp.):

• подсчет путем глубинного посева в чашки Петри, используемый для количественного определения в основном для нефильтруемых проб продуктов;
• подсчет путем фильтрации с использованием мембранных фильтров, используемый для количественного определения фильтруемых проб продуктов;
• выявление путем предварительного обогащения, используемое для качественного обнаружения (выявления) в определенной массе (определенном объеме) пробы продукта.

Допускается применение настоящего стандарта для испытаний безалкогольных напитков, сиропов из сахара(ов) и холодных чаев, содержащих продукты переработки фруктов и (или) овощей, в том числе воды, смывов в производстве соковой продукции, без дополнительной валидации.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2493 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3652 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4198 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4233 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709 <1> Вода дистиллированная. Технические условия

<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 58144-2018 «Вода дистиллированная. Технические условия».

ГОСТ 9284 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 10929 Реактивы. Водорода пероксид. Технические условия

ГОСТ 18300 <1> Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 55878-2013 «Спирт этиловый технический гидролизный ректификованный. Технические условия».

ГОСТ 26668 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29227 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 25336 (ИСО 835-1-81) Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 30425 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ 31904 Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ ISO 5725-2 <2> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».

ГОСТ ISO 6887-1 Микробиология пищевой продукции и кормов. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятикратных разведений

ГОСТ ISO 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ ISO 11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред

ГОСТ ISO/IEC 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 спорообразующие термоацидофильные бактерии Alicyclobacillus spp.: Микроорганизмы, образующие типичные или менее типичные колонии на твердых селективных средах и обладающие морфологическими, физиологическими и биохимическими характеристиками.

3.2 спорообразующие термоацидофильные бактерии Alicyclobacillus spp., образующие гваякол: Микроорганизмы, образующие гваякол.

3.3 обнаружение спорообразующих термоацидофильных бактерий Alicyclobacillus spp.: Определение спорообразующих термоацидофильных бактерий в определенной массе или объеме продукта, сырья, материала окружающей среды или на поверхности.

3.4 подсчет спорообразующих термоацидофильных бактерий Alicyclobacillus spp.: Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) спорообразующих термоацидофильных бактерий в одном или в десяти граммах или в одном или десяти миллилитрах, или в одном квадратном сантиметре, или в устройстве для отбора проб.

3.5 обнаружение спорообразующих термоацидофильных бактерий, продуцирующих гваякол: Определение спорообразующих термоацидофильных бактерий, образующих гваякол, в определенной массе или объеме продукта, сырья, материала окружающей среды или на поверхности.

3.6 подсчет спорообразующих термоацидофильных бактерий, продуцирующих гваякол: Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) спорообразующих термоацидофильных бактерий, образующих гваякол, в одном или в десяти граммах или в одном или десяти миллилитрах, или в одном квадратном сантиметре, или в устройстве для отбора проб.

3.7 гваякол (2-метоксифенол): Продукт жизнедеятельности бактерий рода Alicyclobacillus spp., характеризующийся появлением постороннего запаха, характеризуемого как лекарственный, дымный или фенольный.

4 Общие положения

4.1 Бактерии Alicyclobacillus spp. образуют споры, которые хорошо выживают в соковой продукции даже при низких значениях pH и после термообработки.

4.2 Каждую пробу соковой продукции подвергают термической обработке для стимуляции прорастания спор.

4.3 При проведении отбора проб соковой продукции для исследования ее на наличие бактерий Alicyclobacillus spp. используют посуду и инструменты, стерилизованные в суховоздушном шкафу или путем автоклавирования, или используют стерильную одноразовую посуду и инструменты.

Примечание - При проведении отбора проб соковой продукции для исследования ее на наличие бактерий рода Alicyclobacillus spp. не рекомендуется погружение в спирт и фламбирование им посуды для отбора проб, контуров, шпателей или контейнеров, так как это не гарантирует уничтожения спор этих бактерий.

5 Питательные среды и реактивы

5.1 Общие требования к качеству реактивов — в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт. Проверка пригодности и обеспечение качества готовых питательных сред — по ГОСТ ISO 11133.

5.2 Селективная питательная среда BAT-бульон и BAT-агар.

Примечание — Состав питательных сред, их приготовление и проверка эффективности для обеспечения качества приведены в приложении А.

5.3 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор массовой концентрацией 100 г/дм3.

5.4 Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор массовой концентрацией 36,5 г/дм3; готовят по ГОСТ 10444.1.

5.5 Раствор физиологический; готовят по ГОСТ 10444.1.

5.6 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

5.7 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.

5.8 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

5.9 Растворы и реактивы для окраски по Граму по ГОСТ 10444.1 или готовые наборы.

5.10 Допускается применение других питательных сред, предназначенных для целей настоящего стандарта, и реактивов, по качеству не хуже вышеуказанных, в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Используют обычное микробиологическое лабораторное оборудование по ГОСТ ISO 7218, и в частности следующее.

Одноразовая посуда является приемлемой альтернативой многоразовой стеклянной посуде, если отвечает соответствующим требованиям.

6.1 Аппарат для суховоздушной стерилизации (сушильный шкаф) или стерилизатор паровой (автоклав), с регулирующими устройствами для поддержания заданной температуры.

6.2 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с наибольшим пределом взвешивания 200 г для взвешивания проб, 500 г для взвешивания реактивов и питательных сред, с ценой поверочного деления не более e = 0,01 г и с дискретностью d не более 0,001 г.

6.3 Комплект для вакуумного фильтрования (держатель для воронок, шланги, краны, насос).

6.4 Стерильные воронки для фильтрации (при необходимости).

6.5 Стерильные щипцы (при необходимости) для работы с мембранными фильтрами, с закругленными концами.

6.6 Бани водяные любой конструкции, обеспечивающие поддержание температуры (45,5 +/- 1,5) °C и (80 +/- 1) °C, оснащенные устройством циркуляции.

6.7 Термостаты любой конструкции, обеспечивающие поддержание температуры (45 +/- 1) °C, оснащенные устройством циркуляции.

6.8 pH-метр любой конструкции, с погрешностью измерений +/- 0,1 ед. pH при температуре от 20 °C до 25 °C, в комплекте с электродом.

6.9 Фильтры мембранные стерильные с диаметром пор 0,45 мкм.

6.10 Петля бактериологическая диаметром около 3 мм, вмещающая за один раз около 10 мм3 культуральной среды.

6.11 Стерильные чашки Петри, диаметром 90 мм и (при необходимости) большего размера (диаметром до 140 мм) по нормативным документам государств, принявших стандарт.

6.12 Стерильные пробирки, флаконы или колбы с крышками соответствующей вместимости.

6.13 Стерильные градуированные пипетки номинальным объемом от 0,1 до 10 см3 по ГОСТ 29227.

6.14 Колбы мерные вместимостью 50, 100 и 1000 см3 по ГОСТ 1770.

6.15 Цилиндры мерные вместимостью 100, 500 и 1000 см3 по ГОСТ 1770.

6.16 Стаканы лабораторные вместимостью 50, 100 и 1000 см3 по ГОСТ 25336.

6.17 Стекла предметные и покровные.

6.18 Стерильные чаши с широким горлышком, контейнеры или пластиковые пакеты соответствующей вместимости.

6.19 Стерильные шпатели (при необходимости), изготовленные из стекла или пластика, сделанные из стержня диаметром около 3,5 мм и длиной 20 см, согнутого под прямым углом примерно на 3 см с одного конца и с гладкими краями.

6.20 Гомогенизатор или шейкер лабораторный (при необходимости).

6.21 Микроскоп оптический лабораторный, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900 — 1000x.

6.22 Контрольные тест-штаммы, указанные в приложении Б, включая Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446 <1> (при проведении пероксидазного теста).

<1> Информация приведена для удобства пользователей стандарта. Можно использовать другой эквивалентный штамм из национальной коллекции, например ATCC 27009, NCIB 11725.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также посуды и материалов по качеству не хуже указанных.

7 Отбор и подготовка проб

7.1 Отбор проб

Отбор проб — по ГОСТ 26668, ГОСТ 31904, а также по [1] для отбора проб с поверхностей.

Если не существует конкретного стандарта, касающегося отбора проб рассматриваемого продукта, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к соглашению по этому вопросу.

Важно, чтобы лаборатория получила репрезентативный образец. Образец не должен быть поврежден или изменен во время транспортирования или хранения.

Пробы отбирают асептическим способом, исключающим микробиологическое обсеменение из окружающей среды, с помощью подходящего стерильного инструмента и контейнеров. Не рекомендуются дезинфекция спиртом посуды, фламбирование шпателей или контейнеров при отборе проб соковой продукции, не гарантирующих уничтожения спор бактерий. Для этого используют посуду и инструменты, стерилизованные в суховоздушном шкафу или путем автоклавирования, или стерильную одноразовую посуду и инструменты.

7.2 Подготовка проб — по ГОСТ ISO 6887-1, ГОСТ 26669 со следующим дополнением.

При исследовании готовой к употреблению соковой продукции, расфасованной в потребительские упаковки, для проявления жизнедеятельности бактерий Alicyclobacillus spp. перед исследованием их термостатируют, не вскрывая, при температуре 45 °C не менее 72 ч.

7.3 Приготовление исходной суспензии и последующих десятикратных разведений

7.3.1 Приготовление исходной суспензии и последующих десятикратных разведений проводят по ГОСТ ISO 6887-1 со следующими дополнениями.

7.3.2 Для приготовления исходной суспензии или разведения их дальнейшая термическая обработка проводится с использованием жидкой среды для обогащения (BAT-бульон).

7.3.3 Если не установлено иное, масса (объем) пробы образца для испытания должна (должен) быть не менее 10 г (10 см3).

Репрезентативную часть образца для испытания взвешивают в стерильную колбу или стерильный полиэтиленовый пакет с погрешностью измерения массы +/- 5% или отмеряют с погрешностью измерения объема +/- 5%.

Добавляют определенное количество BAT-бульона, равное 9m или 9V. Это количество взвешивают (по массе) или отмеряют (по объему) с погрешностью измерения +/- 5%.

Примечания

1 Для продукции, у которой исходная суспензия слишком вязкая или густая, можно добавить дополнительное количество BAT-бульона, что следует учитывать для последующих операций и (или) при выражении результатов. В таких случаях BAT-бульон следует добавлять в других соотношениях (например, 1:20, 1:50, 1:100) до тех пор, пока не будет получена удовлетворительная по консистенции первоначальная суспензия для дальнейших разведений.

2 Исходное разведение частично обуславливает значение нижнего предела подсчета, которое также зависит от применяемого метода (например, для чашечного метода с 1 см3 инокулята суспензии 10-1, для которой предел составляет 10 КОЕ). Если подсчет в некоторых видах продукции нужно вести ниже этого предела, то возможно использовать меньший объем BAT-бульона. Следует отметить, что инокуляция исходной суспензии может вызывать трудности вследствие несбалансированности соотношения инокулята и среды (сдерживания роста бактерий за счет повышенной пищевых компонентов в продукте).

3 Фильтруемые образцы не требуют разбавления.

7.3.4 Во избежание повреждения микроорганизмов из-за резких перепадов температуры температура всех растворов должна быть примерно такой же, как температура окружающей среды в лаборатории, за исключением случаев, когда для конкретных продуктов указано иное.

7.3.5 Полученную суспензию перемешивают путем вращательных движений вручную или на шейкере или гомогенизируют в гомогенизаторе (для пакетов) в соответствии с рекомендациями ГОСТ ISO 7218.

При необходимости дают крупным частицам осесть в течение 15 мин. Можно использовать системы фильтрации, дающие аналогичные результаты.

7.3.6 При необходимости приготовления последующих разведений с помощью пипетки переносят 1 см3 исходной суспензии после теплового удара с погрешностью измерения +/- 5% в пробирку, в которой содержится 9 см3 стерильного BAT-бульона при соответствующей температуре.

Примечание - Погрешность измерения +/- 5% учитывает значения погрешности используемых пипеток.

Время между окончанием приготовления исходной суспензии и моментом, когда инокулят переносят на питательную среду, должно быть не более 45 мин.

Время между приготовлением исходной суспензии и началом приготовления любых последующих разведений должно быть не более 30 мин.

7.4 Термическая обработка

Время между термической обработкой должно быть не более 15 мин после приготовления исходной суспензии или продукта, с целью избежания прорастания спор в продукте или в исходной суспензии.

Стерильную колбу или пакет для гомогенизации с подготовленной пробой по 7.3 помещают в водяную баню, нагретую до 80 °C, убедившись, что уровень воды в бане находится выше уровня образца. Температуру следует контролировать, поместив термометр в контрольную бутылку или пакет того же размера, что и бутылка или пакет с образцом, и содержащий тот же объем воды при той же начальной температуре, что и обрабатываемый образец. Время, необходимое для достижения 80 °C, не должно превышать 15 мин, и его можно сократить, обеспечив, чтобы уровень воды был как минимум на 4 см выше уровня образца, а вода в водяной бане циркулировала для максимального теплообмена.

Примечания

1 Для термической обработки можно использовать другое оборудование, кроме водяной бани, если доказана его эквивалентность.

2 Наиболее подходящий способ термической обработки для оптимизированного температурного режима для конкретной водяной бани или другого оборудования для термической обработки должен быть протестирован в первую очередь.

Образец выдерживают при температуре 80 °C в течение 10 мин, затем извлекают его из водяной бани и быстро охлаждают примерно до 20 °C под струей холодной воды.

8 Методы подсчета и выявления спорообразующих термоацидофильных бактерий (Alicyclobacillus spp.)

8.1 Метод мембранной фильтрации

8.1.1 Сущность метода

Метод основан на фильтровании через мембранный фильтр определенного объема продукта или его разведения с последующим переносом фильтров на поверхность плотной питательной среды, инкубировании посевов и подсчете выросших колоний на фильтрах.

Схема проведения этапов исследований приведена в приложении В.

Примечания

1 Настоящий метод предназначен только для жидких продуктов, проходящих через мембранный фильтр и не содержащих взвешенных нерастворимых частиц (мякоти, клеток цитрусовых и других), в том числе для осветленной соковой продукции с содержанием растворимых сухих веществ не более 15%, безалкогольных напитков и холодных чаев, содержащих продукты переработки фруктов и (или) овощей, а также для воды и смывов.

2 Концентрированную соковую продукцию предварительно восстанавливают до содержания растворимых сухих веществ не более 15%.

Предел обнаружения данного метода составляет 1 КОЕ/10 см3 или 1 КОЕ/10 г.

8.1.2 Подготовка пробы

Неразбавленную пробу продукта или ее исходное разведение, подготовленные по 7.2 или 7.3, подвергают термической обработке по 7.4. Затем пропускают 100 см3 жидкости с применением мембранных фильтров и смывают остатки пробы с боковых частей установки для фильтрования примерно 20 см3 стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора.

В случае необходимости проводят дополнительное фильтрование десятикратных разведений продукта или его исходного разведения по 7.3 в тех же условиях.

8.1.3 Проведение посева

Проводят два параллельных определения в условиях повторяемости по ГОСТ ISO 7218. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ ISO 7218.

Мембранный фильтр щипцами переносят на поверхность BAT-агара, предварительно разлитого в чашки Петри, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Примечания

1 Качество мембранных фильтров может варьироваться в зависимости от производителя или даже от партии к партии. Поэтому рекомендуется регулярно проверять их качество в соответствии с рекомендациями производителя.

2 Одновременно для контроля стерильности питательных сред в контрольную стерильную чашку Петри наливают около 15 см3 среды и инкубируют вместе с посевами.

8.1.4 Инкубирование посевов

Переворачивают чашки Петри с посевами и с контролем питательных сред крышкой вниз, помещают в термостат и инкубируют при температуре (45 +/- 1) °C в течение (120 +/- 2) ч в аэробных условиях.

8.1.5 Подтверждение принадлежности выросших колоний к бактериям рода Alicyclobacillus spp.

Подтверждение принадлежности выросших колоний к характерным спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp. проводят с помощью соответствующих морфологических, физиологических и биохимических тестов по разделу 9.

8.1.6 Обработка результатов

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно и регистрируют в протоколе согласно ГОСТ ISO/IEC 17025 с указанием метода и настоящего стандарта.

При подсчете числа выросших колоний на BAT-агаре, по окончании культивирования посевов по 8.1.4 отбирают чашки Петри с фильтрами и подсчитывают выросшие колонии в том случае, если их число отвечает требованиям, указанным в 8.1.2. Если на каждой из параллельных чашек Петри число колоний менее 10 — 15 КОЕ, то допускается использовать для подсчета суммарное количество колоний, выросших на двух параллельных чашках, а также допускается использовать чашки Петри, на которых выросло в сумме менее 15 колоний.

Пример - Количество подсчитанных колоний равно А (менее 15), а в скобках указывают нижнюю и верхнюю границу для 95%-ного доверительного интервала. Если на чашках выросло более 15 отдельных колоний, то эти чашки также используют для подсчета.

Обработку результатов подсчета колоний проводят по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 26670.

Конечный результат подсчета выражают в следующем виде: «Число бактерий Alicyclobacillus spp. КОЕ в 10 г (или в 10 см3 или в 10 см2)».

В случае, если при проведении пероксидазного теста по 9.3 наличие гваяколположительных бактерий подтверждены в 80% случаев, то есть не менее чем в четырех из пяти колоний, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри, принадлежат к гваяколположительным бактериям рода Alicyclobacillus. Конечный результат подсчета выражают в следующем виде: «Число гваяколположительных бактерий рода Alicyclobacillus составляет КОЕ в 10 г (или в 10 см3, или в 10 см2)».

Результаты подсчета должны учитывать полученные результаты проведения процедуры подтверждения принадлежности выросших колоний к спорообразующим термоацидофильным бактериям (Alicyclobacillus spp.) и гваяколположительным бактериям рода Alicyclobacillus (при необходимости).

8.2 Метод глубинного посева

8.2.1 Сущность метода

Метод основан на глубинном посеве определенного объема (массы) продукта или его разведений в плотную селективную питательную среду, с последующим инкубированием посевов и подсчете числа типичных выросших колоний на поверхности плотной селективной питательной среды.

Данный метод используют, когда требуется количественный результат и когда мембранная фильтрация невозможна из-за наличия взвешенных нерастворимых частиц (мякоти, клеток цитрусовых и других) или других свойств продукта, которые могут препятствовать процессу фильтрации.

Предел обнаружения данного метода составляет 1 КОЕ/см3 или 1 КОЕ/г.

Схема проведения этапов исследований приведена в приложении В.

8.2.2 Подготовка пробы

Неразбавленную пробу продукта или ее исходное разведение, подготовленные по 7.2 или 7.3, подвергают термической обработке по 7.4.

8.2.3 Проведение посева

Проводят два параллельных определения в условиях повторяемости по ГОСТ ISO 7218.

Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ ISO 7218.

Проводят посев пробы продукции или исходного разведения в две параллельные чашки Петри из каждого выбранного для посева разведения. Переносят с помощью стерильной пипетки 10 см3 жидкой соковой продукции, исходной суспензии (первичное разведение) или других разведений в середину каждой большой чашки Петри и заливают не менее 90 см3 расплавленного BAT-агара.

Тщательно перемешивают инокулят с питательной средой, аккуратно вращая чашку Петри, описывая фигуру восьмерки. Далее чашки Петри помещают на прохладную горизонтальную поверхность для затвердевания.

В случае необходимости проводят дополнительный посев десятикратных разведений продукта или его исходного разведения по 7.3 в тех же условиях. Последующие десятикратные разведения готовят таким образом, чтобы на поверхности чашки Петри вырастало от 15 до 150 типичных колоний.

Примечание - Вместо одной большой чашки Петри для образца объемом 10 см3 можно использовать пять маленьких чашек Петри с образцом объемом 2 см3, заполненных 15 — 20 см3 расплавленного BAT-агара.

8.2.4 Культивирование посевов

После полного затвердевания переворачивают подготовленные таким образом чашки и ставят их дном вверх в пакет, затем помещают в термостат и инкубируют при температуре (45 +/- 1) °C в течение (120 +/- 2) ч в аэробных условиях.

8.2.5 Подтверждение принадлежности выросших колоний к бактериям рода Alicyclobacillus spp.

Подтверждение принадлежности выросших колоний к характерным спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp. проводят с помощью соответствующих морфологических, физиологических и биохимических тестов по разделу 9.

8.2.6 Обработка результатов

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно и регистрируют в протоколе согласно ГОСТ ISO/IEC 17025 с указанием метода и настоящего стандарта.

При подсчете числа выросших колоний на BAT-агаре, по окончании культивирования посевов по 8.2.4 отбирают чашки Петри и подсчитывают выросшие колонии, в том случае, если их число отвечает требованиям, указанным в 8.1.2. Если на каждой из параллельных чашек Петри число колоний менее 10 — 15 КОЕ, то допускается использовать для подсчета суммарное количество колоний, выросших на двух параллельных чашках, а также допускается использовать чашки Петри, на которых выросло в сумме менее 15 колоний.

Пример - Количество подсчитанных колоний равно А (менее 15), а в скобках указывают нижнюю и верхнюю границу для 95%-ного доверительного интервала. Если на чашках выросло более 15 отдельных колоний, то эти чашки также используют для подсчета.

Обработку результатов подсчета колоний проводят по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 26670.

Конечный результат подсчета выражают в следующем виде: «Число бактерий Alicyclobacillus spp. составляет КОЕ/г (или КОЕ/см3)».

В случае, если при проведении пероксидазного теста по 9.3 наличие гваяколположительных бактерий подтверждены в 80% случаев, то есть не менее чем в четырех из пяти колоний, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри, принадлежат к гваяколположительным бактериям рода Alicyclobacillus. Конечный результат подсчета выражают в следующем виде: «Число гваяколположительных бактерий рода Alicyclobacillus составляет КОЕ/г (или КОЕ/см3)».

Результаты подсчета должны учитывать полученные результаты проведения процедуры подтверждения принадлежности выросших колоний к спорообразующим термоацидофильным бактериям (Alicyclobacillus spp.) и гваяколположительным бактериям рода Alicyclobacillus (при необходимости).

8.3 Метод выявления

8.3.1 Сущность метода

Метод основан на использовании предварительного обогащения для выявления присутствия (или отсутствия) бактерий Alicyclobacillus spp. путем посева определенного (нормируемого) объема или массы пробы продукта в жидкую селективную питательную среду (BAT-бульон).

Предел обнаружения данного метода составляет 1 КОЕ/10 см3 или 1 КОЕ/10 г.

Схема проведения этапов исследований приведена в приложении В.

8.3.2 Подготовка пробы

Неразбавленную пробу продукта или ее исходное разведение, подготовленные по 7.2 или 7.3, подвергают термической обработке по 7.4.

8.3.3 Проведение посева

Пробу, подготовленную по 8.3.2, помещают в термостат и инкубируют при температуре (45 +/- 1) °C в течение (120 +/- 2) ч в аэробных условиях.

Далее из инкубационной жидкости проводят пересев одним из способов: глубинным в BAT-агар или на поверхность BAT-агара.

Для посева на поверхность агара 0,1 см3 инкубационной жидкости для обогащения наносят на поверхность среды и с помощью шпателя осторожно, равномерно, и как можно быстрее, не касаясь края чашки Петри, распределяют по поверхности предварительно залитого в чашку BAT-агара.

Чашки Петри с закрытыми крышками выдерживают примерно 15 мин при комнатной температуре, чтобы инокулят впитался в агар. После полного впитывания инокулята переворачивают подготовленные таким образом чашки Петри.

При посеве в агар вносят 1 см3 инкубационной жидкости в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и заливают 15 — 20 см3 расплавленного BAT-агара при температуре от 44 °C до 47 °C толщиной слоя 3 мм.

Тщательно перемешивают инокулят с питательной средой, аккуратно вращая чашку Петри, описывая фигуру восьмерки. Далее чашки Петри помещают на прохладную горизонтальную поверхность для затвердевания.

Примечания

1 При использовании метода глубинного посева в чашки Петри сложнее выделить отдельные колонии для подтверждения.

2 В зависимости от свойств продукта метод посева на чашках Петри может привести к ложноотрицательным результатам.

8.3.4 Культивирование посевов

Чашки Петри с посевами помещают в термостат и инкубируют при температуре (45 +/- 1) °C в течение (120 +/- 2) ч в аэробных условиях.

Если колонии предположительно Alicyclobacillus spp. появляются раньше, чем через (120 +/- 2) ч инкубации, инкубацию можно прекратить на этом этапе. Если через (48 +/- 4) ч рост отсутствует, необходимо продолжить термостатирование чашек Петри при температуре 45 °C в течение дополнительных (72 +/- 4) ч.

По истечении этого периода, если рост колоний отсутствует, считают, что результат отрицательный. В противном случае проводят дальнейшее подтверждение принадлежности выросших колоний по 8.3.5.

8.3.5 Подтверждение принадлежности выросших колоний к бактериям рода Alicyclobacillus spp.

Подтверждение принадлежности выросших колоний к характерным спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp. проводят с помощью соответствующих морфологических, физиологических и биохимических тестов по разделу 9.

8.3.6 Обработка результатов

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно и регистрируют в протоколе согласно ГОСТ ISO/IEC 17025 с указанием метода и настоящего стандарта.

Конечный результат присутствия или отсутствия бактерий Alicyclobacillus spp. в пробе продукта выражают в следующем виде: «Бактерии Alicyclobacillus spp. обнаружены (не обнаружены) в X г (или в X см3, или в X см2), где X — масса (объем, площадь) пробы, взятой на исследование.»

В случае, если хотя бы одна отобранная колония для подтверждения по 8.3.5 имеет положительный результат, конечный результат присутствия бактерий Alicyclobacillus spp. в пробе продукта выражают в следующем виде: «Бактерии Alicyclobacillus spp. обнаружены в X г (или в X см3, или в X см2), где X — масса (объем, площадь) пробы, взятой на исследование.»

В случае, если все из отобранных колоний для подтверждения по 8.3.5 имеют отрицательный результат, то результат выражают в следующем виде: «Бактерии Alicyclobacillus spp. не обнаружены в X г (или в X см3, или в X см2), где X — масса (объем, площадь) пробы, взятой на исследование.»

В случае, если при проведении пероксидазного теста по 9.3 обнаружены гваяколположительные бактерии, то результат выдают в следующем виде: «Гваяколположительные бактерии рода Alicyclobacillus обнаружены в X г (или в X см3, или в X см2), где X — масса (объем, площадь) пробы, взятой на исследование».

В случае, если при проведении пероксидазного теста по 9.3 не обнаружены гваяколположительные бактерии, то результат выдают в следующем виде: «Гваяколположительные бактерии рода Alicyclobacillus не обнаружены в X г (или в X см3, или в X см2), где X — масса (объем, площадь) пробы, взятой на исследование».

9 Подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp.

9.1 Общие указания

9.1.1 После процедуры подсчета или выявления бактерий Alicyclobacillus spp. необходимо подтвердить их принадлежность к данной группе микроорганизмов.

9.1.2 Для дальнейшего подтверждения принадлежности выделенных колоний к спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp. изучают их ростовые характеристики и способность к образованию гваякола (при необходимости), отношение к окраске по Граму.

9.1.3 Для подтверждения принадлежности выделенных колоний к спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp. в случае их количественного подсчета выбирают репрезентативное количество колоний (по пять колоний каждого типа) из каждой чашки Петри, с которыми будут выполнены последующие исследования. Если в посевах выросло менее пяти колоний, то для подтверждения принадлежности к бактериям рода Alicyclobacillus spp. отбирают все выросшие колонии.

9.1.4 Для подтверждения принадлежности выделенных колоний к спорообразующим термоацидофильным бактериям Alicyclobacillus spp. в случае их выявления выбирают не менее одной колонии. Если первая отобранная колония дала отрицательный результат, выбирают еще дополнительные колонии, максимум до пяти.

9.2 Подтверждение по ростовым свойствам

Питательные среды BAT поддерживают рост всех известных на данный момент видов Alicyclobacillus spp. Поэтому вероятно, что на этих средах будет виден более широкий спектр типов колоний.

Из каждой выбранной колонии засевают штрихами по ГОСТ ISO 7218 на одну чашку Петри с неселективной питательной средой с нейтральным pH (например, мясо-пептонный агар, МПА) и на одну чашку Петри с BAT-агаром.

Примечание - Из-за низкого pH BAT-агар имеет слабую гелевую консистенцию, поэтому поверхностное инокулирование штрихованием следует проводить осторожно.

Термостатирование обеих чашек Петри проводят при температуре 45 °C в течение (72 +/- 4) ч.

Спорообразующие термоацидофильные бактерии Alicyclobacillus spp. дают результаты роста в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

9.3 Проведение пероксидазного теста на гваякол (необязательный)

При необходимости чашку с BAT-агаром (после культивирования по 9.2) сохраняют для пероксидазного теста на выявление гваякола (см. приложение Г).

По результатам пероксидазного теста у выявленных спорообразующих термоацидофильных бактерий Alicyclobacillus spp. оценивают способность к образованию гваякола.

9.4 Окраска по Граму

Приготовление мазков из культур, выросших на BAT-агаре, и их окраску проводят по ГОСТ 30425.

Бактерии Alicyclobacillus spp. — грамположительные палочки <1>.

<1> Возможна вариабельность (неоднородность) окрашивания для культур более 24 ч.

10 Рабочие характеристики метода

10.1 Валидация методов подсчета

Результаты межлабораторного исследования для определения точности методов были установлены в ходе межлабораторного эксперимента, приложение Д. Пределы повторяемости и воспроизводимости были определены с использованием образцов, загрязненных на различном уровне. Значения, полученные в результате межлабораторного исследования, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и типам матриц, отличным от указанных в стандарте.

10.2 Валидация метода обнаружения

Характеристики метода были определены в ходе межлабораторного эксперимента для определения специфичности, чувствительности и LOD50 метода, приложение Д. Значения, полученные в ходе межлабораторного исследования, могут быть неприменимы к типам матриц, отличным от указанных в стандарте.

10.3 Предел обнаружения 50% образцов (LOD50)

LOD50 (уровень обнаружения) — это концентрация (КОЕ/проба), для которой вероятность обнаружения составляет 50%.

11 Протокол испытания

В протоколе испытаний должно быть указано следующее:

• используемый метод отбора проб, если он известен;
• размер навески и/или характер исследуемого объекта;
• используемый метод испытаний со ссылкой на настоящий стандарт;
• любые использованные отклонения в средах обогащения или условиях инкубации;
• все условия эксплуатации, не указанные в этом документе или рассматриваемые как дополнительные, вместе с подробной информацией о любых инцидентах, которые могли оказать влияние на результаты испытаний;
• полученные результаты.

Приложение А (справочное)

СОСТАВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

А.1 Питательная среда BAT-агар <1>

<1> Питательная среда является рекомендуемой к применению. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает, что настоящий стандарт устанавливает обязательное применение указанной питательной среды. Допускаются к использованию готовые питательные среды производства других изготовителей, например, HiMedia Pvt., Döhler и другие аналогичные среды, предназначенные для целей описываемого метода.

А.1.1 Состав:

• дрожжевой экстракт — 2,0;
• глюкоза — 5,0;
• хлорид кальция CaCl2·2H2O — 0,25066;
• магния сульфат MgSO4·7H2O — 0,50;
• аммония сульфат (NH4)SO4 — 0,20;
• калия дигидрофосфат KH2PO4 — 3,0;
• цинка сульфат ZnSO4·7H2O — 0,00018;
• меди сульфат CuSO4·5H2O — 0,00016;
• марганца сульфат MnSO4·7H2O — 0,00015;
• кобальта хлорид CoCl2·6H2O — 0,00018;
• борная кислота H3BO3 — 0,00010;
• натрия молибдат Na2MoO4·2H2O — 0,00030;
• агар питательный — от 15 до 22 г (в зависимости от желирующих свойств агара);
• вода дистиллированная — 1000 см3.

А.1.2 Приготовление

Компоненты среды растворяют в дистиллированной воде, нагревают, при необходимости, для полного растворения и стерилизуют автоклавированием при 0,11 МПа (121 °C) в течение 15 мин.

Кислотность среды доводят асептически до (4,0 +/- 0,2) ед. pH с помощью соляной кислоты или раствора NaOH. После автоклавирования среду охлаждают примерно до температуры 50 °C и разливают в стерильные чашки Петри.

Готовая среда имеет бледно-янтарную окраску, слегка опалесцирует либо внешний вид среды соответствует описанию в паспорте производителя.

А.1.3 Хранение

Базовую среду до корректировки pH допускается хранить в плотно укупоренной посуде в темноте при температуре от 5 °C до 8 °C не более 3 мес в условиях, не допускающих каких-либо изменений в ее составе и свойствах.

Перед началом микробиологического исследования необходимо отрегулировать pH расплавленного и охлажденного до температуры от 44 °C до 47 °C BAT-агара и как можно скорее его использовать.

А.1.4 Ростовые характеристики эталонных штаммов приведены в приложении Б.

А.2 Питательная среда BAT-бульон <1>

<1> Питательная среда является рекомендуемой к применению. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает, что настоящий стандарт устанавливает обязательное применение указанной питательной среды. Допускаются к использованию готовые питательные среды производства других изготовителей, например, HiMedia Pvt., Döhler и другие аналогичные среды, предназначенные для целей описываемого метода.

А.2.1 Состав

Состав питательной среды BAT-бульон аналогичен составу среды BAT-агар, за исключением агара.

А.2.2 Приготовление

Компоненты среды растворяют в дистиллированной воде, нагревают, при необходимости, для полного растворения и стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121 °C) в течение 15 мин.

При приготовлении BAT-бульона рекомендуется выполнить регулировку pH перед автоклавированием (в отличие от приготовления BAT-агара).

А.2.3 Хранение

Приготовленную среду хранят в закрытых контейнерах при температуре от 5 °C до 8 °C до 4 недель.

А.2.4 Ростовые характеристики эталонных штаммов приведены в приложении Б.

Приложение Б (справочное)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАБОЧИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПРИ КОНТРОЛЕ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Таблица Б.1

Определение рабочих характеристик при контроле качества питательных сред

Приложение В (справочное)

СХЕМЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ПОДСЧЕТА СПОРООБРАЗУЮЩИХ ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ALICYCLOBACILLUS SPP.

В.1 Блок-схема проведения процедуры подсчета методом глубинного посева

Рисунок В.1

В.2 Блок-схема проведения процедуры подсчета методом мембранной фильтрации

Рисунок В.2

В.3 Блок-схема проведения процедуры выявления

Рисунок В.3

Приложение Г (справочное)

ПЕРОКСИДАЗНЫЙ ТЕСТ НА ПОДТВЕРЖДЕНИЕ НАЛИЧИЯ ГВАЯКОЛА

Г.1 Сущность

Пероксидазный тест может применяться для подтверждения способности исследуемых микроорганизмов образовывать гваякол из ванилиновой кислоты. Такие виды, как A. acidoterrestris, A. acidiphilus, A. herbarius и пр., могут давать положительные результаты в данном тесте, но необязательно будут продуцировать гваякол во всей соковой продукции. Такие виды, как A. acidocaldarius, дают отрицательный результат в этом тесте. Поскольку результаты могут варьироваться в зависимости от активности исследуемой культуры и видов, важно включить в тест положительные и отрицательные контрольные культуры, т.е. A. acidoterrestris и A. acidocaldarius, соответственно, которые были выращены в тех же условиях, что и тестируемые колонии.

Определение основано на изменении цвета среды YSG с ванилиновой кислотой после реакции окисления пероксидом водорода. Реакция окисления катализируется пероксидазой. Гваякол окисляется до органического соединения красно-коричневого цвета, 3,3'-диметокси-4,4'-дифенилхинона (тетрагваякол) по следующей схеме:

Использование YSG-бульона с ванилиновой кислотой позволяет за короткий промежуток времени накопить концентрации гваякола на уровне 10 мг/дм3.

Г.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы — по разделу 6.

Г.3 Приготовление реагентов <1>

<1> Могут быть использованы наборы для пероксидазного теста Döhler GmbH 2.04737.991 или Cosmo Bio Article KYO-08921. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность применения наборов других производителей.

Г.3.1 Для проведения пероксидазного теста на наличие гваякола используют следующие реактивы:

• кислота 4-гидрокси-2-метоксибензойная (ванилиновая), C₈H₈O₄, с массовой долей основного вещества не менее 97%;
• пероксид водорода по ГОСТ 10929 с массовой долей пероксида водорода 29% — 35%;
• пероксидаза хрена, лиофилизированный препарат с показателем чистоты RZ >= 3, раствор с ферментативной активностью 5 Е/мг;
• кислота лимонная по ГОСТ 3652, раствор с массовой концентрацией 200 г/дм3; готовят по ГОСТ 10444.1;
• калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198 или двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

Г.3.2 Приготовление YSGVA-бульона с содержанием 250 мг/дм3 ванилиновой кислоты

Взвешивают на весах 0,125 г ванилиновой кислоты и растворяют в стакане при перемешивании в 500 см3 YSG-бульона.

Стерилизуют бульон путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120 °C. После автоклавирования разливают по 2 см3 в пробирки.

Г.3.3 Приготовление фосфатного буферного раствора

97 г двузамещенного фосфорнокислого натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 500 см3 в дистиллированной воде, доводят до метки и перемешивают.

Стерилизуют путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120 °C.

Буферный раствор хранят в склянке из темного стекла с плотно закрытой пробкой не более 1 мес.

Г.3.4 Приготовление раствора пероксида водорода с объемной долей 1%

3,5 см3 пероксида водорода переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Раствор готовят непосредственно перед применением.

Г.3.5 Приготовление раствора гваякола с содержанием 1000 мг/дм3 (контрольный раствор)

Взвешивают на весах 1,0 г гваякола и растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в дистиллированной воде, доводят до метки и перемешивают.

Стерилизуют путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120 °C.

Срок хранения раствора в холодильнике при температуре не более 10 °C — не более 1 мес.

Г.4 Обнаружение

Г.4.1 Для каждой группы исследуемых колоний готовят по пять пробирок с 2 см3 YSGVA-бульона.

Г.4.2 В первую пробирку с YSGA-бульоном с помощью петли переносят несколько колоний (около 5 — 10, в зависимости от их размеров) с посева YSG-агара, культивированного при температуре (45 +/- 1) °C так, чтобы получилась умеренно густая суспензия. Тщательно перемешивают.

Г.4.3 Засевают положительную (A. acidoterrestris) и отрицательную (A. acidocaldarius) контрольные культуры в дополнительные YSGA-бульоны. Тщательно перемешивают.

Г.4.4 Параллельно инкубируют еще два YSGVA-бульона без инокуляции: один используется в качестве холостой пробы, а второй — для контроля гваякола. В пробирку для контроля на гваякол добавляют 100 мм раствора гваякола.

Г.4.5 Инкубируют все пробирки при температуре (45 +/- 1) °C на водяной бане не менее 3 ч. Затем охлаждают содержимое пробирок до комнатной температуры.

Г.4.6 В каждую из трех пробирок с культурами последовательно добавляют:

• 1 см3 фосфатного буфера;
• 0,02 см3 раствора H₂O₂;
• 0,02 см3 раствора пероксидазы.

Г.4.7 Перемешивают содержимое пробирок и оставляют на 5 — 10 мин.

Г.4.8 Оценивают изменение цвета в пробирках и сравнивают с изменениями в контрольной пробе и пробиркой с гваяколом:

• положительная пробирка с культурой (коричневый цвет);
• отрицательная пробирка с культурой (бледный бежево-коричневый цвет, но без изменений);
• холостая проба (бледный бежево-коричневый цвет, но без изменений);
• контрольная пробирка на гваякол (густой коричневый/оранжевый цвет).

Г.4.9 Записывают результаты теста на гваякол как положительные для пробирок, показавших положительную реакцию, и как отрицательные для пробирок, показавших отрицательную реакцию.

Тест оценивают как положительный или отрицательный для каждой группы исследованных колоний. Если результат промежуточный, то исследование повторяют с применением более насыщенной посевной культуры и соответствующих контрольных проб (положительной и отрицательной) или увеличивают период культивирования.

Приложение Д (справочное)

СВЕДЕНИЯ ПО ВАЛИДАЦИИ МЕТОДА И ОПРЕДЕЛЕНИЮ РАБОЧИХ ХАРАКТЕРИСТИК

Д.1 Результаты межлабораторных исследований

Были проведены международные межлабораторные исследования с участием 12 лабораторий из 6 стран. В качестве матриц для валидации метода был использован ультрапастеризованный яблочный сок. Каждый из образцов тестировался при трех разных уровнях заражения, и отрицательный контроль. Исследование было организовано в 2017 — 2018 годах NEOGEN, в рамках Soleris ACB в соответствии с [2]. Использовались мембранные фильтры и питательные среды производства Merck, Германия.

Межлабораторное исследование проводилось в соответствии с методикой, изложенной в настоящем стандарте. Результаты, полученные некоторыми участниками, были отклонены после оценки данных, после идентификации наличия технических отклонений от методов.

Значения рабочих характеристик, полученные в результате межлабораторных исследований, приведены по типам проб в таблице Д.1 - Д.3, рассчитанные в соответствии с ГОСТ ISO 5725-2.

Таблица Д.1

Межлабораторные результаты, полученные для метода прямого посева на поверхность питательной среды

Таблица Д.2

Межлабораторные результаты, полученные для метода мембранной фильтрации

Таблица Д.3

Межлабораторные результаты, полученные для метода выявления, с предварительным обогащением

БИБЛИОГРАФИЯ