ГОСТ 25583-83 (СТ СЭВ 1744-79). Государственный стандарт Союза ССР. Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита

(введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 06.01.1983 № 18)

(ред. от 17.03.1988)

Введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 6 января 1983 г. № 18

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА

Agricultural poultry. Methods of laboratory diagnostics of infectious bronchitis

ГОСТ 25583-83 (СТ СЭВ 1744-79)

ОКСТУ 9809

(введено Изменением № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

Группа С79

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 6 января 1983 г. № 18 срок действия установлен

с 1 июля 1983 года до 1 июля 1988 года

Настоящий стандарт распространяется на кур и устанавливает методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1744-79.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1. Для вирусологического исследования берут пробы тканей и органов — трахеи, слизистой оболочки носовой полости, почек и легких убитой или только что павшей птицы, а от взрослой птицы — почек и яйцеводов.

1.2. Для серологического исследования берут не менее чем от 10 голов птицы дважды с интервалом 14 — 21 сут пробы крови по 5 см3 от каждой птицы. Отстаивают сыворотку крови.

1.3. Пробы органов и тканей или их 10%-ную суспензию хранят при температуре минус 20 °C. Пробы сыворотки крови хранят без добавления консервантов при температуре минус 20 °C.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Вирусологический метод

Сущность метода заключается в изолировании и идентификации возбудителя заболевания на куриных эмбрионах или на культуре клеток.

2.1.1 Аппаратура и материалы

Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 37 — 38 °C;

инкубатор;

ступки фарфоровые;

центрифугу с частотой вращения 3000 мин-1;

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 25336-82;

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

овоскоп;

шприцы с иглами;

куриные эмбрионы 9-суточного возраста;

культуру клеток почек куриных эмбрионов или фибробласты;

раствор Хенкса;

стрептомицин, пенициллин.

2.1.2 Подготовка к исследованию

Пробы органов и тканей растирают в стерильной ступке в физиологическом растворе в соотношении 1:10 и экстрагируют в течение 2 ч при 4 °C. Суспензию центрифугируют с частотой вращения от 1500 до 2000 мин-1 в течение 15 мин. В надосадочную жидкость добавляют 2000 ЕД/см3 пенициллина и 2 мг/см3 стрептомицина, выдерживают при комнатной температуре 1 ч и делают высевы на питательные среды.

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

2.1.3 Проведение исследования

Обработанную антибиотиками надосадочную жидкость инокулируют в дозе 0,2 см3 через воздушную камеру в аллантоисную полость шести куриным эмбрионам 9-суточного возраста.

Зараженные эмбрионы инкубируют при 37,5 °C и относительной влажности 60 — 70% и два раза в день овоскопируют. Эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после заражения, не учитывают. Оставшихся в течение 72 ч трех живых эмбрионов убивают охлаждением при температуре 4 °C, а остальных собирают и охлаждают через 7 сут после заражения. От первых трех эмбрионов собирают аллантоисную жидкость и хориоаллантоисную оболочку для следующего пассажа, а остальные эмбрионы исследуют на наличие макроскопических изменений.

Проводят шесть последовательных пассажа вируса на куриных эмбрионах, так как первый пассаж в большинстве случаев не вызывает гибели или изменения эмбрионов.

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

Идентификацию вируса проводят на 9-суточных куриных эмбрионах в реакции нейтрализации (РН), используя известные специфические антисыворотки как минимум к двум основным серотипам вируса (Massachusets, Connecticut) с индексом нейтрализации антисывороток более 3 lg (см. п. 2.2.3.1), или в реакции нейтрализации в культуре клеток почек куриных эмбрионов или фибробластов (см. п. 2.2.3.2).

2.1.4 Обработка результатов

2.1.4.1. Вирус считают идентифицированным и результат положительным, если эмбрионы, инокулированные смесью испытываемого вируса со специфической антисывороткой, остаются живыми и развиваются нормально, а эмбрионы, инокулированные только испытываемым вирусом, погибают или отстают в развитии; у эмбрионов наблюдается перекручивание тела, сворачивание тела в шар, уменьшается количество амниотической жидкости, оболочки плотно прилегают к эмбриону.

В культуре клеток при положительной реакции специфическая антисыворотка ингибирует цитопатический эффект, вызванный вирусом инфекционного бронхита.

2.1.4.2. Исключен с 01.07.1988. - Изменение № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596.

2.2 Серологический метод

Сущность метода заключается в выявлении у переболевшей птицы специфических антител в реакции нейтрализации (РН) и реакции преципитации в агаровом геле (РПАГ).

2.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения исследования применяют:

баню водяную;

термостат с температурой нагрева 37 — 38 °C;

центрифугу с частотой вращения 3000 мин-1;

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

пробирки вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 25336-82;

пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 20292-74;

чашки Петри по ГОСТ 25336-82;

штамп для изготовления лунок в агаре;

воронку по ГОСТ 25336-82;

пенициллин;

стрептомицин;

агар очищенный или агар Дифко;

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

мединал;

куриные эмбрионы 9-суточного возраста;

культуры клеток почек куриных эмбрионов, выращенные на среде с 10%-ной телячьей сывороткой;

среды питательные для культуры клеток;

антисыворотки типоспецифические к инфекционному бронхиту, положительные;

штаммы эталонные вирусов инфекционного бронхита разных антигенных типов;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, 0,87%-ный раствор;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

2.2.2 Подготовка к исследованию

Пробы сыворотки крови инактивируют прогреванием при температуре 56 °C в течение 30 мин. Загрязненную сыворотку фильтруют через бактериальные фильтры или обрабатывают антибиотиками.

2.2.3 Проведение исследования в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах

2.2.3.1. В реакции используют вирус с титром не ниже 107 ЭИД 50/1 см3. Готовят серийные десятикратные разведения вируса от 10-3 до 10-8. Равные количества разведенного вируса, специфических антисывороток и испытываемых сывороток крови смешивают и смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

Каждым разведением инокулируют по четыре куриных эмбриона 9-суточного возраста в аллантоисную полость в дозе 0,2 см3. Инокулированные куриные эмбрионы овоскопируют ежедневно в течение 3 — 8 сут (в зависимости от используемого штамма); погибшие эмбрионы в течение первых 24 ч не учитывают.

2.2.3.2 Обработка результатов

По истечении 3 — 8 сут определяют инфекционный статус каждой группы инокулированных куриных эмбрионов и вычисляют ИД50. Разница между логарифмами титра контрольного ряда вируса и титра смеси вируса с испытываемой сывороткой выражает индекс нейтрализации.

При значениях индекса нейтрализации от 0,0 до 1,0 результат реакции считают отрицательным, от 1,1 до 2,0 — сомнительным, от 2,1 и выше — положительным.

Если для 20 и более процентов испытываемых сывороток крови получится сомнительный результат, исследование проводят в реакции преципитации в агаровом геле. При получении сомнительных результатов проводят исследование сывороток крови, полученных при повторном взятии крови от птицы на 14 — 21 сут. Вируснейтрализующие антитела образуются через 2 — 3 недели после вспышки заболевания и сохраняются пожизненно, а преципитирующие антитела — от 2 до 7 недель после начала заражения.

2.2.4 Проведение исследования в реакции нейтрализации на культурах клеток

2.2.4.1. Берут свежеполученную культуру клеток при образовании сплошного монослоя и адаптированный к культурам клеток вирус с титром 5 — 5,5 ед/см3.

Готовят серийные 10-кратные разведения вируса до 10-6. Каждое разведение вируса смешивают с равным количеством типоспецифической сыворотки. Если в реакции используются кроличьи контрольные сыворотки (положительная и отрицательная), их разводят до 10-1, так как неразведенные сыворотки вызывают неспецифическое гранулирование цитоплазмы клетки. Разведение сыворотки учитывают при вычислении индекса нейтрализации. Для каждого разведения вируса и смеси вируса с сывороткой берут по четыре пробирки. Разведения вируса и смеси вируса с сывороткой вносят в каждую пробирку в объеме 0,1 см3, адсорбируют в течение 30 — 40 мин при комнатной температуре, а затем добавляют поддерживающую среду в объеме 0,9 см3, содержащую 2,5% телячьей сыворотки, и инкубируют при 37,5 °C в течение 6 сут.

2.2.4.2 Обработка результатов

Учет реакции ведут по цитопатическому действию вируса. Разница логарифмов титра вируса и смеси вируса с сывороткой считается индексом нейтрализации. Результат реакции определяют по п. 2.2.3.2.

2.2.5 Проведение исследования в реакции преципитации в агаровом геле

2.2.5.1. Очищенный агар или агар Дифко от 1,1 до 1,5%, содержащий 8% хлористого натрия и имеющий pH 7,6 — 7,8, наливают в чашки Петри. Штампом делают лунки (углубления) диаметром 4 или 6 мм на расстоянии 4 мм друг от друга. На дно каждой лунки наносят каплю расплавленного агара; антиген получают из гомогенизированных хориоаллантоисных оболочек (ХАО) погибших куриных эмбрионов, инокулированных адаптированным к ним штаммом. Выбирают только те ХАО, которые показывают четкую и сильно выраженную реакцию с преципитирующей специфической антисывороткой; сыворотки — контрольные (положительная и отрицательная) и испытуемые должны быть в нативном состоянии и не инактивированными. Чашки Петри выдерживают во влажной камере при температуре 37 °C или при комнатной температуре в течение 24 — 72 ч.

(в ред. Изменения № 1, утв. Постановлением Госстандарта СССР от 17.03.1988 № 596)

Кроме контрольной положительной и отрицательной сывороток, в РПАГ ставят и контроль на антиген, изготовленный из гомогената ХАО незараженных куриных эмбрионов того же самого возраста.

2.2.5.2 Обработка результатов

Появление линии преципитации между антигеном и сыворотками свидетельствует о положительном результате.

Небольшой процент положительных результатов в реакции преципитации в агаровом геле выявляют в том случае, если заражение птиц происходило за 2 — 7 недель до исследования.

Если устанавливают большой процент преципитирующих сывороток, стадо птицы считают неблагополучным по инфекционному бронхиту.

УДК 636:576.8.07:006.354

---